Name: Hodowla i manipulacja komórkami grzebienia nerwowego O9-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metody hodowli i różnicowania komórek grzebienia nerwowego O9-1 myszy. Protokoły obejmują manipulację genetyczną siRNA i CRISPR-Cas9, zapewniając niezawodne narzędzie do badań nad biologią grzebienia nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, z Scientific Publications at the Texas Heart Institute, zapewniła wsparcie redakcyjne. Dziękujemy również następującym źródłom finansowania: Grantowi Naukowemu Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego (14SDG19840000 dla J. Wanga), Nagrodzie Badawczej Lawrence'a 2014 z Rolanette and Berdon Lawrence Bone Disease Program of Texas (dla J. Wanga) oraz National Institutes of Health (DE026561 i DE025873 dla J. Wanga, DE016320 i DE019650 dla R. Maxsona).

<ol><li>Achilleos, A., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cells%3A+discovery%2C+properties+and+potential+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy.</a> Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Dupin, E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X03001138">Multipotentiality of the neural crest.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).</li>
<li>Santagati, F., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+neural+crest+and+the+building+of+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cranial neural crest and the building of the vertebrate head.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).</li>
<li>Cordero, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+neural+crest+cells+on+the+move%3A+their+roles+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).</li>
<li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniofacial+birth+defects%3A+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).</li>
<li>Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+migrating+into+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The neural crest migrating into the twenty-first century.</a> Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).</li>
<li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quo+vadis%3A+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li>
<li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li>
<li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+neural+crest%3A+a+multigene+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li>
<li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+network+during+neural+crest+induction%3A+from+cell+specification+to+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li>
<li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+neural+crest%3A+achieving+specificity+in+regulatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li>
<li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+progenitors+and+stem+cells%3A+from+early+development+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li>
<li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li>
<li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li>
<li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li>
<li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+early+human+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li>
<li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-activated+kinase+1+%28Tak1%29+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li>
<li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li>
<li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway%3A+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li>
<li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li>
<li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo%2FYap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).</li>
<li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li>
<li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+organ+development%2C+homeostasis%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li>
<li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li>
<li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208(2016).</li>
<li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li>
<li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%2C+but+not+collagen+I%2C+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).</li>
<li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li>
<li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

NCC jest wszechstronnym i kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do różnych tkanek i narządów podczas morfogenezy embrionalnej. Linia komórkowa O9-1 zachowuje swój potencjał do różnicowania się w wiele różnych typów komórek i naśladuje charakterystykę NCC in vivo , co czyni ją użytecznym narzędziem in vitro do badania funkcji genów i regulacji molekularnej w NCC. Różny status komórek O9-1 może odpowiadać różnym potomstwu grzebienia nerwowego in vivo, w zależności od warunków hodowli komórek O...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 &#181;M beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 &#181;M dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 &#181;g/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 &#181;g/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 &#181;M dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58346/culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to multipotencjalne komórki macierzyste o niezwykłej zdolności migracyjnej i przejściowym istnieniu podczas rozwoju embrionalnego. NCC powstają między ektodermą powierzchniową a cewą nerwową i migrują do innych części zarodka podczas rozwoju embrionalnego1. Na podstawie ich domen funkcjonalnych, NCC można podzielić na kilka różnych typów, w tym NCC czaszkowe, tułowiowe, błędne, krzyżowe i sercowe. Ponadto NCC mogą różnicować się w wiele linii komórkowych, takich jak komórki mięśni gładkich, komórki kostne i neurony, i dawać początek różnym tkankom2,3. Rozwój NCC charakteryzuje się złożoną serią zdarzeń morfogenetycznych, które są precyzyjnie dostrojone przez różne sygnały molekularne. Biorąc pod uwagę złożoną regulację NCC i ich istotny wkład w liczne struktury, rozregulowanie rozwoju NCC może często prowadzić do wrodzonych wad wrodzonych, które stanowią prawie 30% wszystkich wrodzonych wad wrodzonych u ludzi. Nieprawidłowości podczas rozwoju grzebienia nerwowego mogą prowadzić do rozszczepu wargi/podniebienia, wadliwego kształtowania nosa, syndromów, wad, takich jak wadliwy przewód odpływu serca, a nawet śmiertelności niemowląt1,4,5,6,7. Zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju NCC jest ważne dla opracowania metod leczenia chorób spowodowanych defektami w rozwoju NCC. Dzięki zastosowaniu różnych podejść in vitro i in vivo8,9,10,11,12,13,14,15, poczyniono znaczne postępy w badaniach NCC. In vivo, modele zwierzęce, w tym kurczaki,, danio pręgowany i myszy, zostały wykorzystane do zbadania NCCs1. Co więcej, ludzkie embriony zostały wykorzystane do zbadania procesu migracji NCC we wczesnym rozwoju ludzkich embrionów16. In vitro, modele komórkowe NCC, takie jak ludzkie NCC, które pochodzą z podskórnej tkanki tłuszczowej pacjenta, zostały wykorzystane do zbadania choroby Parkinsona17. Linia O9-1 NCC, która pierwotnie pochodziła z masowych hodowli endogennych NCC wyizolowanych z zarodków myszy E8.518, jest potężnym modelem komórkowym do badania NCC. Co ważne, w warunkach hodowli nieróżnicującej komórki O9-1 są multipotencjalnymi NCC podobnymi do łodyg. Jednak w różnych warunkach hodowli komórki O9-1 mogą być różnicowane w wyróżniające się typy komórek, takie jak komórki mięśni gładkich, osteoblasty, chondrocyty i komórki glejowe18. Biorąc pod uwagę te właściwości, komórki O9-1 są szeroko stosowane w badaniach związanych z NCC, takich jak badanie molekularnego mechanizmu wad czaszkowo-twarzowych19,20.
Tutaj podane są szczegółowe protokoły do utrzymywania komórek O9-1, różnicowania komórek O9-1 na różne typy komórek i manipulowania komórkami O9-1 poprzez przeprowadzanie badań utraty funkcji genów z edycją genomu CRISPR-Cas9 i technologiami knockdown za pośrednictwem małych interferujących RNA (siRNA). Jako reprezentatywny przykład opisano zastosowanie komórek O9-1 do badania utraty funkcji Yap i Taz. Yap i Taz są efektorami szlaku sygnałowego Hippo, który odgrywa kluczową rolę w proliferacji, różnicowaniu i apoptozie komórek. Wykazano również, że szlak hipopotama jest ważny w rozwoju i homeostazie kilku różnych tkanek i narządów, a także w patogenezie różnych chorób20,21,22,23,24,25,26,27,28. Podstawowe składniki sygnalizacji Hippo obejmują supresorowe sterylne kinazy 20-podobne Mst1 / 2, białko rusztowania Salvador zawierające domenę WW oraz kinazy homologu dużego guza supresorowego (Lats1/2). Sygnalizacja hipopotama hamuje aktywność Yap i Taz i sprzyja ich degradacji w cytoplazmie. Bez represji ze strony Hippo, Yap i Taz mogą przemieszczać się do jąder i funkcjonować jako koaktywatory transkrypcji. Niedawno wykazaliśmy, że specyficzna inaktywacja efektorów sygnalizacyjnych Hippo Yap i Taz w mysich NCC za pomocą sterowników Wnt1cre i Wnt1Cre2SOR spowodowała śmiertelność zarodka w E10.5 z poważnymi wadami twarzoczaszki20. Przeprowadziliśmy również badania z wykorzystaniem komórek O9-1 w celu zbadania roli Yap i Taz w NCC. Aby zbadać funkcję Yap i Taz w proliferacji i różnicowaniu NCC, komórki knockdown Yap i Taz zostały wygenerowane w komórkach O9-1 za pomocą siRNA, a komórki nokautujące Yap zostały wygenerowane przy użyciu edycji genomu CRISPR-Cas9. Te same strategie utraty funkcji genów mogą być stosowane do różnych genów docelowych w innych szlakach. Ponadto badania wzmocnienia funkcji i testy transfekcji mogą być również stosowane do komórek O9-1 w celu zbadania funkcji i regulacji genów. Opisane tutaj protokoły mają być wykorzystywane przez badaczy jako przewodniki do hodowli komórek O9-1 w celu utrzymania multipotencjalnej macierzystości, do różnicowania komórek O9-1 w inne typy komórek w różnych warunkach hodowli oraz do badania funkcji genów i mechanizmów molekularnych NCC.

<table><tbody><tr><td>Aktywne ogniwa zasilające STO</td><td></td><td>ATCC ATCC CRL-1503</td><td>Dostępne również w postaci inaktywowanej mitomycyną C, katalog # ATCC 56-X</td></tr><tr><td>O9-1 mysia linia komórkowa grzebienia nerwowego</td> czaszki <td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminy</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hyklon o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td><td>Millipore Sigma</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina - streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,25% w HBSS</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco) bez wapń lub magnez</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminokwasy endogenne (MEM NEAA) 100Xx</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO czynnik hamujący białaczkę (LIF) 106 jednostka/ml</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-zasadowy (rhFGF-zasadowy)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetylosulfotlenek)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>MX1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x)</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna niezbędna pożywka, alfa 1x z solami Earle'a, rybonukleozydami, dezoksyrybonukleozydami i L-glutamina</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-041057</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Pula nieprzeznaczona do kierowania</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-046247</td><td></td></tr><tr><td>FCS (płodowa surowica cielęca)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina-transferyna-selen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF-b3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMP2 (białko morfogenetyczne kości 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Suplement</td> deksametazonu <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla i manipulacja komórkami grzebienia nerwowego o9-1

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to migrujące multipotencjalne komórki macierzyste, które mogą różnicować się w różne typy komórek i dawać początek wielu tkankom i organom. Linia komórkowa O9-1 pochodzi z endogennych embrionalnych NCC myszy i utrzymuje swoją multipotencję. Jednak w określonych warunkach hodowli komórki O9-1 mogą różnicować się w różne typy komórek i być wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań badawczych. Niedawno, dzięki połączeniu badań na myszach i badań na komórkach O9-1, wykazaliśmy, że efektory szlaku sygnałowego Hippo Yap i Taz odgrywają ważną rolę w rozwoju twarzoczaszki wywodzącej się z grzebienia nerwowego. Chociaż proces hodowli komórek O9-1 jest bardziej skomplikowany niż w przypadku innych linii komórkowych, linia komórkowa O9-1 jest potężnym modelem do badania NCC in vitro. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli linii komórkowej O9-1 w celu utrzymania jej macierzystości, a także protokoły różnicowania komórek O9-1 w różne typy komórek, takie jak komórki mięśni gładkich i osteoblasty. Ponadto opisano protokoły przeprowadzania badań nad utratą funkcji genów w komórkach O9-1 przy użyciu delecji CRISPR-Cas9 i małego interferującego knockdownu, w którym pośredniczy RNA.

Celem naszych eksperymentów z wyciszeniem (knockdown) i wyeliminowaniem (knockout) było zbadanie efektów utraty funkcji Yap i Taz w komórkach O9-1. Przed przystąpieniem do eksperymentów z knockdown i knockout należy upewnić się, że przygotowano pożywkę podstawową i hodowlę komórek O9-1 zgodnie z powyższym opisem (na przykład macierz błony podstawnej musi pokrywać całą płytkę, jak pokazano na Ryc. 1, a komórki O9-1 muszą zostać odzyskane z ci...

O9-1 to multipotencjalna linia komórek grzebienia nerwowego myszy. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły krok po kroku dotyczące hodowli komórek O9-1, różnicowania komórek O9-1 w określone typy komórek i genetycznego manipulowania komórkami O9-1 za pomocą knockdownu za pośrednictwem siRNA lub edycji genomu CRISPR-Cas9.

Hodowla i manipulacja komórkami grzebienia nerwowego O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Linia komórkowa O9-1 jest bardzo przydatnym narzędziem do badania komórek grzebienia nerwowego in vitro. Ma duży potencjał do wykorzystania w szerokim zakresie aplikacyjnym w różnorodnym wykorzystaniu badań. Komórki O9-1 mają oczywiste zalety, takie jak łatwy dostęp i szybkie uzyskanie wystarczającej liczby komórek do eksperymentów, co czyni je potężną metodą uzupełniającą badania in vitro komórek grzebienia nerwowego.Na początek przygotuj podłoże podstawowe do hodowli komórek O9-1, zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie przefiltruj podłoże podstawowe i zawiń je w folię, aby chronić je przed światłem. Następnie zbierz kondycjonowane podłoże podstawowe z aktywowanych komórek STO zgodnie z protokołem tekstowym.Najpierw rozmrażaj podwielokrotność macierzy błony podstawnej na lodzie przez dwie godziny. Następnie rozcieńczyć matrycę błony podstawnej przefiltrowanym sterylizowanym DMEM z 10% FBS do końcowego stężenia 0,5 mg / ml. Pokryj płytkę matrycą membrany podstawnej w temperaturze pokojowej na jedną godzinę.Następnie zassaj matrycę błony podstawnej, przechylając płytkę. Suszyć płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodając matrycę błony podstawnej do płytki, up

culturing-and-manipulation-of-o9-1-neural-crest-cells

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Do hodowli komórek macierzystych grzebienia neuronalnego (NCSC) in vitro wymagane jest specjalne medium (NCSCM). Niezbędnym składnikiem NCSCM jest ekstrakt z embrionu kurczaka (CEE). Opisujemy tutaj precyzyjne techniki pozwalające na uzyskanie maksymalnej ilości czystego i wysokiej jakości CEE, w tym szczegóły dotyczące procesów izolacji, maceracji, wirowania oraz filtracji.

Wytwarzanie ekstraktu z zarodka kurczaka do hodowli mysich komórek macierzystych grzebienia neuronalnego

Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Ten film demonstruje użycie małego interferującego RNA (siRNA) do wyciszania określonych genów w nerwowych komórkach macierzystych i różnicowania ich w pożądane typy komórek za pomocą odpowiedniego podłoża różnicującego. Procedura ta umożliwia zbadanie kluczowej roli określonych genów w procesie różnicowania nerwowych komórek macierzystych.

Wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA w nerwowych komórkach macierzystych

Ten film ilustruje technikę izolowania fałdów nerwowych czaszki od śródmózgowia zarodków piskląt. Przedstawiono szczegółowy proces rozwarstwiania fałdów nerwowych, ich rozmieszczenia i mocowania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, a następnie obserwację migracji komórek grzebienia nerwowego z fałdów nerwowych.

Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.

Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Ten protokół przedstawia eksperyment migracji in vitro odpowiedni do analizy funkcjonalnej cząsteczek biorących udział w migracji in vivo komórek grzebienia nerwowego do bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej.

In vitro Badanie wpływu bogatej w hialuronian macierzy zewnątrzkomórkowej na migrację komórek grzebienia nerwowego

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) protokół różnicowania in vitro, generujący neurosfery o powtarzalnych rozmiarach do produkcji komórek grzebienia nerwowego czaszki z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pokazujemy, że ta metodologia zmniejsza zmienność w porównaniu z poprzednimi protokołami i jak można ją wykorzystać do testu multipleksowego do badania rozwoju komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

Poznaj metody hodowli i różnicowania komórek grzebienia nerwowego O9-1 myszy. Protokoły obejmują manipulację genetyczną siRNA i CRISPR-Cas9, zapewniając niezawodne narzędzie do badań nad biologią grzebienia nerwowego.

Hodowla i manipulacja komórkami grzebienia nerwowego O9-1

Przeglądaj więcej filmów