Name: Nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym w mysim modelu endometriozy. Technika umożliwia dynamiczną ocenę skuteczności leków poprzez pomiar zmian wielkości zmian endometrialnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności poprzez Program Miguela Serveta [CP13/00077] współfinansowany przez FEDER (Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego) i przyznany dr R. Gómezowi, jak również przez granty Instytutu Zdrowia Carlosa III przyznane dr R Gómezowi [PI14/00547 i PI17/02329] oraz prof. A. Cano [PI12/02582].

Użycie próbek tkanek ludzkich zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną i Komisję Etyki Szpitala Universitario La Fe. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę. Badanie na zwierzętach zostało zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, a wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania ssaków z National Institutes of Health.
1. Pobieranie i wstępne przetwarzanie tkanek endometrium
<ol>
	<li>Uzyskaj dobrej jakości biopsję ludzkiego aspiratu endometrium za pomocą kaniuli podłączonej do urządzenia ssącego. Wlać biopsję do kolby zawierającej 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej i przemyć delikatnym ręcznym mieszaniem. 
	nuta: Procedury dotyczące uzyskiwania biopsji dobrej jakości zostały wcześniej opisane17.</li>
	<li>Umyj biopsję z pozostałej krwi lub śluzu. Powtórz proces, wlewając tkankę do kolb zawierających świeżą sól fizjologiczną, tyle zębów, ile potrzeba, aż do momentu, gdy tkanka będzie czysta.</li>
	<li>Przenieść fragmenty biopsji o zdrowym wyglądzie do roztworu zawierającego 10 ml kompletnej pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.</li>
	<li>Wlej zawartość na 10-centymetrową szalkę Petriego i przystąp do krojenia tkanki na 5–10 mm3 kawałki za pomocą skalpeli.</li>
</ol>
2. Transfekcja adenowirusowa fragmentów endometrium
UWAGA: Wszystkie materiały, które zostaną użyte w tym procesie, powinny być wcześniej wprowadzone do maski. Wyjmij wszystko, co nie zostanie użyte w tym procesie i umieść kolbę z wybielaczem. Cały materiał, który ma kontakt z wektorem adenowirusowym, musi zostać zdezynfekowany wybielaczem przed wyrzuceniem go do pojemnika na zagrożenie biologiczne.
<ol>
	<li>Po posiekaniu biopsji weź nową szalkę Petriego. Odpipetować wielokrotne krople DMEM o pojemności 30–50 μl rozprowadzane po całym naczyniu. Pozostaw wystarczająco dużo miejsca między kroplami, aby się nie stykały.</li>
	<li>Za pomocą igły przymocowanej do strzykawki umieść pojedynczy kawałek fragmentu w każdej z kropli pożywki. 
	UWAGA: Każda kropla powinna zawierać pojedynczy fragment endometrium.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy Ad-mCherry, rozcieńczając 1:20 roztworu podstawowego mCherry adenoviral [1 x10 pfu/ml]) w pożywce DMEM BEZ antybiotyków (DMEM + 10% przefiltrowany FBS).</li>
	<li>Dozować 100–200 μl roztworu Ad-mCherry na dołek na 96-dołkową płytkę, wypełniając tyle dołków, ile fragmentów jest dostępnych w kroplach na szalce Petriego (krok 2.2). Ponadto należy napełnić co najmniej 3 studzienki pożywką DMEM wolną od adenowirusa jako kontrolą negatywną.</li>
	<li>Za pomocą igły przymocowanej do strzykawki, przenieść każdy z fragmentów na szalce Petriego (krok 2.2) do każdej z studzienek zawierających roztwór ad-mCherry na płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Umieścić 96-dołkową płytkę zawierającą fragmenty endometrium z roztworem Ad-mCherry w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 16 godzin.</li>
	<li>Wypłukać pozostałe adenowirusy w pożywce, przenosząc tkanki na nową 96-dołkową płytkę wypełnioną kompletnym podłożem DMEM (Z antybiotykami przeciwgrzybiczymi, wolnymi od adenowirusa) i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24–48 h. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby pokryć wybielaczem wszystkie płytki i końcówki, które miały kontakt z wirusem AD, przed wyrzuceniem do pojemnika na zagrożenie biologiczne.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić ją pod mikroskopem fluorescencyjnym o długości fali 568 nm (kanał czerwony) w celu sprawdzenia optymalnego oznakowania.</li>
	<li>Wybierz najbardziej błyskotliwe fragmenty i umieść je na nowej 96-dołkowej płytce ze świeżą, kompletną pożywką DMEM (Z antybiotykami-lekami przeciwgrzybiczymi, wolnymi od adenowirusa).</li>
	<li>Dobrze uszczelnij płytkę folią parafinową z tworzywa sztucznego i przetransportuj ją do obszaru dla zwierząt wolnego od specyficznych patogenów w celu implantacji fragmentów endometrium zwierzętom biorczym.</li>
</ol>
3. Generowanie mysiego modelu endometriozy
UWAGA: Użyj 6-8 tygodniowych samic myszy z obniżoną odpornością, które są trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów, jako zwierząt biorców. Aby uniknąć zmian zależnych od cyklu hormonalnego i jednocześnie napędzać wzrost zmian za pomocą estradiolu, zwierzęta są poddawane owariektomii i umieszczane w kapsułkach o 60-dniowym uwalnianiu zawierających 18 mg 17 βeta-estradiolu (17β-E2). Wycięcie jajników i umieszczenie osadu należy wykonać co najmniej tydzień przed przeszczepieniem fragmentów endometrium zwierzętom biorcom.
<ol>
	<li>Wycięcie jajników 
	UWAGA: Przygotuj wysterylizowany materiał chirurgiczny w kapturze. Przygotuj sprzęt anestezjologiczny i strefę rekonwalescencji pooperacyjnej w tym samym pomieszczeniu.
	<ol>
		<li>Wykonać podskórne wstrzyknięcie pochodnej morfiny w dawce 5 mg/kg na mysz. Pozwól myszom odpocząć przez 30 minut po wstrzyknięciu, aby mogły objawić się przeciwbólowe działanie leku.</li>
		<li>Podłącz sprzęt do znieczulenia wziewnego i pozwól, aby tlen i izofluran (2% mg/kg) przepływały przez kilka minut do szczelnej komory anestezjologicznej.</li>
		<li>Wprowadzić zwierzę do komory anestezjologicznej izofluranu. Odczekaj 3–5 minut i sprawdź, czy zwierzęta są w pełni znieczulone, naciskając jedną z ich łap. Przenieść zwierzę na salę operacyjną i utrzymać znieczulenie, umieszczając maskę z ciągłym przepływem izofluranu pokrywającego drogi oddechowe.</li>
		<li>Po zdezynfekowaniu obszaru chloroheksydyną wykonaj poprzeczne nacięcie żebrowe o długości 0,5 cm mniej więcej na wysokości biodra ostrymi nożyczkami.</li>
		<li>Oddziel skórę od mięśnia, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej, zidentyfikuj białą poduszeczkę tłuszczową otaczającą jajnik i wycofaj jajnik za pomocą kleszczy preparacyjnych.</li>
		<li>Zawiąż węzeł wokół jajowodu za pomocą wchłanialnego szwu i zaciśnij go, aby zapewnić odpowiednią hemostazę przed wycięciem jajnika.</li>
		<li>Zamknij warstwę mięśniową szwem wchłanialnym 6-0, a następnie zamknij skórę szwem niewchłanialnym 6-0. Ponownie oczyść obszar roztworem antyseptycznym.</li>
		<li>Powtórz procedurę, aby usunąć przeciwległy jajnik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implant granulatu estradiolu 
	UWAGA: Zadbaj o to, aby zwierzę było znieczulone podczas operacji wycięcia jajników, aby w tym momencie umieścić granulki.
	<ol>
		<li>Bezpośrednio po zakończeniu zabiegu wycięcia jajników należy oczyścić skórę roztworem antyseptycznym otaczającym szyję i wykonać poprzeczne podskórne małe (0,5 cm) nacięcie ostrymi nożyczkami w karku.</li>
		<li>Użyj nożyczek, aby wyciąć skórę z mięśnia, tworząc kieszeń wystarczająco dużą, aby umożliwić umieszczenie granulek.</li>
		<li>Wprowadzić osad zawierający 18 mg 17β-E2 i zszyć skórę niewchłanialnym szwem 6-0. Ponownie oczyść obszar roztworem antyseptycznym.</li>
		<li>Umieść zwierzę w strefie rekonwalescencji i podaj optymalną dawkę długotrwałego środka przeciwbólowego, aby ułatwić okres rekonwalescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chirurgia implantów endometrium 
	UWAGA: Należy odczekać co najmniej siedmiodniową kwarantannę, aby umożliwić pełne wyzdrowienie zwierząt po wycięciu jajników przed rozpoczęciem operacji implantacji fragmentu endometrium. Aby uzyskać optymalną synchronizację z etykietowaniem tkanki, należy pobrać biopsję 2-3 dni przed zabiegiem implantacji, aby uniknąć długotrwałej hodowli eksplantatów.
	<ol>
		<li>Przygotuj z wyprzedzeniem salę operacyjną w strefie wolnej od patogenów. Przygotuj kaptur z całym wymaganym materiałem chirurgicznym, sprzętem anestezjologicznym, a także strefą rekonwalescencji pooperacyjnej.</li>
		<li>Przyprowadź zwierzęta do pokoju, wykonaj podskórne wstrzyknięcie pochodnej morfiny w dawce 5 (mg/kg) każdej myszy. Pozwól myszom odpocząć przez 30 minut po wstrzyknięciu, aby można było zamanifestować przeciwbólowe działanie leku.</li>
		<li>Podłącz sprzęt do znieczulenia wziewnego i pozwól, aby tlen i izofluran (2% mg/kg) przepływały przez kilka minut do szczelnej komory anestezjologicznej.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem operacji należy przenieść płytkę zawierającą fluorescencyjnie znakowane fragmenty (z kroku 2.10) do kaptura, rozszczelnić ją i wsypać fragmenty na szalkę Petriego w celu łatwiejszej obsługi.</li>
		<li>Wprowadzić zwierzę do komory anestezjologicznej izofluranu. Odczekaj 3–5 minut i sprawdź, czy zwierzęta są w pełni znieczulone, naciskając jedną z ich łap. Przenieść zwierzę na salę operacyjną i utrzymać znieczulenie, umieszczając maskę z ciągłym przepływem izofluranu pokrywającego drogi oddechowe.</li>
		<li>Ułóż znieczulone zwierzę twarzą do góry. Zdezynfekuj obszar brzuszny. Wykonaj podłużne 1,5 cm nacięcie brzucha ostrymi nożyczkami i oddziel skórę od mięśnia. Następnie wykonaj podłużne 1,5 cm nacięcie w mięśniu, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej.</li>
		<li>Przytrzymaj lewą krawędź ściany mięśniowej brzucha za pomocą mini-kleszczy i złóż ją, próbując odsłonić wewnętrzną powierzchnię otrzewnej na zewnątrz.</li>
		<li>Weź implant endometrium za pomocą mini pęsety, zanurz go na krótko w kleju cyjanoakrylowym z estru n-butylu i umieść go w otrzewnej, gdzie zostanie przyczepiony. Pozostaw do wyschnięcia na kilka sekund. Powtórz kroki 3.3.6 i 3.3.7, aby umieścić implant po przeciwnej stronie otrzewnej.</li>
		<li>Zamknij warstwę mięśniową wchłanialnym szwem 6-0, a następnie zamknij skórę niewchłanialnym szwem 6-0. Ponownie oczyść obszar roztworem antyseptycznym.</li>
		<li>Umieść zwierzę w strefie odwyu i podaj optymalną dawkę długotrwałego środka przeciwbólowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie fluorescencyjne in vivo za pomocą systemu obrazowania in vivo
<ol>
	<li>Włącz urządzenie systemu obrazowania in vivo, zainicjuj program i pozwól kamerze CCD ostygnąć przez kilka minut.</li>
	<li>Przygotuj sprzęt do znieczulenia wziewnego. Otworzyć przepływ izofluranu o stężeniu 2% na kilka minut, aby napełnić komorę znieczulającą. Przygotuj strefę rekonwalescencji po znieczuleniu.</li>
	<li>Po uruchomieniu programu i ostygnięciu kamery CCD kliknij narzędzie Kreator obrazowania: Samouczek rozpoczyna się od wyświetlenia serii kolejnych okien, z których każde odpowiada interesującemu go parametrowi z kilkoma opcjami dostępnymi do wyboru, klikając odpowiednie pole. Przejdź przez samouczek, zaznaczając odpowiednie pola w każdym oknie i kliknij przycisk OK, aby przejść do następnego zestawu parametrów w następującej sekwencji.
	<ol>
		<li>Zaznacz pole Epiluminescencja dla parametru fluorescencji, wybierz pole mCherry dla parametru par filtrów. Zaznacz pola Tryb fotografowania i Potwierdź ostrość, a następnie wybierz pole Automatycznie dla parametru ekspozycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ustawieniu instrumentu przenieś jedno zwierzę do komory anestezjologicznej. Po całkowitym znieczuleniu przenieś zwierzę do klatki systemu obrazowania in vivo i umieść je stroną do góry z głową w kanaliku podłączonym do aparatu do znieczulenia. Zamknij pokrywę i kliknij przycisk Pobierz do monitorowania.</li>
	<li>Pobierz pojawiające się obrazy (w sumie pięć obrazów, po jednym obrazie dla każdej pary wybranych filtrów) i zapisz dane, klikając przycisk Zapisz jako. Przesuń mysz do obszaru rekonwalescencji po znieczuleniu. Powtórz ten proces z pozostałymi zwierzętami.</li>
	<li>Powtarzaj monitorowanie dwa lub trzy razy w tygodniu, aby odpowiednio śledzić sygnał w trakcie trwania kursu czasowego.</li>
	<li>Przystąp do złożenia zwierzęcia w ofierze pod koniec biegu czasu przez uduszenie CO2 .</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja obrazów fluorescencyjnych in vivo
<ol>
	<li>Segregacja rzeczywistej fluorescencji poprzez wymieszanie obrazu:
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do analizy sprzężonej z obrazowaniem in vivo.</li>
		<li>Wybierz plik "Sequenceinfo", aby rozpocząć analizę. Pojawią się dwa okna: "Widok sekwencji" i "Paleta narzędzi". Wybierz Paletę narzędzi, a po wyświetleniu menu wybierz następujące opcje.</li>
		<li>Wybierz Korekcje i kliknij pole Adaptacyjne odejmowanie tła FL, aby usunąć niepożądane sygnały fluorescencyjne z danych obrazu luminescencyjnego. Wybierz próg, który najbardziej Cię interesuje, i kliknij przycisk Ustaw.</li>
		<li>Kliknij opcję Spectral Unmixing, wybierz interesujące Cię długości fal, metodę wybranego rozmieszania (biblioteka, z przewodnikiem, automatyczna lub ręczna), a następnie kliknij przycisk Start Unmix.</li>
		<li>Wybierz niezmieszany obraz odpowiadający sygnałowi mCherry i kliknij dwukrotnie. Pojawi się nowe okno z końcowym obrazem interesującego sygnału.</li>
		<li>Powtórz krok 5.1.3.</li>
		<li>OPCJONALNIE: Jeśli potrzebny jest reprezentatywny obraz (JPEG) wyniku mieszania, wybierz żądane ustawienia w Palecie narzędzi | Dostosuj obraz (tabela kolorów, binowanie, kontrast itp.), a następnie kliknij Eksportuj grafikę w oknie unmix, aby wyeksportować bieżący widok obrazu jako obraz.</li>
		<li>Zapisz niezmieszany plik: Plik | Zapisz jako | Wybierz folder i OK.</li>
		<li>Powtórz ten proces z pozostałymi dniami monitorowania i ze wszystkimi zwierzętami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja ROI i kwantyfikacja sygnału
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Browse (Przeglądaj) i wybierz plik niezmieszany (patrz krok 5.1.8), który ma zostać przeanalizowany. Pojawi się nowe okno.</li>
		<li>Kliknij Dodaj do listy, aby dołączyć wszystkie niezmieszane pliki z każdego zwierzęcia w różnych punktach czasowych, a następnie kliknij Załaduj jako grupę. Wszystkie obrazy muszą być wyświetlane jako pojedyncza sekwencja.</li>
		<li>Przejdź do okna Paleta narzędzi: Zaznacz pole Skalaindywidualna, aby uzyskać wszystkie obrazy w tej samej skali.</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie jeden obraz sekwencji i utwórz ROI w strefie zainteresowania, korzystając z poniższej sekwencji. Przejdź do Narzędzi ROI i wybierz opcję Countour i Auto 1, kliknij pojawiający się kształt koła, umieść go na środku sygnału fluorescencyjnego, a następnie kliknij Utwórz w wyświetlonym oknie. 
		Uwaga: Spowoduje to automatyczne podświetlenie pikseli o intensywności fluorescencji powyżej wartości tła (tj. uszkodzenia) i wygenerowanie kształtu, którego obszar obejmuje obrysowane piksele.</li>
		<li>Skopiuj utworzony kształt ROI i wklej go w strefie tła, w której nie ma sygnału.</li>
		<li>Kliknij Mierz zwrot z inwestycji | Wybierz opcję Wszystkie, aby wyświetlić wartości intensywności fluorescencji. Przejdź do wybierania wartości danych za pomocą myszy, kliknij prawym przyciskiem, naciśnij kopiuj i wklej w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Dane (sygnał fluorescencyjny) Normalizacja
<ol>
	<li>Wybierz początkowy punkt czasowy, w którym intensywność sygnału jest maksymalna. Przejdź do normalizacji sygnału w każdym punkcie czasowym, korzystając ze wzoru: 
	Natężenie sygnału w każdym punkcie czasowym / Maksymalne natężenie sygnału obserwowane w czasie trwania kursu) x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Obstetrics+%26+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of endometriosis.</a> Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).</li>
<li>Holoch, K. J., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/clinicalobgyn/Abstract/2010/06000/Endometriosis_and_Infertility.19.aspx">Endometriosis and infertility.</a> Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).</li>
<li>Eskenazi, B., Warner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+and+Gynecology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of endometriosis.</a> Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).</li>
<li>Giudice, L. C., Kao, L. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15541453">Endometriosis.</a> Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).</li>
<li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+medical+and+surgical+treatment+of+endometriosis-associated+infertility+and+pelvic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+and+Obstetric+Investigation%22%5BJournal%5D)">The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain.</a> Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).</li>
<li>D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+laparoscopic+appearance+of+spontaneous+endometriosis+in+the+baboon+%28Papio+anubis%2C+Papio+cynocephalus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus).</a> Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).</li>
<li>Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Record+review+of+baboons+with+histologically+confirmed+endometriosis+in+a+large+established+colony%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Primatology%22%5BJournal%5D)">Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony.</a> Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).</li>
<li>Donnez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+endometriotic+nodules+in+an+experimental+baboon+modelmimicking+human+deep+nodular+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+%26+Sterility%22%5BJournal%5D)">Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions.</a> Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).</li>
<li>Grummer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+endometriosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Animal models in endometriosis research.</a> Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+aspects+of+endometriosis+in+a+mouse+model+through+analysis+of+implantation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).</li>
<li>Grummer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+endometriosis%3A+validation+of+an+in-vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model.</a> Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).</li>
<li>Becker, C. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002944010622249">A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy.</a> The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).</li>
<li>Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+contribute+to+the+vascularization+of+endometriotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).</li>
<li>Nap, A. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15001592">Antiangiogenesis therapy for endometriosis.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodrug+of+green+tea+epigallocatechin-3-gallate+%28Pro-EGCG%29+as+a+potent+anti-angiogenesis+agent+for+endometriosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice.</a> Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).</li>
<li>Delgado-Rosas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+ergot+and+non-ergot-derived+dopamine+agonists+in+an+experimental+mouse+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis.</a> Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).</li>
<li>Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pilot+study+to+evaluate+the+relative+efficacy+of+endometrial+biopsy+and+full+curettage+in+making+a+diagnosis+of+endometriosis+by+the+detection+of+endometrial+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+%26+Gynecology%22%5BJournal%5D)">A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers.</a> American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578(2007).</li>
<li>Fortin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+human+endometriotic+tissue+maintenance+and+regression+in+a+noninvasive+mouse+model+of+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis.</a> Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nude+mouse+models+for+green+fluorescence+human+endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Obstetrics+and+Gynaecology+Research%22%5BJournal%5D)">Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis.</a> Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+fluorescent+nude+mouse+model+of+human+endometriosis%3A+advantages+of+a+non-invasive+imaging+method%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Obstetric+Gynecologic+and+Reproductive+Biology%22%5BJournal%5D)">A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method.</a> European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje implementację zwierzęcego modelu endometriozy, w którym zachowana jest architektura implantacji zmian chorobowych, a jednocześnie możliwa jest ocena w czasie rzeczywistym fluorescencji emitowanej przez tkankę endometrium znakowaną mCherry. W tym protokole opisujemy zastosowanie specyficznego systemu obrazowania in vivo i powiązanego oprogramowania do nieinwazyjnej oceny fluorescencji emitowanej przez znakowaną zmianę. Każdy użytkownik powinien dostosować protokół w zależności od kon...

Endometrioza to przewlekła choroba ginekologiczna zainicjowana przez zagnieżdżenie się funkcjonalnego endometrium poza jamą macicy. Zmiany ektopowe rosną i wywołują procesy zapalne prowadzące do przewlekłego bólu miednicy i niepłodności1. Szacuje się, że endometrioza dotyka nawet 10–15% kobiet w wieku rozrodczym2 i występuje ona u około 40–50% kobiet niepłodnych3. Obecne leczenie farmakologiczne endometriozy nie jest w stanie całkowicie wyeliminować zmian chorobowych i nie jest wolne od skutków ubocznych4,5. Badania nad skuteczniejszymi terapiami wymagają udoskonalenia istniejących zwierzęcych modeli endometriozy w taki sposób, aby można było odpowiednio naśladować zmiany chorobowe u ludzi, a także dokładnie ocenić wpływ związków chemicznych na wielkość zmiany.
Modele naczelnych zostały użyte do naśladowania endometriozy poprzez wszczepianie zmian ektopowych histologicznie identycznych i w podobnych miejscach jak u ludzi6,7,8; jednak obawy etyczne i wysokie koszty ekonomiczne związane z eksperymentami na naczelnych ograniczają ich stosowanie9. W związku z tym wykorzystanie małych zwierząt, zwłaszcza gryzoni, do wdrażania modeli endometriozy in vivo jest nadal preferowane, ponieważ pozwala to na badania z większą liczbą osób10,11. Endometriozę można wywołać u tych zwierząt poprzez przeszczepienie kawałków rogów macicy gryzoni ("modele homologiczne")12,13 lub ludzkiej tkanki endometrialnej/endometriotycznej do miejsc ektopowych (modele heterologiczne)14. W przeciwieństwie do ludzi, gryzonie nie zrzucają tkanki endometrium, a tym samym endometrioza nie może rozwinąć się spontanicznie u tych gatunków. W związku z tym homologiczne mysie modele endometriozy zostały skrytykowane ze względu na fakt, że wszczepiona ektopowa tkanka macicy myszy nie odzwierciedla cech ludzkich zmian endometriotycznych 15.
Odpowiednią fizjologię endometriozy można naśladować w heterologicznych modelach endometriozy, gdzie świeże ludzkie fragmenty endometrium są wszczepiane zwierzętom z niedoborem odporności. W konwencjonalnych modelach heterologicznych efekty terapeutyczne związków będących przedmiotem zainteresowania są zwykle oceniane w punkcie końcowym poprzez ocenę wielkości zmiany za pomocą suwmiarki16. Oczywistym ograniczeniem jest to, że modele zwierzęce punktów końcowych nie pozwalają na badanie dynamiki implantacji lub rozwoju zmian endometriotycznych w czasie. Dodatkowym ograniczeniem jest to, że stosowanie suwmiarki nie pozwala na dokładne zmierzenie wielkości zmiany. Rzeczywiście, błąd standardowy zapewniany przez suwmiarki mieści się w tym samym zakresie (tj. milimetrach) co rozmiar zmian wszczepionych myszom, ograniczając w ten sposób zdolność tych narzędzi do wykrywania rzeczywistych zmian wielkości.
Aby przezwyciężyć takie ograniczenia, opisujemy tutaj generowanie heterologicznego mysiego modelu endometriozy, w którym wszczepiona ludzka tkanka jest zaprojektowana tak, aby wyrażała reporterowe białko fluorescencyjne m-wiśni. Detekcja sygnału fluorescencyjnego za pomocą odpowiedniego systemu obrazowania umożliwia nieinwazyjne monitorowanie stanu zmiany chorobowej z jednoczesną kwantyfikacją jej wielkości w czasie rzeczywistym. W związku z tym nasz model zapewnia wyraźne korzyści w porównaniu z konwencjonalnymi modelami punktów końcowych, ponieważ daje możliwość nieinwazyjnego monitorowania w czasie rzeczywistym oraz możliwość przeprowadzenia bardziej obiektywnego i dokładnego oszacowania zmian wielkości zmiany.

<table><tbody><tr><td>Endosampler&handel;</td><td>Medgyn</td><td>22720</td><td>Kaniula do pobierania próbek endometrium macicy</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>VWR</td><td>HYCLSH30285. FS</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>Vector Biolabs</td><td>1767</td><td>Wektor adenowirusowy z ekspresją mCherry</td></tr><tr><td>PBS, 1x roztwór, sterylny, pH 7,4</td><td>VWR</td><td>E504-500ML</td><td>Bufor do mycia</td></tr><tr><td>Granulki 17-B-Estradiol 18 mg/60 dni</td><td>Innowacyjne badania Ameryki</td><td>SE-121</td><td>Granulki hormonalne dla gryzoni</td></tr><tr><td>Vetbond&trade; Klej tkankowy</td><td></td><td>3M 780-680</td><td>Klej tkankowy</td></tr><tr><td>Szalki Petriego z kryształu polistyrenowego</td><td>Levantina</td><td>367-P101VR20</td><td>szalki Petriego</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Strzykawki medyczne 10 ml 0,5 ml</td><td>Strzykawki</td><td>VWR</td><td>CODA626616</td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe, bezpudrowe</td><td>Rękawice VWR</td><td>112-2754</td><td></td></tr><tr><td>Miękkie szwajcarskie nagie myszy</td><td>Charles River</td><td>SNUSSFE05S</td><td>Myszy do eksperymentu na zwierzętach</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum System obrazowania in vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Sprzęt do monitorowania in vivo</td></tr><tr><td>Żywy obraz&reg; (Oprogramowanie Ivis)</td><td>Perkin Elmer</td><td>---</td><td>Oprogramowanie do monitorowania in vivo</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>10082147</td><td>Serum wzbogacające</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki poddane hodowli komórkowej</td><td>Technologie życiowe</td><td>167008</td><td>Płytki hodowlane</td></tr><tr><td>Kolby na mocz</td><td>Summedical</td><td>4004-248-001</td><td>Kolby do płukania</td></tr><tr><td>Sterylne ostrza chirurgiczne</td> <td>(Aesculap Division) Sanycare</td><td>1609022-0008</td><td>Ostrza chirurgiczne</td></tr><tr><td>Isovet 1 000 mg/g</td><td>B-BRAUN</td><td></td>---<td>Isoflurane (znieczulenie)</td></tr><tr><td>Buprex&reg; 0,3 mg</td><td>Schering Plough S.A.</td><td>---</td><td>Buprenorfina (roztwór przeciwbólowy)</td></tr><tr><td>Roztwór morfiny do wstrzykiwań 10 mg/ml</td><td>B BRAUN</td><td></td>---<td>Morfina (roztwór przeciwbólowy)</td></tr><tr><td>Monofyl&reg; Szwy wchłanialne</td><td>COVIDIEN</td>---<td></td><td>Szwy</td></tr><tr><td>Desinclor chlorheksydyna Promedic</td><td>SA</td><td></td>---<td>Roztwór antyseptyczny</td></tr><tr><td>Mikroskopia DMi8</td><td>Leica Mycrosystems</td><td>---</td><td>mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Inkubator Hera Cell 150</td><td>Inkubator 51026282 Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Tutaj opisujemy protokół implementacji heterologicznego modelu myszy, w którym postęp endometriozy może być oceniany w czasie rzeczywistym poprzez nieinwazyjne monitorowanie fluorescencji emitowanej przez wszczepioną ektopową ludzką tkankę endometrium. W tym celu pobiera się biopsje ludzkiego endometrium od dawczyń będących dawczyniami w trakcie dawstwa komórek jajowych. Ludzkie fragmenty endometrium są hodowane w obecności adenowirusów zmodyfikowanych do ekspresji cDNA dla reporterowego białka fluorescencyjnego mCherry. Po wizualizacji, znakowane tkanki o optymalnym współczynniku fluorescencji po infekcji są następnie wybierane do implantacji u myszy biorców. Na tydzień przed zabiegiem implantacji myszy biorcy są poddawane orektomizacji jajników, a granulki estradiolu są umieszczane podskórnie, aby utrzymać przeżycie i wzrost zmian. W dniu operacji myszy są znieczulane, a dostęp do jamy otrzewnej odbywa się przez małe (1,5 cm) nacięcie przez kreskę białą. Implanty znakowane fluorescencyjnie są pęsetą, krótko nasączane klejem i przyklejane do warstwy otrzewnej. Nacięcia są zszywane, a zwierzęta pozostawiane do wyzdrowienia na kilka dni. Fluorescencja emitowana przez implanty endometriotyczne jest zwykle nieinwazyjnie monitorowana co 3 dni przez 4 tygodnie za pomocą systemu obrazowania in vivo. Różnice w wielkości implantów endometriotycznych można oszacować w czasie rzeczywistym poprzez kwantyfikację sygnału mCherry i normalizację w stosunku do początkowego punktu czasowego wykazującego maksymalną intensywność fluorescencji.
Tradycyjne przedkliniczne gryzonie na modelach endometriozy nie pozwalają na nieinwazyjne monitorowanie zmiany w czasie rzeczywistym, ale raczej pozwalają na ocenę efektów leków testowanych w punkcie końcowym. Protokół ten pozwala na śledzenie zmian chorobowych w czasie rzeczywistym i jest bardziej przydatny do badania potencjału terapeutycznego leków w przedklinicznych modelach endometriozy. Głównym ograniczeniem wygenerowanego w ten sposób modelu jest to, że nieinwazyjne monitorowanie nie jest możliwe przez długi czas ze względu na episomalną ekspresję wirusa Ad.

Opisujemy tutaj proces tworzenia heterologicznego modelu endometriozy, w którym architektura zmian zostaje zachowana poprzez implantację fluorescencyjnie znakowanych fragmentów ludzkiego endometrium do myszy z niedoborem odporności, co umożliwia nieinwazyjne monitorowanie progresji zmian. Znakowanie fragmentów endometrium odbywa się poprzez infekcję adenowirusem zmodyfikowanym tak, aby wprowadzał ekspresję mCherry – białka emitującego fluorescencję w obszarze bliskiej podczerwieni. Na <st...

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania na żywo fluorescencyjnie znakowanych fragmentów ludzkiego endometrium przeszczepionych myszom. Metoda pozwala na badanie wpływu wybranych leków na wielkość zmiany endometriotycznej poprzez monitorowanie i kwantyfikację fluorescencji emitowanej przez reporter fluorescencyjny w czasie rzeczywistym

Nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w ocenie efektów terapeutycznych leków w dziedzinie endometriozy, takich jak wpływ związków antyandrogennych na wielkość zmian endometriozy. Główną zaletą tej techniki jest to, że działanie konkretnych leków można ocenić w zwierzęcych modelach endometriozy w czasie rzeczywistym, a nie w punkcie końcowym. Procedurę zademonstrują Jessica Martinez, która jest technikiem z mojego laboratorium, a także Viviana Bisbal i Nerea Marin, które są weterynarzami z Centro de Investigacion Principe Felipe i które ściśle współpracują z naszym zespołem.Dwa do trzech dni przed zabiegiem wszczepienia implantu przenieś wypłukane, zdrowe fragmenty biopsji tkanki endometrium na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą kompletne podłoże i użyj skalpeli, aby zmielić tkankę na kawałki o wielkości od pięciu do 10 milimetrów sześciennych. Za pomocą mikropipety dodaj od 30 do 50 mikrolitrów kropli DMEM na dno nowej 10-centymetrowej płytki hodowlanej, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca między każdą kroplą, aby nie stykały się ze sobą. Po umieszczeniu wszystkich kropli użyj igły strzykawki, aby umieścić pojedynczy fragment tkanki biopsyjnej w każdej

noninvasive-monitoring-lesion-size-heterologous-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opis chirurgicznego indukowania endometriozy u myszy i szczurów poprzez autotransplantację tkanki macicy do kaskady tętniczej krezki jelitowej.

Myszowy model chirurgicznie wywołanej endometriozy poprzez autotransplantację tkanki macicy

Opisujemy nieinwazyjną platformę obrazowania zwierząt, która pozwala na wykrywanie, kwantyfikację i monitorowanie wzrostu i nawrotów raka jajnika. Ten model ksenoprzeszczepu dootrzewnowego naśladuje profil kliniczny pacjentek z rakiem jajnika.

Mysi model do nieinwazyjnego obrazowania w celu wykrywania i monitorowania nawrotu raka jajnika

Opisujemy metody długotrwałego monitorowania skuteczności terapii w leczeniu patologii jelita grubego u myszy za pomocą sztywnego endoskopu. Protokół ten może być z łatwością wykorzystany do scharakteryzowania odpowiedzi terapeutycznej pojedynczego guza u żywych myszy, a także do monitorowania potencjalnego nawrotu choroby.

Nieinwazyjna ocena skuteczności nowych terapii patologii jelitowych za pomocą seryjnego obrazowania endoskopowego żywych myszy

Przerzuty raka jajnika charakteryzują się licznymi rozlanymi zmianami wewnątrzotrzewnowymi, tak że dokładne wizualne określenie obciążenia guzem jest trudne.  W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego oznaczania obciążenia guzem przerzutowym in situ i ex vivo przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) i obrazowania optycznego.

Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Wiele modeli endometriozy u gryzoni jest ograniczonych przez techniczną złożoność, powtarzalność i/lub potrzebę stosowania zwierząt z obniżoną odpornością lub specjalnych myszy reporterowych. Przedstawiamy uproszczony system indukcji zmian chorobowych przy użyciu dowolnej myszy eksperymentalnej z niezależnie weryfikowalnym, obiektywnym systemem punktacji i bez konieczności wycinki owariektomii lub operacji przeżycia.

Syngeniczny mysi model endometriozy przy użyciu myszy z naturalną jazdą na rowerze

Ten protokół opisuje metodę monitorowania postępu zmian morfologicznych w czasie w macicy w indukowalnym mysim modelu raka endometrium za pomocą obrazowania ultrasonograficznego z korelacją zmian ogólnych i histologicznych.

Nieinwazyjna ocena ultrasonograficzna progresji raka endometrium w kierowanej przez Pax8 delecji supresorów guza Arid1a i Pten u myszy

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Choroba Parkinsona jest spowodowana utratą unerwienia dopaminergicznego prążkowia, którą można wywołać eksperymentalnie za pomocą 6-OH-dopaminy. Opisujemy sposób wykonania stereotaktycznej lekcji oraz monitorowania zachowania rotacyjnego indukowanego apomorfiną u myszy. Model ten jest użyteczny i wiarygodny w testowaniu nowych terapii choroby Parkinsona.

Model mysi choroby Parkinsona: od uszkodzenia dopaminergicznego 6-OHDA do testów behawioralnych

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

Poznaj nieinwazyjną metodę obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym w mysim modelu endometriozy. Technika umożliwia dynamiczną ocenę skuteczności leków poprzez pomiar zmian wielkości zmian endometrialnych.

Nieinwazyjne monitorowanie wielkości zmiany w heterologicznym mysim modelu endometriozy

Przeglądaj więcej filmów