Name: Test biosensoryczny beztlenowy do wykrywania rtęci i kadmu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę biosensorów beztlenowych do oceny biodostępności rtęci i kadmu w bakteriach. Technika dostarcza danych w czasie rzeczywistym o cyklu biogeochemicznym metali w środowiskach beztlenowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować komentarzom od dwóch anonimowych recenzentów, a także członków Laboratorium Poulain za wnikliwą dyskusję na temat rozwoju biosensora beztlenowego. Badanie zostało sfinansowane z nagrody Early Researcher Award przyznanej przez prowincję Ontario oraz grantu Discovery Grant i suplementu akceleracyjnego przyznanego przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada) dla A.J.P.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Biosensory mikrobiologiczne są użytecznymi narzędziami do identyfikacji mechanizmów, za pomocą których metale wchodzą w interakcje z drobnoustrojami. W tym miejscu opisujemy metodę, która może beztlenowo określić ilościowo biodostępność HgII i CdII dla Gram-ujemnej komórki gospodarza (E. coli) i dać wymierny wynik w ciągu kilku godzin. Jedną z głównych zalet tego protokołu jest to, że umożliwia on szeroką kontrolę specjacji metali w podłożu ekspozycyjnym poprzez unikanie silnych ligandów wiążących lub składników, które mogą prowadzić do wytrącania się metali. Specjacja metali została zamodelowana i przetestowana w tym ośrodku ekspozycyjnym przy użyciu PHREEQC17, jednak można zastosować inne oprogramowanie do specjacji metali. W przypadku braku dodanych ligandów oczekuje się, że specjacja Hg będzie obecna jako 97% Hg(OH)2 i 3% Hg(NH3)22+, podczas gdy specjacja Cd będzie obecna jako 59% Cd-β-glicerofosforanu, 25% Cd2+ i 16% CdSO4. Korzystając z prostego oprogramowania do modelowania termodynamicznego, użytkownik może zaprojektować media ekspozycyjne i przetestować biodostępność interesującego go metalu. Ponadto komórka gospodarza biosensora (E. coli NEB5α) jest zdolna do pracy w szerokim zakresie pH (5-8,5) i stężenia NaCl (0-0,55 M)17.
Metylacja Hg jest procesem beztlenowym, a protokół opisany w tym badaniu nie wymaga tlenu, co pozwala na dokładniejszy opis metabolizmu beztlenowego na biodostępność metali. Jest to ważne, ponieważ obecność tlenu zmienia profile ekspresji genów 48,49, a tym samym potencjalne szlaki transportu; W związku z tym metoda ta ma przewagę nad obecnie istniejącymi alternatywami aerobowymi. Przedstawiony tutaj konstrukt biosensoryczny może być potencjalnie stosowany z innymi beztlenowymi gospodarzami, którzy mogą być bardziej istotni dla metylacji rtęci (np. Geobacter, Desulfovibrio), ale mogą być mniej podatni na manipulacje niż E. coli. Jednym z obecnych ograniczeń przedstawionego tutaj podejścia jest to, że nasza granica wykrywalności nie osiągnęła jeszcze poziomów pM, w przeciwieństwie do istniejących systemów tlenowych 4,19,37. Należy jednak zauważyć, że aby osiągnąć te niskie granice wykrywalności, należy podjąć kilka kroków44: i) wymagane jest dodanie liganda, aby zapewnić, że Hg pozostaje w roztworze i nie adsorbuje się na ścianie komórkowej drobnoustrojów (Hg nieodwracalnie wiąże się z tiolami na powierzchni komórki, zapobiegając jego biodostępności25,27; patrz odpowiedź progowa dla Hg na rysunku 3A), ii) modyfikacje gęstości komórek, lub iii) modyfikacje konstruktu genetycznego w celu uwzględnienia białek transportowych mer-operonu (tj. merT i merP), zwiększając przepływ Hg wewnątrz komórki50,51. Modyfikacje te byłyby korzystne w wykrywaniu niskich stężeń Hg, ale niekoniecznie idealne w przypadku oceny sytuacji istotnych dla środowiska. Podczas gdy poprzednie bioczujniki kadmu istnieją przede wszystkim jako "dowód zasady", zostały zaprojektowane w złożonych podłożach, które nie pozwalają badaczowi ocenić roli specjacji w biodostępności 41,42,43,44.
Bioczujnik jest niezwykle przydatnym narzędziem w określaniu mechanizmów, w których gatunki metali są biodostępne. Ponieważ organizm gospodarza nie jest metylatorem Hg, można go użyć jedynie do opracowania modelu tego, w jaki sposób Hg może dostać się do bakterii Gram-ujemnych, a nie ostatecznego uzasadnienia, w jaki sposób metylatory Hg pozyskują Hg. Istnieją inne metody określania biodostępności Hg, takie jak metylacja, w wyniku absorpcji lub zastosowania metody bilansu masy 10,15,20,45,46. Biorąc to pod uwagę, przedstawiona tutaj metoda oferuje przewagę w postaci danych o biodostępności w czasie quasi rzeczywistym w żywotnych komórkach. Nie zaleca się, aby ta metoda była stosowana do ilościowego określania całkowitych poziomów Hg lub Cd w matrycy środowiskowej. Pomimo proponowanego zastosowania bioczujników do określania stężeń metali w środowisku36, dostępnych jest wiele innych łatwo dostępnych metod standardowych, takich jak ICP-MS, FAAS (do analizy Cd) lub spektroskopia absorpcji atomowej z zimną parą (do analizy Hg). Bioczujnik może być jednak wykorzystany do określenia, czy dana matryca środowiskowa może potencjalnie zwiększać lub hamować biodostępność; Osiąga się to poprzez wykonywanie standardowych dodatków.
pH pożywki ekspozycyjnej może być zmienione do dowolnego miejsca w zakresie od 5 do 8,5, pod warunkiem że wolny kwas MOPS (bufor) zostanie wymieniony na alternatywny wolny kwas buforu o odpowiednim pKa (patrz wykaz odpowiednich (Ferreira i wsp. (2015)47) i dostosowano KOH do odpowiedniego pH podczas wytwarzania mediów ekspozycyjnych. Ponadto metoda nie ogranicza się do Hg i Cd, ale może zostać rozszerzona na inne metale przy użyciu innych regulatorów transkrypcji.
Test narażenia może być zmodyfikowany w celu zbadania wpływu innych akceptorów elektronów, takich jakO2 i fumaran, na biodostępność Hg lub Cd. Drobne modyfikacje metody wykorzystania zarównoO2 , jak i fumaranu jako akceptorów elektronów są dostępne na żądanie.
Podsumowując, chcielibyśmy podkreślić następujące punkty: I) Konieczne jest, aby stężenia zapasów Cd lub Hg były znane w kroku 2, ponieważ zostaną one wykorzystane do kalibracji biosensora. II) W dniu narażenia wzrost komórek musi zostać zatrzymany przy OD600 wynoszącym 0,6 (± 0,1) i należy zachować ostrożność podczas ponownego zawieszania kultur komórkowych, ponieważ bioczujnik jest skalibrowany do tej gęstości komórek. III) Wreszcie, ważne jest, aby podłoże ekspozycyjne było starannie wykonane w dniu ekspozycji. Aby zapewnić powodzenie protokołu, wiele kultur powinno być hodowanych jednocześnie (aby obejść możliwość niepowodzenia wzrostu), a podłoże wzrostowe powinno być ponownie przygotowywane co tydzień (aby obejść metastabilność pożywki i możliwe zanieczyszczenie). Należy również zauważyć, że kontrugrupowania biologiczne (hodowle wielokomórkowe) wykazują zmienność, jeśli chodzi o produkcję sygnału. Chociaż reakcje fluorescencyjne mogą się różnić w zależności od kultury, trendy fluorescencyjne w odpowiedzi na daną zmienną powinny pozostać takie same w wielu kontrpróbach biologicznych.

Rtęć (Hg) jest globalnym zanieczyszczeniem, a jej biodostępność dla mikrobów metylujących Hg jest pierwszym krokiem w kierunku jej biomagnifikacji przez sieci pokarmowe i możliwych efektów neurotoksycznych u ludzi i dzikich zwierząt1. Obecnie uważa się, że mikrobiologiczna metylacja Hg jest procesem wewnątrzkomórkowym, który wymaga: i) aby gatunek Hg był biodostępny2,3,4,5,6,7 oraz ii) aby komórka była fizjologicznie zdolna do metylacji Hg8,9,10. Kadm (Cd) ulega bioakumulacji w organizmach, ale nie ulega biomagnifikacji w sieciach pokarmowych i jest szeroko stosowany w procesach przemysłowych i handlowych, które często powodują ostre narażenie ludzi i środowiska11. Chociaż mikroorganizmy odgrywają kilka kluczowych ról w losie Hg w środowisku, większość badań nad geochemią Cd i ekotoksykologią koncentruje się na mikroorganizmach eukariontów12. Konsumpcja upraw rolnych (np. ryżu) jest głównym źródłem bezpośredniego narażenia na kadm; w tym przypadku biodostępność Cd dla mikroorganizmów ryzosfery bezpośrednio wpływa na ilość, jaką rośliny mogą gromadzić13.
Ścieżki transportu Hg są skomplikowane i mogą obejmować aktywny etap transportu14. Ostatnie prace sugerują, że gdy w grę wchodzi transporter, HgII używa transportera ZnII lub MnII7,15,16,17. Podczas gdy przypuszcza się, że CdII jest przypadkowo transportowany do cytozolu przez szlaki transportu metali dwuwartościowych (w szczególności MnII lub ZnII), mechanizmy transportu CdII wewnątrz komórek pozostają w sferze spekulacji i nie zidentyfikowano szlaku transportu specyficznego dla Cd13,18. Niezależnie od charakteru zaangażowanych transporterów, trzy czynniki mechanistyczne ostatecznie determinują zdolność metali do wnikania do komórki: i) specjacja metalu w roztworze2,6,15,16,17,19,20,21, 22,23, ii) właściwości biofizjochemiczne błony komórkowej17,24,25,26,27,28,29,30,31oraz iii) możliwość dostępu metalu do miejsca transportu7,32. Jest mało prawdopodobne, aby Cd i Hg występowały jako wolne jony w warunkach fizjologicznie istotnych dla mikroorganizmów ze względu na ich wysokie powinowactwo do rozpuszczonej materii organicznej (DOM), zanieczyszczeń chelatujących (np. EDTA) lub zredukowanych ugrupowań siarki33,34,35 (CdII może istnieć jako wolny jon lub tworzyć pary jonowe przy braku tych ligandów). Brakuje skutecznych metod określania, w jaki sposób te gatunki metali są biodostępne w warunkach istotnych dla ich losów w środowisku. Na przykład Hg jest metylowany w warunkach beztlenowych14, a zarówno kadm, jak i Hg są metalami miękkimi (lub kationami klasy B), co wymaga zbadania ich specjacji w warunkach, które zachowują integralność zredukowanych grup siarki.
Biosensory mikrobiologiczne to komórki bakteryjne, które emitują wymierny sygnał w odpowiedzi na wewnątrzkomórkowe stężenia metalu, w tym przypadku Hg lub Cd. W związku z tym są idealnymi narzędziami do zrozumienia, w jaki sposób metale dostają się do komórki36, pod warunkiem, że warunki ekspozycji są dokładnie kontrolowane. Bioczujniki Hg zazwyczaj zawierają fuzje genów między obwodami regulatorowymi mer-operonu (w tym genami kodującymi regulator transkrypcji MerRas, a także regionami operatora i promotora operonu) a genami raportującymi (np. Geny lux, gfp, lac). Gdy rtęć jest obecna w cytoplazmie, wiąże się z MerR, co powoduje transkrypcję genów raportujących i późniejszą produkcję sygnału19,37. Specyficzne biosensory Cd są zwykle projektowane przy użyciu regulatorów transkrypcji kodowanych w kodach cadC, cadAC, zntA lub zntR38, ale warto zauważyć, że MerR ma niższe, ale wymierne powinowactwo do Cd5. Ze względu na ograniczenia tlenowe najczęściej stosowanych luminescencyjnych lub fluorescencyjnych białek reporterowych, do niedawna bioczujniki mikrobiologiczne nie były w stanie zapewnić wglądu w biotransformację metali w warunkach beztlenowych. To sprawia, że beztlenowe wykrywanie biodostępności metali jest bardzo trudne w różnych warunkach istotnych dla ich losów w środowisku, w szczególności w obecności ligandów wrażliwych na redoks (np. siarczków i tioli)4,5,39.
Aby złagodzić metodologiczną przeszkodę związaną z obrazowaniem na żywo przy braku tlenu, Drepper et al. (2007) opracowali białko fluorescencyjne na bazie flawiny (FbFp), oparte na domenie napięcia tlenu świetlnego białka SB2 z P. putida. Ta rodzina białek jest zdolna do fluorescencji przy braku tlenu40. Opierając się na pracy Dreppera i wsp., nasze laboratorium zaprojektowało bioczujnik beztlenowy pozwalający na badanie biodostępności Hg w warunkach tlenowych i beztlenowych oraz w szerokim zakresie zasolenia 17. W niniejszym artykule opisano, jak przygotować i wykorzystać bioczujnik do badania wpływu zmiennych środowiskowych na biodostępność Hg lub Cd. Chociaż opracowaliśmy bioczujnik dla HgII, zdecydowaliśmy się przeprowadzić eksperymenty z CdII jako sposób na zwrócenie uwagi czytelnika na fakt, że bioczujniki mogą również reagować na wiele stresorów, które prawdopodobnie współwystępują w matrycach środowiskowych; w tym przypadku CdII został zbadany, ponieważ wiadomo, że wiąże się z regulatorem transkrypcji MerR5. Tutaj pokazujemy reprezentatywną kalibrację i funkcjonalne zakresy liniowe w odniesieniu do każdego metalu. Podajemy również przykład, gdy wyniki biosensora są jednoznaczne (MgII i MnII dotyczące biodostępności Hg) i niejednoznaczne (ZnII dotyczące biodostępności Hg).

<table><tbody><tr><td>Fiolka standardowa 7 ml, zaokrąglone wnętrze</td><td>Delta Scientific</td><td>200-007-20</td><td>zalecana 34</td></tr><tr><td>Tacka na fiolki, otwory 21 mm</td><td>Delta Scientific</td><td>730-2001</td><td>4 do (siatka 4 x 8)</td></tr><tr><td>Zamknięcie 24 mm</td><td>Delta Scientific</td><td>600-024-01</td><td>32 zalecane</td></tr><tr><td>NAROŻNIK POKRYWY WCIĘCIE BLK STR CS/50</td><td>Corning</td><td>Corning 3931</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-dołkowa mikropłytka z przezroczystym, niewiążącym dnem</td><td>Corning</td><td>Corning 3651</td><td></td></tr><tr><td>Komora anaerobowa (komora rękawicowa)</td><td></td><td></td><td>Powietrze w komorze beztlenowej powinno mieć (97 % N2 &plusmn; 2 % i 3 % H2 &plusmn; 2 %)</td></tr><tr><td>Katalizator</td><td></td><td></td> <td>palladowyPrzekształca O2 na H2O w komorze beztlenowej. Nie jest to wymagane, ale zalecane.</td></tr><tr>Czytnik <td></td><td></td><td></td><td>mikropłytek</td></tr><tr><td>450 (&plusmn; 10) Filtr nM do czytnika</td><td></td><td></td><td></td>mikropłytek</tr><tr><td>500 (&plusmn; 10) Filtr nM do czytnika</td><td></td><td></td><td></td>mikropłytek</tr><tr><td>Fiolka do hodowli anaerobowych (probówki balchowe) + korki</td><td></td><td></td><td></td>gumowe</tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td></td><td></td><td>Zmodyfikowany do probówek do hodowli beztlenowych</td></tr><tr><td>MA-3000 (analizator rtęci)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sonda</td><td></td><td></td> pH <td>Każda sonda pH będzie działać</td></tr><tr><td>50 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy z polieterosulfonu + strzykawka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne/czyste butelki</td><td></td><td></td> szklane <td>Do pożywek wzrostowych i wzorców</td></tr><tr><td>Sterylne/czyste butelki</td><td></td><td></td> plastikowe lub PTFE <td>Do roztworów alkalicznych (NaOH/KOH)</td></tr><tr><td>Odczynniki w proszku: Na2MoO4, Na2SeO4, H3BO3, NaOH, KOH, MnSO4, ZnSO4, CoCl2, NiCl2, sól sodowa ampicyliny, Difco M9 Sole minimalne, glukoza, MgSO4, Tiamina HCl, NaNO3, l-leucyna, l-izoleucyna walina, sól sodowa EDTA, FeSO4, beta-gylcerofosforan sodu, kwas wolny od mopów, (NH4)2SO4, Hg(NO3)2, CdCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td></td><td></td> Milli-Q <td>autoklawizowana lub sterylizowana filtrem jest w porządku.</td></tr><tr>Rosół <td></td><td></td><td></td><td>lizogeniczny</td></tr><tr><td>Klasa analityczna H2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test biosensoryczny beztlenowy do wykrywania rtęci i kadmu

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

Biodostępność rtęci (Hg) dla mikroorganizmów jest kluczowym krokiem do toksycznej biomagnifikacji Hg w sieciach pokarmowych. Przemiany kadmu (Cd) i biodostępność dla bakterii kontrolują ilość, która gromadzi się w podstawowych uprawach spożywczych. Biodostępność tych metali zależy od ich specjacji w roztworze, ale w szczególności w warunkach beztlenowych, w których Hg jest metylowany do toksycznej monometylortęci (MeHg), a Cd utrzymuje się w ryzosferze. Bioczujniki mikrobiologiczne działające w całych komórkach dają wymierny sygnał, gdy metal dostanie się do cytozolu, a zatem są przydatnymi narzędziami do oceny biodostępności metalu. Niestety, większość prób biodetekcji była do tej pory ograniczona do środowisk tlenowych ze względu na ograniczoną zdolność istniejących białek reporterowych do funkcjonowania przy braku tlenu. W tym badaniu przedstawiamy nasze wysiłki na rzecz opracowania i optymalizacji testu biosensora całego komórkowego zdolnego do działania beztlenowego, który może wykrywać metale w warunkach beztlenowych w czasie quasi-rzeczywistym i w ciągu kilku godzin. Opisujemy, w jaki sposób bioczujnik może pomóc w ocenie, w jaki sposób zmienne chemiczne istotne dla środowiskowego obiegu metali wpływają na ich biodostępność. Poniższy protokół obejmuje metody (1) przygotowania wzorców Hg i Cd w warunkach beztlenowych, (2) przygotowania bioczujnika przy braku tlenu, (3) zaprojektowania i przeprowadzenia eksperymentu w celu określenia, w jaki sposób szereg zmiennych wpływa na biodostępność Hg lub Cd oraz (4) ilościowego określenia i interpretacji danych z biosensorów. Pokazujemy zakresy liniowe bioczujników i podajemy przykłady pokazujące zdolność metody do rozróżniania biodostępności metali i toksyczności poprzez wykorzystanie zarówno szczepów indukowanych metalami, jak i konstytutywnych.

Po ilościowym oznaczeniu szczytów fluorescencji zgodnie z krokiem 5.3, wyniki można przedstawić na wykresie w zależności od zmiennej stężenia, aby zilustrować, w jaki sposób dana zmienna wpływa na względną biodostępność Hg lub Cd. Na przykład krzywa kalibracyjna fluorescencji w funkcji [HgII] z Rysunku 2 dostarczy danych indukowalnych przedstawionych na Rysunku 3A. W przypadku kalibracji HgII krzywa dla szczepu indukowalnego zawsze składa się z 3 komponentów: odpowiedzi progowej wynoszącej około 1-2 nM HgII, zanim produkcja sygnału fluorescencji stanie się liniowo proporcjonalna do [HgII], zakresu liniowego, w którego centrum zawsze będzie znajdować się 5 nM HgII, oraz plateau, gdzie zwiększanie [HgII] nie będzie już powodować wzrostu sygnału fluorescencji. Brak zmian w produkcji sygnału w szczepie konstytutywnym wskazuje, że toksyczność [HgII] nie wpływa na produkcję sygnału. Dla CdII na Rysunku 3B w przypadku szczepu indukowalnego zawsze występują 2 komponenty: zakres liniowy, w którego centrum zawsze będzie znajdować się 200-300 nM CdII, oraz plateau. Spadek sygnału fluorescencji wraz ze wzrostem [CdII] pokazuje, że wyższe stężenia Cd są toksyczne dla komórek, co może wyjaśniać spadek indukowanej produkcji fluorescencji po osiągnięciu plateau przy 1000 nM CdII. Dlatego przy badaniu biodostępności Hg lub Cd w odniesieniu do zmiennej środowiskowej sugerujemy stosowanie 5 nM dla HgII oraz 300 nM dla CdII.
W niektórych przypadkach generowanie sygnału można właściwie przypisać biodostępności Hg lub Cd, jednak w innych sytuacjach na generowanie sygnału może wpływać zmienność stanu fizjologicznego komórki gospodarza biosensora (np. badany metal lub warunki środowiskowe są toksyczne). Na Rysunku 4A biodostępność 5 nM Hg została przetestowana w gradiencie Zn (0-10 µM). Zarówno w szczepach indukowalnych przez Hg, jak i konstytutywnych, obserwuje się podobny spadek sygnału wraz ze wzrostem stężeń Zn. W związku z tym nie można rozstrzygnąć, czy sygnał wynika z obniżonej biodostępności, czy jest efektem toksyczności Zn. Na Rysunku 4B oraz 4C biodostępność 5nM Hg została przetestowana w gradiencie MgII (0-10 mM) oraz MnII (0-10 µM). Zwiększenie stężeń MgII i MnII spowodowało spadek sygnału fluorescencji szczepu indukowalnego. Z drugiej strony szczep konstytutywny nie wykazał spadku fluorescencji przy wzroście stężeń MgII i MnII (MgII i MnII są korzystne dla komórek w produkcji FbFp, o czym świadczy wzrost sygnału fluorescencji). Dowodzi to, że komórki są żywotne, a spadek fluorescencji szczepu indukowalnego przez Hg wynika ze zmniejszenia biodostępności Hg. Dane te podkreślają, jak ważne jest, aby wszystkie testy biosensorowe obejmowały również pomiary konstytutywne ogólnej kondycji komórek.
<img alt="Wykres odpowiedzi fluorescencyjnej dla jonów Hg(II), Cd(II). Dane ekspresji genów indukowalnej i konstytutywnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zakresy liniowe biosensora dla rtęci i kadmu. Maksymalna fluorescencja mierzona jako względne jednostki fluorescencji (RFU) ± 1 odchylenie standardowe emitowana przez E. coli NEB5α zawierającą pUC57merR-Pp (indukowalny Hg) oraz pUC19Balch-Pp (konstytutywny) po dodaniu A) HgII (0-15 nM) i B) CdII (0-1,000 nM) w warunkach beztlenowych. Fluorescencja stanowi średnią z 3 powtórzeń technicznych w temperaturze 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy odpowiedzi fluorescencyjnej dla stężeń Zn(II), Mg(II), Mn(II); indukowalny vs konstytutywny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykład wyniku niejednoznacznego dla cynku oraz wyników jednoznacznych dla magnezu i manganu. Maksymalna fluorescencja mierzona jako względne jednostki fluorescencji (RFU) ± 1 odchylenie standardowe emitowana przez E. coli NEB5α zawierające pUC57merR-Pp (indukowalny Hg) oraz pUC19Balch-Pp (konstytutywny) po dodaniu A) ZnII (0-10 µM), B) MgII (0-10 mM) oraz C) MnII (0-10 µM) w warunkach beztlenowych. Stężenie [HgII] ustalono na poziomie 5 nM dla wszystkich prób, a fluorescencja stanowi średnią z 3 powtórzeń technicznych w temperaturze 37 ˚C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół korzystania z beztlenowego biosensora mikrobiologicznego całych komórek do oceny, jak różne zmienne środowiskowe wpływają na biodostępność Hg i Cd dla bakterii w środowisku beztlenowym.

Test biosensoryczny beztlenowy do wykrywania rtęci i kadmu

Mercury (Hg) bioavailability to microbes is a key step to toxic Hg biomagnification in food webs. Cadmium (Cd) transformations and bioavailability to ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biogeochemicznego obiegu kadmu i rtęci, takie jak to, jak różne zmienne środowiskowe wpływają na ich biodostępność dla bakterii. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona dane o biodostępności w czasie quasi-rzeczywistym i żywotne komórki niezależnie od obecności tlenu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ istnieje wiele etapów, w których liczy się czas, które wymagają bardzo skrupulatnej dbałości o szczegóły.Procedurę zademonstruje Ben, doktorant z mojego laboratorium. Aby przygotować się do testu, należy pobrać bioczujnik indukowany rtęcią i bioczujnik o konstytutywnej ekspresji z materiału kriogenicznego o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Umieść komórki na płytkach bulionu lizogennego zawierających 120 mikrogramów na mililitr ampicyliny.Hoduj kultury talerzowe w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Między 16:30 a 17:00 zaszczepić kulturę w dziesięciu mililitrach LB ampicyliną i rosnąć przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 220 obr./min.Między dziewiątą a dziesiątą rano następnego dnia przynieś kulturę oraz wcześniej przygotowaną pożywkę wzrostową do komory beztlenowej. Następnie dodaj osiem mililitrów świeżej pożywki wzrostowej i 210 mikrogramów na mililitr ampicyliny do sterylnej probówki z balsamem.Teraz zbierz dwa mililitry wyhodowanej przez noc kultury i przenieś do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Po odwirowaniu w temperaturze 10 000 RCF przez 90 sekund, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w dwóch mililitrach świeżej pożywki wzrostowej. Następnie dodać ponownie zawieszoną kulturę do probówki z balsamem zawierającej osiem mililitrów świeżej pożywki wzrostowej i ampicyliny.Stosując sterylną technikę, ostrożnie umieść gumowy korek na probówce balcha przed wyjęciem jej z komory beztlenowej. Następnie umieść probówkę w inkubatorze i rozwijaj się beztlenowo w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min. Między trzecią a piątą po południu.Wprowadź probówkę Balcha z kulturą, nową sterylną probówkę Balch i pożywkę wzrostową do komory beztlenowej. Dodaj 100 mikrolitrów kultury do 10 mililitrów świeżej pożywki wzrostowej z ampicyliną w sterylnej probówce balcha. Stosując sterylną technikę, ostrożnie umieść gumowy korek na tubce balcha.Wyjmij probówkę z komory beztlenowej przed wyhodowaniem jej przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 220 obr./min. Między dziewiątą a dziesiątą rano następnego dnia przenieś kulturę i pożywkę wzrostową z powrotem do komory beztlenowej.Ponownie dodaj osiem mililitrów pożywki wzrostowej i ampicyliny do sterylnej probówki z balsamem. Przenieś dwa mililitry wyhodowanej przez noc kultury do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Po odwirowaniu, jak poprzednio, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach świeżej pożywki wzrostowej.Następnie dodać ponownie zawieszoną kulturę do probówki z balsamem zawierającej świeżą pożywkę wzrostową i ampicylinę. Stosując sterylną technikę, ostrożnie umieść gumowy korek na tubce balcha. Wyjmij go z komory i rośnij beztlenowo w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 220 obr./min.Monitoruj wzrost kultury za pomocą spektrofotometru, wirując kulturę, a następnie mierząc gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD600. Po trzech do czterech godzinach oczekiwanego wzrostu kultura powinna osiągnąć OD600 na poziomie 6. Teraz przenieś probówkę do komory beztlenowej i przenieś kulturę do dwóch dwumililitrowych mikroprobówek wirówkowych.Po odwirowaniu, jak poprzednio, usunąć supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę podniebienia w dwóch mililitrach świeżej pożywki ekspozycyjnej. Powtórz ten etap mycia raz, aby usunąć wszelkie ślady podłoża wzrostowego. Teraz połącz obie probówki do mikrowirówek z hodowlą komórkową w siedmiomililitrowej standardowej fiolce z PTFE, aby uzyskać materiał biosensora do wykorzystania w teście ekspozycji.Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdź monitor anaerobowy, aby upewnić się, że w komorze beztlenowej nie ma tlenu. Zaprojektuj układ płyt zgodnie z szablonem 96 dołków. Przeprowadzenie eksperymentów na technicznych powtórzeniach trzech pozwoli to na 32 różne zabiegi, które najlepiej jest odwzorowane za pomocą siatki cztery na osiem do ustawiania fiolek.Ustaw siatkę cztery na osiem zgodnie z układem płytki testowej. Następnie umieść siedem mililitrowych standardowych fiolek z PTFE na tacy. Z fiolkami należy obchodzić się wyłącznie poprzez manipulowanie zewnętrzną stroną fiolki.Dodać objętość pożywki ekspozycyjnej do każdej fiolki odpowiadającą każdemu zabiegowi. Do każdej fiolki dodać odpowiednią objętość zmiennej chemicznej, która ma być badana, zgodnie z układem płytek. Teraz dodaj azotany do każdej fiolki, tak aby stężenie wynosiło 200 mikromolowych.Wyklucz ten krok w przypadku konstytutywnych ślepych prób leczenia biosensorami. Aby dodać rtęć do fiolek, najpierw weź bulion od czterech do ośmiu mikromolowych i dobrze wstrząśnij. Rozcieńczyć roztwór i podłoże ekspozycyjne w siedmiomililitrowej fiolce z PTFE do stężenia od 100 do 250 nanomolowych, aby uzyskać działający roztwór rtęci.Z tego roztworu roboczego dodać rtęć do wymaganych fiolek zgodnie z układem płytek. Po dodaniu rtęci lub kadmu ręcznie potrząśnij płytką ruchem orbitalnym. Eksperyment może być teraz wstrzymany w zależności od czasu potrzebnego do specjacji rtęci lub kadmu w roztworze.Po wznowieniu eksperymentu delikatnie pipetuj biosensory w przód iw tył, aby zapewnić jednorodność. Następnie dodaj 100 mikrolitrów bulionu biosensora do każdej fiolki i ręcznie potrząśnij płytką jak poprzednio. Rozgrzej czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza i ustaw bieg kinetyczny na dziesięć godzin z odczytami co dwie punkty, pięć do pięciu minut.Drżenie orbitalne między odczytami. Skonfiguruj przebieg do wykonywania pomiarów fluorescencji ze wzbudzeniem fluorescencji 440 nanometrów i emisją 500 nanometrów. Teraz odpipetuj 200 mikrolitrów z każdej fiolki PTFE w siatce cztery na osiem do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej.Pipetuj tam i z powrotem pięć razy przed przeniesieniem każdych 200 mikrolitrów. Zamiast wyrzucać końcówkę pipety, należy pozostawić końcówkę pipety w fiolce z PTFE, aby śledzić postęp pipetowania. Umieść płytkę 96-dołkową w tacce czytnika płytek.Następnie umieść pokrywkę na płytce 96-dołkowej i rozpocznij test. Poniżej znajdują się reprezentatywne wyniki przedstawiające skorygowane dane fluorescencji w funkcji czasu. Fluorescencja jest wykazywana wraz ze wzrostem stężenia rtęci do indukowalnego bioczujnika.Wszystkie wartości są puste dla kontroli braku rtęci. Piki fluorescencyjne można określić ilościowo, aby pokazać sygnał fluorescencyjny w funkcji stężenia rtęci lub kadmu. Zarówno w przypadku bioczujników indukowalnych, jak i konstytutywnych, do badania zmiennych należy stosować stężenie rtęci lub kadmu w środku zakresu liniowego czujników indukowalnych.Oto przykłady niejednoznacznego wyniku z. I rozstrzygający wynik z magnezem i manganem na biodostępność rtęci do bioczujnika. Wynik w przypadku jest niejednoznaczny, ponieważ fluorescencja konstytutywna rozpada się z indukowaną fluorescencją wskazującą na toksyczność.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wprowadzeniu stężeń kadmu lub rtęci, ponieważ będą one używane do kalibracji bioczujnika. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak modelowanie termodynamiczne układów wodnych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób określone związki chemiczne rtęci lub kadmu wpływają na ich biodostępność. Nie zapominaj, że praca z kadmem i rtęcią oraz silnymi kwasami, takimi jak kwas siarkowy, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią środowiskową do badania biodostępności rtęci lub kadmu w czasie rzeczywistym oraz genetycznie podatnych mikroorganizmów.

an-anaerobic-biosensor-assay-for-the-detection-of-mercury-and-cadmium

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Źródło: Barber, A. E., et al. Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje wykrywanie określonych analitów za pomocą biosensora bakteryjnego. Pobiera się kulturę bakteryjną zawierającą plazmid z genem białka czerwonej fluorescencji (RFP) pod promotorem wrażliwym na analit. Po dokładnym wytarciu powierzchni testowej niewielką część chusteczki zanurza się w kulturze i...

Wykrywanie docelowego analitu za pomocą biosensora bakteryjnego

Źródło: Stenzler, B. R. i wsp., Beztlenowy test biosensoryczny do wykrywania rtęci i kadmu. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych bioczujników bakteryjnych do dokładnego pomiaru biodostępnej frakcji jonów rtęci w warunkach beztlenowych. Zmieniając stężenie siarczanu magnezu, test zapewnia, że bioczujnik selektywnie reaguje na wolne jony rtęci, na co wskazują zmiany intensywności fluorescencji.

Test biosensora bakteryjnego do wykrywania biodostępnej rtęci w warunkach beztlenowych

Integracja hodowli mikroalg z przemysłowymi gazami spalinowymi ostatecznie wprowadzi metale ciężkie i inne związki nieorganiczne do podłoża wzrostowego. W pracy przedstawiono procedurę zastosowaną do określenia końcowego losu i wpływu metali ciężkich i zanieczyszczeń nieorganicznych na wzrost Nannochloropsis salina hodowanych w fotobioreaktorach.

Kwantyfikacja metali ciężkich i innych zanieczyszczeń nieorganicznych na produktywność mikroglonów

Ze względu na znaczenie i szerokie zastosowanie palladu, złota i kobaltu w sprzęcie high-tech, ich odzysk i recykling stanowią ważne wyzwanie przemysłowe. Opisany w niniejszym dokumencie system odzysku metali jest prostym, tanim sposobem na skuteczne wykrywanie, usuwanie i odzysk tych metali z kopalni miejskiej.

Wykrywanie i odzyskiwanie palladu, złota i metali kobaltowych z kopalni miejskiej przy użyciu nowatorskich czujników/adsorbentów oznaczonych nanoskalowymi porami w kształcie koła wagonowego

Przedstawiono charakterystykę kompleksów powstałych w różnych względnych proporcjach tetrapeptydów rtęci(II) do tetrapeptydów dicysteinylu za pomocą spektrometrii mas orbitrap z jonizacją elektrorozpylającą.

Badanie kompleksacji rtęci(II) z tetrapeptydami dicysteinylowymi za pomocą spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania

Opisano zastosowanie cząsteczek polideoxynukleotydu (44-merowego aptameru) do wykrywania niechelatowanego jonu gadolinu(III) w roztworze wodnym. Obecność jonu jest wykrywana poprzez wzrost emisji fluorescencji czujnika.

Oparty na aptamierze czujnik do wykrywania niechelatowanego gadolinu(III)

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

W niniejszej pracy omawiano protokół projektowania i opracowania urządzenia E-Eye-Enable POCT do wykrywania Fe, Cr, As i F w próbkach środowiskowych, próbkach biologicznych oraz żywności i napojach. Przetestowano prawie 2000 próbek, a wyniki odpowiadają standardowej technice.

TD-DFT Guided Advanced E-Eye Sensing Technique do kwantyfikacji na miejscu Fe, Cr, F oraz As w próbkach środowiskowych, biologicznych i spożywczych

Ten artykuł opisuje projekt, budowę i funkcję obiektu o powierzchni 1 000m2 zawierającego 24 indywidualne działki polowe o powierzchni 33,6m2 wyposażone do pomiaru całkowitej objętości spływu z czasem i pobierania podpróbek spływu w wybranych odstępach czasu w celu ilościowego określenia składników chemicznych w wodzie spływającej z symulowanych trawników domowych.

Projekt i budowa Zakładu Badań Spływów Miejskich

Poznaj metodę biosensorów beztlenowych do oceny biodostępności rtęci i kadmu w bakteriach. Technika dostarcza danych w czasie rzeczywistym o cyklu biogeochemicznym metali w środowiskach beztlenowych.

Test biosensoryczny beztlenowy do wykrywania rtęci i kadmu

Przeglądaj więcej filmów