Name: Pobieranie komórek śródbłonka z końcówek balonów cewników Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka z końcówek cewników Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca. Technika umożliwia bezpieczną biopsję komórkową naczyń płucnych z minimalnym ryzykiem dla pacjenta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować lekarzom i personelowi pomocniczemu z Zaawansowanej Niewydolności Serca i Nadciśnienia Płucnego Szpitala Ogólnego w Allegheny za dostarczenie setek próbek cewników w ciągu kilku lat, które ułatwiły optymalizację tej metodologii.

Wszystkie badania opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of the Allegheny Health Network. Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę przed podaniem środków uspokajających i zostali pozbawieni elementów pozwalających na identyfikację poprzez przypisanie numeru badania.
1. Kolekcja przy łóżku
UWAGA: Wszystko w tym protokole powinno być wykonywane na lodzie, przy użyciu wstępnie schłodzonych roztworów. Ważne jest, aby wywołać zimny zastój w komórkach, aby zachować ich fenotyp biologiczny in situ. Protokół ten obejmuje postępowanie z krwią i komórkami pobranymi od ludzi, dlatego należy przestrzegać uniwersalnych środków ostrożności.
<ol>
	<li>Po wyjęciu cewnika z osłonki należy natychmiast zanurzyć cewnik w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml schłodzonego sterylnego roztworu soli fizjologicznej. Zakręć cewnikiem kilka razy, aby usunąć krew i przepłucz linię, jeśli to konieczne, aby usunąć krew zatrzymaną w linii.</li>
	<li>Odetnij dystalną 5 cm końcówkę cewnika i pozwól jej wpaść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej schłodzoną sól fizjologiczną. Natychmiast usuń końcówkę cewnika za pomocą kleszczy i przenieś ją do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 15 ml pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (EC).</li>
	<li>Zamknij probówkę, umieść ją na lodzie i przenieś do laboratorium, aby przygotować się do przetwarzania lub wysyłki. Bardzo ważne jest, aby balon pozostał zanurzony w podłożu, więc upewnij się, że w probówce o pojemności 15 ml jest minimalna przestrzeń, wypełniając ją całkowicie pożywką wzrostową EC.</li>
	<li>Próbkę należy natychmiast przetworzyć, przechodząc do kroku 2.1 lub zapieczętować i wysłać próbkę na mokrym lodzie przez noc w celu przetworzenia w laboratorium wykwalifikowanym w tym protokole. Jeśli komórki mają być ostatecznie wykorzystane do hodowli komórek, zdecydowanie zaleca się, aby końcówka cewnika została natychmiast przetworzona w tym samym miejscu, w którym została pobrana.</li>
</ol>
2.Żniwo komórek
UWAGA: Wszystko w tym protokole powinno być wykonywane na lodzie, przy użyciu wstępnie schłodzonych roztworów. Komórki znajdują się w zimnym zastoju i ważne jest, aby unikać ich budzenia, dopóki nie będą gotowe do utrwalenia lub hodowli. Cały ten protokół powinien być wykonywany w okapie z przepływem laminarnym, przy użyciu sterylnych narzędzi, jeśli ostatecznym celem jest hodowla zebranych PAEC. Jeśli posiew nie jest planowany (np. analiza cytometrii przepływowej), nie jest konieczne przestrzeganie sterylnych środków ostrożności.
<ol>
	<li>Dodać 5 ml roztworu do oddzielania komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml; umieścić na lodzie.</li>
	<li>Pobrać 1 ml pożywki EC z pozostałej w probówce do pobierania próbek przyłóżkowych do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Szybko wykonaj kroki od 2.3 do 2.5. Chwyć odcięty koniec końcówki cewnika hemostatykami.</li>
	<li>Ostrożnie włożyć igłę strzykawki o pojemności 1 ml do "białego" otworu naprzeciwko przewodu doprowadzającego ("otwór"). Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć zranienia igłą.</li>
	<li>Przenieść końcówkę cewnika do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej roztwór do oddzielania komórek.</li>
	<li>Napompuj balon, uważając, aby go nie rozerwać – dobrze sprawdza się napompowanie balonu około 200 μl pożywki.</li>
	<li>Pozostawić cewnik w roztworze do odrywania komórek na lodzie przez 5 minut z napompowanym balonem. Jeśli balon sam opróżni się podczas 5-minutowej inkubacji, jest to dopuszczalne.</li>
	<li>Wlać zawartość 15 ml probówki wirówkowej do naczynia o średnicy 100 mm. Umieść balon w roztworze do odłączania komórek "kałuży".</li>
	<li>Zeskrob napompowany balon za pomocą skrobaka do komórek. Skrobak do komórek można narysować wokół balonu ruchem okrężnym lub ruchem szczotkującym. Skoncentruj się na "biegunach" balonu, w miejscu, w którym styka się on z cewnikiem. Upewnij się, że skrobak do komórek styka się z całą powierzchnią balonu co najmniej dwa razy. Okresowo płukać skrobak do komórek w "kałuży" roztworu do odrywania komórek.</li>
	<li>Opróżnij balon i zeskrob go ruchem szczotkowania. Wypłucz skrobak do komórek w roztworze do odwarstwiania komórek "kałużę".</li>
	<li>Wyrzuć końcówkę cewnika, igłę i skrobak do komórek do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Wlać roztwór do odrywania komórek zawierający pobrane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Wstrząsnąć probówką zbiorczą i wlać pozostałą pożywkę z probówki zbiorczej również do pobranej próbki.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 650 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ważne jest, aby pamiętać, że często kulka NIE będzie widoczna. Pomocne może być zaznaczenie miejsca, w którym kulka byłaby widoczna, jeśli jest widoczna, aby uniknąć zasysania kulki w przypadku, gdy jest zbyt mała, aby była widoczna. 
	nuta: Zwykle granulka jest widoczna tylko wtedy, gdy próbka została zanieczyszczona krwią. Zanieczyszczenie krwi nie ma znaczenia dla ostatecznego produktu zbiorów, ponieważ krew nie wiąże kulek CD146 i przemywa przez kolumnę. Szeroko zakrojone testy wykazały, że konkretna marka probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, o których mowa w Tabeli Materiałów, minimalizuje utratę komórek w porównaniu z innymi probówkami wykorzystywanymi podczas optymalizacji protokołu.</li>
	<li>Ostrożnie zasysać pożywkę i unikać przeszkadzania lub zasysania osadu.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie komórek
UWAGA: Wszystko w tym protokole powinno być wykonywane na lodzie, przy użyciu wstępnie schłodzonych roztworów. Komórki znajdują się w zimnym zastoju i ważne jest, aby unikać ich budzenia, dopóki nie będą gotowe do utrwalenia lub hodowli.
<ol>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml schłodzonego roztworu do lizy krwinek czerwonych i przenieść go do probówki do mikrokrwinek o pojemności 1,5 ml; delikatnie kołysać przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C. Zassać roztwór do lizy RBC.</li>
	<li>Zawiesić osad w 60 μl PBS, 20 μl blokera FcR i 20 μl anty-ludzkich mikrogranulek CD146. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 1 ml schłodzonego PBS. Wirować przez 5 minut w 500 x g i temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml schłodzonego PBS.</li>
	<li>Umieść magnetyczną kolumnę LS na stojaku magnetycznym (patrz Tabela materiałów, aby uzyskać szczegółowe tożsamości handlowe tych przedmiotów) w temperaturze pokojowej. Zalać kolumnę, dodając 1 ml PBS i pozwól, aby cała objętość przepłynęła. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Umieść próbkę w kolumnie magnetycznej. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Przemyć kolumnę trzykrotnie 3 ml schłodzonego PBS. Wyrzuć przepływ z każdego prania.</li>
	<li>Dodać 3 ml schłodzonego PBS do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Zdejmij kolumnę magnetyczną z magnesu, wlej 3 ml PBS z probówki wirówkowej o pojemności 15 ml do kolumny i szybko umieść kolumnę w probówce wirówkowej, aby złapać przepływ. Natychmiast zanurzyć za pomocą tłoka dostarczonego z kolumną. Próbka jest teraz oczyszczona, gotowa do utrwalenia/barwienia lub hodowli.</li>
</ol>

<ol><li>Galie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2015+ESC%2FERS+Guidelines+for+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+hypertension%3A+The+Joint+Task+Force+for+the+Diagnosis+and+Treatment+of+Pulmonary+Hypertension+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29+and+the+European+Respiratory+Society+%28ERS%29%3A+Endorsed+by%3A+Association+for+European+Paediatric+and+Congenital+Cardiology+%28AEPC%29%2C+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation+%28ISHLT%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT).</a> European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).</li>
<li>Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvest+of+pulmonary+artery+endothelial+cells+from+patients+undergoing+right+heart+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization.</a> Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).</li>
<li>Benza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+expression+of+Bcl-2+in+pulmonary+artery+endothelial+cells+associates+with+pulmonary+arterial+hypertension+relative+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction.</a> Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).</li>
<li>Bull, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+cells+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).</li>
<li>Kaneko, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+reaction+products+of+nitric+oxide+as+quantitative+markers+of+primary+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).</li>
<li>Rothman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvenous+procurement+of+pulmonary+artery+smooth+muscle+and+endothelial+cells+using+a+novel+endoarterial+biopsy+catheter+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model.</a> Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).</li>
<li>Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+medicine+and+personalising+therapy+in+pulmonary+hypertension%3A+seeing+the+light+from+the+dawn+of+a+new+era%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Reviews%22%5BJournal%5D)">Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era.</a> European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).</li>
<li>Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+Pulmonary+Arterial+Hypertension%3A+Evolving+Therapeutic+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies.</a> Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).</li>
<li>Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146+%28Mel-CAM%29%2C+an+adhesion+marker+of+endothelial+cells%2C+is+a+novel+marker+of+lymphocyte+subset+activation+in+normal+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood.</a> Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).</li>
<li>Elshal, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+population+of+effector+memory+lymphocytes+identified+by+CD146+having+a+distinct+immunophenotypic+and+genomic+profile%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunolology%22%5BJournal%5D)">A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile.</a> BMC Immunolology. 8, 29(2007).</li>
<li>Newman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PECAM-1+%28CD31%29+cloning+and+relation+to+adhesion+molecules+of+the+immunoglobulin+gene+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily.</a> Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).</li>
</ol>

MJP i RLB są wynalazcami patentów, które zastrzegają sobie część opisanych metod.

Technika opisana w tym artykule jest najlepiej oceniana w kontekście wcześniejszych eksperymentalnych paradygmatów badania śródbłonka naczyń płucnych. Wcześniejsze próby uzyskania PAEC od ludzi ograniczały się do eksplantowanych/zwłok płuc5 i krótkotrwałej próby opracowania cewnika zdolnego do biopsji tętnicy płucnej6. Jak zauważono w niedawnym przeglądzie7, obecna technika różni się od pobierania tkanki płucnej zdolnością do pozyskiwania PAEC od żywego człowieka i to w wielu punktach czasowych progresji choroby i/lub terapii. Należy jednak zauważyć, że niedawno opisano technikę towarzyszącą, za pomocą której indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (IPSC) mogą być transdyferencjowane w PAEC 4,5. Technika ta pozwala na uzyskanie licznych kultur specyficznych dla pacjenta PAEC i umożliwia badanie wpływu specyficznego dla pacjenta tła genetycznego na biologię PAEC. Pomimo tych zalet, te PAEC pochodzące z IPSC nie mogą dostarczyć żadnych informacji na temat interakcji między lokalnym mikrośrodowiskiem a specyficznym dla pacjenta tłem genetycznym. Nasza własna grupa przedstawiła pogląd, że "końcówka cewnikująca" i techniki IPSC prawdopodobnie będą synergiczne w rozwoju tej dziedziny8.
W tym obecnym i historycznym kontekście należy zwrócić uwagę na ograniczenia tej techniki. Po pierwsze, należy zauważyć, że plony PAEC uzyskane tą metodą mogą się znacznie różnić. Przypuszczalnie do tej zmienności przyczyniają się czynniki specyficzne dla pacjenta, stanu choroby i lekarza, ponieważ protokół nie zawiera kroków, które mogłyby spowodować znaczną utratę materiału źródłowego. Tabela 1 przedstawia reprezentatywne plony CD146 + z różnych zbiorów PAEC z wykorzystaniem końcówek cewników uzyskanych od różnych pacjentów z różnymi stanami chorobowymi nadciśnienia płucnego i od różnych lekarzy. Po drugie, wydajność komórek jest ogólnie niska, a ich żywotność do hodowli okazała się jeszcze niższa w naszych rękach. Chociaż wcześniej hodowaliśmy kultury PAEC przy użyciu tej metody1, zakładamy, że wyniki te reprezentują uratowanie podzbioru komórek progenitorowych po obumarciu większości próbki i są skuteczne tylko sporadycznie w naszych rękach. Na przykład nie jest niczym niezwykłym, że rano po zbiorach w uprawach znajduje się tylko kilkadziesiąt przylegających PAEC. Często te mikrokultury nie są w stanie przetrwać do ekspansji. Potrzebne są dalsze prace w celu optymalizacji tego protokołu w sposób, który utrzyma żywotność PAEC i ich warunki w hodowli, aby osiągnąć pożądany cel, jakim jest rozmnażanie zbiorów PAEC specyficznych dla pacjenta. Wreszcie, dostosowana przez nas selekcja pozytywna CD146 nie może wykluczyć zanieczyszczenia innymi komórkami CD146 +, takimi jak krążące komórki śródbłonka4, perycyty, komórki mięśni gładkich i rzadkie limfocyty T CD146 + 9,10. Niemniej jednak zakłada się, że komórki te są bardzo małe w próbkach pobranych w ten sposób, a CD146 jest znacznie bardziej specyficzny dla tego protokołu niż inne markery komórkowe komórek śródbłonka, takie jak CD31 (który jest również obecny na różnych komórkach krwi, w tym płytkach krwi11). Wszelkie przyszłe ulepszenia mające na celu poprawę swoistości powinny być zrównoważone z ich potencjalnie negatywnym wpływem na plon.

Obecne wytyczne amerykańskie i europejskie wymagają cewnikowania prawego serca w celu rozpoznania nadciśnienia płucnego1. Lekarze i naukowcy dążący do zrozumienia tej choroby pragną próbek biologicznych z układu naczyniowego płuc, aby uzupełnić dane hemodynamiczne zebrane podczas RHC. Niestety, ryzyko związane z biopsją naczyń płucnych jest bardzo wysokie, dlatego próbki biologiczne naczyń płucnych są rzadko, jeśli w ogóle, pobierane od żywych pacjentów poddawanych RHC. Chociaż uzyskano wiele informacji na temat tkanki naczyniowej płuc uzyskanej ze zwłok lub eksplantowanych płuc, próbki te nie są w stanie odzwierciedlić biologii procesu chorobowego PH w miarę jego rozwoju u żywego pacjenta. W 2013 roku po raz pierwszy informowaliśmy, że komórki śródbłonka tętnicy płucnej (PAEC) są ogołocone z gałęzi tętnicy płucnej przez fizyczny kontakt z końcówką balonu cewnika Swan-Ganz podczas RHC i mogą być odzyskane w małych ilościach z końcówek cewnika po zabiegu2.
Ten artykuł ilustruje naszą technikę usuwania i oczyszczania komórek śródbłonka tętnicy płucnej (PAEC) z końcówek balonów cewników Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca. Dotychczas metodologia wykonywania tej techniki zbioru była opisana w literaturze na tyle szczegółowo, aby zapewnić jednolite wyniki między laboratoriami stosującymi tę technikę. Niniejszy artykuł ma na celu przezwyciężenie tego braku, oferując wizualizowaną demonstrację techniki, od zbierania końcówek cewników przy łóżku pacjenta do produktu końcowego w postaci oczyszczonych komórek śródbłonka CD146+. Technika ta powinna pomóc w postępie badań nad patobiologią różnych etiologii PH i być może doprowadzić do opracowania nowych testów diagnostycznych uzupełniających dane hemodynamiczne zebrane podczas RHC.
Znaczenie tej techniki dla dziedziny medycyny naczyniowej i badań płucnych polega na tym, że zapewnia ona dostęp do migawki biologii śródbłonka płucnego in situ i w przeciwieństwie do wcześniejszych badań nad płucami eksplantowanymi lub trupimi, nie stanowi punktu końcowego dla płuc podmiotu. Ostatnio wykazaliśmy, że biomarker antyapoptotyczny w tych komórkach może być przydatny w bardziej precyzyjnym fenotypowaniu odmian nadciśnienia płucnego związanych z fenotypowaniem3. Wydajność uzyskanych komórek jest stosunkowo niewielka, ~ 5 000-25 000 PAEC na próbkę, a komórki te są trudne (ale nie niemożliwe) do hodowli. Wierzymy, że sprytni klinicyści i badacze znajdą synergię między tymi technikami towarzyszącymi, aby posunąć naprzód badania, diagnostykę i prognozowanie naczyń płucnych.

<table><tbody><tr><td>Naczynie hodowlane 100 mm</td><td>Fisher</td><td>NC9385690</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki wirówkowe</td><td>Midsci</td><td>C15R</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd Fisher</td><td></td><td>PI28908</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe</td><td>Midsci</td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo</td><td>A1110501</td><td>roztwór do odłączania komórek</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Fisher</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki do wzrostu komórek śródbłonka</td><td>Zastosowania komórkowe</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rurka do mikrofug LoBind</td><td>Fisher</td><td>13-698-794&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Miltenyi CD146</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-596</td><td></td></tr><tr><td>Bloker Miltenyi FCR</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny Miltenyi LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnes Miltenyi</td><td>Miltenyi</td><td>MidiMACS</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>BP2438-4</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strzykawki</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr></tbody></table>

pobieranie komórek śródbłonka z końcówek balonów cewników swan-ganz po cewnikowaniu prawego serca

Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization

Różne patologie prowadzą do nadciśnienia płucnego (PH), które definiuje się jako średnie ciśnienie w tętnicy płucnej przekraczające 25 mmHg w spoczynku. Aby dalej diagnozować i kontrolować PH, pacjenci przechodzą powtarzające się cewnikowanie prawego serca (RHC), w którym cewnik Swana-Ganza jest wprowadzany do gałęzi tętnicy płucnej, a balon jest nadmuchiwany w celu zaklinowania końcówki cewnika. W artykule tym przedstawiono protokół, w którym komórki śródbłonka tętnicy płucnej (PAEC) mogą być pobierane z końcówek balonów cewników Swan-Ganz po RHC i oczyszczane techniką kolumny powinowactwa anty-CD146 w celu oczyszczenia przypuszczalnych PAEC. Komórki te mogą być wykorzystane do zapewnienia obrazu in situ stanu biologicznego śródbłonka naczyń płucnych w celu uzupełnienia pomiarów hemodynamicznych uzyskanych podczas RHC. Zebrane i oczyszczone PAEC mogą być stosowane zarówno do hodowli komórkowych, jak i do późniejszych testów analitycznych, takich jak cytometria przepływowa.

Niniejszy protokół opisuje oczyszczanie komórek z końcówek cewnika Swan-Ganza po cewnikowaniu prawego serca, które wiążą się z kolumną selekcyjną CD146 i wykazują profile rozproszenia przedniego/bocznego nieodróżnialne od hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka tętnicy płucnej (Rycina 1). Biorąc pod uwagę, że balon cewnika pozostaje w bezpośrednim kontakcie jedynie z osłoną wprowadzającą (materiałem wolnym od komórek), ścianą naczynia tętnicy płucnej oraz krwią, w niniejszym opracowaniu przedstawiono dane wykazujące, że komórki te nie pochodzą z krwi (Rycina 2), w związku z czym przyjmuje się, że faktycznie pochodzą one ze ściany naczynia tętnicy płucnej. Należy zauważyć, że magnetyczne koraliki anty-CD146 używane do oczyszczania komórek pozostają przyległe do powierzchni komórki po zakończeniu procedury, dlatego analiza zebranych komórek pod kątem CD146 jako markera komórek śródbłonka jest nieoptymalna. Do znakowania można prawdopodobnie wykorzystać CD31 lub inne markery śródbłonkowe, które mogą być rozważone jako alternatywy.
Zidentyfikowano kluczowe elementy tego protokołu, które mogą wpływać na wyniki. Po pierwsze, ważne jest przepłukanie końcówki cewnika przy łóżku pacjenta w celu usunięcia krwi. Rysunek 3 przedstawia profile rozproszenia bocznego (SSC)/rozproszenia przedniego (FSC) dla przepływu z kolumny anty-CD146 w przypadku jednej próbki prawidłowo przepłukanej oraz jednej nieprzepłukanej. Wydaje się, że kolumna wyklucza komórki pochodzenia krwi z uzyskanego materiału (Rysunek 2), jednak etap płukania zapewni minimalną możliwą kontaminację krążącymi komórkami śródbłonka (które normalnie występują w stężeniu &lt;50 cells/mL krwi4). Zaobserwowaliśmy, że eluat z kolumny CD146 jest całkowicie przejrzysty, nawet w przypadku próbek z końcówek cewników silnie zanieczyszczonych krwią. Sugeruje to, że kolumna jest w stanie obsłużyć znaczne ilości krwi bez zatykania się lub zatrzymywania krążących w krwi komórek nie-CD146+.
Po drugie, ważne jest, aby przynajmniej raz napompować końcówkę balona podczas etapu stosowania roztworu do odrywania komórek/skrobaczki do komórek. Biorąc pod uwagę, że domniemane PAECs na końcówce balona pozostają przylegające mimo etapu płukania solą fizjologiczną, prawdopodobne jest, że mogą być one częściowo uwięzione w fałdach winylowego balona podczas jego spuszczania w przygotowaniu do usunięcia z organizmu pacjenta. Przypuszczalnie, etap pompowania uwalnia PAECs, umożliwiając ich delikatne zeskrobanie. Nie jest od razu jasne, w jaki sposób można przetestować tę hipotezę, jednak w przypadku niepompowania balona obserwowano niższą wydajność uzyskiwania komórek (dane nie przedstawiono).
Na koniec należy zaznaczyć, że wydajność PAEC uzyskiwana za pomocą tej metody może się znacznie różnić. Prawdopodobnie za tę zmienność odpowiadają czynniki zależne od pacjenta, stanu choroby oraz lekarza, ponieważ protokół nie zawiera etapów, które mogłyby prowadzić do znacznej utraty materiału wyjściowego. Tabela 1 przedstawia reprezentatywne wydajności CD146+ z różnych zbiorów PAEC, z wykorzystaniem końcówek cewników pobranych od wielu pacjentów z różnymi stanami nadciśnienia płucnego oraz przez różnych lekarzy operatorów.
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej, wykresy rozproszenia FSC-A vs. SSC-A, porównanie analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Profile SSC/FSC typowej próbki pobranej z końcówki balonu cewnika u pacjenta z nadciśnieniem płucnym (A) oraz podobnej liczby komórek z komercyjnie pozyskanej pierwotnej hodowli ludzkich PAEC (B). Obie próbki zostały oczyszczone przy użyciu kolumny anty-CD146, utrwalone i permeabilizowane zgodnie z opisem w protokole przed analizą FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; wykresy FSC-A vs. SSC-A, analiza populacji komórek w kwadrantach A-D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Profile SSC/FSC typowego materiału pobranego z końcówki balonu cewnika u pacjenta z nadciśnieniem płucnym (A) oraz seryjne rozcieńczenia 1:10 ludzkiego buffy coat oczyszczonego w gradiencie Ficoll (B, C, D). Próbka (A) została oczyszczona za pomocą kolumny anty-CD146, natomiast próbki (B-D) nie. Wszystkie próbki komórek przed analizą FACS zostały utrwalone i permeabilizowane zgodnie z opisem w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej porównujące dane FSC-A vs SSC-A dla analizy eluatu i frakcji przepływowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Profile SSC/FSC z materiału pobranego z końcówki balonika cewnika u pacjenta z nadciśnieniem płucnym, u którego przed obróbką na końcówce cewnika widoczna była krew. Przed krokiem 3.1 protokołu próbkę podzielono, a do jednej z aliquot dodano bufor lizujący, natomiast do drugiej nie. (A) oraz (C) przedstawiają profile SSC/FSC próbki poddanej lizie, zarówno dla komórek zatrzymanych przez kolumnę (A), jak i dla frakcji przepływowej z kolumny. (B) oraz (D) przedstawiają profile SSC/FSC próbki niepoddanej lizie, zarówno dla komórek zatrzymanych przez kolumnę (B), jak i dla frakcji przepływowej z kolumny (D). Wyciągamy wniosek, że liza usuwa część, ale nie wszystkie leukocyty, jednak leukocyty nie są zatrzymywane przez kolumnę i tym samym zostają wykluczone z końcowego materiału, niezależnie od przeprowadzenia lizy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Próbka</td>
			<td >Data</td>
			<td >Wydajność komórkowa</td>
			<td >Rozpoznanie</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >433</td>
			<td >4/17/2018</td>
			<td >7364</td>
			<td >PH-śródmiąższowa choroba płuc</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >279</td>
			<td >4/17/2018</td>
			<td >7130</td>
			<td >PH-twardzina</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >432</td>
			<td >4/13/2018</td>
			<td >3976</td>
			<td >PH-wieloczynnikowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >431</td>
			<td >4/13/2018</td>
			<td >3634</td>
			<td >HFrEF</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >390</td>
			<td >4/13/2018</td>
			<td >5666</td>
			<td >PAH</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >423</td>
			<td >3/23/2018</td>
			<td >9024</td>
			<td >HFrEF</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >272</td>
			<td >3/23/2018</td>
			<td >7098</td>
			<td >HFrEF</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >408</td>
			<td >2/27/2018</td>
			<td >4784</td>
			<td >HFrEF</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >403</td>
			<td >2/14/2018</td>
			<td >10376</td>
			<td >PH-ASD+choroba zastawki mitralnej</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >396</td>
			<td >1/26/2018</td>
			<td >4890</td>
			<td >HFpEF-IPCPH</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >397</td>
			<td >1/26/2018</td>
			<td >7672</td>
			<td >Hemodynamika prawidłowa</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >318</td>
			<td >1/4/2018</td>
			<td >7002</td>
			<td >HFrEF-obecność LVAD</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Wydajność uzyskiwania komórek CD146+ z różnych zbiorów PAEC. Reprezentatywne wydajności uzyskiwania komórek CD146+ z różnych zbiorów PAEC z wykorzystaniem końcówek cewników pobranych od wielu pacjentów w różnych stanach chorobowych nadciśnienia płucnego oraz przy udziale różnych operatorów.

Ten protokół opisuje usuwanie i oczyszczanie komórek śródbłonka tętnicy płucnej (PAEC), które przylegają do końcówek balonów cewników Swan-Ganz, podczas gdy są zaklinowane w tętnicy płucnej podczas cewnikowania prawego serca i pozostają przylegające do opróżnionego balonu po usunięciu z ciała pacjenta.

Pobieranie komórek śródbłonka z końcówek balonów cewników Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca

A variety of pathologies lead to pulmonary hypertension (PH), which is defined as a mean pulmonary artery pressure exceeding 25 mmHg at rest. To further ...

Metoda ta zapewnia nowe podejście do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań naczyniowych płuc, takie jak ścieżka molekularna mechanizmów proliferacji błony wewnętrznej w nadciśnieniu płucnym. Główną zaletą tej metody jest to, że zapewnia ona minutową biopsję komórkową śródbłonka naczyń płucnych bez dodatkowego ryzyka dla pacjenta. Procedurę zademonstrują pani Reina Perez, nasz koordynator kliniczny, oraz dr Phillip Gallo, kierownik mojego laboratorium.Po wyjęciu cewnika z osłonki należy go natychmiast zanurzyć w 50-mililitrowej probówce wirówkowej zawierającej 40 mililitrów schłodzonej sterylnej soli fizjologicznej. Zakręć cewnikiem kilka razy, aby usunąć krew i przepłucz linię, jeśli to konieczne, aby usunąć zatrzymaną w niej krew. Odetnij dystalne pięć centymetrów końcówki cewnika i pozwól mu wpaść do probówki wirówkowej.Użyj kleszczy, aby natychmiast usunąć końcówkę i przenieś ją do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 15 mililitrów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka. Następnie uszczelnij rurkę. Umieść probówkę na lodzie i przenieś ją do laboratorium.Próbkę należy przetworzyć natychmiast lub zapakować ją w mokry lód w celu wysłania przez noc do laboratorium, w którym będzie miało miejsce przetwarzanie. Bardzo ważne jest, aby balon pozostał zanurzony w podłożu. Dlatego upewnij się, że w probówce o pojemności 15 ml jest minimalna przestrzeń nad głową, wypełniając ją całkowicie pożywką do wzrostu komórek śródbłonka.Najpierw dodaj pięć mililitrów roztworu do odrywania komórek do czystej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Umieść tę rurkę na lodzie. Za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra pobierz jeden mililitr pożywki z komórek śródbłonka z tego, co pozostało w probówce do pobierania przy łóżku.Ostrożnie włożyć igłę jednomililitrowej strzykawki do białego otworu naprzeciwko przewodu doprowadzającego. Umieść końcówkę cewnika w 15-mililitrowej probówce wirówkowej, która zawiera roztwór do odrywania komórek. Napompuj balon około 200 mikrolitrami pożywki, uważając, aby go nie rozerwać .Umieść probówkę na lodzie i pozostaw cewnik w roztworze do odłączania komórek przez pięć minut z napompowanym balonem. Następnie wlej zawartość probówki do 100-milimetrowego naczynia, upewniając się, że balon jest umieszczony w tej kałuży roztworu do odrywania komórek. Za pomocą skrobaka do komórek zeskrob napompowany balon, skup się na biegunach balonu, w którym styka się z cewnikiem.Następnie upewnij się, że skrobak do komórek styka się z całą powierzchnią balonu co najmniej dwa razy i okresowo płucz skrobak do komórek w roztworze do odłączania komórek. Opróżnij balon i zeskrob go ruchem szczotkowania. Następnie opłucz skrobak do komórek w kałuży roztworu do odrywania komórek.Wyrzuć końcówkę cewnika, igłę i skrobak do komórek do odpowiedniego pojemnika na odpady. Wlej roztwór do odrywania komórek, który zawiera pobrane komórki, do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Wstrząśnij probówką zbiorczą i wlej z niej pozostałą pożywkę również do pobranej próbki.Odwirować próbkę w temperaturze 650 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Zassać pożywkę, uważając, aby nie przeszkadzać ani nie zasysać osadu. Ponownie zawiesić osad w jednym miliicie schłodzonego roztworu do lizy czerwonych krwinek i przenieść tę zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mikrolitra i delikatnie kołysać probówką w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Odwirować probówkę w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie odessać roztwór do lizy czerwonych krwinek. Zawiesić osad w roztworze zawierającym PBS, bloker FcR i anty-ludzkie mikrogranulki CD-146.Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodaj jeden mililitr schłodzonego PBS. Wirować w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze schłodzonego PBS. Następnie umieść magnetyczną kolumnę LS na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej. Zalać kolumnę, dodając jeden mililitr PBS i pozwalając na przepływ całej objętości.Odrzuć przepływ. Załaduj próbkę na kolumnę magnetyczną i odrzuć przepływ. Przemyć kolumnę trzy razy, używając trzech mililitrów schłodzonego PBS do każdego przemycia.Odrzuć cały ten przepływ. Następnie dodaj trzy mililitry schłodzonego PBS do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Wyjmij kolumnę magnetyczną ze stojaka i wlej PBS z rurki do kolumny.Szybko umieść kolumnę w probówce wirówkowej, aby złapać przepływ. Natychmiast zanurzyć za pomocą tłoka dostarczonego z kolumną. Próbka jest teraz oczyszczona i gotowa do utrwalenia, barwienia lub hodowli.W tym badaniu komórki są oczyszczane z końcówek cewnika Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca. Komórki te wiążą się z kolumną selekcyjną CD-146 i mają profile rozproszenia do przodu i boku, które są nie do odróżnienia od hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka tętnicy płucnej. Ponieważ balon cewnika ma fizyczny kontakt tylko z osłonką wprowadzającą, ścianą naczynia tętnicy płucnej i krwią, a wykazano, że komórki nie pochodzą z krwi, dlatego zakłada się, że pochodzą one ze ściany naczynia tętnicy płucnej.Po zabiegu pobrane komórki można analizować różnymi metodami, takimi jak cytometria przepływowa, qPCR, sekwencjonowanie i proteomix. Wydajność komórek jest zbyt niska dla konwencjonalnego Western blot, ale można rozważyć metodologie blottingu o niskim wkładzie pracy. Komórki można hodować, ale jest to bardzo trudne i nie zawsze udaje się to w naszych rękach.Jeśli ma zostać podjęta próba przeprowadzenia posiewu, ważne jest, aby zminimalizować odstęp czasu między pobraniem końcówki cewnika od pacjenta a końcowymi etapami oczyszczania i powlekania, a także upewnić się, że próbka jest utrzymywana w niskiej temperaturze na wszystkich etapach obsługi metody. Nie zapominaj, że ten protokół obejmuje pracę z ludzką krwią i tkankami. Należy przestrzegać uniwersalnych środków ostrożności.W szczególności na wczesnym etapie protokołu znajduje się krok, który polega na wprowadzeniu ostrej igły w odcięty koniec końcówki cewnika, która jest zanieczyszczona krwią pacjenta. Nigdy nie zapominaj, że na tym etapie końcówka cewnika musi być trzymana hemostatykami, a nie palcami, aby uniknąć ryzyka wkłucia igłą.

harvest-endothelial-cells-from-balloon-tips-swan-ganz-catheters-after

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Tutaj prezentujemy protokół oceny funkcji krążeniowo-oddechowej u obudzonych świń, w spoczynku i podczas stopniowanych ćwiczeń na bieżni. Przewlekła aparatura pozwala na wielokrotne pomiary hemodynamiczne bez wpływu kardiodepresyjnych środków znieczulających.

Chirurgiczne umieszczanie cewników do długotrwałych testów wysiłkowych układu sercowo-naczyniowego u świń

Prezentowany tutaj jest protokół endoskopowego pobierania żył z dolnej części nogi, który można bezpiecznie wprowadzić do rutynowego pomostowania aortalno-wieńcowego. Przeszczepy żylne charakteryzują się doskonałą jakością przeszczepu zgodnie z tym ustandaryzowanym protokołem z ustawieniem nóg, minimalnie inwazyjnym dostępem do żyły i endoskopowym pobraniem żyły przedsionkowej.

Synergia endoskopowa antegrade z pomostowym pobraniem żył w celu poprawy jakości przeszczepu żyły odpiszczelowej z dolnej części nogi

Resuscytacja krążeniowo-oddechowa i defibrylacja są jedynymi skutecznymi opcjami terapeutycznymi podczas zatrzymania krążenia spowodowanego migotaniem komór. Model ten przedstawia ustandaryzowany schemat wywoływania, oceny i leczenia tego stanu fizjologicznego w modelu świniowym, zapewniając w ten sposób podejście kliniczne z różnymi możliwościami gromadzenia i analizy danych.

Standaryzowany model migotania komór i zaawansowanych zabiegów resuscytacji serca u świń

Tutaj prezentujemy podejście zamknięte w klatce piersiowej do zapisów pętli ciśnienia i objętości w dwóch komorach u świń z ostrą dysfunkcją prawej komory.

Zamknięte dwukomorowe nagrania pętli ciśnieniowo-objętościowej klatki piersiowej z cewnikami wstępnymi w modelu wieprzowym

Opisano niezawodne i powtarzalne podejście do wprowadzania i konserwacji tunelizowanego cewnika Hickmana do długoterminowego dostępu naczyniowego u świń. Umieszczenie centralnego cewnika żylnego pozwala na wygodne codzienne pobieranie próbek krwi pełnej od obudzonych zwierząt oraz dożylne podawanie leków i płynów.

Zastosowanie cewnika Hickmana do długotrwałego dostępu naczyniowego w przedklinicznym modelu trzody chlewnej

To badanie przedstawia świński model zatorowości płucnej (PE) wykorzystujący duże autologiczne zatory replikujące ostry PW pośredniego ryzyka. Model doskonale nadaje się do oceny zarówno patofizjologii, jak i odpowiedzi na leczenie.

Świński model ostrej autologicznej zatorowości płucnej

Zwężenie żyły płucnej (PVS) to zagrażający życiu powikłanie fibrozującego śródstności (FM), o słabym rokowaniu, jeśli nie jest odpowiednio leczone. Obecnie angioplastyka endowaskularna oparta na cewniku jest obiecującą strategią terapeutyczną dla PVS związanego z FM. Protokół ten przede wszystkim określa stopniowe podejście do procedury transcewtorowej dla PVS związanego z FM.

Angioplastyka endowaskularna oparta na cewniku w przypadku włóknienia zwężenia żyły płucnej związanej z mediastynitem

Ten artykuł zawiera protokół do echokardiograficznej oceny wielkości prawej komory i nadciśnienia płucnego u myszy.  Zastosowania obejmują określanie fenotypu i seryjną ocenę w transgenicznych i indukowanych toksynami mysich modelach kardiomiopatii i chorób naczyń płucnych.

Echokardiograficzna ocena prawego serca u myszy

Ten artykuł opisuje pomiar funkcji lewej komory myszy za pomocą analizy ciśnienia/objętości przy różnych częstościach akcji serca.

Cewnikowanie serca u myszy w celu pomiaru zależności objętości ciśnienia: badanie efektu Bowditcha

Poznaj metodę izolacji komórek śródbłonka z końcówek cewników Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca. Technika umożliwia bezpieczną biopsję komórkową naczyń płucnych z minimalnym ryzykiem dla pacjenta.

Pobieranie komórek śródbłonka z końcówek balonów cewników Swan-Ganz po cewnikowaniu prawego serca

Przeglądaj więcej filmów