Name: Wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Naucz się wykrywać i izolować ciała apoptotyczne o wysokiej czystości z próbek komórkowych. Ta metoda wykorzystuje cytometrię przepływową i różnicową wirowanie do badań biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To działanie było wspierane przez granty z National Health and Medical Research Council (GNT1125033 i GNT1140187) oraz Australian Research Council (DP170103790) dla I.K.H.P.

1. Indukcja apoptozy
<ol>
	<li>Odwirować próbkę komórek o masie 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant w celu usunięcia wszelkich istniejących wcześniej resztek komórek. 
	UWAGA: W przypadku stosowania komórek przylegających, należy wcześniej wysiać komórki i przemyć 1x roztworem buforowanym fosforanem (PBS) przed indukcją apoptozy.</li>
	<li>Określ numer komórki i zbierz komórki. 
	UWAGA: W zależności od testu po izolacji zalecamy początkową liczbę komórek co najmniej 1 x 107 komórek.</li>
	<li>Zawiesić w kompletnych pożywkach (odpowiednie podłoże zawierające 10% (obj./obj.) płodowej surowicy cielęcej, 50 j.m./ml penicyliny, 50 μg/ml mieszaniny streptomycyny) do uzyskania końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Podwielokrotność ~ 2 x 106 komórek na dołek płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Aby wywołać apoptozę, zdejmij pokrywę płytki i naświetlaj komórki o sile 150 mJ/cm2 za pomocą promiennika UV. Powinno to zająć około 30-60 s. 
	UWAGA: Przed napromienianiem upewnij się, że ~0,5 x 106 komórek jest zachowanych do kontroli komórek "nieleczonych". 
	UWAGA: Apoptoza może być również indukowana za pomocą innych metod, takich jak anty-Fas lub głód surowicy6.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 2-8 godzin, w zależności od linii komórkowej.</li>
	<li>Za pomocą laboratoryjnego mikroskopu świetlnego wizualizuj komórki, aby potwierdzić obecność morfologii apoptozy, takich jak pęcherzyki, tworzenie apoptopodiów i tworzenie ApoBD. 
	UWAGA: Wystarczające jest 40-krotne powiększenie</li>
	<li>Za pomocą pipety P1000 odpipetuj i zbierz próbki apoptotyczne.</li>
	<li>Umyj płytkę 1x PBS i połącz z pozostałą próbką, aby zapewnić maksymalną wydajność.</li>
	<li>Zbierz ~1/10th dla kontroli "Whole Apoptotic Sample" (WAS).</li>
	<li>Pobrać próbkę "niepoddaną obróbce".</li>
	<li>Odwirować zarówno próbki WAS, jak i próbki niepoddane działaniu substancji przy 3 000 x g przez 6 minut.</li>
	<li>Zawiesić w 1 ml 1x PBS i odstawić na lód.</li>
	<li>W przypadku izolacji ApoBD przejdź do kroku 2 lub 3 z pozostałą próbką apoptozy.</li>
</ol>
2. Izolacja ApoBD za pomocą FACS
<ol>
	<li>Odwirować całą próbkę o masie 3 000 x g przez 6 minut.</li>
	<li>Usunąć większość supernatantu, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w roztworze barwiącym zawierającym 1 ml buforu wiążącego 1x A5, 75 μl A5-FITC i 2 μl TO-PRO-3 na 1x107 komórek.</li>
	<li>Próbkę inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 1-2 ml 1x buforu wiążącego A5 i odwirować próbkę o stężeniu 3 000 x g przez 6 minut, aby usunąć nadmiar plamy. 
	UWAGA: W przypadku mieszanych populacji komórek lub próbek tkanek należy przeprowadzić etap barwienia przeciwciał przy użyciu kombinacji markerów specyficznych dla typu komórki w buforze wiążącym 1x A5 i inkubować na lodzie przez 20 minut (lub zgodnie z protokołem producenta) przed odwirowaniem przy 3,000 x g przez 6 minut.</li>
	<li>Zawiesić osad próbki w 3 ml buforu FACS (1x PBS, 1x bufor wiążący A5, 10% FSC, 2 mM EDTA) na 1x107 komórek.</li>
	<li>Przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm do okrągłodennej probówki polipropylenowej (cytometria przepływowa) i przechowywać próbki na lodzie i w ciemności.</li>
	<li>Włącz maszynę FACS i wykonaj standardową konfigurację za pomocą dyszy 100 μm, wykonaj opóźnienie upuszczania i zapewnij stabilny strumień.</li>
	<li>Załaduj próbkę i ustaw prędkość akwizycji na ~1000 zdarzeń/s.</li>
	<li>Dostosuj napięcia FSC, SSC, APC (TO-PRO-3) i FITC (A5) oraz zdarzenia położenia na wykresach FACS, aby zapewnić wyraźne rozdzielenie populacji.</li>
	<li>Rekord 20 000 wydarzeń.</li>
	<li>Ustaw strategię bramkowania, jak w części 4.</li>
	<li>W układzie sortowania dodaj końcową bramkę ApoBD jako żądaną populację sortowania.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie próbki i wykonaj sortowanie testowe, zbierając 5 000-10 000 ApoBD do nowej probówki zawierającej ~250 μl buforu FACS.</li>
	<li>Wykonaj płukanie wsteczne systemu i załaduj posortowane ApoBD.</li>
	<li>Pobieranie i rejestrowanie sortowania testowego ApoBDs.</li>
	<li>Sprawdź, czy czystość ApoBD wynosi ~99%, porównując FSC (oś y) z A5 (zdarzenia na osi x). 
	UWAGA: Barwienie A5 może się nieznacznie zmniejszyć podczas ponownej analizy próbek z powodu wybielania laserowego.</li>
	<li>Po osiągnięciu wysokiej czystości załaduj oryginalną próbkę i kontynuuj sortowanie, aż do uzyskania żądanej liczby ApoBDs. 
	UWAGA: W razie potrzeby można przeprowadzić podwójne sortowanie w celu jednoczesnego wyizolowania ApoCells i ApoBDs. 
	UWAGA: W przypadku sortowania przez długi okres czasu zalecamy inkubację probówki zbiorczej w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po zakończeniu sortowania zbierz niewielką porcję ApoBD po sortowaniu, po sortowaniu ApoCells, Untreated i WAS, aby zweryfikować apoptozę i potwierdzić czystość po sortowaniu. 
	UWAGA: Chociaż czystość sortowania testowego i końcowego nie powinna się znacząco różnić, zależy to od ustawień strumienia i stabilności.</li>
</ol>
3. Izolacja ApoBD za pomocą wirowania różnicowego
<ol>
	<li>Pozostałą próbkę apoptotyczną odwirować przy 300 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zebrać supernatant, pozostawiając ~500 μl, aby uniknąć rozerwania osadu komórkowego, i dodać do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Usunąć pozostałe 500 μl i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml 1x PBS (odpowiada to 'frakcji wzbogaconej w ApoCell'.</li>
	<li>Odwirować zebrany sklarowany supernatant przez 20 minut przy stężeniu 3 000 g.</li>
	<li>Sprawdzić, czy nie ma osadu i ostrożnie usunąć supernatant (supernatant może zawierać małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, w tym mikropęcherzyki i egzosomy).</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml 1x PBS (odpowiada to frakcji "wzbogaconej w ApoBD")</li>
	<li>Zbierz 100 μl każdej żywej, WAS, wzbogaconej ApoCell i wzbogaconej ApoBD w nowej okrągłodennej probówce z polistyrenu (cytometria przepływowa).</li>
	<li>Dodać 100 μl barwnika zawierającego 2x bufor wiążący A5, 1:100 A5-FITC i 1:1,000 TO-PRO-3</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności.</li>
	<li>Analizuj próbki za pomocą cytometrii przepływowej, stosując strategię bramkowania, jak opisano powyżej, w celu walidacji pomyślnej indukcji apoptozy i czystości frakcji wzbogaconej w ApoBD.</li>
</ol>
4. Strategia bramkowania cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Wykreślić TO-PRO-3 (oś y) w stosunku do FSC (oś x), aby oddzielić komórki martwicze (wysoki TO-PRO-3) od wszystkich innych zdarzeń nieprzepuszczalnych (TO-PRO-3niski/pośredni</li>).
	<li>Zaznacz wszystkie zdarzenia nieprzepuszczalne i wykreśl SSC względem A5. Bramka dwie populacje, w tym populacja 1 (P1), SSCpośrednie/wysokie, A5niskie/pośrednie komórki i populacja 2 (P2), wszystkie inne zdarzenia.</li>
	<li>Z P2 wykreśl TO-PRO-3 względem A5 i wybierz zdarzeniapośrednie/wysokie A5, aby wykluczyć wszystkie szczątki komórek.</li>
	<li>Zaznacz wszystkie pozytywne zdarzenia A5 i wykreśl FSC w stosunku do A5. Oddziel ApoBD (FSC niski) od ApoCells (FSC pośredni/wysoki). 
	UWAGA: W przypadku bramkowania ApoBD w celu izolacji ApoBD za pomocą podejścia opartego na FACS, zalecamy ostatni krok, wybierając ApoBD i porównując TO-PRO-3 z A5 i wybierając wszystkie zdarzenia. Gwarantuje to, że końcowa bramka sortująca wykorzystuje parametry fluorescencji, a nie FSC/SSC.</li>
	<li>Aby przeprowadzić analizę żywotnych komórek, wybierz P1 i wykonaj jedną z dwóch strategii bramkowania. W celu ogólnej analizy żywotnych komórek, należy wykreślić FSC w stosunku do A5 i wybrać wszystkie ogniwaFSC pośrednie/wysokie, usuwając w ten sposób pozostałe resztki komórek. Alternatywnie, w celu dogłębnej analizy, żywe komórki można oddzielić od wczesnych ApoCells A5, wykreślając TO-PRO-3 w stosunku do FSC. Wybierz ogniwa TO-PRO-3o niskiej żywotności i komórki TO-PRO-3pośrednie,pośrednie FSC/o wysokiej zawartości A5 - wczesne ApoCells.</li>
</ol>

<ol><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+the+Dying%3A+Mechanisms+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions.</a> Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).</li>
<li>Tixeira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+morphologic+features+and+products+of+cell+disassembly+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%3A+An+International+Journal+on+Programmed+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis.</a> Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).</li>
<li>Sebbagh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-mediated+cleavage+of+ROCK+I+induces+MLC+phosphorylation+and+apoptotic+membrane+blebbing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing.</a> Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).</li>
<li>Coleman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I.</a> Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+generating+extracellular+vesicles+during+apoptosis+via+a+beads-on-a-string+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure.</a> Nature Communications. 6, 7439(2015).</li>
<li>Poon, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+link+between+an+antibiotic%2C+pannexin+channels+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis.</a> Nature. 507, 329-334 (2014).</li>
<li>Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+microtubules+in+apoptotic+chromatin+dynamics+and+cellular+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation.</a> Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).</li>
<li>Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+basic+biological+phenomenon+with+wide-ranging+implications+in+tissue+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.</a> British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).</li>
<li>Witasp, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+over+troubled+water%3A+milk+fat+globule+epidermal+growth+factor+8+promotes+human+monocyte-derived+macrophage+clearance+of+non-blebbing+phosphatidylserine-positive+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells.</a> Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).</li>
<li>Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinase+regulates+fragmentation+and+phagocytosis+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells.</a> Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).</li>
<li>Holmgren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+transfer+of+DNA+by+the+uptake+of+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies.</a> Blood. 93, 3956-3963 (1999).</li>
<li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Science Signaling. 2, ra81(2009).</li>
<li>Schiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigens+are+translocated+into+small+apoptotic+bodies+during+early+stages+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis.</a> Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).</li>
<li>Elamin, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibits+the+Sonic+Hedgehog+signaling+pathway+and+triggers+apoptosis+in+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells.</a> Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).</li>
<li>Sagulenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIM2+and+NLRP3+inflammasomes+activate+both+apoptotic+and+pyroptotic+death+pathways+via+ASC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles%3A+apoptotic+bodies%2C+microvesicles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li>
<li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li>
<li>Lleo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics%3A+identification+of+unique+protein+profiles+of+apoptotic+bodies+from+biliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells.</a> Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).</li>
<li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846(2017).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Od czasu jej wczesnego opisu w latach pięćdziesiątych XX wieku, dziedzina apoptozy znacznie się rozwinęła, stając się znaczącym obszarem badawczym. Pomimo szerokiego zainteresowania i szeroko zakrojonych wysiłków, niektóre aspekty apoptozy, w szczególności powstawanie ApoBDs, nie zostały dobrze zbadane ze względu na brak odpowiednich metodologii. Obejmują one w szczególności ograniczenie w jednoczesnym śledzeniu progresji apoptozy i powstawania ApoBD przy użyciu tradycyjnej cytometrii przepływowej A5/PI oraz zanieczyszcz...

Apoptoza, dobrze zbadana forma programowanej śmierci komórki, jest niezbędna do utrzymania fizjologicznej homeostazy i usunięcia potencjalnie szkodliwych komórek w ludzkim ciele1. Po indukcji apoptozy komórki apoptotyczne (ApoCells) mogą przejść szereg zmian morfologicznych i rozpadnąć się na małe pęcherzyki związane z błoną, zwane ApoBDs. Ogólnie rzecz biorąc, proces ten jest znany jako demontaż komórek apoptotycznych i można go podzielić na 3 odrębne etapy w zależności od morfologii2,3. Krok 1 (pęcherzyki błony komórkowej) charakteryzuje się tworzeniem na powierzchni komórki struktur przypominających balony, znanych jako pęcherzyki4,5. Krok 2 (tworzenie wypukłości apoptotycznej) obejmuje tworzenie długich wypukłości błonowych, takich jak apoptopodia, apoptopodia z koralikami i kolce mikrotubul6,7,8. Wreszcie, Krok 3 (tworzenie ApoBD) obejmuje fragmentację apoptotycznych wypukłości i/lub ApoCells w celu wygenerowania ApoBDs6,9. Wcześniejsze odkrycia sugerowały rolę ApoBD we wspomaganiu apoptotycznego usuwania komórek i pośredniczeniu w komunikacji międzykomórkowej. Na przykład, sugeruje się, że fragmentacja ApoCell na ApoBD może generować małe kawałki "wielkości kęsa", które można łatwo usunąć przez otoczenie fagocytów2,10,11. Ponadto ApoBD mogą zawierać szereg biomolekuł, takich jak DNA, RNA i białka, które mogą być transportowane do otaczających komórek, aby ułatwić komunikację między komórkami12,13,14. Aby funkcjonalnie zbadać te procesy, konieczne jest potwierdzenie trzech kluczowych parametrów, w tym (i) walidacji indukcji apoptozy i tworzenia ApoBD, (ii) izolacji ApoBD oraz (iii) potwierdzenia czystości ApoBD.
Poprzednio, wiele metod, w tym cytometria przepływowa i mikroskopia elektronowa, były używane do badania apoptozy i ApoBDs15,16,17,18. Jednak wykrywanie i kwantyfikacja ApoBD są często trudne lub pomijane. Na przykład najczęściej stosowany test apoptozy oparty na cytometrii przepływowej wykorzystuje aneksynę V (A5, białko, które wiąże eksternalizację sygnału "zjadaj mnie" fosfatydyloserynę (PtdSer)) i jodek propidium barwienia kwasem nukleinowym (PI)19. Jednak przy użyciu tej uniwersalnej kombinacji barwienia analiza zakłada, że w próbce występują tylko trzy typy podzbiorów komórek (komórki żywotne, ApoCells i komórki martwicze). Ponadto, choć przez wielu badaczy uważa się je za "złoty standard" w odniesieniu do apoptozy, testy cytometrii przepływowej i późniejsza analiza danych często wykluczają ApoBD poprzez początkowy etap bramkowania, wybierając zdarzeniapośredniego wzrostu FSC/SSC. Dlatego niedawno opracowaliśmy nowatorski test cytometrii przepływowej przy użyciu A5 i TO-PRO-3, innego barwienia nukleinowego, które może być selektywnie wychwytywane przez kanały aktywowanej kaspazą 3/7 pannexin 1 (PANX1) 7,20. Ponieważ aktywacja PANX1 indukowana kaspazą 3 poprzedza ekspozycję na PtdSer we wczesnym stadium apoptozy, TO-PRO-3 w różny sposób barwi komórki apoptotyczne i martwicze. Ponadto podejście to w połączeniu z naszą nowatorską strategią bramkowania obejmuje wszystkie zdarzenia uzyskane podczas analizy danych, w wyniku czego identyfikowanych jest sześć podzbiorów komórek/cząstek, w tym: (i) żywotne komórki (FSC/SSCpośrednie/wysokie, A5niskie, TO-PRO-3niskie), (ii) A5- wczesne ApoCells (FSC/SSCpośrednie/wysokie, A5niskie, TO-PRO-3pośrednie), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCpośrednie/wysokie, A5wysoki, TO-PRO-3pośredni), (iv) komórki martwicze lub późne ApoCells (FSC/SSCpośrednie/wysokie, A5wysokie, TO-PRO-3wysokie), (v) ApoBD (FSC/SSC niskie, A5pośrednie, TO-PRO-3niskie/pośrednie) i (vi) zanieczyszczenia (FSC/SSCniskie, A5niskie, TO-PRO-3niskie)20. Nasze podejście podkreśla znaczenie analizy wszystkich podzbiorów komórek/cząstek oraz, co ważniejsze, oddzielenia ApoBD od komórek i szczątków20. W ten sposób podejście to demonstruje skuteczną technikę walidacji jednoczesnej indukcji apoptozy i powstawania ApoBD.
Tradycyjnie, ApoBDs były izolowane za pomocą różnych metod wirowania różnicowego, dzięki którym ApoBDs mogą być oddzielane od komórek lub innych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w zależności od gęstości. Jednak takie metody wirowania są często ograniczone przez niską czystość ApoBD, brak etapu kwantyfikacji w celu potwierdzenia czystości próbki i/lub niemożność oddzielenia ApoBDs-specific dla typu komórki17,21,22. Dlatego niedawno opracowaliśmy dwa podejścia, oparte na FACS i nowe podejście oparte na wirowaniu różnicowym, które można połączyć z naszą wcześniej ustaloną metodą cytometrii przepływowej w celu walidacji indukcji apoptozy i czystości próbki23. Izolacja ApoBD za pomocą naszego podejścia opartego na FACS może wzbogacić ApoBD do czystości do 99% i może być sprzężona z różnymi przeciwciałami specyficznymi dla typu komórki w celu wyizolowania ApoBD z mieszanych populacji komórek, próbek tkanek i płynów ustrojowych23. Co więcej, nasze zmienione podejście do wirowania różnicowego demonstruje skuteczną metodę izolowania ApoBD do czystości >90%23.
W tym artykule szczegółowo opisujemy naszą eksperymentalną procedurę walidacji indukcji apoptozy oraz wykrywania i ilościowego określania powstawania ApoBD. Omówiono również procesy izolacji ApoBD przy użyciu metod opartych na FACS i wirowaniu różnicowym. Reprezentatywne dane pokazują, że opisana metodologia stanowi skuteczne, najnowocześniejsze narzędzie dla przyszłych badań nad ApoBD.

<table><tbody><tr><td>Komórki, np. hodowane ludzkie monocyty THP-1 (numer klonu: TIB-202)</td><td>ATCC-RPMI</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina penicyliny i streptomycyny</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FSC</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-</td><td></td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>BD </td><td></td> Bioscience-TO-PRO-3 <td></td></tr><tr><td>jodek</td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td>TO-PRO-3 może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Unikaj bezpośredniego kontaktu.</td></tr><tr><td>10x Bufor wiążący Annexin V</td><td>BD Bioscience</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001710526</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa (15 mL)</td><td></td>Probówka do mikrowirówek <td>Cellstar</td> 188271 <td></td></tr><tr><td>(1,5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych (37 &deg; C, 5% CO2)</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cytometr przepływowy, skonfigurowany z dwoma laserami do wykrywania FITC i APC</td><td>BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Canto II Cytometr przepływowy, skonfigurowany z dwoma laserami do wykrywania FITC i APC</td><td>Oprogramowanie BD Bioscience-FACS</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Diva 6.1.1</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo 8.8.6</td><td></td>-<td></td>-<td></td></tr><tr><td>&nbsp; UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości

Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Ciała apoptotyczne (ApoBDs), mikropęcherzyki i egzosomy są kluczowymi członkami rodziny pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, przy czym ApoBDs są jednym z największych. Zaproponowano, że ApoBD mogą wspomagać usuwanie komórek, a także komunikację międzykomórkową poprzez transport biomolekuł. Konwencjonalne podejścia stosowane do identyfikacji i izolacji ApoBD są często ograniczone ze względu na brak dokładnej kwantyfikacji i niską czystość próbki. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy w celu potwierdzenia indukcji apoptozy, walidacji powstawania ApoBD i wyizolowania ApoBD do wysokiej czystości. Przedstawimy również i porównamy metody sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i wirowania różnicowego w celu wyizolowania ApoBDs. Ponadto czystość wyizolowanych ApoBD zostanie potwierdzona przy użyciu wcześniej ustalonej metody barwienia i analizy opartej na cytometrii przepływowej. Podsumowując, przy użyciu opisanego podejścia, indukowano i zwalidowano apoptozę monocytów THP-1 i rozkład komórek apoptotycznych, a ApoBD wyizolowano z monocytów THP-1 do czystości 97-99%.

Stosując procedurę opisaną w niniejszym materiale, indukowano apoptozę monocytów THP-1, a następnie wykrywano i izolowano ApoBD za pomocą metody FACS lub różnicowego wirowania (Rycina 1). W pierwszej kolejności apoptozę indukowano poprzez naświetlanie promieniami UV, a próbki pobierano po 2-3 h inkubacji, gdy komórki wykazywały morfologię apoptotyczną, w tym pęcherzykowanie, tworzenie wypustek błony apoptotycznej oraz generowanie ApoBD6</sup...

Opracowany jest przepływ pracy wykorzystujący cytometrię przepływową lub wirowanie różnicowe do wykrywania, ilościowego oznaczania i izolowania ciał apoptotycznych z próbki apoptotycznej do wysokiej czystości.

Wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zarówno wykrycie, jak i wyizolowanie ciał apoptotycznych do wysokiej czystości. Ciała apoptotyczne to rodzaj pęcherzyków zewnątrzkomórkowych generowanych w celu pomocy w indukcji hematozy. Są największym typem zewnątrzkomórkowej rodziny fizycznej, zwykle o średnicy od jednego do pięciu mikrometrów.Obecnie staje się oczywiste, że ciała apoptotyczne mogą wspomagać procesy komórkowe, takie jak apoptotyczny oczyszczanie komórek i komunikacja wewnątrzkomórkowa. Dlatego opracowanie dokładnej metodologii wykrywania, ilościowego określania i izolowania ciał apoptotycznych ma kluczowe znaczenie dla personalizacji ich funkcji i mechanizmów. W tej serii prób pokażemy Ci, jak wykrywać, określać ilościowo i izolować ciała apoptotyczne z próbek apoptotycznych.Część A, indukcja apoptozy. Aby wywołać apoptozę w liniach komórkowych, takich jak monocyty THB1, najpierw zacznij od zebrania komórek. Policz komórki i zbierz około 10 milionów komórek lub zgodnie z wymaganiami.Zalecamy 10 milionów do analizy ciał apoptotycznych. Podziel dwa miliony komórek na studzienkę z sześciodołkowej płytki. Zdejmij pokrywkę z sześciodołkowej płytki i ogniw UV za pomocą UV Stratalinke

detection-and-isolation-of-apoptotic-bodies-to-high-purity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano dokładną metodę oceny śmierci komórek. Protokół ten stanowi ulepszenie konwencjonalnych protokołów z użyciem Annexin V/jodku propidyny (PI), które wykazują do 40% wyników fałszywie dodatnich w liniach komórkowych i komórkach pierwotnych pochodzących z szerokiej gamy modeli zwierzęcych.

Zmodyfikowany test apoptozy z użyciem Annexin V i jodku propidyny w celu dokładnej oceny śmierci komórek

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

W tym filmie test TUNEL jest wykonywany w celu wykrycia obecności komórek apoptotycznych w próbce. Badanie polega na użyciu specjalnej polimerazy DNA - końcowej deoksynukleotydylotransferazy - która katalizuje dodawanie znakowanych dUTP do końca 3' fragmentowanego DNA, który można obserwować i identyfikować pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Końcowe znakowanie końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej — test TUNEL: metoda in situ do wykrywania fragmentacji DNA w komórkach apoptotycznych

W tym filmie demonstrujemy test efferocytozy do badania klirensu komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Efferocytoza to wieloetapowy proces, w którym komórki apoptotyczne są pochłaniane przez fagocyty i degradowane w pęcherzykach zwanych efferosomami. Protokół ten zapewnia metodę wizualizacji zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych oraz ilościowego określenia efferocytozy.

Test esterocytozy utrwalonych: metoda badania wychwytu efferocytarnego komórek apoptotycznych przez makrofagi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek apoptotycznego raka piersi poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i dalsze wykrywanie przejścia komórek raka piersi niebędących komórkami macierzystymi do komórek podobnych do komórek macierzystych raka piersi po odwróceniu apoptozy za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie cytometryczne przepływowe nowo powstałych komórek przypominających komórki macierzyste raka piersi po odwróceniu apoptozy

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych oraz analizy skuteczności efferocytozy i specyficznego blokowania apoptotycznych tymocytów za pośrednictwem inhibitorów. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w usuwaniu innych cząstek, w tym sztucznych kulek i bakterii, za pośrednictwem komórek.

Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Apoptozę można scharakteryzować za pomocą analizy cytometrycznej wczesnych i późnych biomarkerów apoptozy. Linię komórkową raka szyjki macicy, SiHa, analizowano pod kątem biomarkerów apoptozy po leczeniu aktynomycyną D przy użyciu laboratoryjnego cytometru przepływowego.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Tutaj prezentowany jest eksperymentalny przepływ pracy, który umożliwia wykrywanie przetwarzania kaspazy-8 bezpośrednio w wywołującym śmierć kompleksie sygnalizacyjnym (DISC) i określa skład tego kompleksu. Metodologia ta ma szerokie zastosowanie, od odkrywania mechanizmów molekularnych szlaków śmierci komórkowej po dynamiczne modelowanie sieci apoptozy.

Pomiar składu kompleksu sygnalizacyjnego indukującego śmierć CD95 i przetwarzanie prokaspazy-8 w tym kompleksie

Naucz się wykrywać i izolować ciała apoptotyczne o wysokiej czystości z próbek komórkowych. Ta metoda wykorzystuje cytometrię przepływową i różnicową wirowanie do badań biologii komórkowej.

Wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości

Przeglądaj więcej filmów