Name: Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Poznaj test komórkowy badający kurczliwość miozyny II niezwiązanej z mięśniami w komórkach S2R+ Drosophila poprzez szlak sygnałowy Fog. Ta metoda umożliwia odkrywanie genów białek regulujących kurczliwość komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować członkom Rogers Lab i Applewhite, Grecie Glover, oraz studentom kursu biologii komórkowej Reed College na wiosnę 2018 roku, którzy przyczynili się do rozwoju tego protokołu. Ponadto autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Ritz za uważne przeczytanie i zredagowanie tego manuskryptu. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Science Foundation w ramach nagrody numer 716964 dla D.A.A. i A.R. oraz Wydziału Biologii Reed College.

<ol><li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).</li>
<li>Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlyBase+portals+to+human+disease+research+using+Drosophila+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">FlyBase portals to human disease research using Drosophila models.</a> Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).</li>
<li>Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high-throughput+RNA+interference+screens+to+problems+in+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology.</a> Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).</li>
<li>Currie, J. D., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Drosophila+melanogaster+D17-c3+cell+culture+system+to+study+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).</li>
<li>Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+the+Cytoskeleton+Using+Live+and+Fixed+Drosophila+Tissue+Culture+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells.</a> Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).</li>
<li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+actin-based+lamella+formation+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).</li>
<li>Yi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+reveals+multiple+regulators+of+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).</li>
<li>Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RNAi+screen+reveals+CD36+family+member+required+for+mycobacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection.</a> Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).</li>
<li>Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+RhoGAP%2FGTPase+regulation+using+single-cell+morphological+data+from+a+combinatorial+RNAi+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen.</a> Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).</li>
<li>Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+morphogenesis+by+the+G+protein-coupled+receptor+mist+and+its+ligand+fog%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog.</a> Science Signaling. 6 (301), 98(2013).</li>
<li>Leptin, M., Grunewald, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2081472">Cell shape changes during gastrulation in Drosophila.</a> Development. 110 (1), 73-84 (1990).</li>
<li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+movements%3A+the+logic+and+the+nuts+and+bolts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li>
<li>Martin, A. C., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+constriction%3A+themes+and+variations+on+a+cellular+mechanism+driving+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis.</a> Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).</li>
<li>Dawes-Hoang, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((folded+gastrulation%2C+cell+shape+change+and+the+control+of+myosin+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization.</a> Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).</li>
<li>Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+RhoGEF2+associates+with+microtubule+plus+ends+in+an+EB1-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner.</a> Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).</li>
<li>Coravos, J. S., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+Sarcomere-like+Actomyosin+Contracts+Nonmuscle+Drosophila+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells.</a> Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).</li>
<li>Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+domain+polarization+localizes+actin-myosin+activity+to+drive+ratchet-like+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction.</a> Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).</li>
<li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abelson+kinase+%28Abl%29+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134 (3), 567-578 (2007).</li>
<li>Manning, A. J., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fog+signaling+pathway%3A+insights+into+signaling+in+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis.</a> Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).</li>
<li>Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+G%CE%B112%2F13+exacerbates+apical+area+dependence+of+actomyosin+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).</li>
<li>Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+myosin+phosphorylation+regulates+contractile+pulses+and+tissue+integrity+during+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).</li>
<li>Parks, S., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+gastrulation+gene+concertina+encodes+a+G+alpha-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein.</a> Cell. 64 (2), 447-458 (1991).</li>
<li>Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GTPase+and+a+putative+RhoGEF+mediate+a+signaling+pathway+for+the+cell+shape+changes+in+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation.</a> Cell. 91 (7), 905-915 (1997).</li>
<li>Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+cell+signal+encoded+by+the+folded+gastrulation+gene+coordinates+cell+shape+changes+during+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation.</a> Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).</li>
<li>Peters, K. A., Rogers, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Ric-8+interacts+with+the+G%CE%B112%2F13+subunit%2C+Concertina%2C+during+activation+of+the+Folded+gastrulation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway.</a> Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).</li>
<li>Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Control+of+GPCR+Organization+and+Signaling+by+Endocytosis+in+Epithelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis.</a> Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).</li>
<li>Kerridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+activation+of+Rho1+by+GPCR+signalling+imparts+polarized+myosin+II+activation+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).</li>
<li>Myat, M. M., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+shape+in+the+Drosophila+salivary+gland+is+controlled+by+regulated%2C+sequential+internalization+of+the+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia.</a> Development. 127 (4), 679-691 (2000).</li>
<li>Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotrimeric+G+protein+signaling+governs+the+cortical+stability+during+apical+constriction+in+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation.</a> Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).</li>
<li>Nikolaidou, K. K., Barrett, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rho+GTPase+signaling+pathway+is+used+reiteratively+in+epithelial+folding+and+potentially+selects+the+outcome+of+Rho+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation.</a> Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).</li>
<li>Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+line+of+Drosophila+Schneider+S2+cells+that+respond+to+wingless+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling.</a> Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).</li>
<li>Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+GTPase+inhibition+organizes+contraction+during+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis.</a> The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół testu kurczliwości opartego na komórkach przy użyciu linii komórkowej hodowli tkankowej Drosophila (komórki S2R +), która ulega zwężeniu miozyny II bez mięśni w odpowiedzi na sygnalizację mgły. Ten test jest przydatny do badania szlaku mgły, a także mechanizmów regulujących kurczliwość miozyny II niemięśniowej.
Rozważania dotyczące hodowli komórkowych: Warunki, w których utrzymywane są komórki S2R+, mają kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych z tego testu. Planując wykonanie testu kurczliwości, najlepiej utrzymać komórki S2R+ w pożywce dla owadów Shield i Sang M3. Podczas gdy komórki S2R+ mogą rozwijać się w innych pożywkach do hodowli komórek owadów (np. SF900 lub pożywce dla owadów Schneidera), często tracą reakcję na mgłę. Komórki S2R +, które mają wysoką liczbę pasaży, zwykle ponad 20 - 25 pasaży, zaczynają tracić wrażliwość na RNAi. Do wszystkich eksperymentów najlepiej jest używać komórek wczesnego pasażu. Innym ważnym aspektem eksperymentów z detrukcją RNAi jest wybór odpowiednich kontroli. Typowe kontrole negatywne obejmują dsRNA ukierunkowane na EGFP lub pBlueScript, z których żaden nie jest homologiczny do genomu muchy. Celowanie w białka w szlaku mgły (Rho, Rok itp.), które po wyczerpaniu zapobiegają aktywacji kurczliwości miozyny niemięśniowej, są również użytecznymi kontrolami. S2: Komórki Fog-Myc mogą być utrzymywane w alternatywnym pożywce do hodowli komórek, takiej jak SF900 uzupełniona 100 jednostkami / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny i 0,25 amfoterycyny B. Należy pamiętać, że FBS nie jest wymagany podczas hodowli komórek w SF900. Gęstość komórek jest również kluczowym elementem wszystkich aspektów hodowli tkankowej komórek Drosophila . W przeciwieństwie do komórek hodowli tkankowych ssaków, komórki hodowli tkankowej pochodzące od Drosophila najlepiej rozwijają się w wyższych gęstościach komórek (gęstości nie mniejsze niż 5 x 105 komórek/ml). Jednak podczas wykonywania tego testu bardzo ważne jest, aby komórki nie były posiewane na naczyniach ze szklanym dnem pokrytych koncentrycznym A powyżej 80% konfluencji, ponieważ kwantyfikacja komórek skurczonych i nieskurczonych stanie się niezwykle żmudna.
Krytyczne aspekty i alternatywne podejścia do testu kurczliwości komórkowej: Produkcja Fog, ligandu, który wyzwala kurczliwość miozyny II poza mięśniami, jest kluczowym elementem tego testu. Gen mgły koduje białko składające się z 730 aminokwasów o przewidywanej masie cząsteczkowej ~78 kDa26. Analiza hydropatii ujawniła odcinek 12 hydrofobowych reszt na końcu aminowym Fog, które mogą funkcjonować jako sekwencja sygnału wydzielania. Ponadto sekwencja kodująca zawiera również wiele miejsc dla potencjalnej glikozylacji sprzężonej z N i O, co dodatkowo sugeruje, że Fog jest wydzielanym białkiem26. Na poparcie tego faktu Fog zlokalizowano w pęcherzykach wydzielniczych w przypuszczalnych komórkach naskórka ulegających zwężeniu wierzchołkowemu16. Ekspresja Fog-Myc została indukowana po dodaniu siarczanu miedzi do pożywki, a przeciwciała przeciwko Fog lub Myc rozpoznały białko 150 kD z pożywki hodowlanej zebranej z indukowanych kultur, ale nie z indukowanych pożywek z komórek S2 pozbawionych konstruktu Fog-Myc. Ta masa cząsteczkowa była wyższa niż przewidywana masa cząsteczkowa Fog wynosząca 80 kD i sugeruje, że maszyneria wydzielnicza komórek S2 może glikozylować białko przed egzocytozą. Ze względu na potencjalną zmienność w oczyszczaniu mgły, zaleca się stosowanie tej samej partii pożywek kondycjonowanych we mgle do wszystkich eksperymentów. Tworzenie dużych partii skoncentrowanych pożywek Fog-Myc pomoże w utrzymaniu spójności podczas wszystkich rund eksperymentów.
Powodzenie tego testu zależy również od pewnej identyfikacji komórek, które uległy zwężeniu. Podczas gdy zwężone komórki można obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, barwienia aktyny lub miozyny II bez mięśni, najbardziej niezawodnym sposobem identyfikacji i ilościowego określenia zwężonych komórek jest mikroskopia z kontrastem fazowym lub mikroskopia DIC. Dokładne zliczenia można uzyskać przy użyciu powiększenia 20X - 40X w większości standardowych mikroskopów świetlnych. Chociaż w zapisanym tutaj protokole użyto naczyń ze szklanym dnem, test można również przeprowadzić przy użyciu standardowych szkiełek nakrywkowych 1,5 szklanych pokrytych kon A. Dodanie mgły można przeprowadzić w 35 mm hodowli tkankowej na szkiełku nakrywkowym umieszczonym na parafolii, w celu ograniczenia ilości mgły używanej do każdego testu. Jakość utrwalenia jest krytycznym elementem testu, ponieważ źle utrwalone komórki mogą prowadzić do wyników fałszywie dodatnich. Stosowanie świeżego roztworu utrwalającego i upewnienie się, że komórki nigdy nie wysychają po utrwaleniu, doprowadzi do bardziej wiarygodnych wyników. Na koniec ważne jest, aby policzyć dużą liczbę komórek. Zazwyczaj tylko 30% - 50% komórek nieleczonych lub kontrolnych traktowanych RNAi zwęża się po perfuzji mgły. Istnieje jednak podstawowy poziom zwężenia, który występuje w komórkach S2R +, więc potrzebna jest duża liczba komórek, aby zapewnić, że jakakolwiek zmiana frakcji zwężonych komórek jest spowodowana leczeniem. Co więcej, wyczerpanie niektórych białek biorących udział w regulacji kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami może prowadzić do hiperkurczliwości, nawet przy braku Fog. Przedstawione tutaj dane pochodzą z ponad 3600 komórek, które zostały policzone w trzech kolejnych zabiegach RNAi przy użyciu tej samej partii pożywki kondycjonowanej mgłą.
Zastosowania testu kurczliwości komórkowej: Ten test kurczliwości, w połączeniu z metodami przesiewowymi RNAi, oferuje potężny system do badania sygnalizacji komórkowej, morfogenezy i kurczliwości komórek. Wcześniej był używany do identyfikacji jednego z dwóch koreceptorów mgły21. Ukierunkowane badanie przesiewowe 138 receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) jest zubożone przez RNAi w komórkach S2R +, a jego zdolność do reagowania na Fog została przetestowana zgodnie z opisem w przedstawionym tutaj protokole. Spośród 138 GPCR odkryto pojedynczy, wcześniej niescharakteryzowany gen, obecnie znany jako Mist. Dalsze badania nad funkcją mgły wykazały, że była ona nie tylko niezbędna do indukowanej mgłą kurczliwości komórkowej w komórkach S2R+, ale była również niezbędna do gastrulacji w rozwoju Drosophila21. Co więcej, test ten został wykorzystany do wykazania, że Ric-8, niekanoniczny GEF, jest również składnikiem szlaku sygnałowego mgły27. Seria eksperymentów z RNAi epistazy w połączeniu z testem kurczliwości wykazała, że Ric-8 oddziałuje z podjednostką Gα12/13 Cta i działa w celu zlokalizowania jej w komórce, co ma kluczowe znaczenie dla kurczliwości komórkowej wywołanej mgłą31.
Hodowla tkankowa Drosophila jest odpowiednia dla nowicjuszy, ponieważ komórki są łatwe do utrzymania w temperaturze pokojowej, nie wymagają CO2 ani buforowanej pożywki do hodowli komórkowych i są wytrzymałe, o ile utrzymywana jest odpowiednia gęstość hodowli komórek. Test kurczliwości komórkowej został z powodzeniem przeprowadzony przez sekcję laboratoryjną kursu biologii komórki na studiach licencjackich, gdzie studenci mieli niewielkie lub żadne doświadczenie z hodowlą komórek lub mikroskopią. Przedstawiony tutaj test kurczliwości komórkowej stanowi potężne, oparte na komórkach narzędzie, które można wykorzystać do odkrywania genów lub do badania szlaku sygnałowego mgły, pomagając nam lepiej zrozumieć procesy rozwojowe, takie jak zwężenie wierzchołkowe i kurczliwość miozyny II bez mięśni, w ogóle.

Badania embriogenezy przeprowadzone na modelowych organizmach genetycznych okazały się nieocenione dla naszego zrozumienia, w jaki sposób komórki są składane w tkanki. Badania nad Drosophila melanogaster, w szczególności, doprowadziły do identyfikacji kluczowych genów i zasad biologicznych, które kierują morfogenezą i rozwojem organizmów od zapłodnienia do dorosłości1,2,3. Równolegle do badań genetycznych prowadzonych na Drosophila, wyhodowane linie komórkowe pochodzące z tkanek muszek owocowych stały się również potężnym systemem do rozwiązywania szerokiego zakresu pytań molekularnych i biologicznych komórek4,5,6. Komórki hodowli tkankowej Drosophila mają minimalne wymagania dotyczące konserwacji, ponieważ są hodowane w temperaturze pokojowej i bez CO2 . W związku z tym są podatne na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i mają wysoki stopień podatności na hamowanie genów przez RNAi6,7. Wiele grup wykorzystało komórki hodowli tkankowej Drosophila jako narzędzie do odkrywania genów zaangażowanych w definiowanie kształtu komórki, dynamiki cytoszkieletu, żywotności, fagocytozy i szlaków transdukcji sygnału4,8,9,10,11. Stosowane jako model wraz z całym zwierzęciem, hodowane linie komórkowe Drosophila oferują zestaw bardzo uzupełniających się podejść, które przyspieszają identyfikację cząsteczek ważnych dla rozwoju i zapewniają ramy, w których można określić ich mechanistyczne role12. W tym miejscu opisujemy test oparty na komórkach w celu zbadania szlaków sygnałowych, które wywołują zwężenie wierzchołkowe za pośrednictwem szlaku złożonego gastrulacji (mgły)13,14. Ten oparty na komórkach test kurczliwości pozwala naukowcom zbadać zarówno szlak sygnałowy mgły, jak i mechanizmy molekularne, które regulują kurczliwość miozyny II poza mięśniami.
Gastrulacja wczesnego zarodka Drosophila była badana przez wiele lat jako model genetyczny dla morfogenezy nabłonka i komórkowego przejścia od tożsamości komórki nabłonkowej do mezenchymalnej. Jednym z kluczowych zdarzeń gastrulacji jest morfogeneza podzbioru komórek nabłonkowych wzdłuż embrionalnej brzusznej linii środkowej od kształtu kolumnowego do piramidalnego15,16,17,18. Ta prosta zmiana kształtu komórki powoduje internalizację przypuszczalnych komórek mezodermalnych i jest napędzana przez aktywność motoryczną miozyny II niemięśniowej zwężającej sieć aktyny16,19,20. Dziesięciolecia badań genetycznych zidentyfikowały molekularne składniki tego szlaku i umieściły je kolejno w następującej kolejności: 1) Mgła jest wydzielana z domeny wierzchołkowej komórek nabłonka w brzusznej linii środkowej; 2) Mgła wiąże się z koreceptorami sprzężonymi z białkiem G, Mgłą i Smogiem, i sygnalizuje przez heterotrimeryczny kompleks białka G zawierający podjednostkę Gα12/13 Concertina (Cta), która jest nadzorowana przez niekanoniczny GEF Ric-8; 3) Cta aktywuje czynnik wymiany nukleotydów guaniny, RhoGEF2, który z kolei aktywuje małe białko G Rho1; 4) Rho1 aktywuje kinazę Rho (Rok); 5) Rok aktywuje kurczliwość miozyny II niemięśniowej w domenie wierzchołkowej poprzez fosforylację regulatorowego łańcucha lekkiego (RLC), powodując w ten sposób zwężenie wierzchołkowe (Rysunek 1)15,21,22,23,24,25,26,27,28,29. Mutacje w kilku z tych składników zakłócają normalne gastrulowanie i inne ruchy morfogenetyczne, w tym tworzenie krążka skrzydłowego i gruczołów ślinowych, co wskazuje, że szlak ten jest używany na kilku etapach embriogenezy Drosophila30,31,32. Szlak mgły jest jednym z najlepiej przebadanych modeli kształtowania nabłonka i dostarczył ważnych informacji na temat tego, w jaki sposób morfogeneza na poziomie tkanki jest regulowana od transkrypcji genów do ruchów komórek sterowanych cytoszkieletem14,15,21.
Opracowaliśmy test kurczliwości oparty na komórkach, który podsumowuje wiele odpowiedzi komórkowych poniżej Mgły, które zaobserwowano u rozwijających się zarodków much17. Zaprojektowaliśmy stabilną linię komórkową S2, która wyraża mgłę znakowaną na jej C-końcu za pomocą myc pod kontrolą indukowalnego promotora metallotioniny, który można zebrać po dodaniu siarczanu miedzi (CuSO4) do pożywki. Gdy pożywka kondycjonowana mgłą jest nakładana ektopowo na komórki Receptorów S2+ (S2R+), które są podlinią komórek S2 wyróżniających się różnicową ekspresją receptorów, takich jak podjednostki Frizzled i integryny, komórki przechodzą reorganizację cytoszkieletu bardzo przypominającą zwężenie wierzchołkowe12,17,27,33. Zmiany te można zaobserwować za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, w której leczenie mgłą prowadzi do pojawienia się ciemnych fazowo zmarszczek wskazujących na promienisty wzrost kurczliwości miozyny II niemięśniowej, lub za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, w której leczenie mgłą prowadzi do powstania niemięśniowych pierścieni miozyny II w komórkach wyrażających RLC34 oznaczone EGFP. Pierścienie te zawierają fosforylowany przez miozynę regulatorowy łańcuch lekki (pRLC) widoczny za pomocą barwienia immunologicznego23,34,35. Ta reakcja wywołana mgłą wymagała Cta, RhoGEF2, Rho i Rok; w ten sposób, używając rekombinowanych komórek Fog-Myc i S2R+, ustaliliśmy sposób na zbadanie zwężenia wywołanego mgłą w systemie opartym na kulturze tkankowej24,25,34.

<table><tbody><tr><td>Komórki S2R+</td><td>Centrum Badań Genomicznych Drosophila&nbsp;</td>Linia hodowli komórkowych <td>150</td>, <td>wykazuje kurczliwość po potraktowaniu Fog</td></tr><tr><td>S2:Fog-myc cells</td><td>Drosophila Genomics Resorce Center&nbsp;</td>Linia hodowli komórkowych <td>218</td><td>, wytwarza Fog-myc pod promotorem pMT</td></tr><tr><td>S2R + : komórki Sqh-EGFP</td><td>Centrum Badań Drosophila Genomics&nbsp;</td><td>196</td><td>linia hodowli komórkowych, stabilnie wyraża Sqh (RLC miozyny II bez mięśni) oznaczona EGFP</td></tr><tr><td>Shield i Sang M3</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3652</td></tr><tr><td>Pożywka dla owadów SF900</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12658019</td><td>alternatywna pożywka dla komórek</td></tr><tr><td>Schneider' s pożywka dla owadów</td><td>Thermofisher Scientific 21720024</td><td></td><td>alternatywne podłoże do cięcia komórek</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermofisher Scientific</td><td>16000044</td><td>suplement na podłoża</td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicze (100X)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15240112</td><td>suplement na podłoża przeciwbakteryjne/przeciwfugalne</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>MP Biomedicals</td><td>150710</td><td>stosowany do powlekania naczyń i szkiełek nakrywkowych do adhezji komórkowej</td></tr><tr><td>Szklane płyty denne</td><td>Maktek</td><td>P35G-1.5-10</td><td>stosowany do oznaczania oraz do utrwalania i barwienia komórek</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>szklane Corning</td><td>2940-225</td><td>alternatywa dla naczyń ze szklanym dnem</td></tr><tr><td>Koncentratory białka</td><td>Millipore</td><td>UFC903008</td><td>30 000 odcięcia masy cząsteczkowej, używane do zagęszczania pożywek</td></tr><tr><td>25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 kolby do hodowli tkankowych</td><td>Genessee</td><td>25-204,25-206,25-208,25-210</td><td>służy do hodowli komórek</td></tr><tr><td>6-dołkowych i 12-dołkowych naczyń do hodowli tkankowych</td><td>Genessee</td><td>25-105, 25-106</td><td>służy do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne podłoże montażowe</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>do konserwacji utrwalonych komórek</td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>stosowany do mocowania komórek</td></tr><tr><td>Rury</td><td>EMS</td><td>19240</td><td>stosowane w buforze PEM dla komórki fiksacja</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Myc</td><td>Drosophila Hybirdoma Bank</td><td>cat# 9E10</td><td>używane do wykrywania Fog-Myc&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało PhosphoSerine-19</td><td>Cell Signaling</td><td>3671</td><td>przeciwciało przeciwko fosforylowanemu regulatorowemu łańcuchowi lekkiemu (RLC) seryna 19</td></tr><tr><td>488-falloidyna, 568-falloidyna</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A12379, A12380</td><td>do barwienia dla f-aktyny</td></tr><tr><td>Hawk-VT wielopunktowy skaningowy system konfokalny&nbsp;</td><td>VisiTech International</td><td></td><td>Używany do obrazowania żywych komórek S2R+:Sqh</td></tr><tr><td>Eclipse TE300 Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td></td><td>Używany do obrazowania żywych komórek S2R+:Sqh</td></tr></tbody></table>

test komórkowy do badania kurczliwości miozyny ii niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach s2r + drosophila

A Cell-based Assay to Investigate Non-muscle Myosin II Contractility via the Folded-gastrulation Signaling Pathway in Drosophila S2R+ Cells

Opracowaliśmy test oparty na komórkach z wykorzystaniem komórek Drosophila, który podsumowuje zwężenie wierzchołkowe zainicjowane przez fałdowaną gastrulację (Fog), wydzielany morfogen nabłonkowy. W tym teście Fog jest używany jako agonista do aktywacji Rho poprzez kaskadę sygnalizacyjną, która obejmuje receptor sprzężony z białkiem G (Mist), białko Gα12/13 (Concertina / Cta) i czynnik wymiany nukleotydów guaniny zawierający domenę PDZ (RhoGEF2). Sygnalizacja mgły powoduje szybką i dramatyczną reorganizację cytoszkieletu aktynowego w celu utworzenia kurczliwego sznurka torebki. Rozpuszczalna mgła jest zbierana ze stabilnej linii komórkowej i stosowana ektopowo do komórek S2R +, co prowadzi do zmian morfologicznych, takich jak zwężenie wierzchołkowe, proces obserwowany podczas procesów rozwojowych, takich jak gastrulacja. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, a przy użyciu RNAi może ułatwić identyfikację dodatkowych genów zaangażowanych w ten szlak.

Komórki S2 oraz S2:Fog-Myc hodowano do niemal pełnego stopnia zrastania w kolbach do hodowli tkankowej o powierzchni 150-cm2 i poddawano działaniu 25 - 75 µM CuSO4 przez okres 24 - 48 godzin w celu indukcji ekspresji Fog-Myc (Rysunek 2). Pobrano próbki z komórek S2 (Rysunek 2A) oraz komórek S2:Fog-Myc (Rysunek 2B), a produkcję Fog-Myc monitorowano za pomocą metody western blot. Zgodnie z przewidywaniami, nie wykryto Fog-Myc w pośrodkach pobranych z komórek S2 w żadnych warunkach. Jednakże wykryto Fog w pośrodkach pobranych ze stabilnej linii komórkowej S2:Fog-Myc już 24 godziny po indukcji 75 µM CuSO4. Komórki S2R+ przytwierdzono do szkiełek z dnem szklanym pokrytych kon-A, wykazując ekspresję regulatorowego łańcucha lekkiego (GFP-RLC) miozyny II niemięśniowej z etykietą EGFP (Rysunki 3A i 3B). Obrazowanie żywych komórek przeprowadzono przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 10X/1,4 NA podczas perfuzji pośrodka warunkowanego białkiem Fog. Około 5 minut po podaniu Fog-Myc, RLC tworzyły pierścienie świadczące o skurczu miozyny II niemięśniowej. Pierścienie te można zaobserwować poprzez immunobarwienie komórek S2R+ przeciwciałem skierowanym przeciwko syntetycznemu fosfopeptydowi odpowiadającemu resztom otaczającym Ser19 ludzkiego RLC miozyny (Rysunki 4A i 4B). Przeciwciało to wykazuje reaktywność krzyżową z RLC Drosophila.
Poniżej przedstawiono reprezentatywny przykład analizy kurczliwości komórkowej po 7-dniowej inkubacji komórek z kontrolnym RNAi oraz dsRNA przeciwko Rho1 (Rycina 5A - 5E). Komórki S2R+ wysiano na szalki z szklanym dnem pokryte konkanawalną A (con-A) i poddano działaniu pożywki warunkowanej przez Fog (+Fog) lub pożywki kontrolnej (-Fog). Następnie, po utrwaleniu, określono liczbę skurczonych komórek. Gęste w fazie fałdy świadczące o konstrikcji były wyraźnie widoczne w komórkach z kontrolnym wyciszeniem traktowanych pożywką warunkowaną przez Fog (Rycina 5B). Na Rycynie 5C komórki z wyciszonym Rho traktowane pożywką warunkowaną przez S2 stanowią typowy przykład morfologii z gładkimi krawędziami, przypominającej „smażone jajko”. Należy zauważyć, że Rho odgrywa rolę zarówno w szlaku sygnalizacyjnym Fog, jak i w cytokinezie; w związku z tym komórki z wyciszonym Rho często nie dzielą się prawidłowo, co prowadzi do zwiększenia rozmiaru komórek i ploidalności. Traktowanie komórek z kontrolnym wyciszeniem pożywką warunkowaną przez Fog zazwyczaj prowadzi do konstrikcji u 30% - 50% komórek, podczas gdy w komórkach z wyciszonym Rho nie zaobserwowano istotnej konstrikcji.
<img alt="Schemat transdukcji sygnału, obecność względem braku Fog, obejmuje aktywację RhoGEF2, Rok i NMII." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1:Domniemany szlak sygnalizacyjny Fog. Wobec braku Fog, białko Gα12/13 podjednostka Concertina (Cta), wraz z jej partnerami wiążącymi Gϒ i Gβ, pozostaje nieaktywna i jest związana z koreceptorami Mist i Smog. Białko Ric-8 pełni rolę chaperonu dla Cta i reguluje jego lokalizację wewnątrzkomórkową. Po związaniu Fog, Cta dysocjuje od Gϒ, a Gβ rekrutuje RhoGEF2 do błony komórkowej, gdzie katalizuje ono wymianę GDP na GTP w małej GTPazie Rho1. Rho1 związana z GTP, obecnie aktywna, aktywuje kinazę Rho (Rok), która fosforyluje lekki łańcuch regulacyjny (RLC) miozyny niemięśniowej, prowadząc do jej aktywacji i w konsekwencji do kurczliwości komórkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza Western blot ekspresji αMyc po traktowaniu CuSO₄, z porównaniem pośrodków S2 oraz Fog-myc." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Krzywa czasowa produkcji Fog-Myc. Panele te przedstawiają pożywkę hodowlaną pobraną z kolby z niemal 10% konfluencją (A) kontrolne komórki S2 lub (B) S2:stabilne komórki Fog-Myc. Komórki poddano działaniu 25 - 75 µM CuSO₄4 przez okres od 24 do 48 godzin. Pożywkę hodowli komórkowej zebrano i przygotowano do elektroforezy SDS-PAGE oraz analizy western blot. Białko Fog-Myc wykryto za pomocą przeciwciała anty-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat time-lapse struktury komórkowej; fluorescencja RLC-EGFP; dynamika lokalizacji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3Obrazowanie żywych komórek w procesie zwężenia indukowanego przez Fog. Stabilne linie komórkowe S2R+ wykazujące ekspresję RLC miozyny II niemięśniowej z tagiem EGFP obrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii przeskanowanej (swept-field confocal microscopy) podczas perfuzji pożywki warunkowanej komórkami Fog. Czas podano w minutach i sekundach.A) Na tym panelu przedstawiono obraz płaszczyzny ogniskowej znajdującej się blisko styku komórki z szkiełkiem podstawnym w czasie 0:0, przed perfuzją Fog-Myc. (BTen panel przedstawia serię czasową (0:30 – 10:0) obrazów wykonanych w płaszczyźnie ogniskowej w pobliżu górnej części komórki. Białe strzałki wskazują reorganizację nie mięśniowej miozyny II (oznaczonej EGFP-RLC) w pierścienie kurczliwe podczas przewężenia. Pasek skali wynosi 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający barwienie aktyny, pRLC i DNA w próbkach komórkowych, porównanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4Fosforylowana RLC lokalizuje się w pierścieniach kurczliwych po indukowaniu skurczu przez Fog-Myc. Komórki S2R+ utrwalono i wybarwiono w celu wykrycia aktyny przy użyciu faloidyny (czerwony), fosforylowanej RLC przy użyciu przeciwciała przeciwko fosforylowej serynie-19 (zielony) oraz DAPI (DNA, niebieski), po zastosowaniuA) kontrolna lub (B) Pożywka warunkowana Fog-Myc. Zauważ reorganizację fosforylowanego RLC w pierścienie po dodaniu Fog-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Kurczliwość komórek, test RNAi Rho, obrazy mikroskopowe, efekt pożywki fog, wykres frakcji skurczu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58325/58325fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5Reprezentatywna analiza ilościowa testu kurczliwości komórkowej indukowanej przez Fog. Komórki S2R+ poddano działaniu (A i B) kontrolne RNAi lub (C i D) dsRNA przeciwko małej GTPazie Rho1 przez 7 dni. Po tym czasie komórki wysiano na szalki z szklanym dnem pokryte kon-A i poddano działaniu (A i C) pożywka kontrolna lub (B i D) Pośrodki warunkujące Fog-Myc. Pasek skali reprezentuje 10 µm. (E) Wykres punktowy przedstawia średnią oraz 95-procentowe przedziały ufności dla frakcji skurczonych komórek w zależności od warunków. Poszczególne punkty reprezentują frakcję skurczonych komórek w jednym polu widzenia przy powiększeniu 40X (10–120 komórek na pole), a liczby w nawiasach wskazują całkowitą liczbę policzonych komórek (zarówno skurczonych, jak i nieskurczonych) w trzech oddzielnych eksperymentach RNAi. Gwiazdkami oznaczono różnicę statystycznie istotną między warunkami z zastosowaniem RNAi a warunkami z zastosowaniem Fog, wyznaczoną za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (p &lt; 0,01) przy użyciu testu wielokrotnych porównań Tukeya post hoc analiza. Należy zauważyć, że nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy (n.s.) pomiędzy próbkami poddanymi RNAi Rho1 traktowanymi kontrolą a próbkami traktowanymi pożywką warunkowaną komórkami Fog-Myc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58325/58325fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>

Tutaj opisujemy test kurczliwości z użyciem komórek Drosophila S2R+. Zastosowanie egzogennego liganda, gastrulacji fałdowej (Mgła), prowadzi do aktywacji szlaku sygnałowego Mgły i kurczliwości komórek. Test ten można wykorzystać do zbadania regulacji białek kurczliwości komórkowej w szlaku sygnałowym mgły.

Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila

We have developed a cell-based assay using Drosophila cells that recapitulates apical constriction initiated by folded gastrulation (Fog), a secreted ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórkowej i rozwojowej, takie jak to, które białka są zaangażowane w regulację kurczliwości miozyny II poza mięśniami i które białka są kluczowe w szlaku gastrulacji fałdowej lub sygnalizacji mgły. Główną zaletą tej techniki jest to, że w połączeniu ze zubożeniem RNEI, test kurczliwości komórkowej może być stosowany jako narzędzie do odkrywania genów dla białek zaangażowanych w sygnalizację mgły i kurczliwość miozyny II poza mięśniami. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku naszego podstawowego zrozumienia rozwoju.Kurczliwość miozyny II niezwiązanej z mięśniami ma uniwersalne znaczenie dla zmiany kształtu komórki lub morfogenezy, która zachodzi podczas rozwoju. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w rozwój drosophila, może być również stosowana do innych systemów, ponieważ ma kluczowe znaczenie dla całego szeregu innych funkcji komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ uzyskanie prawidłowej gęstości komórek i rozpoznanie różnicy między komórkami skurczonymi i nieskurczonymi może być trudne.Na początek pokryj szklaną część 35-milimetrowych naczyń ze szklanym dnem 200 mikrolitrami roztworu con-A. Inkubować szalki przez około dwie minuty w temperaturze pokojowej w kapturze do hodowli tkankowych. Następnie usuń roztwór con-A i pozostaw naczynia do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.Dodaj około dwóch mililitrów świeżej pożywki do hodowli komórkowych do każdego z naczyń ze szklanym dnem. Następnie ponownie zawiesić komórki S2R+, pipetując pożywkę do hodowli komórkowej w górę iw dół. Przenieś ponownie zawieszone komórki S2R+ do przygotowanych naczyń ze szklanym dnem.Następnie sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem kultur tkankowych, skupiając się w górę iw dół na wielu płaszczyznach komórek. Ustalenie początkowej gęstości komórek ma kluczowe znaczenie. Zbyt mała liczba komórek utrudni określenie ilościowe, a zbyt wiele komórek sprawi, że kwantyfikacja będzie żmudna.Użyj mikroskopu, aby ustawić ostrość w górę iw dół naczynia, aby oszacować liczbę komórek. Następnie pozwól komórkom przyłączyć się do naczyń ze szklanym dnem pokrytych konwektorem A przez 45 do 60 minut. Najpierw delikatnie odpipetuj pipetą, aby usunąć całą pożywkę do hodowli komórkowych z dołączonych komórek S2R+.Następnie ostrożnie dodaj z powrotem 75 mikrolitrów świeżej pożywki. Następnie dodaj 75 mikrolitrów pożywki kondycjonowanej we mgle do szklanej części naczynia. Za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy 20-krotnym lub 40-krotnym powiększeniu monitoruj kurczliwość całego pola komórek.Śledź morfologię komórek pod kątem naprzemiennego wzorca fazowego ciemnego i jasnego marszczenia, charakterystycznego dla zmiany kształtu. Prawidłowa identyfikacja komórek ulegających skurczowi może być trudna za pierwszym razem. W miarę kurczenia się komórek tworzą się ciemne i jasne falbanki, które sprawiają, że komórka wygląda jak gwiazda.Napraw komórki S2R + za pomocą 10% roztworu paraformaldehydu. Następnie pipetą, aby usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z komórek S2R + poddanych działaniu mgły i zastąpić ją 1,5 do dwóch mililitrów roztworu paraformaldehydu. Inkubować zarówno komórki S2R+, jak i komórki S2R poddane działaniu mgły przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie użyj pipety, aby usunąć roztwór paraformaldehydu i odpowiednio zutylizuj odpady. Następnie trzykrotnie przepłucz komórki PBS, aby usunąć resztki roztworu utrwalającego. Zablokuj komórki 200 mikrolitrami 5% normalnej surowicy koziej w PBS uzupełnionym 0,1% PBST przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Następnie rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w PBST, używając objętości około 200 mikrolitrów, aby całkowicie pokryć szklaną część naczynia. Użyj pipety, aby usunąć roztwór blokujący i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała bezpośrednio do szklanej części naczynia. Następnie inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie użyj pipety, aby usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i trzykrotnie przepłukać komórki świeżym PBS. Aby przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, należy rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w PBST. Następnie dodaj wtórny roztwór przeciwciał bezpośrednio do szklanej części naczynia.Inkubuj naczynie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie za pomocą pipety usuń wtórny roztwór przeciwciał i trzykrotnie przepłucz komórki świeżym PBS. Następnie dodaj wystarczającą ilość fluorescencyjnego medium montażowego zapobiegającego blaknięciu, aby pokryć szklaną część naczynia.Próbki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza z dala od światła. Najpierw użyj 20-krotnego lub 40-krotnego powiększenia, aby uchwycić od 10 do 30 nienakładających się na siebie pól obrazu nieruchomych komórek. Na koniec użyj standardowego licznika komórek, aby policzyć i zarejestrować liczbę zakontraktowanych i niezakontraktowanych komórek w każdym z przechwyconych pól.Korzystając z tego protokołu, komórki S2 i S2 fog-myc hodowano i traktowano siarczanem miedzi w celu wywołania ekspresji fog-myc. Nic dziwnego, że mgła-myc nie została wykryta w komórkach S2 w żadnych warunkach. Jednak mgłę wykryto w pożywkach pobranych z linii komórkowej S2 mgła-myc-stabilna już 24 godziny po indukcji siarczanem miedzi.Około pięć minut po leczeniu fog-myc, RLC utworzył pierścienie wskazujące na zwężenie miozyny-II poza mięśniami. W reprezentatywnym teście kurczliwości komórkowej zmarszczki o gęstej fazie wskazujące na zwężenie były widoczne w komórkach zubożonych w kontrolę, potraktowanych pożywką kondycjonowaną mgłą. Komórki zubożone w rho potraktowane pożywką kondycjonowaną S2 wykazywały typową morfologię przypominającą jajko sadzone o gładkich krawędziach.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o czasie i ważnej jest fiksacja jakości. Po 10 minutach komórki zaczynają się rozluźniać, więc komórki powinny zostać naprawione przed tym czasem. Złe warunki fiksacji mogą prowadzić do wyników fałszywie dodatnich.Korzystając z tego testu, naukowcy zidentyfikowali mgłę, jeden z dwóch koreceptorów mgły. Test ten został również wykorzystany do lepszego zrozumienia roli rigatu podczas sygnalizacji mgłowej.

a-cell-based-assay-to-investigate-non-muscle-myosin-ii-contractility

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Tutaj opisujemy procedurę przechwytywania na żywo obrazów gastrulacji Drosophila. Umożliwiło nam to lepsze zrozumienie zwężenia wierzchołkowego związanego z wczesnym rozwojem i dalszą analizę mechanizmów rządzących ruchami komórek podczas modyfikacji struktury tkanki.

Obrazowanie zmiany kształtu komórki i ruchu komórek w gastrulacji Drosophila przy użyciu transgenicznych much reporterowych DE-kadheryny

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj prezentujemy łatwą w użyciu i wszechstronną metodę do wykonywania na żywo obrazowania procesów rozwojowych w ogóle, a morfogenezy mięśniowo-ścięgnistej w szczególności u żyjących poczwarek Drosophila.

In vivo (in vivo) Obrazowanie morfogenezy mięśniowo-ścięgnistej u poczwarek Drosophila

Ten protokół zapewnia opartą na Fidżi, przyjazną dla użytkownika metodologię wraz z prostymi instrukcjami wyjaśniającymi, jak niezawodnie analizować zachowanie aktomiozyny w pojedynczych komórkach i zakrzywionych tkankach nabłonkowych. Do korzystania z samouczka nie są wymagane żadne umiejętności programowania; wszystkie kroki są wykonywane w sposób półinteraktywny przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika Fiji i powiązanych wtyczek.

Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila

Tutaj prezentujemy metodę rejestrowania skurczów mięśni embrionalnych w zarodkach Drosophila w sposób nieinwazyjny i zorientowany na szczegóły.

Obrazowanie i analiza na żywo skurczów mięśni w zarodku Drosophila

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Poznaj test komórkowy badający kurczliwość miozyny II niezwiązanej z mięśniami w komórkach S2R+ Drosophila poprzez szlak sygnałowy Fog. Ta metoda umożliwia odkrywanie genów białek regulujących kurczliwość komórkową.

Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila

Przeglądaj więcej filmów