Name: Neurogeneza z wykorzystaniem komórek raka zarodkowego P19 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę indukcji neurogenezy w komórkach raka zarodkowego P19 przy użyciu kwasu retinowego. Protokół ułatwia różnicowanie neuronów i poszerza możliwości badań nad mechanizmami neurogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane finansowo przez Narodowe Centrum Nauki (grant nr. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) oraz Konsorcjum Naukowego KNOW "Zdrowe Zwierzę – Bezpieczna Żywność", decyzja MNiSW nr 05-1/KNOW2/2015

1. Utrzymanie kultury
<ol>
	<li>Hodowla linii komórkowej P19 w pożywce podtrzymującej (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco z 4500 mg / L glukozy uzupełnionej 10% FBS, 100 jednostek / ml penicyliny i 100 jednostek / ml streptomycyny). Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Komórki podhodowlane
<ol>
	<li>Gdy komórki osiągną około 80% zbieżności, należy usunąć zużytą pożywkę z kolb do hodowli komórkowych (powierzchnia 25cm2).</li>
	<li>Umyj komórki 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) wolnej od wapnia i magnezu.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) na monowarstwę komórki.</li>
	<li>Umieścić kolbę w inkubatorze CO2 (37 °C i 5% CO2 ) na 2-3 minuty.</li>
	<li>Ocenić przyłączenie komórek do powierzchni kolby. Upewnij się, że wszystkie komórki są odłączone i unoszą się w podłożu.</li>
	<li>Dodaj 9 ml pożywki podtrzymującej, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną trypsyny.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w pożywce konserwacyjnej.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 200 x g i temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml świeżej pożywki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Użyj zawiesiny ogniwa, aby określić numer ogniwa za pomocą licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Komórki nasienne w proporcjach 2 x 104 komórki/cm2 w nowej kolbieo średnicy 25 cm2.</li>
	<li>Dodaj pożywkę konserwacyjną do 10 ml.</li>
	<li>Umieścić kolbę z komórkami w inkubatorze CO2 (37 °C i 5% CO2 ) na 2-3 dni.</li>
</ol>
3. Trawienie trypsyny
<ol>
	<li>Odessać pożywkę konserwacyjną z kolby komórkowej. Umyj komórki raz 2 ml PBS bez wapnia i magnezu.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Umieścić kolbę z komórkami w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na 2-3 minuty.</li>
	<li>Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby oddzielić komórki, pipetując je dziesięć razy.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając do komórek 9 ml pożywki różnicującej (zmodyfikowanej pożywki Eagle'a firmy Dulbecco z 4500 mg / l glukozy uzupełnionej 5% FBS, 100 jednostek / ml penicyliny i 100 jednostek / ml streptomycyny) bez RZS.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 200 x g i RT.</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad i dodać 1 ml pożywki różnicującej bez kwasu retinowego (RA). Ponownie zawiesić osad komórkowy.</li>
	<li>Użyj zawiesiny ogniwa, aby określić numer ogniwa za pomocą licznika ogniw zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
4. Generowanie agregatów
<ol>
	<li>Dodać 5 μl RA (1 mM bulion rozpuszczony w 99,8% etanolu, przechowywany w temperaturze -20 °C) do 10 ml pożywki różnicującej i dobrze wymieszać (końcowe stężenie 0,5 μM RA). 
	nuta: RZS jest wrażliwy na światło. Niskie stężenie EtOH nie wpływa na różnicowanie komórek19,20,21.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki różnicującej (z RA) do niepoddanego działaniu substancji naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm (przeznaczonej do hodowli zawiesinowych).</li>
	<li>Wysiewaj 1 x 106 komórek w naczyniu o średnicy 100 mm (powierzchnia naczynia 56,5 cm2).</li>
	<li>Umieścić kolbę z komórkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 2 dni w celu pobudzenia tworzenia się agregatów.</li>
	<li>Po 2 dniach wymień podłoże różnicujące. Odessać pożywkę zawierającą agregaty za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść do probówki o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pozwól kruszywu osiadać grawitacyjnie przez 1,5 minuty przy suchej temperaturze względnej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać świeże 10 ml pożywki różnicującej z 0,5 μM RZS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. 
	ostrożność: Nie należy pipetować agregatów komórek w górę iw dół.</li>
	<li>Wysiewać kruszywa do nowego 100 mm niepoddanego działaniu substancji naczyń hodowlanych (przeznaczonych do hodowli zawiesinowych).</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C i 5% CO2 ) na 2 dni.</li>
</ol>
5. Dysocjacja agregatów
<ol>
	<li>Odessać agregaty komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Przenieść kruszywa do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól agregatom komórek osiąść grawitacyjnie przez 1,5 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant.</li>
	<li>Umyj agregaty samym DMEM (bez surowicy i antybiotyków).</li>
	<li>Pozwól, aby agregaty komórek osiadły przez sedymentację grawitacyjną przez 1,5 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać 2 ml trypsyny-EDTA (0,25%).</li>
	<li>Umieść agregaty komórkowe w łaźni wodnej (37 °C) na 10 minut. Delikatnie mieszaj agregaty co 2 minuty, stukając ręką.</li>
	<li>Zatrzymaj proces trypsynizacji, dodając 4 ml pożywki konserwacyjnej.</li>
	<li>Pipeta agreguje się w górę i w dół 20 razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 200 x g i RT.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki konserwacyjnej.</li>
	<li>Określ numer komórki za pomocą licznika komórek.</li>
</ol>
6. Komórki poszycia
<ol>
	<li>Dodać 3 ml pożywki konserwacyjnej na dołek do płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Komórki nasienne w 6-dołkowej płytce hodowlanej o gęstości 0,5 x 106/dołek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przy stężeniu 5% CO2 . </li>
	<li>Wysiewaj komórki na szkle przykrywkowym na 6-dołkowej płytce hodowlanej i wykonaj barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-MAP2 (konfluencja 20%). Użyj płytki 6-dołkowej, aby wyizolować RNA i wykonaj RT-PCR dla Map2, NeuN, Oct4, Nanog i Gapdh (konfluencja 20%).</li>
</ol>

<ol><li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+mouse+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488(2011).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation%3A+making+and+shaping+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li>
<li>Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTam%2C+PPL+%22Gastrulation%3A+From+Cells+to+Embryo%22">Gastrulation: From Cells to Embryo</a>. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 233-262 (2004).</li>
<li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li>
<li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li>
<li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons%3A+the+P19+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li>
<li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li>
<li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li>
<li>Jasmin,, Spray, D. C., Campos de Carvalho, A. C., Mendez-Otero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li>
<li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine%2C+nitrite%2C+and+nitrate+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li>
<li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Prague+Medical+Report%22%5BJournal%5D)">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li>
<li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li>
<li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19%2C+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42(2017).</li>
<li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li>
<li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li>
<li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li>
<li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+retinoic+acid+%28RA%29-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+%28RAR+alpha%29-%2C+RAR+beta-%2C+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li>
<li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li>
<li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051(2013).</li>
<li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li>
<li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li>
<li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li>
<li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li>
<li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+%28embryonal+carcinoma%29+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy prosty protokół neurogenezy z wykorzystaniem linii komórkowej P19. Chociaż opublikowano wiele doniesień w tym zakresie, szczegółowa metodologia indukcji neurogenezy z wykorzystaniem linii komórkowej P19 pozostaje niejasna. Co więcej, w całym eksperymencie wykorzystaliśmy prostą pożywkę DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,500 mg / L) z 10% FBS. Pozwoliło nam to na przeprowadzenie eksperymentu neurogennego w sposób przyjazny dla użytkownika i rozszerzenie zastosowania tej metody na przyszłość....

Podczas rozwoju embrionalnego, pojedyncza warstwa komórki przekształca się w trzy oddzielne warstwy zarodkowe1,2,3. Aby zwiększyć możliwości badawcze zjawisk zachodzących in vivo, jako wygodny model opracowano generowanie trójwymiarowych agregatów (ciał embrionalnych). Powstałe w ten sposób agregaty komórkowe mogą być narażone na różne warunki powodujące różnicowanie komórek, które odzwierciedlają rozwój zarodka4,5. Linia komórkowa mysiego raka zarodkowego P19 (linia komórkowa P19) jest powszechnie stosowana jako model komórkowy do badań neurogenezy in vitro6,7,8. Linia komórkowa P19 wykazuje typowe cechy pluripotencjalnych komórek macierzystych i może różnicować się w neurony w obecności kwasu retinowego (RZS) podczas agregacji komórek, a następnie wzrostu neurytów w warunkach przylegania. Co więcej, niezróżnicowana linia komórkowa P19 jest również zdolna do tworzenia komórek podobnych do mięśni i kardiomiocytów pod wpływem dimetylosulfotlenku (DMSO)9,10,11,12.
Wiele metod13,14,15,16 zostało zgłoszonych dotyczących różnicowania neuronów, ale metodologia jest czasami skomplikowana i niełatwa do zrozumienia poprzez samo czytanie opisów. Na przykład, protokoły czasami wymagają kombinacji pożywki Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej mieszaniną surowicy cielęcej (CS) i płodowej surowicy bydlęcej (FBS)13. Co więcej, pożywki używane do rozwoju neuronów często składają się z suplementów Neurobasel i B2713,14,15,16. W związku z tym istniejące metody są skomplikowane w ich przygotowaniu, a naszym celem jest uproszczenie protokołów. W tym badaniu wykazaliśmy, że DMEM z FBS może być wykorzystany do utrzymania linii komórkowej P19 (DMEM + 10% FBS), a także do rozwoju neuronów (DMEM + 5% FBS + RA). Ta uproszczona metoda neurogenezy wykorzystująca linię komórkową P19 pozwala nam badać molekularny mechanizm rozwoju neuronów. Co więcej, badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, są również prowadzone przy użyciu linii komórkowej P1917,18 i wierzymy, że metoda opracowana w tym badaniu odegra rolę w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych w nieprawidłowościach neurorozwojowych i chorobach neurodegeneracyjnych.

<table><tbody><tr><td>6x Barwnik ładujący DNA</td><td>EURx</td><td>E0260-01</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do syntezy cDNA</td><td>EURx</td><td>E0801-02</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&,6-Diamidine-2&prime;-dichlorowodorek fenyloindolu)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>10236276001</td><td>Stężenie robocze: 1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l) z L-glutaminą</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99,8%</td><td>Chempur</td><td>CHEM*613964202</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>EURx</td><td>E5050-03</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało MAP2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA517646</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Zestaw reakcyjny</td><td>PCR EURx</td><td>E0411-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x zagęszczona bez Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17- 517Q</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>&nbsp; rozpuszczony w 99,8% etanolu; Przechowywać w temperaturze -20 & C do 6 miesięcy</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe (Alexa Fluor 488)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Mleko odtłuszczone</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>1153630500</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B52</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25% - EDTA w HBSS, bez&nbsp; Ca2+, Mg2+, z czerwienią fenolową</td> Tworzywa <td>sztuczne</td><td>LM-T1720/500</td><td></td></tr><tr><td>Tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych Pipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>serologiczne 1 ml</td><td>Profilab</td><td>515.01</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipety serologiczne</td><td>Profilab</td><td>515.10</td><td></td></tr><tr><td>100 mm naczynie dedykowane do hodowli zawiesinowych</td><td>Corning</td><td>C351029</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Profilab</td><td>515.05</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych, powierzchnia 25 cm2</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>CLS430639-200EA</td><td></td></tr></tbody></table>

neurogeneza z wykorzystaniem komórek raka zarodkowego p19

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

Linia komórkowa P19 pochodząca z teratocarcinoma pochodzącego z zarodka myszy ma zdolność różnicowania się na trzy listki zarodkowe. W obecności kwasu retinowego (RZS) linia komórkowa P19 z hodowli zawiesinowej jest indukowana do różnicowania się w neurony. Zjawisko to jest szeroko badane jako model neurogenezy in vitro. Dlatego linia komórkowa P19 jest bardzo przydatna w badaniach molekularnych i komórkowych związanych z neurogenezą. Jednak opisane w literaturze protokoły różnicowania neuronalnego linii komórkowej P19 są bardzo złożone. Metoda opracowana w tym badaniu jest prosta i odegra rolę w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych w nieprawidłowościach neurorozwojowych i chorobach neurodegeneracyjnych.

Uproszczony schemat protokołu indukcji neurogenezy w linii komórkowej P19 został przedstawiony w Rycina 1W celu zdefiniowania charakteru linii komórkowej P19 w stanie nieróżnicowania oraz podczas neurogenezy zastosowano metodę RT-PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją). Nieróżnicująca się linia komórkowa P19 wykazywała ekspresję genów pluripotencji, takich jak transporter kationów organicznych/karnityny 4 (Oct4) oraz homeoboks Nan...

Linia komórkowa raka embrionalnego myszy P19 (linia komórkowa P19) jest szeroko stosowana do badania molekularnego mechanizmu neurogenezy z dużym uproszczeniem w porównaniu do analizy in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokół neurogenezy indukowanej kwasem retinowym w linii komórkowej P19.

Neurogeneza z wykorzystaniem komórek raka zarodkowego P19

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

Wiadomo, że linia komórkowa P19 różnicuje się w neurony. Jednak protokół różnicowania neuronów linii komórkowej P19 jest czasami skomplikowany. Metoda ta pozwala na przeprowadzenie eksperymentu neurogennego w sposób przyjazny dla użytkownika i poszerza możliwości wykorzystania linii komórkowej P19 w przyszłości.Na początek utrzymuj komórki P19 w pożywce podtrzymującej, składającej się z DMEM, z 4,5 gramami na litr glukozy, uzupełnionymi 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostkami na mililitr penicyliny i 100 jednostkami na mililitr streptomycyny. Inkubuj hodowlę komórkową w środowisku o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż komórki będą zlewać się w około 80%. Usunąć zużytą pożywkę z kolby do hodowli komórkowych i umyć komórki dwoma mililitrami PBS wolnego od wapnia i magnezu.Dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny-EDTA, aby całkowicie pokryć monowarstwę komórek i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie do trzech minut. Pod mikroskopem sprawdź, czy wszystkie komórki są odłączone. Ponownie zawiesić komórki w dziewięciu mililitrach pożywki konserwacyjnej w celu zneutralizowania trypsyny.Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i wiruj w temperaturze 200 razy G i pokojowej przez pięć minut, aby osadzać komórki. Następnie odessać supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach świeżej pożywki konserwacyjnej i użyć licznika komórek, aby określić liczbę komórek zgodnie z instrukcjami producenta.Wysiewaj 20 000 komórek na centymetr kwadratowy w nowej kolbie T-25 i dodaj do 10 mililitrów pożywki konserwacyjnej. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa do trzech dni. Aby rozpocząć trawienie trypsyny, najpierw powoli odessaj supernatant i umyj komórki dwoma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu.Następnie dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny EDTA do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwie do trzech minut. Po inkubacji, aby zneutralizować trypsynę, ponownie zawieś komórki w dziewięciu mililitrach pożywki różnicującej, składającej się z DMEM o wysokim poziomie glukozy i uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostkami na mililitr penicyliny i 100 jednostkami na mililitr streptomycyny. Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki i wiruj w temperaturze 200 razy G i pokojowej przez pięć minut, aby osadzać komórki.Następnie powoli odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze świeżej pożywki różnicującej bez RA. Użyj licznika komórek, aby określić numer ogniwa zgodnie z instrukcjami producenta. W celu wytworzenia agregatu należy rozpocząć od dodania 10 mililitrów pożywki różnicującej, uzupełnionej pięcioma mikrolitrami RZS do 100-mililitrowej, niepoddanej działaniu substancji naczyń hodowlanej. Wysiewaj milion komórek w szalce hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni, aby pobudzić tworzenie agregatów.Po inkubacji, za pomocą 10-mililitrowej pipety, odessać pożywkę zawierającą agregaty i przenieść ją do 15-mililitrowej probówki o temperaturze pokojowej. Odczekaj 1,5 minuty, aż agregaty osiądą na dnie, a następnie wyrzuć supernatant. Dodać 10 mililitrów świeżej pożywki różnicującej uzupełnionej 0,5 mikromolowym RA. Delikatnie wysiew agregaty w nowym, 100-milimetrowym, niepoddanym obróbce naczyniu hodowlanym i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez dwa dni.Na początek użyj 10-mililitrowej pipety, aby przenieść agregaty komórek do 15-mililitrowej probówki. Odczekaj 1,5 minuty w temperaturze pokojowej, aż kruszywa osiądą na dnie, a następnie wyrzuć supernatant. Umyj agregaty surowicą i DMEM bez antybiotyków.Poczekaj, aż agregaty komórkowe osiądą na dnie, odrzuć supernatant i dodaj dwa mililitry 0,25% trypsyny EDTA. Inkubować probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, stukając co dwie minuty, aby utrzymać komórki w zawiesinie. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki konserwacyjnej, aby zatrzymać aktywność trypsyny i pipetuj w górę iw dół 20 razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra.Na koniec odwiruj komórki w temperaturze 200 razy G i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki konserwacyjnej. Użyj licznika komórek, aby określić liczbę komórek i przystąp do powlekania komórek.Do komórek płytkiowych najpierw dodaj trzy mililitry pożywki konserwacyjnej na dołek do sześciodołkowej płytki hodowlanej. Następnie zasiej komórki o gęstości 500 000 na dołek. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Umieść komórki na szkiełkach nakrywkowych na sześciodołkowej płytce hodowlanej. Gdy osiągną 20% zbiegu, przystąp do barwienia immunologicznego przeciwciałem Anti-MAP2. Następnie wyizoluj RNA i wykonaj PCR z odwrotną transkrypcją dla MAP2, NueN, OCT4, NANOG i GAPDH.W niniejszej pracy przedstawiono uproszczoną metodę różnicowania neuronów. Linia komórkowa P19 jest hodowana w niepoddanym działaniu substancji naczyniu hodowlanym z 5% FBS i 0,5 mikromolowym RZS. Po czterech dniach agregaty komórkowe są dysocjowane za pomocą trypsyny i wysiewane na przylegającej płytce do hodowli komórkowej przez następne cztery dni. Skuteczność tej metody ocenia się poprzez porównanie analizy RTPCR linii komórkowej P19 w stanie niezróżnicowanym i podczas neurogenezy.Wyniki wskazują na szybki spadek ekspresji genów pluripotencji, takich jak Oct4 i NANOG, oraz regulację w górę genów markerów neuronalnych, takich jak MAP2 i NeuN. Wierzymy, że metoda opracowana w tym badaniu jest prosta i odegra rolę w wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów neurogenezy, a także chorób neurodegeneracyjnych.

neurogenesis-using-p19-embryonal-carcinoma-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Ten film demonstruje prostą technikę neurogenezy wywołanej kwasem retinowym w komórkach raka embrionalnego myszy P19. Kwas retinowy aktywuje czynniki transkrypcyjne i wyzwala ekspresję genów w celu różnicowania neuronów.

Neurogeneza indukowana kwasem retinowym przy użyciu mysich komórek raka embrionalnego

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi.  W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji.  Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Ten protokół opisuje, jak neuronalne komórki progenitorowe mogą być odróżniane od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w celu uzyskania solidnej i replikacyjnej populacji komórek nerwowych, która może być wykorzystana do identyfikacji ścieżek rozwojowych przyczyniających się do patogenezy choroby w wielu zaburzeniach neurologicznych.

Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

Protokół przedstawia przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu wywołania nerwowych komórek macierzystych przez infekcję wirusem Sendai, różnicowanie iNSC w neurony dopaminergiczne, przeszczepianie prekursorów DA do jednostronnie uszkodzonych modeli mysich choroby Parkinsona oraz ocenę bezpieczeństwa i skuteczności prekursorów DA pochodzących z iNSC w leczeniu PD.

Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych

Prezentowany tutaj jest protokół spontanicznego generowania neurosfer wzbogaconych w neurony progenitorowe neuronów o dużej gęstości. Podczas tego samego eksperymentu, gdy neurony są powlekane o mniejszej gęstości, protokół powoduje również przedłużone hodowle pierwotnych neuronów szczurów.

Generowanie neurosfer z mieszanych pierwotnych neuronów hipokampa i kory mózgowej wyizolowanych z zarodka szczura E14-E16 Sprague Dawley

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia manipulacji genetycznej w mózgu fretki embrionalnej za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta pozwala na celowanie w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej in vivo.

Celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero

Poznaj uproszczoną metodę indukcji neurogenezy w komórkach raka zarodkowego P19 przy użyciu kwasu retinowego. Protokół ułatwia różnicowanie neuronów i poszerza możliwości badań nad mechanizmami neurogenezy.

Neurogeneza z wykorzystaniem komórek raka zarodkowego P19

Przeglądaj więcej filmów