Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy
November 1st, 2018
Jaja zapłodnione myszami i zarodki we wczesnym stadium są chronione przez osłonkę przejrzystą, matrycę glikoproteinową, która tworzy barierę przed dostarczaniem genów. W artykule opisano protokół perforacji zony za pomocą lasera w celu transdukcji komórek embrionalnych za pomocą wektorów lentiwirusowych i stworzenia myszy transgenicznych.
Jest to alternatywna i łatwa w użyciu metoda dostarczania genów będących przedmiotem zainteresowania do zapłodnionych jaj myszy poprzez laserową perforację osłonki przejrzystej i dostarczanie genów lentiwirusowych. Procedura perforacji dawcy myszy wspomagana laserem może być również stosowana do zapłodnionych jaj innych gatunków w celu ułatwienia wnikania innych typów wirusów lub odczynników do transfekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga specjalistycznych umiejętności w zakresie mikromanipulacji i mikroiniekcji zapłodnionych jaj myszy.
Procedurę izolacji zapłodnionych jaj myszy zademonstruje Page Myers, naukowiec z oddziału medycyny porównawczej w NIEHS. 16 do 24 godzin po kryciu wyizoluj jajniki i owody od samic myszy za pomocą czopów dopochwowych, zgodnie ze standardowymi protokołami. Po zebraniu wszystkich tkanek rozerwij bańkę każdego jajnika i uwolnij zapłodnione jaja otoczone komórkami kumulowanymi i przenieś jaja w komórkach skumulowanych do 35-milimetrowego naczynia zawierającego jedną hialuronidazę w świeżym pożywce M2, na trzy do pięciu minut inkubacji w temperaturze pokojowej.
Odpipetuj jaja kilka razy, aby uwolnić kłębiaste komórki, i przenieś jaja do nowego 35-milimetrowego naczynia zawierającego podłoże M2, z pipetowaniem w celu zmycia enzymu. Następnie przenieś umyte jaja do 35-milimetrowego naczynia zawierającego pożywkę zoptymalizowaną pod kątem potasa jednoznacznie lub KSOM i odpipetuj pipetę, aby zmyć pozostałą pożywkę M2 i hialuronidazę. Następnie przenieś jaja na 35-milimetrowe płytki poddane działaniu kultur tkankowych wysianych 50 mikrolitrami KSOM i dwoma mililitrami dimetylopolisiloksanu przez dwugodzinną równowagę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i tlenu oraz 90% azotu.
Gdy jaja znajdują się w inkubatorze, ustaw i skalibruj laser XYClone, zgodnie z zaleceniami producenta. Gdy jaja będą gotowe, umieść pierwszą płytkę kroplową na stoliku mikroskopu laserowego i ręcznie ustaw ostrość osłonki przejrzystej. Po upewnieniu się, że światło LED lasera jest widoczne przez obiektyw, przesuń stolik mikroskopu, aby wycelować w strefę za pomocą lasera LED i użyj oprogramowania komputerowego, aby ustawić laser XYClone na 250 mikrosekund.
Dostosuj rozmiar światła LED do odpowiednich wymiarów i trzykrotnie przebij osłonę przezroczystą każdego jajka za pomocą lasera, aby uzyskać trzy otwory o średnicy 10 mikrometrów. Bardzo ważne jest, aby wykonać perforację szybko, ale ostrożnie, ponieważ zapłodnione jaja nie mogą przebywać poza inkubatorem dłużej niż 15 minut. Następnie włóż perforowane jaja z powrotem do inkubatora na kolejne dwie godziny.
Pod koniec drugiej inkubacji kroplę KSOM o pojemności 50 mikrolitrów należy potraktować dwoma mikrolitrami skoncentrowanego lentiwirusa bez mieszania. I włóż jaja do inkubatora na cztery dni. Kiedy jaja rozwiną się w blastocysty, użyj niechirurgicznego urządzenia do transferu zarodków, aby zdeponować około 10-15 zarodków w około dwóch mikrolitrach KSOM.
17 dni po transferze zarodków pozwól ciężarnej myszy urodzić naturalnie lub w razie potrzeby pobierz noworodki przez cesarskie cięcie. Następnie zbierz tkankę od młodych do genotypowania, aby określić szybkość transgenezy. Izolowany i transdukowany rozwój jaj zapłodnionych myszami można codziennie sprawdzać pod mikroskopem.
Od 60 do 70% zdrowych, nieleczonych zarodków przekształca się w blastocysty w ciągu trzech do czterech dni. Podczas gdy około 47% perforowanych, transdukowanych zarodków przekształca się w blastocysty, z których 85% wyraża trandukowany gen będący przedmiotem zainteresowania. Skierowanie lasera w celu rozrzedzenia strefy, zamiast tworzenia, pozwala rozwijającym się zarodkom korzystać z nienaruszonej, otaczającej osłony przejrzystej, pozostając jednocześnie podatnym na transdukcję lentiwirusową.
Transdukcja rekombinowanym lentiwirusem, wyrażająca GFP widłonoga z promotora czynnika wydłużenia 1A, indukuje wielokrotne integracje lentiwirusowe i wysoką ekspresję GFP pod niebieską lampą LED. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że chociaż zdolność lentiwirusów do integracji z genomem gospodarza czyni je potężnym narzędziem do stabilnego dostarczania genów, to losowa integracja może również prowadzić do mutacji insercyjnych. Technika ta może umożliwić naukowcom zajmującym się genetyką szybkie opracowanie transgenicznych modeli zwierzęcych do badania chorób w celu produkcji białek in vivo lub do badań genów funkcjonalnych.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak immunohistochemia, na izolowanych próbkach tkanek od transdukowanych młodych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące lokalizacji i zakresu ekspresji genów w różnych tkankach będących przedmiotem zainteresowania. Nie zapominaj, że praca z lentiwirusami może być bardzo niebezpieczna. W związku z tym należy postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi pracy z lentiwirusami.
Nosić osobistą odzież ochronną i odkazić wszystkie odpady przed utylizacją.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie dotyczy dostarczania genów w zarodkach myszy poprzez perforację laserową strefy przezroczystej, co umożliwia transdukcję za pomocą wektorów lentiwirusowych. Protokół demonstruje metodę tworzenia myszy transgenicznych z minimalnymi wymaganiami specjalistycznymi, która może mieć zastosowanie w innych gatunkach.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Genetyka
- Biologia rozwoju
- Metody dostarczania genów
Tło
- Strefa przezroczysta jako bariera we wczesnym rozwoju embrionalnym
- Wyzwania w dostarczaniu genów do komórek embrionalnych
- Znaczenie opracowywania modeli transgenicznych dla badań
Stosowane metody
- Technika perforacji laserowej
- Zarodki myszy jako model biologiczny
- System dostarczania genów lentiwirusowych
Główne wyniki
- 70% zdrowych zarodków rozwija się w blastocysty; 47% transdukowanych zarodków osiąga to samo
- 85% transdukowanych zarodków ekspresuje gen interesujący
- Technika wspiera szybki rozwój transgenicznych modeli zwierzęcych
Wnioski
- Metoda skutecznie ułatwia stabilne dostarczanie genów w zarodkach myszy
- Istotne implikacje dla badań in vivo dotyczących chorób genetycznych
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Laser-assisted lentiviral delivery to mouse fertilized eggs addresses a key bottleneck in transgenic model generation by eliminating the need for micromanipulation expertise. This approach enhances accessibility to stable germline modification for target validation and phenotypic screening in early discovery. By enabling efficient lentiviral transduction without microinjection, the method supports scalable creation of disease-relevant systems for preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables stable gene delivery to embryonic cells for functional interrogation of therapeutic targets and pathway modulation.
- Operational Value: Reduces dependency on highly skilled embryologists, broadening access to transgenic model creation across discovery teams.
- Predictive Value: Supports generation of germline-transmissible models for assessing target phenotype and mechanism with high translational confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces lentiviral-transduced embryos that develop into blastocysts, providing a scalable system for early-stage phenotypic readouts.
- Operational Value: Standardizes zona perforation via laser parameters (250 microseconds, three 10-micrometer holes), improving reproducibility across laboratories.
- Assay Readiness: Generates embryos suitable for downstream applications like immunohistochemistry to assess transgene expression patterns in tissues of interest.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Transduced embryos implanted in pseudopregnant mice yield transgenic pups, enabling seamless progression from discovery to in vivo validation.
- Disease Model Relevance: Facilitates rapid creation of transgenic animals for studying gene function in genetic disease models and protein production studies.
- Risk Mitigation: Stable genomic integration of lentiviral cargo allows long-term expression studies, though insertional mutagenesis risk requires consideration in experimental design.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation through embryo transduction and enabling lead identification via germline-transmissible models.
- Discovery Biology: Facilitates biological de-risking by testing gene function in intact embryonic systems prior to animal generation.
- Screening: Laser perforation parameters (250 microseconds, triple perforation) ensure consistent zona modification for reliable lentiviral access.
- Analytics: Blastocyst formation rate (47% of transduced embryos) and transgene expression rate (85% of blastocysts) provide quantitative endpoints for efficiency assessment.
- Translational Research: Embryo transfer to pseudopregnant females enables in vivo development of transgenic pups for phenotypic and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Protocol adaptability to other species and viral/reagent types positions it as a reusable platform for transgenic model generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Stable germline transmission and high transgene expression (85% of blastocysts) increase confidence in target phenotype attribution.
- Operational Value: Eliminates need for microinjection equipment and specialized training, reducing technical barriers to transgenic model generation.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in target validation by shortening timelines for in vivo model availability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets through rapid generation of disease-relevant systems for preclinical evaluation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling and lentiviral biosafety protocols per institutional guidelines.
- Dependent on XYClone laser system calibration and software-controlled perforation parameters (250 microseconds).
- Necessitates standardized embryo culture conditions (KSOM medium, 37°C, 5% CO2) for consistent blastocyst development.
- Adaptation to other species requires optimization of laser settings and zona pellucida thickness.
- Practical limitation: Perforation must be completed within 15 minutes outside incubator to maintain embryo viability.
