Name: Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj przygotowanie liposomalnych nanocząsteczek antygenowych do aktywacji limfocytów B in vitro i in vivo. Ta metoda umożliwia tworzenie niezawodnych modeli alergii u myszy z mniejszą liczbą zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Departamentu Obrony (W81XWH-16-1-0302 i W81XWH-16-1-0303).

<ol><li>Gupta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence%2C+severity%2C+and+distribution+of+childhood+food+allergy+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States.</a> Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).</li>
<li>Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((US+prevalence+of+self-reported+peanut%2C+tree+nut%2C+and+sesame+allergy%3A+11-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).</li>
<li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublingual+immunotherapy+for+peanut+allergy%3A+clinical+and+immunologic+evidence+of+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).</li>
<li>Vickery, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+unresponsiveness+to+peanut+in+subjects+who+have+completed+peanut+oral+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).</li>
<li>Jones, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicutaneous+immunotherapy+for+the+treatment+of+peanut+allergy+in+children+and+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).</li>
<li>Varshney, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+controlled+study+of+peanut+oral+immunotherapy%3A+clinical+desensitization+and+modulation+of+the+allergic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).</li>
<li>Anagnostou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+efficacy+of+oral+immunotherapy+for+the+desensitisation+of+peanut+allergy+in+children+%28STOP+II%29%3A+a+phase+2+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial.</a> Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).</li>
<li>Sampson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Varying+Doses+of+Epicutaneous+Immunotherapy+vs+Placebo+on+Reaction+to+Peanut+Protein+Exposure+Among+Patients+With+Peanut+Sensitivity%3A+A+Randomized+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial.</a> The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).</li>
<li>Bednar, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD22+Inhibits+Murine+B+Cell+Receptor+Activation+in+a+Human+CD22+Transgenic+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model.</a> Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).</li>
<li>Macauley, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+liposomes+displaying+CD22+ligands+induce+antigen-specific+B+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis.</a> Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).</li>
<li>Orgel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+CD22+on+antigen-specific+B+cells+to+prevent+allergy+to+the+major+peanut+allergen+Ara+h+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2.</a> Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).</li>
<li>Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-fixed+leukocytes+tolerize+Th2+responses+in+mouse+models+of+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).</li>
<li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2S+albumin+allergens+of+Arachis+hypogaea%2C+Ara+h+2+and+Ara+h+6%2C+are+the+major+elicitors+of+anaphylaxis+and+can+effectively+desensitize+peanut-allergic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice.</a> Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).</li>
<li>Dang, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+accuracy+of+peanut+allergy+diagnosis+by+using+Ara+h+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2.</a> Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).</li>
<li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).</li>
<li>Sen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+plays+a+critical+role+in+peanut+allergen+stability+and+may+determine+immunodominant+IgE-binding+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes.</a> Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).</li>
<li>Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-selective+protein-modification+chemistry+for+basic+biology+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development.</a> Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).</li>
<li>Jimenez-Saiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+memory+responses+perpetuate+humoral+TH2+immunity+and+anaphylaxis+in+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy.</a> Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).</li>
<li>Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Treatment+of+Peanut-Allergic+Mice+with+Bortezomib+Significantly+Reduces+Serum+Anti-Peanut+IgE+but+Does+Not+Affect+Allergic+Symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>LaMothe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerogenic+Nanoparticles+Induce+Antigen-Specific+Regulatory+T+Cells+and+Provide+Therapeutic+Efficacy+and+Transferrable+Tolerance+against+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).</li>
<li>Srivastava, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+peanut+oral+immunotherapy+with+CpG%2Fpeanut+nanoparticles+in+a+murine+model+of+peanut+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy.</a> J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).</li>
<li>Bellinghausen, I., Saloga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+allergic+immune+responses+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Analysis of allergic immune responses in humanized mice.</a> Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).</li>
<li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells and autoimmunity.</a> Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).</li>
<li>Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+myasthenia+gravis%3A+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+General+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations.</a> International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).</li>
<li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+myasthenia+gravis.+A+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental myasthenia gravis. A murine system.</a> J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).</li>
<li>Berman, P. W., Patrick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+the+frequency+of+muscular+weakness+and+loci+that+regulate+immune+responsiveness+in+murine+experimental+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis.</a> J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).</li>
<li>Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+the+pathophysiology+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis.</a> Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione tutaj metody są ogólnym protokołem koniugacji białka z lipidem, który umożliwia wyświetlanie białka na liposomalnych nanocząstkach. W przypadku bardzo dużych białek wielopodjednostkowych protokół ten może mieć ograniczoną użyteczność. Idealną metodą byłoby wprowadzenie znacznika specyficznego dla miejsca, który umożliwia zastosowanie biorthogonalnej strategii łączenia chemicznego. W przypadku rekombinowanej ekspresji białka można to osiągnąć przy użyciu dostępnych strategii specyficznych dla miejsca<sup cla...

Alergia pokarmowa dotyka 8% dzieci w Stanach Zjednoczonych i stała się częstsza w ciągu ostatniej dekady1. Alergia na orzeszki ziemne dotyka 1% dzieci i zazwyczaj nie jest wyrastająca z grupy2. Chociaż prowadzonych jest kilka obiecujących badań klinicznych dotyczących leczenia alergii pokarmowej, w tym immunoterapii doustnej (OIT), immunoterapii podjęzykowej (SLIT) i immunoterapii naskórnej (EPIT), obecnie nie ma zatwierdzonych przez FDA strategii leczenia osób uczulonych na orzeszki ziemne3,4,5,6,7,8. Dlatego osoby uczulone muszą bezwzględnie unikać alergenów, aby uniknąć anafilaksji. Pozostaje wiele pytań dotyczących dróg uczulenia i mechanizmów leżących u podstaw rozwoju alergii pokarmowej.
Modele myszy są cennym narzędziem do badania mechanizmów alergii, jak również opracowywania nowych terapii tolerogennych i desensytyzujących9,10,11,12. Jest to szczególnie prawdziwe, ponieważ główny alergen orzeszków ziemnych (Ara h 2; Ah2) u ludzi jest również dominującym alergenem w kilku opisanych modelach myszy13,14. Podczas gdy mysie modele alergii na orzeszki ziemne są nieocenione w badaniu mechanizmów uczulenia i tolerancji, wadą jest to, że mogą być zmienne i wymagać stosowania adiuwantów. Silniejsze immunogeny byłyby jednym ze sposobów na zminimalizowanie wewnętrznej zmienności takich modeli. Ponieważ limfocyty B są silnie aktywowane przez antygeny wielowartościowe, liposomy antygenowe wykazujące alergen są dobrym rozwiązaniem ze względu na ich zdolność do potencjalnej aktywacji komórek B przez receptor komórek B (BCR), a jednocześnie mają właściwość skutecznego pobudzania przedziału komórek T poprzez niespecyficzne pobieranie przez komórki prezentujące antygen.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół koniugacji antygenów białkowych z liposomalnymi nanocząstkami przy użyciu łatwej i modułowej strategii. Używając zastępczego antygenu, fragmentu anty-IgM Fab, pokazujemy, jak silne mogą być takie antygenowe liposomy w stymulowaniu aktywacji komórek B. Liposomy antygenowe wykazujące antygen Ah2 wykorzystano do opracowania nowego mysiego modelu o nadanej czułości. W tym modelu splenocyty od zweryfikowanych myszy alergicznych na orzeszki ziemne, zawierające komórki B i T pamięci specyficzne dla orzeszków ziemnych, są przenoszone do naiwnych myszy kongenicznych. Odpowiedzi przeciwciał pamięciowych są indukowane przez wstrzyknięcie liposomów sprzężonych z Ah2 do myszy biorcy w celu indukcji przeciwciał przeciwko Ah2. Po którym następuje tylko jedno wzmocnienie rozpuszczalnym Ah2, przeciwciała specyficzne dla Ah2 wywołują silną odpowiedź anafilaktyczną, gdy myszy te są następnie prowokowane Ah2. Ponieważ myszy poddawane reakcji alergicznej reagują w bardzo jednolity sposób i nie otrzymały adiuwanta, podejście to jest pożądanym modelem alergii na orzeszki ziemne, a wyniki sugerują, że może mieć zastosowanie w innych modelach mysich napędzanych antygenami skierowanymi na alergeny i ewentualnie autoantygeny.

<table><tbody><tr><td>Kolektor frakcji model 2110</td><td>BioRad</td><td>7318122</td><td></td></tr><tr><td>Cholestrol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td>Sigma grade 99%</td></tr><tr><td>SPDP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21857</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DSPC Avanti</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG 18:0</td><td>Avanti</td><td>880120</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG Maleimide</td><td>Avanti</td><td>880126</td><td></td></tr><tr><td>Ekstruder</td><td>Avanti</td><td>610000</td><td>1 mL strzykawka z uchwytem/blokiem grzewczym</td></tr><tr><td>Filtry 0,1 i mikro; m</td><td></td><td>Avanti</td> 610005 <td></td></tr><tr><td>Filtry 0,8 i mikro; m</td><td>Avanti</td><td>610009</td><td></td></tr><tr><td>10 mm Wsporniki filtracyjne</td><td>Avanti</td><td>6100014</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolba okrągłodenna</td><td>Sigma</td><td>Z100633</td><td></td></tr><tr><td>Korki obrotowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P-301398</td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P-198194</td><td></td></tr><tr><td>Leur Lock</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>k4201634503</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Sephadex G50</td><td>GE Life Sciences</td><td>17004201</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Sephadex G100</td><td>GE Life Sciences</td><td>17006001</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica dla cieląt płodowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x bufor do lizy RBC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Indo-1</td><td>Invitrogen</td><td>I1203</td><td></td></tr><tr><td>CD5-PE</td><td>BioLegend</td><td>100608</td><td></td></tr><tr><td>B220-PE-CY7</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170112</td><td>bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Fab anty-mysie IgM</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-007-020</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 anty-mysie IgM</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-006-020</td><td></td></tr><tr><td>Mąka orzechowa</td><td>Golden Peanut Co.</td><td>521271</td><td>12% tłuszczu jasne pieczenie, 50% białka</td></tr><tr><td>Igły do karmienia zwierząt</td><td>Cadence Science</td><td>7920</td><td>22g x 1,5", 1,25 mm - proste</td></tr><tr><td>Termometr z mikrosondą</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Sonda doodbytnicza dla myszy</td><td>Physitemp</td><td>Ret-3</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna, od Vibrio</td><td>List Biological Laboratories, Inc.</td><td>100B</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td> bez azydku <td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bufor węglanowo-wodorowęglanowy</td><td>Sigma</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór zatrzymujący TMB</td><td>KPL</td><td>50-85-06</td><td></td></tr><tr><td>SureBlue TMB Podłoże peroksydazy mikrostudzienkowej</td><td>KPL</td><td>5120-0077</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka Immulon 4HBX</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony rozpuszczalny Ara h 2</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>oczyszczony jak w: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology</td></tr><tr><td>HSA-DNP</td><td>Sigma</td><td>A-6661</td><td></td></tr><tr><td>Mysia IgE anty-DNP</td><td>Dokładny chemiczny</td><td>BYA60251</td><td></td></tr><tr><td>owce anty-mysie IgE</td><td>Miejsce wiązania</td><td>PC284</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany osioł anty-owczy IgG</td><td>Dokładny</td><td>JNS065003 chemiczny</td><td></td></tr><tr><td>Białko NeutrAwidyna, HRP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31001</td><td></td></tr><tr><td>Mysia IgG1 anty-DNP</td><td>Dokładny</td><td>chemiczny MADNP105</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat anty-mysie IgG1</td><td>Southern Biotech</td><td>1070-05</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Strzykawki insulinowe</td><td>BD</td><td>329412</td><td>U-100, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-14</td><td>25 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>gibco firmy Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>70 &mu; m Nylon, Biały, Sterylny, Pakowany pojedynczo</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkowe</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td>10 żeli</td></tr><tr><td>Bufor NuPAGE LDS, 4x</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Wstępnie barwiony standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>500 &micro; L</td></tr><tr><td>Bufor do biegania NuPAGE MES/SDS, 20x</td><td>Invitrogen</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain</td><td>Thermo Scientific</td><td>24590</td><td>500 mL</td></tr></tbody></table>

liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Odpowiedzi przeciwciał zapewniają krytyczną odporność ochronną na szeroki wachlarz patogenów. Nadal istnieje duże zainteresowanie wytwarzaniem silnych przeciwciał do szczepień, a także zrozumieniem, w jaki sposób rozwijają się patogenne odpowiedzi przeciwciał w alergiach i chorobach autoimmunologicznych. Generowanie silnych odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu nie zawsze jest trywialne. W modelach mysich często wymaga wielu rund szczepień z adiuwantem, co prowadzi do dużej zmienności poziomów indukowanych przeciwciał. Jednym z przykładów są mysie modele alergii na orzeszki ziemne, gdzie korzystne byłyby bardziej solidne i powtarzalne modele, które minimalizują liczbę myszy i zastosowanie adiuwantu. Przedstawiono tutaj wysoce powtarzalny mysi model anafilaksji alergicznej na orzeszki ziemne. Ten nowy model opiera się na dwóch kluczowych czynnikach: (1) splenocyty specyficzne dla antygenu są adoptywnie przenoszone z myszy uczulonej na orzeszki ziemne do naiwnej myszy biorcy, normalizując liczbę komórek B i T pamięci specyficznych dla antygenu u dużej liczby myszy; oraz (2) myszy biorcze są następnie wzmacniane silnym wielowartościowym immunogenem w postaci liposomalnych nanocząstek wykazujących główny alergen orzeszków ziemnych (Ara h 2). Główną zaletą tego modelu jest jego powtarzalność, co ostatecznie obniża liczbę zwierząt wykorzystywanych w każdym badaniu, jednocześnie minimalizując liczbę zwierząt otrzymujących wielokrotne wstrzyknięcia adiuwantu. Modułowy montaż tych immunogennych liposomów zapewnia stosunkowo łatwą zdolność adaptacji do innych modeli alergicznych lub autoimmunologicznych, które obejmują przeciwciała chorobotwórcze.

Koniugację białka docelowego z DSPE-PEG(2000) można wykazać poprzez przeprowadzenie redukującego elektroforezy, co wykaże wzrost masy cząsteczkowej w porównaniu z niekoniugowanym białkiem. Rycina 1A przedstawia reprezentatywny żel z koniugacją fragmentu F(ab) przeciwciał antymysich IgM z PEG-DSPE, wykazując przesunięcie prążka o 2–3 kDa dla zdenaturowanego białka. Należy zauważyć, że zmodyfikowanych wydaje się być około 50% białka, co jest spodziewane, biorąc...

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak to, w jaki sposób aktywowane są białe krwinki i jak rozwijają się alergie na poszczególne alergeny? Główną zaletą tego solidnego i powtarzalnego modelu myszy alergicznej jest to, że można wykorzystać mniejszą liczbę myszy, aby uzyskać niższą wariancję z populacją eksperymentalną. Nowe immunoterapie mające na celu kontrolowanie odpowiedzi immunologicznej wymagają solidnych modeli mysich jako wstępnego sposobu testowania skuteczności in vivo.W związku z tym implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku immunoterapii alergii. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat alergii, może być również stosowana do innych systemów, takich jak autoimmunizacja, w której niepożądane odpowiedzi przeciwciał odgrywają kluczową rolę w chorobie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu braku doświadczenia w pracy z nanocząstkami liposomalnymi lub braku doświadczenia w technikach wymaganych w pracy na myszach.Rozpocznij od dodania 2,5 molowego odpowiednika heterobifunkcyjnego środka sieciującego do białka i umieszczenia reakcji na osc

antigenic-liposomes-for-generation-of-disease-specific-antibodies

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano techniczne aspekty przeprowadzania metody LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems). Ogólne podejście polega na ekspresji chimerycznych genów kodujących antygeny połączone z lucyferazą Renilla (Ruc) w komórkach ssaków. Następnie przygotowuje się surowe ekstrakty antygenów-Ruc, które bez oczyszczania są wykorzystywane w testach immunoprecypitacyjnych do ilościowego oznaczenia przeciwciał.

Profilowanie przeciwciał za pomocą systemów immunoprecypitacji lucyferazy (LIPS)

Źródło: Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (2019)W niniejszym filmie zaprezentowano sposób generowania rekombinowanych wirusów odry z wykorzystaniem liposomów do dostarczania plazmidów kodujących antygenom wirusa oraz niezbędne białka pomocnicze do komórek producentów. Transkrypcja i replikacja RNA prowadzą do powstania cząstek wirusowych wykazujących ekspresję białek immunostymulujących oraz...

Generowanie rekombinowanego wirusa odry kodującego białko immunostymulujące

Ten film prezentuje ocenę aktywacji limfocytów B poprzez wykorzystanie antygenowych liposomów. Limfocyty B potraktowane wrażliwym na wapń barwnikiem Indo-1 rozróżnia się za pomocą cytometrii przepływowej i analizuje się ich stosunek fluorescencji fioletowej do niebieskiej. Gdy komórki napotykają liposomy antygenowe, wyzwala to aktywację limfocytów B poprzez napływ wapnia, stopniowo zwiększając z czasem stosunek sygnału fluorescencji fioletowej do niebieskiej.

Monitorowanie aktywacji limfocytów B za pomocą liposomów antygenowych przy użyciu testu strumienia wapnia

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania i oceny przeciwciał monoklonalnych przeciwko naturalnym produktom do wykorzystania w różnych testach immunologicznych. Procedura ta obejmuje immunizację, fuzję komórek, pośredni kompetycyjny test ELISA do dodatniego badania przesiewowego klonów oraz przygotowanie hybrydoma monoklonalnego. Podano również specyfikacje dotyczące charakterystyki przeciwciał za pomocą analiz MALDI-TOF-MS i ELISA.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Poznaj przygotowanie liposomalnych nanocząsteczek antygenowych do aktywacji limfocytów B in vitro i in vivo. Ta metoda umożliwia tworzenie niezawodnych modeli alergii u myszy z mniejszą liczbą zwierząt.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Przeglądaj więcej filmów