Zautomatyzowana metoda określania wydajności Drosophila w odpowiedzi na zmiany temperatury w czasie i przestrzeni

Tutaj prezentujemy protokół do automatycznego określania sprawności lokomotorycznej Drosophila przy zmieniających się temperaturach za pomocą programowalnej areny kontrolowanej temperaturą, która wytwarza szybkie i dokładne zmiany temperatury w czasie i przestrzeni.

Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące reakcji muszek na zmiany temperatury, takie jak różnice między genotypami, interakcja z innymi sygnałami sensorycznymi lub funkcja różnych receptorów temperatury. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wiele szybkich i precyzyjnych zmian temperatury, kontrolując czas i przestrzeń w sposób zautomatyzowany. Zacznij od umieszczenia 20 samców i 20 samic much w butelce hodowlanej zawierającej 45 mililitrów pożywki dla much i umieszczeniu butelki w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza w 12-godzinnych cyklach światła i 12-godzinnej ciemności.

Po 10 dniach znieczulenie nowo zamkniętych much na podkładkach z dwutlenkiem węgla przez maksymalnie cztery minuty. I użyj pędzla, aby zebrać dziewicze muchy w fiolkach do hodowli much o wymiarach 2,5 na 9,5 centymetra zawierających 6,5 mililitra świeżej pożywki dla much, podzielonych według płci na grupy po 20 much na fiolkę. Następnie należy umieścić fiolki z powrotem w inkubatorze na pięć do siedmiu dni.

Aby skonfigurować arenę z kontrolowaną temperaturą, włącz arenę i otwórz skrypt faz temperatury w komputerze sterującym. Sprawdź, czy sekwencja temperatur jest prawidłowo ustawiona i sprawdź, czy czas trwania każdej fazy eksperymentalnej jest ustawiony na 60 sekund. W sekcji bloku eksperymentalnego start potwierdź te ustawienia: żądana liczba faz, iteracyjna konfiguracja włączania/wyłączania orientacyjnych diod elektroluminescencyjnych czerwonego światła, wzrost temperatury o dwa stopnie Celsjusza na fazę i 16 stopni Celsjusza jako temperatura początkowa.

Następnie uruchom skrypt faz temperatury. Oprogramowanie zostanie zainicjowane na pięć sekund, a następnie zatrzyma się. W przypadku eksperymentów z zachowaniem temperatury umieść pasmo białej taśmy przewodzącej na wierzchu miedzianych płytek areny, upewniając się, że wszystkie krawędzie są zakryte.

Umieść rozgrzany aluminiowy pierścień wokół miedzianych płytek i użyj czystej chusteczki do wytarcia szklanej pokrywy. Umieść pokrywę na górze aluminiowego pierścienia, pozostawiając szczelinę, przez którą mucha może zostać wdmuchiwana i postukaj w zaaklimatyzowaną fiolkę na muchy dwa razy, aby zmusić muchy do zejścia na dno fiolki. Za pomocą aspiratora doustnego złap jedną muchę i zamknij fiolkę przed włożeniem jej z powrotem do inkubatora.

Wydmuchaj muchę na arenę przez szczelinę między szklaną pokrywą a aluminiowym pierścieniem i natychmiast popchnij szklaną koniczynę, aby zamknąć szczelinę. Umieść ramkę świateł wokół areny, aby zapewnić symetryczne oświetlenie i rozpocznij nagrywanie za pomocą programu do nagrywania wideo. Następnie naciśnij spację na komputerze sterującym, aby rozpocząć uruchamianie faz eksperymentalnych.

Aby śledzić filmy, otwórz oprogramowanie do śledzenia kroków w locie i otwórz plik konfiguracyjny w folderze fly tracker. Ustaw lokalizację filmów w folderze wideo oraz nazwy filmów w plikach wideo. Określ granice areny lotów w ustawieniach areny na podstawie współrzędnych pikseli x/y wielu punktów na krawędzi areny.

Określ lokalizację nieaktywnych czerwonych diod LED w ustawieniach diod LED, na podstawie współrzędnych pikseli x/y lokalizacji środka diod LED. Aby sprawdzić położenie granic areny latania, ustaw debug na true w ustawieniach areny, kliknij zapisz i uruchom skrypt w terminalu. Pojawi się zrzut ekranu z filmem z niebieskim kwadratem utworzonym przez współrzędne wprowadzone w ustawieniach areny.

Następnie zmień debugowanie w ustawieniach areny na false. Kliknij Zapisz i ponownie uruchom ekran w terminalu, aby rozpocząć proces śledzenia. W typowym eksperymencie behawioralnym dotyczącym temperatury, pojedyncze muchy wystawione na działanie 16, 20 lub 24 stopni Celsjusza wykazują większą lokomocję na początku eksperymentu niż po pięciu minutach.

Arena z kontrolowaną temperaturą może być również wykorzystana do porównania reakcji behawioralnych much z różnych środowisk genetycznych na dynamiczne zmiany temperatury. Na przykład w tym eksperymencie prędkość wszystkich badanych gatunków rosła zgodnie z ich własnymi krzywymi odpowiedzi wraz ze wzrostem temperatury, aż do osiągnięcia punktu maksymalnej wydajności, po którym ich prędkości zanikały, a muchy ginęły. Kiedy poszczególne muchy zostały wystawione na działanie 40 stopni Celsjusza na środku i na jednej bocznej płytce, z drugą boczną płytką na komfortowej temperaturze 22 stopni Celsjusza, muchy typu dzikiego szybko przestały poruszać się po arenie i pozostały w wygodnym miejscu.

W przeciwieństwie do tego, klasyczne zmutowane muchy Dunce wciąż eksplorują arenę i spędzają mniej czasu niż sterowanie w wygodnym miejscu. Co więcej, testowanie kombinacji temperatury i lokalizacji jest również przydatne w zrozumieniu funkcji różnych receptorów temperatury podczas dynamicznych zmian temperatury. Jak pokazano w tym eksperymencie, w którym poszczególne mutanty d melanogaster były wystawione na działanie rosnących temperatur, podczas gdy zapewniono również zmianę wygodnej lokalizacji o temperaturze 22 stopni Celsjusza.

Podczas wykonywania tej procedury pamiętaj, aby wykonywać kroki w kolejności i szybko, aby uchwycić jak najwięcej zachowań much. Oprócz tej procedury można zastosować inne metody, takie jak ujemna geotaksja lub testy dławienia cieplnego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, gdzie muchy poruszają się normalnie lub mają normalną odporność na ciepło. Implikacje tej techniki rozciągają się na zrozumienie zaburzeń neurologicznych lub mutacji, w których percepcja temperatury lub ból odgrywają rolę.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ każdy krok jest prosty sam w sobie, ale muszą być doskonale skoordynowane, więc technikę należy ćwiczyć.