Indukcja blaszek miażdżycowych poprzez aktywację receptorów mineralokortykoidowych u myszy z niedoborem apolipoproteiny E

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patofizjologii wczesnej miażdżycy u myszy. Główną zaletą tej techniki jest skuteczność, szybkość, z jaką aldosteron indukuje rozwój blaszek miażdżycowych w okresie wzrostu dorosłych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ niektóre kroki techniczne są trudne do nauczenia się za pomocą samych instrukcji tekstowych.

Procedurę zademonstruje Caterina Mammi, naukowiec z mojego laboratorium. Zakładając rękawice chirurgiczne, przymocuj rurkę do napełniania mini-pompy do jednomililitrowej strzykawki i załaduj rurkę 125 mikrolitrami roztworu aldosteronu lub nośnika. Włóż rurkę napełniającą przez otwór w górnej części minipompy, aż nie będzie mogła się dalej przesuwać i powoli napełnij pompę roztworem aldosteronu.

Przestań napełniać pompę, gdy kropla płynu wydostanie się z korpusu pompy i ostrożnie wyjmij rurkę napełniającą. Włożyć regulator przepływu do korpusu minipompy, uważając, aby regulator był ściśle przylegający do korpusu pompy i zalać napełnioną pompę w zlewce zawierającej sterylny roztwór soli fizjologicznej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, na okres do 24 godzin przed implantacją. Aby wszczepić pompy, użyj maszynki do golenia, aby usunąć włosy z pola operacyjnego i zdezynfekuj odsłoniętą skórę za pomocą płatka z włókniny nasączonej 70% alkoholem izopropylowym.

Następnie wykonaj nacięcie o długości od 0,8 do jednego centymetra przez skórę, ale nie przez leżące pod nią tkanki i użyj kleszczy, aby otworzyć nacięcie. Używając trokara w drugiej ręce, rozprowadź skórę, aby utworzyć kieszeń dla pompy od nacięcia w kierunku łopatki i włóż pompę do nacięcia, z głową regulatora skierowaną do przodu myszy, delikatnie wciskając pompkę całkowicie do kieszeni, tak aby było wystarczająco dużo skóry, aby zamknąć ranę bez napięcia lub rozciągania. Po włożeniu pompy zszyj nacięcie drutem chirurgicznym i za pomocą czystego wacika nałóż miejscowo maść z 10% jodowidonem.

Następnie pozwól myszy zregenerować się na etapie rozgrzewania z monitorowaniem aż do pełnego leżenia. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym przelej mysz przez lewą komorę za pomocą perfuzji grawitacyjnej z 10 do 15 mililitrami lodowatego DPBS, a następnie 40 do 50 mililitrów 10% neutralnego buforowanego preparatu. Po 10 do 20 minutach umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą kleszczy i nożyczek usuń nadmiar tkanki tłuszczowej okołoaortalnej i osierdziowej.

Trzymaj nieruchome serce kleszczami i przetnij prostopadle do dostępu do łuku aorty, jak najbliżej serca, nie powodując uszkodzenia. Po oddzieleniu serca od aorty użyj skalpela, aby przeciąć poprzecznie wzdłuż linii prostej, łącząc dolne punkty prawego i lewego przedsionka i wypełnij górną część otwartego serca związkiem o optymalnej temperaturze cięcia. Umieścić wyciętą tkankę za pomocą plastikowej formy do kriosekcji z osią aorty umieszczoną prostopadle do podstawy prostokątnej formy i przykryć tkankę świeżym OCT.

Podświetl formę, aby upewnić się, że tkanka jest odpowiednio zorientowana, a następnie ostrożnie umieść formę na metalowej płytce na suchym lodzie, owijając całą formę srebrną folią do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, gdy OCT zmieni kolor na biały. Gdy kriostat osiągnie minus 20 stopni Celsjusza, zamontuj zamrożony blok serca na uchwycie próbki z komorą skierowaną na zewnątrz i włóż uchwyt próbki do głowicy orientującej próbkę. Dostosuj orientację uchwytu próbki, aby przeciąć blok tak, aby korzeń aorty był prostopadły do ostrza i odciąć blok, aż dojdziesz do korzenia aorty.

Zbierz seryjne skrawki na szkiełka podstawowe, monitorując anatomiczny profil korzenia aorty, aż pojawią się wszystkie trzy zastawki aortalne. Następnie zbierz od sześciu do ośmiu odcinków o grubości 10 mikrometrów lub do momentu, gdy jeden z trzech zaworów zniknie lub nie będzie już nienaruszony. W przypadku barwienia tłuszczem neutralnym na czerwono O, utrwal skrawki w 70 mililitrach 37% formaldehydu na pięć minut, a następnie dokładnie umyj w wodzie z kranu.

Po dwóch do trzech minutach zetrzyj wodę dostępową i zaplamij sekcje w 70 mililitrach 0,3% czerwonego oleju O przez 10 minut. Pod koniec inkubacji umyj szkiełka w wodzie z kranu przez 10 minut i zabarwij komórki przez jedną minutę w 70 mililitrach hematoksyliny Meyera, a następnie jednominutowe płukanie wodą i jednominutową emercję w 70 mililitrach 0,5% węglanu litu. Następnie umyj komórki w wodzie przez ostatnią minutę i zamontuj skrawki wodnym medium montażowym do obrazowania za pomocą mikroskopii świetlnej.

Po czterech tygodniach leczenia myszy z nokautem apolipoproteiny-E wykazywały znaczny wzrost zawartości lipidów w porównaniu ze zwierzętami z grupy kontrolnej typu dzikiego. Co więcej, leczenie aldosteronem zwiększa zawartość makrofagów u zwierząt z nokautem, o czym świadczy barwienie mack-3 i wskazuje na bardziej zapalną blaszkę miażdżycową u tych zwierząt w porównaniu z myszami leczonymi podłożem. Leczenie aldosteronem nie zmienia jednak zawartości kolagenu w blaszkach miażdżycowych.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że ta metoda jest zwalidowana tylko dla myszy z apolipoproteiną, które są naturalnie podatne na rozwój miażdżycy, gdy są karmione barwnikiem aterogennym. Dlatego nie można go zastosować do różnych modeli zwierzęcych. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie w podczerwieni, w celu scharakteryzowania miażdżycy w innym obszarze aorty i ilościowego określenia całkowitego obciążenia miażdżycowego.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się miażdżycą do zbadania wczesnych mechanizmów miażdżycy, takich jak stan zapalny i dysfunkcja śródbłonka. Nie zapominaj, że praca z lotnymi związkami, takimi jak izofan i formalina, może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie laboratoryjnej maski ochronnej.