Name: Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Poznaj metodę dostarczania genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy przy użyciu laserowej perforacji strefy pellucidy. Technika umożliwia szybkie tworzenie modeli transgenicznych bez zaawansowanych umiejętności mikromanipulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH), Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (NIEHS). Jesteśmy wdzięczni dr Robertowi Petrovichowi i dr Jasonowi Williamsowi za krytyczną lekturę manuskryptu i pomocne rady. Chcielibyśmy również wyrazić uznanie i podziękować dr Berndowi Glossowi, rdzeniowi Knockout, Zakładowi Cytometrii Przepływowej, Centrum Mikroskopii i Obrazowania Fluorescencji oraz obiektom Oddziału Medycyny Porównawczej NIEHS za ich wkład techniczny. Chcielibyśmy podziękować Panu Davidowi Gouldingowi z Oddziału Medycyny Porównawczej oraz Pani Lois Wyrick z Centrum Obrazowania w NIEHS za udostępnienie nam zdjęć i ilustracji.

Wszystkie procedury i zabiegi na zwierzętach stosowane w tym protokole były zgodne z wytycznymi NIH/NIEHS dotyczącymi opieki nad zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (ACUC) przy NIH/NIEHS, Protokół dla zwierząt 2010-0004.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotuj/kup rekombinowane, nierozmnażające się lentiwirusy przenoszące interesujący Cię gen. W tym badaniu do transdukcji wykorzystano lentiwirus SBI511 wyrażający białko zielonej fluorescencji widłonoga (copGFP; w skrócie GFP) z promotora czynnika elongacji 1a. Standardowe protokoły2 zostały użyte do produkcji i mianowania lentiwirusów przy mianach wyższych niż 1e8 jednostek transdukcyjnych na ml (TU/mL). 
	UWAGA: Zachowaj ostrożność i wybielaj wszystkie materiały, które miały kontakt z lentiwirusami. Zapoznaj się z wytycznymi swojego instytutu dotyczącymi bezpiecznego stosowania i obchodzenia się z lentiwirusami.</li>
	<li>Ustaw pary hodowlane pożądanego szczepu myszy na dzień przed zbiorem zarodków. W tym eksperymencie wykorzystano szczep myszy C57BL/6J. Samice myszy wykorzystywane do pobierania jajników i jajowodów nie były leczone żadnymi hormonami do superowulacji.</li>
	<li>2–24 godziny przed zbiorem jaj zapłodnionych myszami przygotuj kilka płytek Potassium Simplex Optimized Medium24 (KSOM) w następujący sposób: dodać 50 μl kropli pożywki KSOM do środka naczynia poddanego hodowli tkankowej o średnicy 35 mm i zalać 2 ml dimetylopolisiloksanu (DMPS5X) i umieścić w temperaturze 37 oC, 5% CO2, 5% O2 i 90% N2 do równowagi. 
	UWAGA: Używaj jednorazowych sterylnych płytek i wyrzuć po ekspozycji na lentiwirusy.</li>
	<li>Przygotować 1x roztwór hialuronidazy w pożywce M2 z roztworu podstawowego (100x, 30 mg/ml, przechowywać w temperaturze -20 °C). 100x roztwór podstawowy przygotowywano w wodzie.</li>
	<li>24 godziny po wspomaganej laserowo transdukcji zapłodnionych jaj myszy, ustaw pary hodowlane między samcami i samicami myszy poddanych wazektomii, aby przygotować samice myszy w ciąży rzekomej.</li>
</ol>
2. Izolacja jaj zapłodnionych przez myszy
<ol>
	<li>16–24 godziny po kryciu, wybierz samice myszy z czopami dopochwowymi wskazującymi na udane krycie i humanitarnie poddaj je eutanazji25. Myszy wykorzystane w tym badaniu zostały poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy pod wpływem głębokiego wdychania CO2 lub izofluranu.</li>
	<li>Izoluj jajniki i jajowody zgodnie ze standardowymi protokołami25.</li>
	<li>Przenieś jajniki i jajowody do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego pożywkę M2.</li>
	<li>Dla każdego jajnika rozerwij bańkę, aby uwolnić zapłodnione jaja otoczone komórkami wzgórka.</li>
	<li>Przenieś zapłodnione jaja i komórki wzgórka do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego 1x hialuronidazę w pożywce M2 i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut.</li>
	<li>Pipetuj zapłodnione jaja w górę iw dół, aby uwolnić komórki wzgórka.</li>
	<li>Przenieś zapłodnione jaja do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego pożywkę M2 i pipetuj w górę iw dół, aby zmyć hialuronidazę.</li>
	<li>Przenieś zapłodnione jaja do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego KSOM i pipetuj w górę iw dół, aby zmyć pozostałą pożywkę M2 i hialuronidazę.</li>
	<li>Przenieś zapłodnione jaja na przygotowane płytki wkroplowe KSOM z kroku 1.3. 
	UWAGA: Jaja zapłodnione myszami w KSOM muszą być trzymane w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 5% O2 i 90% N2 w celu zrównoważenia. Wyjmowanie płytek z inkubatora na dłużej niż 15 minut spowoduje uszkodzenie zarodków.</li>
	<li>Pozwól zapłodnionym jajom zregenerować się przez 2 godziny w inkubatorze przed przejściem do następnego kroku.</li>
</ol>
3. Perforacja jaj zapłodnionych myszami za pomocą lasera XYClone
<ol>
	<li>Ustaw i skalibruj laser XYClone zgodnie z zaleceniami producenta. Inne lasery, zwykle używane do zapłodnienia in vitro, mogą być zastąpione laserem XYClone do perforacji zapłodnionych jaj.
	<ol>
		<li>Podłącz przewód skrzynki kontrolera lasera do aparatu laserowego w mikroskopie.</li>
		<li>Podłącz skrzynkę kontrolera lasera do komputera, na którym działa oprogramowanie lasera, przez port USB. 3.1.3. Podłącz kontroler lasera i włącz go.</li>
		<li>Patrząc przez okular, należy przebić próbkę testową (np. oznaczenia suchościeralne na szkiełku podstawowym).</li>
		<li>Użyj małego śrubokręta (dołączonego do zestawu laserowego), aby wyregulować pozycję X i Y lasera tak, aby pasowała do światła LED widocznego przez okular mikroskopu i skalibruj laser.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść płytkę KSOM zawierającą zapłodnione myszami jaja na stoliku mikroskopowym. Nie należy trzymać płytki poza inkubatorem dłużej niż 15 minut.</li>
	<li>Spójrz przez okular mikroskopu i upewnij się, że osłonka przejrzysta zarodka jest ostra, a światło lasera LED jest widoczne.</li>
	<li>Przesuń stolik mikroskopu, aby wycelować w strefę za pomocą światła/lasera LED.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania komputerowego ustaw laser XYClone na 250 μs.</li>
	<li>Dostosuj rozmiar światła LED do żądanych wymiarów (ustawienie 5 w tym eksperymencie).</li>
	<li>Trzykrotnie przedziurawij strefę każdego zapłodnionego jaja za pomocą lasera. Zona może być przekłuta lub przerzedzona. Korzystając z powyższych ustawień, laser wykona otwór o średnicy 10 μm (<klasa silna="xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Celowanie blisko ciała biegunowego utrzymuje laser z dala od komórki embrionalnej.</li>
	<li>Pozwól zapłodnionym jajom zregenerować się przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych przed przejściem do następnego etapu.</li>
</ol>
4. Transdukcja zapłodnionych jaj myszy po perforacji lasera XYClone
<ol>
	<li>Odmierzyć pipetą 2 μl stężonego lentiwirusa (miano większe niż 1e8 j./ml) do kropli KSOM o objętości 50 μl. Nie pipetować w górę i w dół. Zapłodnione jaja łatwo przyczepiają się do końcówki pipety. Z naszego doświadczenia wynika, że jednostki transdukcyjne 1e5-5e5 lentiwirusa w objętości mniejszej niż 3 μl są optymalne do dostarczania genów.</li>
	<li>Pozwól, aby zapłodnione jaja rozwinęły się w blastocystę przez 4 dni w inkubatorze. Nie ma potrzeby wymiany nośnika.</li>
</ol>
5. Niechirurgiczny transfer transdukowanych embrionów myszy do myszy pseudo-ciężarnych
<ol>
	<li>Użyj myszy w ciąży rzekomej, 3,5 dnia po kryciu, przygotowanych w kroku 1.5.</li>
	<li>Użyj urządzenia do niechirurgicznego transferu zarodków (NSET), aby wszczepić zarodki myszy myszom w ciąży rzekomej.
	<ol>
		<li>Za pomocą mikroskopu chirurgicznego lub preparacyjnego włóż wziernik dopochwowy, aby uwidocznić szyjkę macicy.</li>
		<li>Wprowadzić urządzenie do niechirurgicznego transferu zarodków (NSET) około 5 mm do szyjki macicy i zdeponować zarodki w objętości około 2 μl. 
		UWAGA: Do każdego transferu używane jest sterylne urządzenie NSET, które po zabiegu jest wyrzucane. Wszystkie odczynniki używane do manipulowania zarodkami muszą być sterylne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś 10-15 zdrowych blastocyst w objętości 2 μl KSOM do każdej myszy w ciąży rzekomej.</li>
	<li>Kontynuuj monitorowanie i pomiar przyrostu masy ciała u myszy w ciąży rzekomej w kolejnych dniach, aby ustalić, czy NSET był skuteczny.</li>
	<li>Odzyskaj młode, pozwalając ciężarnym myszom urodzić naturalnie lub wykonując cesarskie cięcie 17 dni po transferze zarodków26. Cesarskie cięcie jest często konieczne, jeśli obecnych jest bardzo mało zarodków i rosną one zbyt duże, aby można je było urodzić naturalnie.</li>
	<li>Zbierz tkankę od szczeniąt do genotypowania, aby określić szybkość transgenezy27.</li>
</ol>

<ol><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+basic+to+translational%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Filipiak, W. E., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+transgenic+rat+production%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Advances in transgenic rat production.</a> Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).</li>
<li>McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+conservation+between+rodents+and+chicken+of+regulatory+sequences+driving+skeletal+muscle+gene+expression+in+transgenic+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens.</a> BMC Developmental Biology. 10, 26(2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+pigs+mediated+by+pseudotyped+lentivirus+and+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm.</a> PLoS One. 7 (4), e35335(2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+quail+production+by+microinjection+of+lentiviral+vector+into+the+early+embryo+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels.</a> PLoS One. 7 (12), e50817(2012).</li>
<li>Wassarman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zona+pellucida+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annul+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Zona pellucida glycoproteins.</a> Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).</li>
<li>Clift, D., Schuh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restarting+life%3A+fertilization+and+the+transition+from+meiosis+to+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).</li>
<li>Fong, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocyst+transfer+after+enzymatic+treatment+of+the+zona+pellucida%3A+improving+in-vitro+fertilization+and+understanding+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation.</a> Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).</li>
<li>Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+different+isolation+procedures+for+blastomeres+from+two-cell+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos.</a> Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).</li>
<li>Ribas, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+zona+pellucida+removal+on+DNA+methylation+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos.</a> Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Scientific Reports. 4, 6382(2014).</li>
<li>Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoporation+of+biomolecules+into+single+cells+in+living+vertebrate+embryos+induced+by+a+femtosecond+laser+amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier.</a> PLoS One. 6 (11), e27677(2011).</li>
<li>Horii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+microinjection+methods+for+generating+knockout+mice+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Scientific Reports. 4, 4513(2014).</li>
<li>Hamra, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+rats+by+lentiviral+transduction+of+male+germ-line+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).</li>
<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+rats+via+lentiviral+transduction+and+xenogeneic+transplantation+of+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).</li>
<li>Dann, C. T., Garbers, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+knockdown+rats+by+lentiviral+transduction+of+embryos+with+short+hairpin+RNA+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes.</a> Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).</li>
<li>Chandrashekran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgenic+mice+by+lentivirus-mediated+modification+of+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa.</a> FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).</li>
<li>Woods, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+in+vitro+fertilization+facilitates+fertilization+of+vitrified-warmed+C57BL%2F6+mouse+oocytes+with+fresh+and+frozen-thawed+spermatozoa%2C+producing+live+pups%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups.</a> PLoS One. 9 (3), e91892(2014).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 20(2006).</li>
<li>Martin, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+masse+lentiviral+gene+delivery+to+mouse+fertilized+eggs+via+laser+perforation+of+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida.</a> Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).</li>
<li>Lawitts, J. A., Biggers, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Culture of preimplantation embryos.</a> Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caesarean+section+and+fostering%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Caesarean section and fostering.</a> CSH Protocols. 2006 (2), (2006).</li>
<li>Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+of+plant+and+animal+samples+without+prior+DNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Bin Ali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+pregnancy+and+birth+rates+with+routine+application+of+nonsurgical+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer.</a> Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).</li>
<li>Liu, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrase-deficient+lentivirus%3A+opportunities+and+challenges+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdolność lentiwirusów do integracji z genomem gospodarza sprawia, że są one idealnym wektorem do stabilnego dostarczania genów. Wektory lentiwirusowe mogą przenosić do 8,5 kilopary zasad (kbp) materiału genetycznego, który może pomieścić specyficzne dla komórki lub indukowalne promotory, markery selekcyjne lub ugrupowania fluorescencyjne. Włączony materiał genomowy może replikować się jako część genomu gospodarza i być regulowany w celu ekspresji lub dezaktywacji w pożądanych punktach czasowych. Wektory te pozwalają na c...

Ta metoda dostarcza szczegółowych instrukcji dotyczących przepuszczalności osłonki przezroczystej zapłodnionych jaj myszy, aby umożliwić komórkom embrionalnym dostarczenie genów przez lentiwirusy. Lentiwirusy zostały zaprojektowane przez naturę z myślą o efektywnym dostarczaniu genów do komórek ssaków. Infekują one dzielące się i niedzielące się komórki i integrują genom lentiwirusa z chromosomami gospodarza1. Zakres komórek gospodarza lentiwirusa można łatwo rozszerzyć poprzez pseudotypowanie rekombinowanego lentiwirusa z glikoproteiną wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G), ze względu na szeroki tropizm białka VSV-G2. Po transdukcji geny lentiwirusowe są stabilnie integrowane i ulegają ekspresji jako część chromosomów gospodarza, tworząc idealne narzędzie do generowania zwierząt transgenicznych. Po dostarczeniu do komórek embrionalnych we wczesnym stadium genom lentiwirusa ulega replikacji i ekspresji w całym organizmie. Transdukcja lentiwirusowa doprowadziła do produkcji myszy, szczurów, kurczaków, przepiórek i świń3,4,5,6,7 wśród innych gatunków transgenicznych. Typowa metoda dostarczania genów lentiwirusowych wymaga jednak wykwalifikowanych techników i specjalistycznego sprzętu, aby pokonać barierę osłonki przejrzystej, która otacza zarodki we wczesnym stadium rozwoju. Ogólnym celem tej metody jest opisanie sposobu przepuszczalności strefy za pomocą lasera w celu ułatwienia dostarczania genów lentiwirusowych.
Jaja ssaków są otoczone przezroczystą osłoną, która twardnieje po zapłodnieniu, aby chronić zapłodnione jaja przed polispermią i ograniczyć interakcje środowiskowe8,9. Zona tworzy barierę, która utrzymuje lentiwirusy z dala od komórek embrionalnych, dopóki zarodki nie wyklują się jako blastocysta. Wyhodowane jaja zapłodnione myszami wykluwają się po 4 dniach i muszą zostać wszczepione myszom w ciąży przed wykluciem, aby zapewnić normalny rozwój w młode. Dlatego w celu transdukcji lentiwirusy są mikrowstrzykiwane przed wykluciem się z strefy do jamy periviteliny, przestrzeni między strefą a komórkami embrionalnymi.
Osłona przejrzysta jest często usuwana do zapłodnienia in vitro ludzkich jajeczek, aby zwiększyć szybkość zapłodnienia10. Jednak chemiczne usunięcie mysiej osłony przejrzystej niekorzystnie wpływa na rozwój zarodków myszy i jest szkodliwe dla komórek embrionalnych11,12. Inne metody dostarczania genów do zapłodnionych jaj myszy pokonują barierę osłonki przejrzystej poprzez bezpośrednią mikroiniekcję DNA do jądra komórkowego13. Mikroiniekcja przedjądrowa jest skutecznym sposobem dostarczania genów do zarodków. Ponieważ jednak każdy zarodek jest utrzymywany indywidualnie do mikroiniekcji, praktyka ta może być pracochłonna i czasochłonna dla początkującego użytkownika.
Inne metody, takie jak elektroporacja i fotoporacja, są przydatne do przejściowego i krótkoterminowego dostarczania genów do zapłodnionych jaj myszy14,15,16. Metody te są szeroko stosowane do dostarczania komponentów i rekombinaz CRISPR-Cas9. Jednak elektroporacja i fotoporacja dostarczania genów nie mogą być efektywnie wykorzystane do tworzenia transgeników. Plemniki, które są pobierane z nakłutego najądrza myszy, mogą być również transdukowane przez lentiwirusy i wykorzystywane do zapłodnienia in vitro w celu wytworzenia transgenicznych zwierząt17,18,19,20.
W tym protokole, dostarczanie genu lentiwirusowego do embrionów myszy jest ułatwione przez przenikanie strefy za pomocą lasera. Laser XYClone został opracowany jako pomoc w zapłodnieniu in vitro21 i hodowli embrionalnych komórek macierzystych22. Jest to małe urządzenie, które jest proste w konfiguracji i łatwe w użyciu. Po zainstalowaniu w mikroskopie zajmuje on miejsce soczewki obiektywu, a dołączone oprogramowanie pozwala na celowanie laserem podczas patrzenia przez okulary mikroskopu (patrz Protokół: rozdział 3). Po perforacji zony przez laser XYClone, lentiwirusy mogą zostać wprowadzone do pożywki hodowlanej w celu dostarczenia genów23. Wiele lentiwirusów może być wykorzystywanych do jednoczesnego dostarczania kilku genów do inkorporacji chromosomalnej.
Ten protokół opisuje, jak izolować i hodować zapłodnione jaja myszy, ilustruje użycie lasera do perforacji osłonki przejrzystej i demonstruje transdukcję komórek embrionalnych myszy przez lentiwirusy.

<table><tbody><tr><td>Plazmid CD510B-1</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>używany do pakowania lentiwirusa eksprymującego EF1a-copGFP</td></tr><tr><td>Dimetylopolisiloksan</td><td>Sigma</td><td>DMPS5X</td><td>hodowla zarodków</td></tr><tr><td>hialuronidaza</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td>używana do usuwania komórek wzgórka</td></tr><tr><td>XYClone Laser</td><td>Hamilton Thorne Biosciences</td><td></td><td>perforacja zapłodnionych jaj myszy</td></tr><tr><td>Niechirurgiczne urządzenie do transferu zarodków (NSET)</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>NSET zarodków</td></tr><tr><td>KSOM medium</td><td>Millipore</td><td>MR-020P-5F</td><td>hodowla zarodków</td></tr><tr><td>Skład KSOM:</td><td></td><td></td><td>mg/100mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>555</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>18,5</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>4.75</td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td></td><td></td><td>4.95</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td></td><td></td><td>25</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td></td><td>210</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td></td><td></td><td>3.6</td></tr><tr><td>Na-pirogronian</td><td></td><td></td><td>2,2</td></tr><tr><td>DL-kwas mlekowy, sól</td><td></td><td></td> sodowa <td>0,174 ml</td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td>100 i mikro; L</td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td></td><td></td><td>5</td></tr><tr><td>Penicylina</td><td></td><td></td><td>6,3</td></tr><tr><td>0,5% czerwień</td><td></td><td></td> fenolowa <td>0,1 ml</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td></td><td></td><td>14,6</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy egzogenne</td><td></td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>MEM Endogenne AA</td><td></td><td></td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td><silny>M2 średni</silny></td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>hodowla zarodków</td></tr><tr><td><silny>Skład M2:</silny></td><td></td><td></td><td><silny>mg/100mL</silny></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td><td></td> wapnia <td>25,1</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (bezwodny)</td><td></td><td></td><td>16,5</td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td><td></td> potasu <td>35,6</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, Monobasic</td><td></td><td></td><td>16,2</td></tr><tr><td>Wodorowęglan</td><td></td><td></td> sodu <td>35</td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td><td></td> sodu <td>553,2</td></tr><tr><td>Albumina frakcja bydlęca</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>Na-HEPES</td><td></td><td></td><td>54,3</td></tr><tr>Czerwień <td></td><td></td><td>fenolowa</td><td>1,1</td></tr><tr><td>Kwas</td><td></td><td></td> pirogronowy <td>3,6</td></tr><tr>Kwas <td></td><td></td><td>DL-mlekowy</td><td>295</td></tr></tbody></table>

wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiwirusy są skutecznymi wektorami dostarczania genów do komórek ssaków. Po transdukcji genom lentiwirusa jest stabilnie włączany do chromosomu gospodarza i przekazywany potomstwu. W związku z tym są idealnymi wektorami do tworzenia stabilnych linii komórkowych, dostarczania wskaźników in vivo i transdukcji zapłodnionych jaj jednokomórkowych w celu stworzenia zwierząt transgenicznych. Jednak zapłodnione jaja myszy i zarodki we wczesnym stadium rozwoju są chronione przez osłonkę przejrzystą, matrycę glikoproteinową, która tworzy barierę przed dostarczaniem genów lentiwirusowych. Lentiwirusy są zbyt duże, aby przeniknąć do strefy i są zwykle dostarczane przez mikrowstrzyknięcie cząstek wirusa do jamy perivitelin, przestrzeni między strefą a komórkami embrionalnymi. Zapotrzebowanie na wysoko wykwalifikowanych technologów i specjalistyczny sprzęt zminimalizowało wykorzystanie lentiwirusów do dostarczania genów do zarodków myszy. W tym artykule opisano protokół przepuszczalności zapłodnionych jaj myszy poprzez perforację zony za pomocą lasera. Perforacja laserowa nie powoduje żadnych uszkodzeń zarodków i umożliwia lentiwirusom uzyskanie dostępu do komórek embrionalnych w celu dostarczenia genów. Transdukowane zarodki mogą przekształcić się w blastocystę in vitro, a jeśli zostaną wszczepione myszom w pseudociężarnej, rozwinąć się w transgeniczne młode. Laser zastosowany w tym protokole jest skuteczny i łatwy w użyciu. Geny dostarczane przez lentiwirusy stabilnie integrują się z komórkami embrionalnymi myszy i są przenoszone przez linię zarodkową. Jest to alternatywna metoda tworzenia myszy transgenicznych, która nie wymaga mikromanipulacji i mikroiniekcji zapłodnionych jaj.

Rozwój izolowanych/transdukowanych zapłodnionych komórek jajowych myszy można sprawdzać codziennie pod mikroskopem (Rysunek 1). Zdrowe embriony rozwijają się do stadium blastocysty w ciągu 3–4 dni. W niniejszym protokole 60–70% niepoddanych działaniu preparatów embrionów rozwija się do stadium blastocysty23. Spośród 114 transdukowanych embrionów poddanych perforacji laserowej, 54 rozwinęło się do stadium blastocysty (wskaźnik 47%), a 4...

Jaja zapłodnione myszami i zarodki we wczesnym stadium są chronione przez osłonkę przejrzystą, matrycę glikoproteinową, która tworzy barierę przed dostarczaniem genów. W artykule opisano protokół perforacji zony za pomocą lasera w celu transdukcji komórek embrionalnych za pomocą wektorów lentiwirusowych i stworzenia myszy transgenicznych.

Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Jest to alternatywna i łatwa w użyciu metoda dostarczania genów będących przedmiotem zainteresowania do zapłodnionych jaj myszy poprzez laserową perforację osłonki przejrzystej i dostarczanie genów lentiwirusowych. Procedura perforacji dawcy myszy wspomagana laserem może być również stosowana do zapłodnionych jaj innych gatunków w celu ułatwienia wnikania innych typów wirusów lub odczynników do transfekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga specjalistycznych umiejętności w zakresie mikromanipulacji i mikroiniekcji zapłodnionych jaj myszy.Procedurę izolacji zapłodnionych jaj myszy zademonstruje Page Myers, naukowiec z oddziału medycyny porównawczej w NIEHS. 16 do 24 godzin po kryciu wyizoluj jajniki i owody od samic myszy za pomocą czopów dopochwowych, zgodnie ze standardowymi protokołami. Po zebraniu wszystkich tkanek rozerwij bańkę każdego jajnika i uwolnij zapłodnione jaja otoczone komórkami kumulowanymi i przenieś jaja w komórkach skumulowanych do 35-milimetrowego naczynia zawierającego jedną hialuronidazę w świeżym pożywce M2, na trzy do pięciu minut inkubacji w temperaturze pokojowej.Odpipetuj jaja kilka razy, aby uwolnić kłębiaste komórki, i przenieś jaja do n

laser-assisted-lentiviral-gene-delivery-to-mouse-fertilized-eggs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Źródło: Lutz, D., et al. Ocena parametrów neuroplastyczności ultrastrukturalnej po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje transdukcję wirusa poprzez wstrzyknięcie do macicy w zarodkach myszy. Ciężarna mysz jest przygotowywana do operacji, a następnie wykonuje się nacięcie w linii środkowej w celu odsłonięcia rogów macicy. Mieszanina wirusa zawierającego pożądany gen i barwnika śledzącego jest wstrzykiwana do zarodków w...

Transdukcja wirusa w macicy u myszy

Źródło: Koza, P., et al. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (2020)Niniejszy film demonstruje dostarczanie wektorów lentiwirusowych do zapłodnionych embrionów szczura za pomocą mikroiniekcji w celu uzyskania stabilnej integracji transgenu do generowania szczurów transgenicznych.

Transdukcja zapłodnionych zarodków szczura z wykorzystaniem wektora lentiwirusowego

Generowanie zakażonych lentiwirusem mysich embrionalnych komórek macierzystych

Ten film opisuje wstrzyknięcie projądrkowe wektorów lentiwirusowych do przestrzeni okołokomórkowej zapłodnionego zarodka myszy. Lentiwirus zawiera transgen, który jest włączany do genomu zapłodnionego zarodka, ostatecznie dając początek transgenicznym myszom.

Wstrzyknięcie periviteliny opartej na wektorze lentiwirusowym: metoda transdukcji interesującego genu do zapłodnionych jednokomórkowych oocytów myszy

W tym filmie demonstrujemy wspomagane laserem przenikanie warstwy ochronnej osłonki przejrzystej do zapłodnionych jaj myszy w celu ułatwienia dostarczania genów lentiwirusowych. Lentiwirus umożliwia generowanie zwierząt transgenicznych, których gen jest stabilnie zintegrowany z ich genomem.

Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych: technika przenikania zapłodnionych jaj myszy w celu ułatwienia dostarczania genów lentiwirusowych

Ten protokół pokazuje, jak wykonać mikroiniekcję cytoplazmatyczną u zygot zwierząt hodowlanych. Technika ta może być wykorzystana do dostarczenia dowolnego roztworu do zarodka jednokomórkowego, takiego jak narzędzia do edycji genomu w celu wygenerowania zwierząt z nokautem.

Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich

Konwencjonalne badania utraty funkcji genów przy użyciu zwierząt nokautujących często były kosztowne i czasochłonne. Mutageneza somatyczna oparta na CRISPR oparta na elektroporacji jest potężnym narzędziem do zrozumienia funkcji genów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy metodę analizy fenotypów nokautu w proliferujących komórkach móżdżku.

Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Ten artykuł ma na celu przedstawienie metodologii transgenezy lentiwirusowej w zarodkach szczurów przy użyciu wielokrotnych wstrzyknięć zawiesiny wirusa do przestrzeni zygoty periviteliny. Samice szczurów, które są kojarzone płodnym szczepem samców o innym dominującym kolorze futra, są wykorzystywane do generowania pseudociężarnych matek zastępczych.

Wytwarzanie transgenicznych szczurów przy użyciu podejścia wektora lentiwirusowego

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Poznaj metodę dostarczania genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy przy użyciu laserowej perforacji strefy pellucidy. Technika umożliwia szybkie tworzenie modeli transgenicznych bez zaawansowanych umiejętności mikromanipulacji.

Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy

Przeglądaj więcej filmów