Name: Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Poznaj protokół oczyszczania białek beztlenowych i analizy kinetycznej enzymu DesB przy użyciu elektrody tlenowej. Metoda zapewnia stabilność aktywności enzymów wrażliwych na tlen w biochemii nieorganicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Camille Keller z Uniwersytetu Wesleyan za wsparcie techniczne. Specjalne podziękowania dla profesor Lindsay D. Eltis i Jenny K. Capyk z University of British Columbia, a także Christiana Whitmana z University of Texas w Austin, za ich porady dotyczące metod oczyszczania białek beztlenowych i stosowania elektrody czułej naO2.

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Kluczowe etapy otrzymywania aktywnego, oczyszczonego białka DesB obejmują tworzenie i utrzymywanie zredukowanego miejsca aktywnego Fe(II) w enzymie. W związku z tym prawidłowe przeprowadzenie etapów indukcji, oczyszczania, zagęszczania i odsalania jest niezbędne do pomyślnego uzyskania aktywnego enzymu. Indukowanie ekspresji białka w obecności 1 mM siarczanu żelazawowo-amonowego zapewnia, że Fe(II) jest prawidłowo włączony do miejsca aktywnego DesB. Metoda ta jest inspirowana badaniami, takimi jak te z metaloenzymami ami...

Enzymy, które wykorzystują żelazo lub inne metale do aktywacji tlenu, są często podatne na inaktywację podczas procesu oczyszczania, ponieważ są usuwane ze środowiska redukującego komórkę. Dlatego białka te muszą być używane jako lizaty komórkowe, poddawane działaniu zewnętrznych środków redukujących lub oczyszczane beztlenowo, aby zapewnić optymalną aktywność enzymatyczną1,2,3,4. W przypadku enzymów, które są wrażliwe na tlen (w szczególności enzymów zawierających żelazo), przeprowadzenie wszystkich etapów oczyszczania i charakterystyki przy jednoczesnym utrzymaniu warunków beztlenowych jest konieczne ich pełne scharakteryzowanie. To skłoniło naukowców do opracowania całych zestawów laboratoryjnych w obrębie komór beztlenowych do badań od ekspresji białek po krystalografię5,6,7,8.
Niniejszym opisujemy metody beztlenowego oczyszczania i kinetycznej charakterystyki enzymu DesB za pomocą systemu elektrod tlenowych. DesB to dioksygenaza galusnowa z bakterii Sphingobium sp. szczep SYK-6, która jest spokrewniona z LigAB, dioksygenazą protokatechianową z tego samego organizmu. Oba enzymy należą do nadrodziny dioksygenazy protokatechuatowej typu II (PCAD), która do tej pory nie została dokładnie przebadana9, prawdopodobnie częściowo ze względu na podatność enzymów z tej nadrodziny na inaktywację po oczyszczeniu przy użyciu standardowych metod tlenowego oczyszczania białek. Ponieważ niektóre enzymy PCAD wykazują rozwiązłość substratów, podczas gdy inne są specyficzne dla substratu2,10, dalsza charakterystyka tej nadrodziny jest konieczna w celu zidentyfikowania determinantów specyficzności. Jak zaobserwowano w kilku nadrodzinach enzymów11,12,13,14,15, małe cząsteczki mogą zmieniać aktywność poprzez bezpośrednie hamowanie konkurencji lub wiązanie cząsteczek w oddzielne kieszenie allosteryczne, co powoduje wzrost lub spadek aktywności enzymatycznej16. Chociaż sama kinetyka nie jest w stanie zróżnicować miejsca wiązania modulatora, określenie wielkości zmiany aktywności jest ważne dla zrozumienia efektów. W związku z tym przedstawiono metody kinetycznej charakterystyki natywnej aktywności DesB i jej aktywności w obecności 4-nitrokatecholu (4NC), związku powszechnie stosowanego do charakteryzowania i hamowania enzymów dioksygenazy2,17,18.
DesB jest w stanie rozbić galusan, związek aromatyczny pochodzący z ligniny, poprzez reakcję dioksygenazy extradiolu (EDO), w której otwarcie pierścienia jest katalizowane przy użyciu tlenu jako jednego z substratów10,19. Ta reakcja enzymatyczna zachodzi w kontekście rozkładu ligniny, aromatycznego heteropolimeru znajdującego się w ścianie komórkowej roślin. Lignina może ulegać depolimeryzacji, co daje różnorodne związki aromatyczne, które mogą być dalej rozkładane na metabolity centralne3,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Dioksygenazy ekstremolowe (EDO) katalizują reakcję otwarcia pierścienia na dihydroksylowanych związkach aromatycznych, w której rozszczepienie następuje w sąsiedztwie diolu skoordynowanego z metalem; w przeciwieństwie do tego, dioksygenazy intradiolu rozszczepiają analogiczne związki aromatyczne między dwiema grupami hydroksylowymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). EDO, podobnie jak wiele innych metaloenzymów, mają dwuwartościowe centrum metalu do koordynowania Fe(II) składające się z dwuhistydynowej, jedno-karboksylowej triady9,34,35. Te metaloenzymy ulegają utlenieniu poprzez autooksydację lub inaktywację opartą na mechanizmie, podczas gdy enzym staje się nieaktywny2,36,37,38.
W procedurach eksperymentalnych opisanych w tym manuskrypcie, wykorzystujemy DesB, członka nadrodziny PCAD z bakterii Sphingobium sp. SYK-6, do katalizowania dodawania tlenu przez wiązanie C4-C5 galusanu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Regiochemia tego rozszczepienia jest analogiczna do LigAB, który jest protokatechuat-4,5-dioksygenazą (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). Dotychczasowe badania tej dioksygenazy galusnowej nie zawierają doniesień o związkach hamujących DesB10,19,39. Dzięki zastosowaniu metod oczyszczania tlenowego DesB wykazywał zmienną aktywność, natomiast przy zastosowaniu metod beztlenowych udało nam się konsekwentnie uzyskać białko o powtarzalnej aktywności. Opisane tu badania kinetyczne pokazują metody beztlenowego oczyszczania DesB, kinetyczną charakterystykę reakcji DesB z galusanem oraz inhibicję DesB przez 4-nitrokatechol (4NC).

<table><tbody><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranodyza</td><td>Złoto Bio Technologies</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Błękit brylantowy R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>30% Akrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>N,N'tetrametylo-etylenodiamina</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Żywica amyloza o wysokim przepływie</td><td>New England Biolabs</td><td>E8022S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) kompetentne komórki Escherichia coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>kwas galusowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>4-nitrokatechol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N15553</td><td></td></tr><tr><td>Żelazny Siarczan amonu</td><td>Mallinckrodt</td><td>5064</td><td></td></tr><tr><td>Ditionian sodu</td><td>Alfa Aesar</td><td>33381-22</td><td></td></tr><tr><td>butelki z serum pszenicznego</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-406G</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Acrodisc PF 25 mm z membraną Supor</td><td>Pall Corportation</td><td>4187</td><td></td></tr><tr><td>400 mL Koncentrator komórek mieszanych Amicon</td><td>EMD Millipore</td><td>UFSC40001</td><td></td></tr><tr><td>76 mm Millipore Ultracel 10 kDa odcięcie z odcięciem Filtr membranowy z celulozy</td><td>EMD Millipore</td><td>PLGC07610</td><td></td></tr><tr><td>DL-ditiotreitol</td><td>Gold Bio Technologies</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 gruboziarnista kolumna odsalająca</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0033-01</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Fiolki z zaciśniętym zamknięciem</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-391-38</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka</td> <td>sterująca elektrodą Oxygraph PlusHansatech Instruments</td><td>OXYG1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Komora Tlenowej Elektrody</td><td>Hansatech Instruments</td><td>DW1</td><td></td></tr><tr><td>Dysk elektrody</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0,0125 mmX25mm) szpula 30m</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia elektrod</td><td>Hansatech Instruments</td><td>S16</td><td></td></tr><tr><td>Papier dystansowy</td><td>Zig Zag</td><td>dostępne na każdej stacji</td><td></td>benzynowej</tr><tr><td>Schowek rękawicowy Dri-Lab serii He-Vacuum</td><td>/ Atmospheres Firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HE-493 Dri-Train</td><td>Vacuum/Atmospheres Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna mikrostożkowa szpatułka ze stali nierdzewnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>DWK Nauki Przyrodnicze Kimble Kontes Flex Kolumna ekonomiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>k420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; L, Model 701 N SYR, Cementowany NDL 26s ga, 2 cale, strzykawka</td><td>punktowa 2</td> Hamilton <td>80300</td><td></td></tr><tr><td>DWK Nauki przyrodnicze Kimble Kontes Flex Kolumna ekonomiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>K420401-1505</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator wysokociśnieniowy Emulsiflex-C5</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-PER Kompletny odczynnik do ekstrakcji białek bakteryjnych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89821</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym z białka jaja kurzego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12650-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>ampicylina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7177-48-2</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>soduFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>G46-500</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy desb

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Białka wrażliwe na tlen, w tym enzymy, które wykorzystują tlen jako substrat, mogą mieć zmniejszoną stabilność podczas oczyszczania przy użyciu tradycyjnych metod oczyszczania tlenowego. Niniejszy manuskrypt ilustruje szczegóły techniczne związane z procesem oczyszczania beztlenowego, w tym przygotowanie i odczynników, metody chromatografii kolumnowej w komorze rękawicowej oraz odsalanie białka przed kinetyką. Opisano również metody przygotowania i wykorzystania elektrody tlenowej do przeprowadzenia kinetycznej charakterystyki enzymu wykorzystującego tlen. Metody te zilustrowano przy użyciu enzymu dioksygenazy DesB, dioksygenazy galusnowej z bakterii Sphingobium sp. szczep SYK-6.

Przedstawiono analizę żelu SDS-PAGE poszczególnych frakcji z oczyszczania białka fuzyjnego DesB-maltose binding protein (MBP) (Rycina 3). Żel wykazuje, że białko jest czyste (MW = 91.22 kDa), z wyjątkiem obecności DesB (MW = 49.22 kDa) i domeny białkowej MBP (42 kDa) odszczepionych od siebie. Do zagęszczenia (krok 4.2) wybrano frakcje E2 i E3.
Powtarzalne wyniki testów kinetycznych DesB zależą od pr...

Tutaj prezentujemy protokół beztlenowego oczyszczania białek, koncentracji białka beztlenowego i późniejszej charakterystyki kinetycznej za pomocą systemu elektrod tlenowych. Metodę zilustrowano przy użyciu enzymu DesB, enzymu dioksygenazy, który jest bardziej stabilny i aktywny, gdy jest oczyszczany i przechowywany w środowisku beztlenowym.

Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Metoda ta ma na celu udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biochemii nieorganicznej, dotyczące tego, jak utrzymać aktywność enzymów w białkach zawierających metale wrażliwe na tlen. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomaga ona zwizualizować sposoby, w jakie można utrzymać metal białka w stanie zredukowanym. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej technice będą miały trudności, ponieważ trudno jest utrzymać materiały i odczynniki tak, aby były całkowicie beztlenowe.24 godziny po wywołaniu ekspresji białka zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad komórek bakteryjnych w 20 mililitrach buforu kolumny amylozy na 1,5 litra wzrostu. Dodaj jeden miligram lizozymu do zawiesiny komórek i mieszaj komórki przez 20 minut na lodzie. Pod koniec inkubacji poddać lizie zawieszony roztwór komórkowy poprzez homogenizację wysokociśnieniową z trzema do pięciu przejściami przy około 15 000 psi i przenieść białko do 50-mililitrowej probówki wirówkowej.Przepłukać przestrzeń nad powierzchnią azotem przez jedną minutę i odwirować lizat komórkowy w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń. Przenieś supernatant do co najmniej jednej 50-mililitrowej probówki i przykryj lizat gumową przegrodą. Za pomocą igły o rozmiarze 20 powoli przepuszczaj azot przez roztwór przez dwie minuty, aby wyprzeć tlen.Następnie owinąć przegrodę folią parafinową, zabezpieczyć Parafilm drutem miedzianym i umieścić supernatant w komorze rękawicowej z materiałami kolumny. Gdy rozpuszczalnik znajduje się tuż nad złożem żywicy, we wcześniej przygotowanej kolumnie amylozy załadować 50 mililitrów supernatantu białkowego na kolumnę, zbierając przepływ w pięciomililitrowych frakcjach pod umiarkowanie sprężonym azotem w tempie około pięciu mililitrów na minutę. Gdy cały przepływ zostanie wymyty, przemyć kolumnę kolejnymi trzema objętościami buforu kolumnowego amylozy.Dodaj pięć CV buforu elucyjnego, a następnie ręcznie zbierz trzymililitrowe frakcje w szklanych probówkach pod umiarkowanie ciśnieniowym azotem. Przetestuj roztwory na obecność tlenu za pomocą siarczanu żelazawo-amonu i ditiotreitolu. Roztwór zmieni kolor na ciemnoniebieski lub, jeśli obecny jest tlen, jak rurka po prawej stronie.Obecność tlenu spowoduje oczyszczenie białka o niskiej aktywności katalitycznej. Roztwory z minimalną ilością tlenu będą miały lawendowy lub jasnoniebieski półprzezroczysty kolor, jak rurka po lewej stronie. Następnie użyj zewnętrznej linii azotowej, aby zwiększyć ciśnienie w mieszanej komorze komórkowej i dwukrotnie zagęścić białko do 50 mililitrów z umiarkowaną prędkością mieszania.Następnie skoncentruj białko do 10 mililitrów i przefiltruj skoncentrowane białko przez filtr strzykawkowy o porach 0,45 mikrometra. Podwielokrotność 150 mikrolitrów białka do pojedynczych probówek reakcji łańcuchowej polimerazy o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie wyjąć zakryte porcje ze schowka na rękawiczki w celu natychmiastowego błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie i przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W przypadku odsalania DesB najpierw dodaj trzy mililitry gruboziarnistego żelu odsalającego Sephadex G-25 do dziewięciomililitrowej kolumny borokrzemianowej i umyj kolumnę dwiema objętościami odgazowanego buforu odsalającego. Gdy DesB się rozmrozi, załaduj oczyszczone białko do kolumny w procesie kontrolowanym grawitacyjnie i odrzuć przepływ przed uwolnieniem trzech kropli białka do każdej z 12 fiolek, z około pięcioma mililitrami buforu odsalającego. Aby przygotować elektrodę tlenową, użyj nożyczek, aby wyciąć jeden około 1.5 cala kwadratowego papieru dystansowego i wytnij małe trójkąty na każdej powierzchni kwadratu, ze szczelinami w rogach, aby pomóc w owinięciu elektrody.Dodaj pięć kropli 50% roztworu chlorku potasu na rowek srebrnej anody elektrody i połącz krople tak, aby tworzyły ciągły pierścień roztworu. Dodaj dwie krople roztworu chlorku potasu do górnej części elektrody platynowej i ostrożnie umieść papier dystansowy na elektrodzie platynowej, wygładzając papier dystansowy, aby nie było pęcherzyków powietrza. Wytnij kawałek membrany PTFE S4 30m o długości około dwóch cali i umieść go na papierze dystansowym, usuwając krawędzie membrany tak, aby były wyrównane z zewnętrznym pierścieniem elektrody.Za pomocą aplikatora O-ring nasuń mały O-ring na elektrodę, aby przymocować papier dystansowy i membranę do elektrody, a następnie umieść większy O-ring na okrągłym rowku elektrody, uważając, że pod spodem nie ma membrany. Wsuń górną komorę elektrody na podstawę i skręć ze sobą oba elementy. Umieść zmontowaną elektrodę na podstawie i podłącz elektrodę do systemu monitorowania.Aby określić szybkość reakcji enzymatycznej, należy użyć wrażliwej na tlen elektrody typu Clark, z integracją komputerową do pomiaru zużycia tlenu za pomocą jednostki sterującej elektrodą. Dodaj jeden mililitr buforu Tris w odpowiedniej objętości substratu do komory elektrody i mieszaj roztwór przez 10 sekund. Po 10 sekundach powoli uszczelnij komorę tłokiem i przykręć górną część do dołu.Użyj czystej chusteczki, aby wchłonąć nadmiar płynu, który jest wypierany z komory, i pozwól elektrodzie zrównoważyć się w miejscu, w którym może zapewnić stabilny pomiar stężenia tlenu w roztworze przez co najmniej jedną minutę. Następnie użyj gazoszczelnej strzykawki o pojemności 10 mikrolitrów, aby dodać około jednego mikrolitra enzymu do komory elektrody przez tłok i zbierz dane dotyczące szybkości. Po zebraniu całej dawki dla danego stężenia substratu, użyj plastikowej rurki podłączonej do kolby próżniowej z bocznym ramieniem, aby opróżnić komorę elektrody i kilkakrotnie przepłukać komorę wodą przez cztery do sześciu cykli.Następnie umieść roztwór w elektrodzie, jak pokazano, używając nowego stężenia substratu. Analiza żelowa SDS-PAGE poszczególnych frakcji z oczyszczania konstruktu fuzji białka wiążącego DesB i maltozę ujawnia izolację czystego produktu białkowego, pomijając obecność produktów domeny białka wiążącego DesB i maltozę, które oddzieliły się od siebie. Po wykonaniu wszystkich pomiarów kinetycznych można na przykład uzyskać aktywność DesB z galusanem, mierząc szybkość zużycia tlenu w różnych stężeniach galusanu.I odwrotnie, szybkość inhibicji DesB za pomocą cztero-nitrokatecholu można określić, obserwując zmniejszenie szybkości zużycia tlenu przez DesB za pomocą galusanu jednego milimola w obecności różnych stężeń cztero-nitrokatecholu, co wskazuje na przykład, że czteronitrokatechol hamuje zużycie tlenu, a tym samym reakcję DesB. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji do badania enzymów dioksygenazy zależnej od żelaza, można ją zastosować do innych układów, takich jak inne metaloenzymy. Nie zapominaj, że praca w schowku rękawicowym może być trudna, więc uważaj, aby nie spieszyć się podczas wykonywania tej techniki.

anaerobic-protein-purification-kinetic-analysis-via-oxygen-electrode

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy zastosowanie spektrometru z przepływem zatrzymanym (stopped-flow) do badania reakcji redukcyjnej i utleniającej sideroforu A Aspergillus fumigatus (SidA), który jest monooksygenazą zależną od flawiny. Następnie przedstawiamy widma odpowiadające produktom reakcji SidA i obliczamy stałe szybkości ich powstawania.

Monitorowanie reakcji połowicznych redukcyjnych i utleniających monooksygenazy zależnej od flawiny z wykorzystaniem spektrofotometrii z szybkim mieszaniem (stopped-flow)

Źródło: Tokunou, Y. i wsp., Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia metodę elektrochemiczną obejmującą całe komórki, aby ocenić, w jaki sposób transfer protonów wpływa na zewnątrzkomórkowy transport elektronów (EET) u bakterii elektroaktywnych. Zastępując protony deuteronami za pomocą tlenku deuteru, metoda mierzy zmiany prądu, aby ujawnić kinetyczny efekt...

Pomiar kinetycznego wpływu izotopów na transport elektronów drobnoustrojów za pomocą tlenku deuteru

Ponieważ mitochondria stanowią tylko niewielki procent komórki roślinnej, muszą zostać oczyszczone do szeregu badań. Mitochondria można wyizolować z różnych organów roślinnych poprzez homogenizację, a następnie wirowanie w gradiacji różnicowej i gęstości w celu uzyskania wysoce oczyszczonej frakcji mitochondrialnej.

Izolacja i pomiary oddechowe mitochondriów Arabidopsis thaliana

Mitochondria zawierają kilka enzymów zależnych od flawin, które mogą wytwarzać reaktywne formy tlenu (ROS). Monitorowanie uwalniania ROS z poszczególnych miejsc w mitochondriach jest trudne ze względu na niepożądane reakcje uboczne. Przedstawiamy łatwą i niedrogą metodę bezpośredniej oceny natywnych wskaźników uwalniania ROS przy użyciu oczyszczonych flawoenzymów i fluorometrii mikropłytek.

Jednoczesny pomiar produkcji nadtlenków/nadtlenku wodoru i NADH przez dehydrogenazy mitochondrialne zawierające flawiny

Tutaj prezentujemy protokół eksperymentów elektrochemicznych na całych komórkach, aby zbadać wpływ transportu protonów na szybkość pozakomórkowego transportu elektronów przez kompleks cytochromów błony zewnętrznej w Shewanella oneidensis MR-1.

Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania metodą chromatografii z immobilizowanym metalem metodą powinowactwa do metalu, a następnie odtworzenia oznaczonej polihistydyną, niehemowej dioksygenazy wiążącej żelazo, odpowiedniej dla laboratorium nauczania na studiach licencjackich.

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Protokatechuatowa 3,4-dioksygenaza (PCD) może enzymatycznie usuwać wolny dwuatomowy tlen z układu wodnego za pomocą swojego substratu kwasu protokatechowego (PCA). Protokół ten opisuje ekspresję, oczyszczanie i analizę aktywności tego enzymu pochłaniającego tlen.

Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

To badanie wprowadza metodologię badania wpływu ksenobiotyków na funkcję mitochondriów za pomocą testów respirometrycznych i enzymatycznych. Bada modulację łańcucha transportu elektronów u różnych gatunków, dostarczając informacji na temat ukierunkowanego opracowywania biopestycydów przeciwko chorobom przenoszonym przez owady.

Odkrywanie transportu ksenobiotyków i ich wpływu na izolowane mitochondria: wnioski z testów respirometrycznych i enzymatycznych

Protokół ten szczegółowo opisuje syntezę, enkapsulację hemoglobiny oraz powierzchniową PEGylację hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 zaprojektowanych do dostarczania tlenu. Procedura łączy inżynierię defektów z koniugacją biortogonalną wspieraną przez odkształcenie, aby uzyskać wysoce przepuszczalne i fizjologicznie stabilne nośniki odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu

Poznaj protokół oczyszczania białek beztlenowych i analizy kinetycznej enzymu DesB przy użyciu elektrody tlenowej. Metoda zapewnia stabilność aktywności enzymów wrażliwych na tlen w biochemii nieorganicznej.

Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB (Wideo) | JoVE Journal

Oczyszczanie białek beztlenowych i analiza kinetyczna za pomocą elektrody tlenowej do badania aktywności i inhibicji dioksygenazy DesB

Przeglądaj więcej filmów