Neurogeneza z wykorzystaniem komórek raka zarodkowego P19

Wiadomo, że linia komórkowa P19 różnicuje się w neurony. Jednak protokół różnicowania neuronów linii komórkowej P19 jest czasami skomplikowany. Metoda ta pozwala na przeprowadzenie eksperymentu neurogennego w sposób przyjazny dla użytkownika i poszerza możliwości wykorzystania linii komórkowej P19 w przyszłości.

Na początek utrzymuj komórki P19 w pożywce podtrzymującej, składającej się z DMEM, z 4,5 gramami na litr glukozy, uzupełnionymi 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostkami na mililitr penicyliny i 100 jednostkami na mililitr streptomycyny. Inkubuj hodowlę komórkową w środowisku o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż komórki będą zlewać się w około 80%. Usunąć zużytą pożywkę z kolby do hodowli komórkowych i umyć komórki dwoma mililitrami PBS wolnego od wapnia i magnezu.

Dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny-EDTA, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórek i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie do trzech minut. Pod mikroskopem sprawdź, czy wszystkie komórki są odłączone. Ponownie zawiesić komórki w dziewięciu mililitrach pożywki konserwacyjnej w celu zneutralizowania trypsyny.

Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i wiruj w temperaturze 200 razy G i pokojowej przez pięć minut, aby osadzać komórki. Następnie odessać supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach świeżej pożywki konserwacyjnej i użyć licznika komórek, aby określić liczbę komórek zgodnie z instrukcjami producenta.

Wysiewaj 20 000 komórek na centymetr kwadratowy w nowej kolbie T-25 i dodaj do 10 mililitrów pożywki konserwacyjnej. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni. Aby rozpocząć trawienie trypsyny, najpierw powoli odessaj supernatant i umyj komórki dwoma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu.

Następnie dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny EDTA do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie do trzech minut. Po inkubacji, aby zneutralizować trypsynę, ponownie zawieś komórki w dziewięciu mililitrach pożywki różnicującej, składającej się z DMEM o wysokim poziomie glukozy i uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostkami na mililitr penicyliny i 100 jednostkami na mililitr streptomycyny. Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i wiruj w temperaturze 200 razy G i pokojowej przez pięć minut, aby osadzać komórki.

Następnie powoli odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej pożywki różnicującej bez RA. Użyj licznika komórek, aby określić numer ogniwa zgodnie z instrukcjami producenta. W celu wytworzenia agregatu należy rozpocząć od dodania 10 mililitrów pożywki różnicującej, uzupełnionej pięcioma mikrolitrami RZS do 100-mililitrowej, niepoddanej działaniu substancji naczyń hodowlanej. Wysiewaj milion komórek w szalce hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni, aby pobudzić tworzenie agregatów.

Po inkubacji, za pomocą 10-mililitrowej pipety, odessać pożywkę zawierającą agregaty i przenieść ją do 15-mililitrowej probówki o temperaturze pokojowej. Odczekaj 1,5 minuty, aż agregaty osiądą na dnie, a następnie wyrzuć supernatant. Dodać 10 mililitrów świeżej pożywki różnicującej uzupełnionej 0,5 mikromolowym RA. Delikatnie wysiew agregaty w nowym, 100-milimetrowym, niepoddanym obróbce naczyniu hodowlanym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni.

Na początek użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść agregaty komórek do 15-mililitrowej probówki. Odczekaj 1,5 minuty w temperaturze pokojowej, aż kruszywa osiądą na dnie, a następnie wyrzuć supernatant. Umyj agregaty surowicą i DMEM bez antybiotyków.

Poczekaj, aż agregaty komórkowe osiądą na dnie, odrzuć supernatant i dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny EDTA. Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, stukając co dwie minuty, aby utrzymać komórki w zawiesinie. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki konserwacyjnej, aby zatrzymać aktywność trypsyny i pipetuj w górę iw dół 20 razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.

Na koniec odwiruj komórki w temperaturze 200 razy G i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki konserwacyjnej. Użyj licznika komórek, aby określić liczbę komórek i przystąp do powlekania komórek.

Do komórek płytkiowych najpierw dodaj trzy mililitry pożywki konserwacyjnej na dołek do sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie zasiej komórki o gęstości 500 000 na dołek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych na sześciodołkowej płytce hodowlanej. Gdy osiągną 20% zbiegu, przystąp do barwienia immunologicznego przeciwciałem Anti-MAP2. Następnie wyizoluj RNA i wykonaj PCR z odwrotną transkrypcją dla MAP2, NueN, OCT4, NANOG i GAPDH.

W niniejszej pracy przedstawiono uproszczoną metodę różnicowania neuronów. Linia komórkowa P19 jest hodowana w niepoddanym działaniu substancji naczyniu hodowlanym z 5% FBS i 0,5 mikromolowym RZS. Po czterech dniach agregaty komórkowe są dysocjowane za pomocą trypsyny i wysiewane na przylegającej płytce do hodowli komórkowej przez następne cztery dni. Skuteczność tej metody ocenia się poprzez porównanie analizy RTPCR linii komórkowej P19 w stanie niezróżnicowanym i podczas neurogenezy.

Wyniki wskazują na szybki spadek ekspresji genów pluripotencji, takich jak Oct4 i NANOG, oraz regulację w górę genów markerów neuronalnych, takich jak MAP2 i NeuN. Wierzymy, że metoda opracowana w tym badaniu jest prosta i odegra rolę w wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów neurogenezy, a także chorób neurodegeneracyjnych.