Name: Analiza syntezy i wydzielania białek najądrza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj techniki immunofluorescencji i izolacji białek wydzielniczych z najądrza myszy. Metoda ta umożliwia badanie lokalizacji dynaminy i składu białek w płynie najądrzowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Narodowej Radzie Zdrowia i Badań Medycznych Australii APP1103176 za wsparcie tej pracy.

Wszystkie procedury eksperymentalne związane z pobieraniem tkanek zwierzęcych zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle.
1. Barwienie immunofluorescencyjne skrawków najądrza zatopionych w parafinie (ryc. 1 i 2)
<ol>
	<li>Bezpośrednio po eutanazji dorosłych myszy poprzez wdychanie CO2 (myszy szwajcarskie, w wieku powyżej 8 tygodni), ostrożnie wypreparuj najądrze (za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety) z leżącej tkanki łącznej i tłuszczu i zanurz w roztworze utrwalającym Bouina (> dziesięciokrotność objętości / masy tkanki) w celu utrwalenia na noc.</li>
	<li>Umyj tkankę 70% etanolem z 2× zmianami dziennie przez 2 dni, a następnie odwodnij przez klasyfikowany etanol (70%, 95% i 100%) w ramach przygotowań do infiltracji i zatopienia w bloku parafiny.</li>
	<li>Bloki parafiny należy rozdrobnić na grubość 4-6 μm i zamontować na szkiełkach w ramach przygotowań do barwienia immunofluorescencyjnego.</li>
	<li>W dygestorium odparafiny odparafiny najądrza należy odparafiny, dodając wystarczającą ilość ksylenu do słoika ze szkiełkiem, aby całkowicie zanurzyć wycinek tkanki (3× 5 minut za każdym razem).</li>
	<li>Ponownie uwodnić skrawki tkanki przez zanurzenie w stopniowanych roztworach etanolu rozcieńczonych w oczyszczonymH2O(100% etanol 5 min, 100% etanol 5 min, 90% etanol 1 min, 80% etanol 1 min, 70% etanol 1 min i 50% etanol 1 min).</li>
	<li>Umyj skrawki w słoiku na szkiełko raz przez 5 minut wystarczającą ilością soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby całkowicie zanurzyć cały fragment tkanki (postępuj zgodnie z poniższymi wskazówkami dla wszystkich kolejnych płukań).</li>
	<li>Zdekantować odpowiedni roztwór do odzyskiwania antygenu (tj. 10 mmol/l cytrynianu sodu, 50 mmol/l Tris pH 10,5 lub alternatywny roztwór (roztwory) do pobierania antygenu, w zależności od antygenu, który ma być wykryty) do stojaka na szkiełka i kuchenki mikrofalowej do wrzenia. Zanurz szkiełka w tym roztworze i poddaj skrawki tkanki warunkom pobierania antygenu wywołanym ciepłem, zoptymalizowanym dla poszczególnych przeciwciał (patrz Tabela 1). 
	Ostrzeżenie: Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone w roztworze do pobierania antygenu podczas procesu pobierania antygenu.</li>
	<li>Wyjmij pojemnik na szkiełka z kuchenki mikrofalowej i ostudź do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka za pomocą PBS i użyć płynobiegowego markera do szkiełka, aby obrysować okolice tkanki.</li>
	<li>Umieścić szkiełka w nawilżonym pojemniku (utworzonym przez zwilżoną tkankę u podstawy pojemnika) i zastosować roztwór blokujący (3% BSA/PBS, uprzednio przefiltrowany przez filtr 0,45 μm) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka jeden raz za pomocą PBS.</li>
	<li>Inkubować skrawki z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym do eksperymentalnie zoptymalizowanego stężenia w przefiltrowanym 1% BSA/PBS w temperaturze 4 °C przez noc (1:60 dla przeciwciał anty-DNM1, DNM2 i DNM3; 1:100 dla przeciwciał anty-ATP6V1B1, szczegóły dotyczące przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów). 
	Uwaga: Aby odróżnić wiązanie przeciwciał swoistych od nieswoistych, konieczne jest uwzględnienie rygorystycznie ujemnych (tj. tylko przeciwciało drugorzędowe, przeciwciało pierwszorzędowe wstępnie wchłonięte przeciwko peptydowi uodparniającemu) i kontroli pozytywnych24.</li>
	<li>Rozgrzej szkiełka, umieszczając je w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
	<li>Myć szkiełka 3× za pomocą PBS na platformie wytrząsającej (60 obr./min) przez 10 minut każda.</li>
	<li>Inkubować skrawki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 1% BSA/PBS (przefiltrowanym przez filtr 0,45 μm) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (rozcieńczenie 1:400 dla wszystkich przeciwciał drugorzędowych, szczegóły dotyczące przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów). 
	UWAGA: Począwszy od tego kroku, pojemnik na slajdy należy przechowywać w ciemności. W przypadku podwójnego znakowania należy wybrać kompatybilną kombinację przeciwciał drugorzędowych (tj. przeciwciała drugorzędowe muszą być wytworzone u różnych gatunków).</li>
	<li>Myć szkiełka 3× za pomocą PBS na platformie wytrząsającej (60 obr./min) przez 10 minut każda.</li>
	<li>Wybarwić skrawki jodkiem propidyny (PI, 7,48 μmol/l) lub 4 ́,6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI, 4,37 μmol/l) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w celu oznaczenia jądra komórkowego.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą PBS na platformie wytrząsającej (60 obr./min) przez 5 minut każda.</li>
	<li>Zamontuj sekcje z 10% Mowiol 4-88 przygotowanym w roztworze 30% glicerolu w 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) i 2,5% 1,4-diazabicyklo-(2.2.2)-oktanowym.</li>
	<li>Uszczelnić szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C do obserwacji w przyszłości. 
	UWAGA: Zaleca się wykonanie obrazowania preparatów tak szybko, jak to możliwe po przygotowaniu, aby uniknąć nadmiernej utraty fluorescencji.</li>
</ol>
2 Izolacja najądrzy z najądrza myszy (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Bezpośrednio po eutanazji dorosłych myszy poprzez inhalację CO2 (myszy szwajcarskie w wieku powyżej 8 tygodni) należy przeprowadzić perfuzję ich naczyń krwionośnych za pomocą PBS (wstępnie podgrzanego do 37 °C), aby zminimalizować zanieczyszczenie krwi tkanką najądrza. 
	UWAGA: Osocze krwi zawiera różne populacje egzosomów, które są podobnej wielkości do epijąposomów25. Skuteczność usuwania krwi z tkanki najądrza można uzyskać poprzez inspekcję początkowego segmentu, wysoce unaczynionego segmentu najądrza położonego proksymalnie do segmentu kaputowego (tj. Strefa 1 w <silna klasa = "xfig">Rysunek 1A)</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj najądrze z pokrywającego go tłuszczu i tkanki łącznej, a następnie spłucz zmodyfikowanym podłożem Biggersa, Whittena i Whittinghama (BWW; pH 7,4, osmolalność 300 mmol/kg wody26,27), aby zmniejszyć ryzyko powierzchniowego zanieczyszczenia krwi.</li>
	<li>Osusz tkankę najądrza, aby usunąć nadmiar pożywki, rozetnij najądrza caput (tj. strefy 2-5 w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A) i przenieś na świeżą szalkę Petriego (35 × 10 mm) zawierającą pożywkę BWW. Upewnij się, że ilość podłoża jest wystarczająca do ostatecznego odzyskania. 
	Uwaga: W przypadku 6 najądrzy caput zaleca się użycie 1,1 ml pożywki, aby umożliwić odzyskanie ~900 μl, które jest następnie równomiernie dzielone i nakładane na 2 wcześniej przygotowane gradienty (patrz krok 2.9).</li>
	<li>Wykonaj kilka małych nacięć w tkance caput za pomocą żyletki. Nie rozdrabniaj tkanki, a tym samym unikaj zanieczyszczenia próbki nadmierną zawartością cytozolu. Inkubować płytkę zawierającą tkankę z łagodnym mieszaniem w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu uwolnienia zawartości światła.</li>
	<li>Przefiltruj powstałą zawiesinę przez membrany 70 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.</li>
	<li>Zebrać filtrat i poddać go kolejnym etapom wirowania w temperaturze 4 °C ze zwiększającą się prędkością w celu wyeliminowania resztek komórkowych (tj. 500 × g, 2 000 × g, 4 000 × g, 8 000 × g, 5 min każdy; 17 000 × g przez 20 minut, a na koniec 17 000 × g przez dodatkowe 10 minut lub do momentu, gdy po odwirowaniu nie powstanie osadek). 
UWAGA: Ważne jest, aby ocenić kolor osadu po początkowym etapie wirowania 500 × g, aby upewnić się, że występuje minimalne zanieczyszczenie krwi. Wyrzucić wszystkie próbki, w których ten osad wykazuje różowe zabarwienie.</li>
	<li>Przygotować nieciągłe gradienty jodiksanolu (składające się z 40%, 20%, 10%, 5% warstw) przez rozcieńczenie pożywki o gradionym gradienci gęstości (zawierającej 60% (w/v) wodnego roztworu jodiksanolu) roztworem 0,25 mol/l sacharozy i 10 mmol/l Tris (pH 7,5).</li>
	<li>Przygotować gradient w probówce ultrawirówkowej (11 × 35 mm), z każdą frakcją 450 μl (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Sprawdź wzrokowo gradient po nałożeniu każdej frakcji, aby upewnić się, że interfejsy zostały pomyślnie utworzone między każdą warstwą przed załadowaniem próbki płynu najądrza. Przygotować każdy gradient na świeżo w dniu użycia, jednak próbkę płynu świetlnego najądrza można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 godzin przed załadowaniem.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 450 μl zawiesiny płynu świetlnego najądrza (odpowiadającej materiałowi pobranemu z caput 3 najądrzy) na szczycie pojedynczego gradientu.</li>
	<li>Ultraodwirować gradienty w temperaturze 160 000 × g w temperaturze 4 °C przez 18 h. 
	UWAGA: Ponieważ wirowanie to odbywa się z bardzo dużą prędkością, wszystkie probówki ultrawirówek muszą być sparowane i precyzyjnie wyważone. Sprawdź rurki, aby upewnić się, że są wolne od widocznych uszkodzeń, które mogłyby zagrozić ich integralności.</li>
	<li>Delikatnie usuń 12 równych frakcji (każda składa się z 185 μl), zaczynając od najwyższej warstwy i postępując w kierunku dołu gradientu. W stosownych przypadkach należy zgrupować równoważne frakcje odzyskane z każdego gradientu (do dwóch spadków). 
	Uwaga: Mysie najądrza są najbardziej wzbogacone we frakcjach 9 - 1122, patrz Rysunek 4 i dyskusja.</li>
	<li>Po odzyskaniu i połączeniu frakcji 9 – 11 rozcieńczyć do 2 ml PBS i ultraodwirować próbki w temperaturze 100 000 × g w temperaturze 4 °C przez 3 godziny (probówka 13 × 56 mm) w celu osadzenia najądrzy. 
	UWAGA: Ponieważ osad najądrza może być trudny do zauważenia, upewnij się, że orientacja rurek jest odnotowana podczas umieszczania ich w wirniku i zaznacz rurkę, aby wskazać oczekiwaną pozycję osadu najądrza. Upewnij się, że każda rurka zawiera wystarczającą objętość (tj. przekraczającą 50% jej całkowitej pojemności), aby wykluczyć ryzyko zapadnięcia się rurki.</li>
	<li>Ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu najądrza.</li>
	<li>Oceń czystość najądrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Zawiesić osad najądrza w żądanym podłożu zgodnie z dalszymi aplikacjami. Na przykład, pożywka BWW jest zwykle stosowana w eksperymentach obejmujących jednoczesną inkubację z plemnikami lub alternatywnie odpowiedni bufor do lizy w ramach przygotowań do ustąpienia proteomu najądrza za pomocą SDS-PAGE.</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne komórek mECap18
<ol>
	<li>Przygotowanie sterylnych szkiełek nakrywkowych (do przeprowadzenia w kapturze do hodowli komórkowych)
	<ol>
		<li>Namocz szkiełka nakrywkowe (12 × 12 mm) w 70% etanolu na 10 minut i zdezynfekuj przez suszenie w wysokiej temperaturze nad lampą etanolową.</li>
		<li>Schłodzić szkiełko nakrywkowe przez 10 s przed przeniesieniem do płytki 12-dołkowej.</li>
		<li>Nałożyć sterylny roztwór poli-L-lizyny na przykrycie szkiełka nakrywkowego i odstawić na 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić roztwór poli-L-lizyny i przepłukać szkiełko nakrywkowe sterylnymH2Olub odpowiednim podłożem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek mECap18
	<ol>
		<li>Umieścić podwielokrotności 2 × 10 5 komórek mECap18 w każdym dołku płytki 12-dołkowej zawierającej szkiełka nakrywkowe.</li>
		<li>Hodowla komórek za pomocą pożywki komórkowej mECap18 (DMEM uzupełniony 1% L-glutaminy, 1% pirogronianu sodu, 1% penicyliny/streptomycyny i 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-onC-IIIN) zawierających 10% płodowej surowicy cielęcej (FBS) w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez noc.</li>
		<li>Gdy komórki przylgną do szkiełka nakrywkowego, wyrzuć pożywkę i dwukrotnie przepłucz komórki PBS.</li>
		<li>Dodaj wystarczającą ilość 4% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w PBS, aby zanurzyć całe szkiełko nakrywkowe i utrwalić komórki w temperaturze pokojowej na 15 minut.</li>
		<li>Wylać roztwór PFA i dwukrotnie przepłukać szkiełka nakrywkowe w PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>Przepuszczalność komórek mECap18 przez zanurzenie w 0,1% Triton X-100 w PBS na 10 minut.</li>
		<li>Spłucz szkiełka nakrywkowe PBS.</li>
		<li>Zablokuj komórki mECap18 za pomocą 3% BSA i przystąp do znakowania immunologicznego komórek, wykorzystując protokoły równoważne do opisanych dla odcinków tkanki najądrza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Izolacja białek z kondycjonowanej pożywki do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Pobieranie kondycjonowanej pożywki do hodowli komórkowych
	<ol>
		<li>Pasaż 4 × 10 5 komórek mECap18 w każdym dołku na płytce 6-dołkowej z pożywką komórkową mECap18 uzupełnioną 10% FBS przez 24 godziny.</li>
		<li>Umyj komórki mECap18 trzykrotnie pożywką komórkową mECap18 (przygotowaną bez FBS) w celu usunięcia pozostałości FBS i wszelkich związanych z nim zanieczyszczeń białkowych.</li>
		<li>Dodać 1,5 ml pożywki komórkowej mECap18 (przygotowanej bez FBS) do każdej studzienki i inkubować z komórkami mECap18 przez 12 godzin w inkubatorze w temperaturze 37°C w temperaturze 5% CO2, 
		Uwaga: Komórki mECap18 na tym etapie mogą być oceniane pod kątem różnych antygenów docelowych zgodnie z projektem eksperymentalnym.</li>
		<li>Po 12 godzinach inkubacji zebrać pożywkę komórkową i odwirować w stężeniu 2 000 × g przez 10 minut, aby usunąć wszystkie resztki komórkowe. 
		Uwaga: Czas trwania inkubacji może być zmieniany zgodnie z planem doświadczalnym/oceną punktu końcowego oraz z uwzględnieniem tolerancji komórki na zastosowane leczenie. Zaleca się dostosowanie czasu inkubacji w oparciu o określone schematy doświadczalne, aby zapewnić osiągnięcie optymalnych wyników.</li>
		<li>Oceń żywotność komórek mECap18 za pomocą standardowego testu wykluczania błękitu trypanowego28. Wyrzuć cały materiał, w którym żywotność komórek spadła poniżej 90%, aby wyeliminować odchylenia wprowadzone przez białka uwolnione z martwych lub umierających komórek.</li>
		<li>Wyizolować białka z pożywki komórkowej w następujący sposób lub zakonserwować pożywkę w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja białek (do przeprowadzenia w dygestorium)
	<ol>
		<li>Dodać 20% objętości schłodzonego 100% kwasu trichlorooctowego do 80% objętości kondycjonowanej pożywki komórkowej, aby wytrącić białka uwolnione z hodowanych komórek mECap18. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, stale mieszając.</li>
		<li>Po inkubacji, białko wytrącone w osadach przez odwirowanie (17 000 × g, 4 °C przez 10 min). 
		Uwaga: Ze względu na ograniczoną ilość białka, które ma być wydzielane do pożywki, możliwe jest, że osad nie będzie łatwo uwidoczniony po odwirowaniu. Dlatego konieczne jest prawidłowe ustawienie probówki przed odwirowaniem i ostrożnie, aby nie zakłócić miejsca oczekiwania na osad podczas usuwania supernatantu.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć osad schłodzonym acetonem przed ponownym odwirowaniem (17 000 × g, 4 °C przez 10 minut).</li>
		<li>Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant przed wysuszeniem na powietrzu wszelkich pozostałości acetonu w dygestorium.</li>
		<li>Zawiesić osad białkowy w odpowiednim buforze ekstrakcyjnym w celu przygotowania do analizy końcowej w celu wykrycia pełnych profili białek wydzielniczych i/lub poszczególnych białek docelowych (np. SDS-PAGE, immunoblotting).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+Epididymal+Luminal+Environment+Responsible+for+Sperm+Maturation+and+Storage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).</li>
<li>Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epididymal+secretory+proteins+for+spermatozoa+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+research+and+technique%22%5BJournal%5D)">Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation.</a> Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).</li>
<li>Aitken, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+changes+in+mammalian+spermatozoa+during+epididymal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation.</a> Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).</li>
<li>Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epithelial+clear+cells+of+the+rat+epididymis+in+the+disposal+of+the+contents+of+cytoplasmic+droplets+detached+from+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa.</a> The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).</li>
<li>Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobaire%2C+B+%22The+epididymis%22">The epididymis</a>. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).</li>
<li>Nixon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+dissociation+of+sperm+bundles+in+monotremes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).</li>
<li>Cleland, K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/248900780_The_structure_and_fuction_of_the_Epididymis_1_The_histology_of_the_Rat_Epididymis">The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis.</a> Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).</li>
<li>Belleannée, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+luminal+and+secreted+proteins+in+bull+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis.</a> Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).</li>
<li>Turner, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Graaf%27s+thread%3A+the+human+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">De Graaf's thread: the human epididymis.</a> Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).</li>
<li>Holland, M. K., Nixon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specificity+of+epididymal+secretory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+reproduction+and+fertility%22%5BJournal%5D)">The specificity of epididymal secretory proteins.</a> Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).</li>
<li>Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3290172">Epididymal markers in human infertility.</a> Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).</li>
<li>Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segment+boundaries+of+the+adult+rat+epididymis+limit+interstitial+signaling+by+potential+paracrine+factors+and+segments+lose+differential+gene+expression+after+efferent+duct+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation.</a> Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).</li>
<li>Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+histochemical+analysis+of+region-specific+gene+expression+in+the+adult+rat+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+reproduction+and+development%22%5BJournal%5D)">In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis.</a> Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).</li>
<li>Lareyre, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+5-kilobase+pair+promoter+fragment+of+the+murine+epididymal+retinoic+acid-binding+protein+gene+drives+the+tissue-specific%2C+cell-specific%2C+and+androgen-regulated+expression+of+a+foreign+gene+in+the+epididymis+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).</li>
<li>Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRES+gene%3A+a+unique+testis-regulated+gene+related+to+the+cystatin+family+is+highly+restricted+in+its+expression+to+the+proximal+region+of+the+mouse+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis.</a> Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).</li>
<li>Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+epididymal+secretory+proteins.+I.+Characterization+and+hormonal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation.</a> Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).</li>
<li>Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+epididymal+secretory+proteins.+II.+Immunolocalization+and+sperm+association+of+REP38%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38.</a> Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).</li>
<li>Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+epididymal+secretory+proteins.+III.+Molecular+cloning+and+characterization+of+the+complementary+DNA+for+REP38%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38.</a> Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).</li>
<li>Jelinsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rat+epididymal+transcriptome%3A+comparison+of+segmental+gene+expression+in+the+rat+and+mouse+epididymides%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides.</a> Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).</li>
<li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15878890">The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1.</a> Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+dynamin+family+of+mechanoenzymes+in+the+mouse+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis.</a> Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).</li>
<li>Reilly, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+mouse+epididymosomes+reveals+a+complex+profile+of+microRNAs+and+a+potential+mechanism+for+modification+of+the+sperm+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome.</a> Scientific reports. 6, (2016).</li>
<li>Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epididymosomes%3A+a+heterogeneous+population+of+microvesicles+with+multiple+functions+in+sperm+maturation+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage.</a> Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).</li>
<li>Reid, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3+regulates+acrosomal+exocytosis+in+mouse+spermatozoa+via+dynamin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation.</a> The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).</li>
<li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+red+blood+cell+units+bind+to+monocytes+and+induce+proinflammatory+cytokines%2C+boosting+T-cell+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro.</a> Blood. 123 (5), 687-696 (2014).</li>
<li>Anderson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+microRNA+expression+in+mouse+epididymal+epithelial+cells+and+spermatozoa+by+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+data%22%5BJournal%5D)">Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing.</a> Genomics data. 6, 208-211 (2015).</li>
<li>Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggers%2C+J+%22Methods+in+mammalian+embryology%22">Methods in mammalian embryology</a>. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).</li>
<li>Elkjær, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+AQP9+in+liver%2C+epididymis%2C+testis%2C+spleen%2C+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain.</a> Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).</li>
<li>Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-1+is+not+restricted+to+tight+junctions+in+the+rat+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis.</a> Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).</li>
<li>Isnard-Bagnis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ClC-3+and+ClC-5+in+epididymal+epithelium%3A+immunofluorescence+and+RT-PCR+after+LCM%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).</li>
<li>Rojek, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+glycerol+metabolism+in+aquaporin+9+%28AQP9%29+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).</li>
<li>Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+luminal+acidification+in+the+male+reproductive+tract+via+cell-cell+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk.</a> Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).</li>
<li>Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cell-cell+cross+talk+in+the+epididymis%3A+Control+of+luminal+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification.</a> Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).</li>
<li>Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+epididymal+epithelium+in+transgenic+mice+expressing+simian+virus+40+T+antigen%3A+characterization+of+cell+lines+and+regulation+of+the+polyoma+enhancer+activator+3%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3.</a> Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).</li>
<li>Feugang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+relaxin+and+its+receptor+proteins+in+boar+reproductive+tissues+and+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46(2015).</li>
<li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+detection+by+antibody-based+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytokine detection by antibody-based proximity ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).</li>
<li>Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+epididymosomes+collected+in+the+intraluminal+compartment+of+the+bovine+caput+and+cauda+epididymidis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis.</a> Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).</li>
<li>Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+observations+on+enzymatic+activity+and+protein+content+of+vesicles+separated+from+rat+epididymal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid.</a> Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).</li>
<li>Eickhoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+%28MIF%29+on+the+zinc+content+and+redox+state+of+protein-bound+sulphydryl+groups+in+rat+sperm%3A+indications+for+a+new+role+of+MIF+in+sperm+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+human+reproduction%22%5BJournal%5D)">Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation.</a> Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).</li>
<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Hutcheon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+small+non-protein-coding+RNA+profile+of+mouse+spermatozoa+reveals+specific+enrichment+of+piRNAs+within+mature+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa.</a> RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).</li>
<li>Bennett, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+of+the+spread+of+antibiotic+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annali+dell%27Istituto+superiore+di+sanita%22%5BJournal%5D)">Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes.</a> Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).</li>
<li>Nixon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+analysis+reveals+segmental+patterns+of+microRNA+expression+in+mouse+epididymal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells.</a> PloS one. 10 (8), e0135605(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania te obejmowały wykorzystanie utrwalonej tkanki najądrza Bouina, która została poddana zatapianiu parafiny i standardowym protokołom sekcji. Roztwór utrwalający Bouina składa się z mieszaniny formaldehydu, kwasu pikrynowego i kwasu octowego, przy czym każdy składnik ma określoną i komplementarną funkcję. W ten sposób formaldehyd reaguje z aminami pierwszorzędowymi, tworząc wiązania krzyżowe białek, kwas pikrynowy powoli wnika w tkankę, tworząc sole, a tym samym koagulację podstawowych białek i odwrotnie, kwas octow...

Plemniki wszystkich gatunków ssaków nabywają zdolność do wykazywania postępującej ruchliwości do przodu i zapłodnienia komórki jajowej podczas ich długotrwałego zejścia przez najądrze, wysoce wyspecjalizowany obszar męskiego systemu przewodów pozajądrowych, którego nawigacja może zająć 7 - 14 dni (w zależności od gatunku)1. Ze względu na ekstremalną kondensację ojcowskiej chromatyny i zrzucanie większości cytoplazmy, która towarzyszy cytoróżnicowaniu plemników w jądrach, ich późniejsze dojrzewanie funkcjonalne jest napędzane wyłącznie przez ich interakcję z mikrośrodowiskiem najądrza. Środowisko to jest z kolei tworzone przez aktywność wydzielniczą i absorpcyjną wyściółki somy najądrza i wykazuje wyjątkowy poziom zmienności segment-segment1. Tak więc najbardziej aktywnymi segmentami pod względem syntezy i wydzielania białek są te zlokalizowane w proksymalnej części najądrza (a mianowicie w ogonie i ciałie)2. Aktywność ta odzwierciedla profil funkcjonalny plemników, przy czym komórki po raz pierwszy zaczynają wykazywać cechy kompetencji funkcjonalnej (tj. ruchliwość postępową i zdolność do wiązania się z rozpuszczonymi w kwasie glikoproteinami zona) po przejściu przez najądrza caput epi�ymis3. Te atrybuty funkcjonalne nadal się rozwijają, zanim osiągną optymalny poziom, gdy plemniki docierają do dystalnego segmentu najądrza (ogona), w którym są przechowywane w stanie spoczynku w gotowości do wytrysku. Tworzenie i utrzymywanie tego zbiornika do przechowywania plemników jest również ściśle związane z nabłonkiem wyściółkowym, który w ogonie jest zdominowany przez silną aktywność absorpcyjną4,5. Chociaż zgłoszono różnice anatomiczne6,7,8, taki regionalny podział pracy wydaje się być cechą charakterystyczną najądrza, która jest wspólna dla większości badanych do tej pory gatunków ssaków, w tym naszego własnego9,10. Rzeczywiście, z klinicznego punktu widzenia wiadomo, że dysfunkcja najądrza ma istotny wpływ na etiologię niepłodności czynnika męskiego11, podkreślając w ten sposób znaczenie zrozumienia regulacji tej wyspecjalizowanej tkanki.
Szkoda zatem, że nasze zrozumienie fizjologii najądrza i mechanizmów regulujących kolejne fazy dojrzewania i przechowywania plemników w tej tkance pozostaje do pełnego rozwiązania. Wśród czynników ograniczających postępy w badaniach nad najądrzami jest ogólna złożoność tej tkanki oraz znajomość mechanizmów, które sprawują kontrolę regulacyjną nad jej mikrośrodowiskiem świetlnym. Anatomicznie wiemy, że poza rozróżnieniem segmentów caput, body i cauda, najądrza można dalej podzielić na kilka stref (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A), z których każda jest oddzielona przez septa12 i charakteryzowana dyskretnymi profilami ekspresji genów/białek13,14,15,16,17,18. Rzeczywiście, na podstawie szczegółowego profilowania transkrypcyjnego segmentalnej ekspresji genów w najądrzach, w modelach myszy i szczurów zgłoszono aż 6 i 9 odrębnych stref najądrza, odpowiednio19,20. Taka złożoność prawdopodobnie odzwierciedla skład somy najądrza, pseudostratyfikowanego nabłonka obejmującego wiele różnych typów komórek; każdy z nich różni się pod względem liczebności, rozmieszczenia i działań wydzielniczych/absorpcyjnych na całej długości obwodu. Tak więc główne komórki są zdecydowanie najliczniejszym typem komórek najądrza, stanowiącym ponad 80% wszystkich komórek nabłonkowych. W związku z tym główne komórki są odpowiedzialne za większość biosyntezy i wydzielania białek najądrza5. W przeciwieństwie do tego, populacja komórek czystych, które są drugim najliczniejszym typem komórek w somie najądrza, jest przede wszystkim zaangażowana w selektywną absorpcję składników luminalnych i zakwaszenie tego mikrośrodowiska5. Dodając kolejny poziom złożoności, androgeny i inne czynniki lumikrynowe pochodzenia jądrowego wywierają różnicową kontrolę nad każdym z tych typów komórek najądrza w zależności od ich położenia wzdłuż drogi.
Pomimo ograniczeń nałożonych przez taką złożoność, nadal czynione są znaczące postępy w rozwiązywaniu mechanistycznych podstaw funkcji najądrza. Kluczem do tych badań było zastosowanie zaawansowanych strategii spektrometrii mas w celu ustalenia inwentaryzacji proteomu najądrza na szeroką skalę, w połączeniu ze szczegółowymi analizami poszczególnych białek wybranych spośród tych wstępnych badań. Ilustracją tego podejścia jest nasza niedawna charakterystyka rodziny mechanoenzymów DNM w modelu myszy21. Nasze początkowe zainteresowanie DNM było napędzane jego podwójnym działaniem w sprzężeniu procesów egzo- i endocytotycznych. Opierając się na tych obserwacjach, byliśmy w stanie wykazać, że trzy kanoniczne izoformy DNM (DNM1 - DNM3) są wysoce eksprymowane w najądrzu myszy i odpowiednio ustawione do pełnienia ról regulacyjnych w wydzielaniu i wchłanianiu białek21. Co więcej, byliśmy w stanie wyraźnie rozróżnić każdą izoformę DNM na podstawie ich lokalizacji komórkowej i subkomórkowej, sugerując w ten sposób, że posiadają one komplementarną, a nie nadmiarową aktywność w obrębie nabłonka najądrza21.
Tutaj opisujemy eksperymentalną metodologię zastosowaną do badania ekspresji DNM w najądrzach myszy z nadzieją, że ta informacja znajdzie szersze zastosowanie w charakterystyce alternatywnych białek najądrza i tym samym przyczyni się do naszego zrozumienia funkcji tego ważnego elementu męskiego układu rozrodczego. W szczególności opisujemy rozwój solidnej metodologii znakowania immunofluorescencyjnego białek docelowych w skrawkach najądrzy zatopionych w parafinie, a następnie wykrywanie przestrzennego rozkładu tych białek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Dalej dokumentujemy nasze ostatnio zoptymalizowane protokoły22 do izolacji i charakterystyki najądrzy; Małe pęcherzyki podobne do egzosomów, które stanowią kluczowe elementy profilu wydzielniczego najądrza i wydają się odgrywać znaczącą rolę w promowaniu dojrzewania plemników23. Jako podejście uzupełniające opisujemy również immunofluorescencyjne wykrywanie białek docelowych w unieśmiertelnionej linii komórkowej nabłonka najądrza najądrza myszy (mECap18) oraz wykorzystanie tego zasobu jako modelu do zbadania regulacji aktywności wydzielniczej najądrza in vitro.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało Dynamin 1</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Królik, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalne</td></tr><tr><td>przeciwciało Dynamin 2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Koza, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: przeciwciało poliklonalne</td></tr><tr><td>Dynamin 3</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><<td>silny>Gatunek żywiciela</silny>: Królik, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalne</td></tr><tr><td>przeciwciało ATP6V1B1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Koza, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalne</td></tr><tr><td>przeciwciało CD9</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td><silny>Gatunek gospodarza</silny>: Szczur, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: monoklonalne</td></tr><tr><td>przeciwciało flotylliny-1</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Królik, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalne</td></tr><tr><td>przeciwciało ALOX15</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td><silny>Gatunek gospodarza</silny>: Królik, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalne</td></tr><tr><td>przeciwciało TUBB</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td><silny>Gatunek gospodarza</silny>: Mysz, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: przeciwciało monoklonalne</td></tr><tr><td>PSMD7</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Królik, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalny</td></tr><tr><td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Koza, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalny</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Osioł, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalny</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Osioł, <silny>Isotyp</silny>: IgG, <silna>klasa</silna>: poliklonalna</td></tr><tr><td>przeciw szczurom Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td><silny>gatunek żywiciela</silny>: Koza, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalny</td></tr><tr><td>Anti Rabbit HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Koza, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silna>klasa</silna>: poliklonalna</td></tr><tr><td>anty szczura HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td><silny>gatunek żywiciela</silny>: Koza, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silny>Klasa</silny>: poliklonalny</td></tr><tr><td>Anti Mouse HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td><silny>Gatunek żywiciela</silny>: Koza, <silny>Izotyp</silny>: IgG, <silna>klasa</silna>: poliklonalna</td></tr><tr><td>4', 6-diamidyn-2-fenyloindolowa (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>jodek propydyny (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>penicylina/streptomycyna</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&alfa;-androstan-17&beta;-ol-3-onC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-etylenodiaminatetraoctowa kwas (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astral</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1,4-diazabicyklo-(2.2.2)-oktan</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-gizyna</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2,5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly (alkohol winylowy)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówki</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>Duża wytrząsarka orbitalna</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofalówka</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoryjny miernik pH</td><td>Lab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>Płynoodporny marker do slajdów</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td>Slide Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0,45 i mikro; m filtr</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Dustfree Paper</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Probówka ultrawirówkowa (2,2 ml, 11 &; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do ultrawirówek (3,2 ml, 13 &; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 70 &micro; m Nylon</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 35 & razy; 10 mm z krzywkami</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Słoik przesuwny</td><td>TRAJAN#</td><td>23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza syntezy i wydzielania białek najądrza

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Najądrza ssaków wytwarza jeden z najbardziej złożonych płynów śródświetlnych spośród wszystkich gruczołów dokrewnych, aby wspierać dojrzewanie i magazynowanie plemników po jądrach. Taka złożoność wynika z połączonej aktywności wydzielniczej i absorpcyjnej komórek nabłonka wyściełającego. W tym miejscu opisujemy techniki analizy syntezy i wydzielania białek najądrza, koncentrując się na modelowej rodzinie białek mechanoenzymów dynaminy (DNM); duże GTPazy, które mają potencjał do regulowania dwukierunkowych zdarzeń transportu błonowego. W celu zbadania ekspresji białek w tkance najądrza opisujemy solidną metodologię znakowania immunofluorescencyjnego białek docelowych w skrawkach zatopionych w parafinie, a następnie wykrywania przestrzennego rozkładu tych białek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Opisujemy również zoptymalizowaną metodologię izolacji i charakterystyki pęcherzyków podobnych do egzosomów, znanych jako najądrza, które są wydzielane do światła najądrza, aby uczestniczyć w komunikacji międzykomórkowej z dojrzewającymi plemnikami. Jako podejście uzupełniające opisujemy również immunofluorescencyjną detekcję białek docelowych w unieśmiertelnionej przez SV40 linii komórkowej nabłonka najądrza najądrza myszy (mECap18). Ponadto omówiono użyteczność linii komórkowej mECap18 jako odpowiedniego modelu in vitro, za pomocą którego można badać regulację aktywności wydzielniczej najądrza. W tym celu opisujemy wymagania dotyczące hodowli w celu utrzymania linii komórkowej mECap18 i stosowania selektywnych schematów hamowania farmakologicznego, które są w stanie wpływać na ich profil wydzielniczy białka. Te ostatnie można łatwo ocenić poprzez zbiór kondycjonowanej pożywki hodowlanej, stężenie wydzielanych białek poprzez wytrącanie kwasu trichlorooctowego/acetonu, a następnie ich analizę za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. Twierdzimy, że te połączone metody są odpowiednie do analizy alternatywnych celów białkowych najądrza jako wstęp do określenia ich funkcjonalnej roli w dojrzewaniu i/lub przechowywaniu plemników.

Rysunek 1 oraz Rysunek 2 przedstawiają reprezentatywne wyniki lokalizacji immunofluorescencyjnej DNM w głowie najądrza myszy. Każda z trzech badanych izoform DNM wykazuje odmienne profile lokalizacji. Tak więc DNM1 charakteryzuje się stosunkowo umiarkowanym, rozproszonym znakowaniem komórek najądrza w obrębie segmentu początkowego i głowy najądrza (Rysunek 2A). W przeciwieństwie do n...

Tutaj opisujemy lokalizację immunofluorescencji dynaminy, aby zilustrować protokoły wykrywania białek w zatopionych w parafinie odcinkach najądrza myszy oraz tych z nieśmiertelnej linii komórek najądrza (mECap18). Opisano również protokoły izolacji białek wydzielniczych zarówno z płynu najądrza, jak i kondycjonowanych pożywek komórkowych.

Analiza syntezy i wydzielania białek najądrza

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

Połączeni mistrzowie mogą odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad najądrzami, takie jak to, jakie docelowe białka są zaangażowane w regulację dojrzewania i przechowywania plemników. Główną zaletą techniki izolacji najądrza jest to, że ma ona również zastosowanie do izolowania podobnej populacji z innych regionów naskórka wśród różnych gatunków. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś skrawki parafiny najądrza do dygestoria.Dodaj tyle ksylenu do słoika na szkiełko, aby całkowicie zanurzyć sekcję tkanki. Ponownie nawodnić skrawki tkanki, zanurzając je w stopniowanych roztworach etynolu rozcieńczonych w oczyszczonej wodzie, jak opisano w protokole tekstowym. Myj skrawki w słoiku ze szkiełkiem przez pięć minut z wystarczającą ilością PBS, aby całkowicie zanurzyć cały wycinek tkanki.Następnie należy przelać odpowiedni roztwór do pobierania antygenu do stojaka na szkiełka. Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej, aż się zagotuje. Całkowicie zanurz szkiełka w roztworze, poddając skrawki tkanki roztworom do pobierania antygenu wywołanym ciepłem.Następnie wyjmij pojemnik szkiełkowy z kuchenki mikrofalowej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Opłucz szkiełka w słoiku zawierającym PBS przez pięć minut. Za pomocą odpornego na ciecze markera do slajdów obrysuj okolicę odcinka tkanki.Przenieś szkiełka do nawilżonego pojemnika. Stosuj roztwór blokujący przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przepłucz szkiełka raz za pomocą PBS.Inkubować skrawki z odpowiednim pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym do eksperymentalnie zoptymalizowanego stężenia w przefiltrowanym 1% BSA PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po ponownym podgrzaniu szkiełek do temperatury pokojowej myj szkiełka PBS na platformie wstrząsającej z prędkością 60 obr./min przez 10 minut. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.Inkubować skrawki z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w przefiltrowanym 1% BSA PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Od tego momentu trzymaj slajdy w ciemności. Umyj szkiełka trzy razy za pomocą PBS na platformie wytrząsającej z prędkością 60 obr./min przez 10 minut na mycie.Następnie zabarwić, zamontować i zapieczętować próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Natychmiast po eutanazji dorosłych myszy należy obficie napełnić ich naczynia krwionośne PBS, który został wstępnie podgrzany do 37 stopni Celsjusza, aby zminimalizować zanieczyszczenie krwi tkanką najądrza. Ostrożnie wypreparuj najądrze z pokrywającego je tłuszczu i tkanki łącznej, a następnie spłucz zmodyfikowanym podłożem BWW, aby zmniejszyć ryzyko powierzchniowego zanieczyszczenia krwi.Osusz tkankę najądrza, aby usunąć nadmiar pożywki i wypreparuj najądrza najądrza. Następnie przenieś wypreparowany najądrza caput na świeżą szalkę Petriego zawierającą pożywkę BWW, upewniając się, że ilość pożywki jest wystarczająca do ostatecznego wyzdrowienia. Za pomocą żyletki wykonaj kilka małych nacięć w tkance caput.Nie miel tkanki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z łagodnym mieszaniem przez 30 minut, aby uwolnić zawartość światła. Za pomocą membran o grubości 70 mikrometrów przefiltruj powstałą zawiesinę i usuń zanieczyszczenia komórkowe.Zebrać zawiesinę i poddać ją kolejnym etapom wirowania w temperaturze czterech stopni Celsjusza ze zwiększającą się prędkością, aby wyeliminować zanieczyszczenia komórkowe. Następnie należy przygotować nieciągłe gradienty jodiksanolu zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przygotować gradient w probówce ultrawirówkowej, używając każdej frakcji 450 mikrolitrów.Sprawdź wzrokowo gradient po zastosowaniu każdej frakcji, aby upewnić się, że interfejsy zostały pomyślnie utworzone między każdą warstwą. Ostrożnie dodaj 450 mikrolitrów zawiesiny płynu rozświetlającego najądrza na pojedynczy gradient. Ultraodwiruj gradienty pod ciśnieniem 160 000 razy g i w czterech stopniach Celsjusza przez 18 godzin.Delikatnie usuń 12 równych frakcji z odwirowanego gradientu, zaczynając od najwyższej warstwy i postępując w kierunku dołu gradientu. W stosownych przypadkach należy zgrupować równoważne frakcje odzyskane z każdego gradientu. Po odzyskaniu i połączeniu frakcji od 9 do 11 rozcieńczyć je do dwóch mililitrów PBS.Ultraodwirować próbki w temperaturze 100 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny, aby osadzać najądrza. Następnie ostrożnie odessać i wyrzucić supernatant, uważając, aby nie naruszyć pastylki najądrza. Niezbędna jest ocena czystości najądrza przed jakimikolwiek dalszymi zastosowaniami.Po przygotowaniu sterylnych szkiełek nakrywkowych, należy wprowadzić podwielokrotności 200 000 mEcap 18 komórek do każdego dołka 12-dołkowej płytki zawierającej szkiełka nakrywkowe. Hoduj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Gdy komórki przylgną do szkiełka nakrywkowego, należy wyrzucić pożywkę i dwukrotnie przepłukać komórki PBS.Dodaj wystarczającą ilość 4% paraformaldehydu, aby zanurzyć całe szkiełko nakrywkowe i utrwal komórki w temperaturze pokojowej na 15 minut. Następnie wyrzuć roztwór paraformaldehydu i dwukrotnie przepłucz szkiełka nakrywkowe w PBS. Zanurz wypłukane szkiełka nakrywkowe w 0,1 Triton X-100 w PBS na 10 minut, aby przeniknąć do komórek.Przepłucz, zablokuj i oznacz immunologicznie komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po pierwsze, należy wprowadzić podwielokrotności komórek mEcap 18 do płytki 6-dołkowej, jak opisano w protokole tekstowym. Po przyklejeniu należy trzykrotnie przemyć komórki pożywką mEcap 18 bez FBS, aby usunąć resztki FBS i wszelkie związane z nim zanieczyszczenia białkowe.Następnie dodaj 1,5 mililitra 18-komórkowej pożywki mEcap bez FBS do każdej studzienki. Inkubować przez 12 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% CO2. Następnie zbierz pożywkę komórkową i odwiruj pod ciśnieniem 2 000 g przez 10 minut, aby usunąć wszystkie zanieczyszczenia komórkowe.Korzystając ze standardowego testu wykluczania błękitu trypanowego, oceń żywotność komórki mEcap. Dodać 20% objętości schłodzonego 100% kwasu trichlorooctowego do 80% objętości pożywki komórkowej w celu wytrącenia białek uwolnionych z hodowanych komórek mEcap 18. Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, stale mieszając.Następnie odwirować w temperaturze 17 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć osad białkowy schłodzonym acetonem. Następnie ponownie odwirować w temperaturze 17 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Ostrożnie usunąć i ponownie wyrzucić supernatant. Następnie wysuszyć próbki na powietrzu w dygestorium, aby usunąć wszelkie pozostałości acetonu. Każda z badanych izoform DNMI wykazuje odrębny profil lokalizacji immunofluorescencyjnej.DNMI charakteryzuje się stosunkowo skromnym rozproszonym znakowaniem komórek najądrza w całym początkowym segmencie i najądrzu ogona. Izoforma DNM2 jest najpierw wykrywana w pobliżu przeciwległej podstawowej i wierzchołkowej granicy komórek w segmencie początkowym, przed repozycjonowaniem do domeny nadjądrowej w komórkach w sąsiednim segmencie kaputu. Intensywność tego znakowania stopniowo zmniejsza się między strefami drugą i piątą najądrza najądrza, co zasadniczo odzwierciedla aktywność wydzielniczą tych segmentów najądrza.Znakowanie nadjądrowe DNM2 jest następnie postrzegane jako odpowiadające rozmieszczeniu aparatu Golgiego w głównych komórkach caput. Izoforma DNM3 jest wykrywana głównie w domenie wierzchołkowej niewielkiej liczby komórek nabłonka kaputowego, które są postrzegane jako odpowiadające subpopulacji komórek czystych poprzez współznakowanie z rozpoznanym markerem komórek przezroczystych ATP6V1B1. Następnie unieśmiertelniona linia komórkowa mEcap 18 jest wykorzystywana jako model in vitro do badania aktywności wydzielniczej komórek najądrza.Wzorce dystrybucji są zgodne z tymi obserwowanymi w skrawkach tkanki najądrza, przy czym DNM1 wykryto w cytoplazmie komórek mEcap 18, DNM2 skoncentrowany w nadjądrze tych komórek, a DNM3 charakteryzujący się dyskretnymi ogniskami barwienia błony w niewielkiej liczbie subpopulacji. Próbując wykryć immunofluorescencję, należy pamiętać o optymalizacji warunków dla każdego antygenu. Wyizolowana populacja strefy najądrza jest łatwo podatna na wykorzystanie w dalszych zastosowaniach, w tym we wspólnej inkubacji z plemnikami i analizą ocalgo per file, które są potężnymi podejściami do lepszego zrozumienia roli najądrza w regulacji dojrzewania plemników najądrza.

analysis-of-epididymal-protein-synthesis-and-secretion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Analiza proteomiczna dowolnego typu komórek jest wysoce zależna zarówno od czystości, jak i wstępnego frakcjonowania materiału wyjściowego w celu de-kompleksizacji próbki przed chromatografią cieczową metodą spektrometrii mas (MS). Stosując techniki płukania wstecznego, można uzyskać czyste plemniki od gryzoni. Po trawieniu fosfopeptydy można wzbogacić za pomocą TiO2.

Analiza fosfopeptydowa plemników najądrzy gryzoni

Ten protokół wideo demonstruje metodę badania wpływu płynu nasiennego na ślimaki, przy użyciu hermafrodytycznego ślimaka słodkowodnego Lymnaea stagnalis.

Wpływ produktów z męskich gruczołów dodatkowych na składanie jaj u ślimaków

Kontrola syntezy białek występuje głównie na etapie inicjacji translacji, której niedobory są związane z różnymi zaburzeniami. Aby lepiej zrozumieć ich etiologię, opisaliśmy tutaj protokół z wykorzystaniem oocytów Xenopus laevis oceniający translację transkryptu mos w obecności mutanta czynnika inicjacji translacji eIF4G1.

Xenopus laevis jako model do identyfikacji upośledzenia translacji

Ten protokół opisuje prostą metodę ekstrakcji i frakcjonowania transkryptów z tkanek roślinnych na podstawie liczby związanych rybosomów. Pozwala na globalne oszacowanie aktywności translacyjnej i określenie statusu translacyjnego określonych mRNA.

Łatwa metoda profilowania polisomów roślin

Podwyższony poziom białka w płynie mózgowo-rdzeniowym może być wynikiem dyfuzji białka osocza przez zmienioną barierę krew-mózg lub syntezy dokanałowej. W artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół testowy, który pomaga rozróżnić oba przypadki i zapewnia pomiary ilościowe białek syntetyzowanych dokanałowo.

Ilościowy pomiar białek syntetyzowanych dooponowo u myszy

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Opisano tutaj dwa odrębne modele chirurgicznych zastrzyków służących do wywołania bodźców zapalnych w segmencie początkowym (zastrzyk śródmiąższowy) oraz w cauda gididymidis (zastrzyk dotaczny) myszy. Metody te umożliwiają badania reakcji specyficznych dla regionu w różnych obszarach najądrza.

Modele myszy zapalenia najądrza wywołanego przez wzorce molekularne związane z patogenem

Poznaj techniki immunofluorescencji i izolacji białek wydzielniczych z najądrza myszy. Metoda ta umożliwia badanie lokalizacji dynaminy i składu białek w płynie najądrzowym.

Analiza syntezy i wydzielania białek najądrza

Przeglądaj więcej filmów