Name: Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj analizę inwazji komórek nowotworowych w sferoidach 3D przy użyciu mikrokomorowej matrycy hydrożelowej. Ta metoda umożliwia ciągłe monitorowanie inwazji i przesiewowe badania leków przeciwprzerzutowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez testament Moshe Shimona i Judith Weisbrodt.

1. Tłoczenie tabliczki HMCA
UWAGA: Kompletny proces projektowania i produkcji pieczęci z polidimetylosiloksanu (PDMS) i płytki obrazowej HMCA używanych w tym protokole jest szczegółowo opisany w naszych poprzednich artykułach15,16. Stempel PDMS (kształt negatywny) służy do wytłaczania HMCA (kształt pozytywowy), który składa się z około 450 MC na studzienkę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Jak pokazano w Rysunek 1B, każdy z MC ma kształt ściętej odwróconej do góry nogami piramidy w kształcie kwadratu (wysokość: 190 μm, mały obszar podstawy: 90 μm x 90 μm, i duży obszar podstawy: 370 μm x 370 μm). Płytka HMCA służy do przygotowania i hodowli sferoid guza 3D, a następnie do testu inwazji. Alternatywnie, pieczęć handlowa może być używana do produkcji HMCA.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór 6% niskotopliwej agarozy (LMA). Umieścić proszek LMA i sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (0,6 g LMA na 10 ml PBS) do szklanej butelki z mieszadłem magnetycznym. Umieścić butelkę na płycie grzewczej i mieszać roztwór, podgrzewając do temperatury 80 °C przez kilka godzin, aż do uzyskania jednolitego roztworu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 70 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Podgrzej pieczęć PDMS do temperatury 70 °C w piekarniku. Utrzymuj go w cieple do momentu użycia. Możesz też użyć pieczątki handlowej i postępować zgodnie z instrukcją.</li>
	<li>Umieść dostępne w handlu 6-dołkowe płytki ze szklanym dnem w suchej kąpieli podgrzanej do temperatury 75 °C. Odczekaj kilka minut, aż płytka całkowicie się rozgrzeje.</li>
	<li>Wlej kroplę (400 μl) wstępnie podgrzanego LMA na szklane dno każdego z dołków w płytce. Delikatnie umieść podgrzany stempel PDMS na kropli agarozy. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5–10 minut w celu wstępnego żelowania i schłodzenia. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut, aby uzyskać pełne zżelowanie agarozy. Następnie delikatnie oderwij PDMS, pozostawiając żel agarozowy z wzorem MCs. 
	UWAGA: Ten krok jest wykonywany jednocześnie we wszystkich studzienkach.</li>
	<li>Umieść wytłoczoną płytkę w systemie utwardzania światłem wyposażonym w lampę ultrafioletową (UV) i inkubuj przez 3 minuty 
	UWAGA: Teraz płytka HMCA jest sterylizowana promieniami UV.</li>
	<li>Napełnić makrostudzienki sterylnym PBS, aby upewnić się, że są one wilgotne, a następnie przykryć płytkę, owinąć ją parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Przed użyciem należy opróżnić resztki PBS z płytki HMCA. Umieść go w biologicznym kapturze.</li>
</ol>
2. Ładowanie komórek i formacja sferoidów
<ol>
	<li>Zebrać komórki w następujący sposób: usunąć całe podłoże z 10 cm monowarstwy komórek płytki hodowlanej, przemyć dwukrotnie 10 ml PBS w celu usunięcia pozostałości surowicy, dodać 5 ml trypsyny (wstępnie podgrzanej do 37 °C) i inkubować przez 3 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Następnie delikatnie wstrząsnąć płytką, aby zapewnić oderwanie jednej warstwy, dodać 10 ml kompletnego podłoża (wstępnie podgrzanego do 37 °C) i pipetować w górę i w dół, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny komórek. Odwirować i przepłukać zawiesinę komórkową 15 ml świeżej pożywki, a następnie zawiesić w odpowiednich stężeniach w świeżej kompletnej pożywce.</li>
	<li>Delikatnie załaduj zawiesinę komórek (50 μl, 150–360 x 103 komórki/ml w podłożu, ~16–40 komórek na MC) na HMCA i pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie przez 15 minut.</li>
	<li>Delikatnie dodać 6–8 porcji 500 μl świeżej pożywki (łącznie 3–4 ml) do brzegu dna makrostudzienki z tworzywa sztucznego na zewnątrz pierścienia i układu hydrożelowego.</li>
	<li>Inkubować komórki HeLa przez 72 godziny, a komórki MCF7 przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze w celu wytworzenia sferoid.</li>
</ol>
3. Wykrywanie żywotności za pomocą barwienia jodkiem propidyny (PI)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy PI (500 μg PI na 1 ml PBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez około 6 miesięcy. Świeżo przygotować rozcieńczenie 1:2 000 (0,25 μg/ml), dodając 6 μl bulionu do 12 ml kompletnej pożywki bez czerwieni fenolowej, dla 6-dołkowej płytki HMCA (2 ml na studzienkę).</li>
	<li>Przenieś płytkę HMCA ze sferoidami 48-72 h z inkubatora do kaptura biologicznego. Usuń całe medium z HMCA, opierając końcówkę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki obok układu hydrożelowego, pozostawiając zbiornik matrycy wypełniony medium.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 2 ml rozcieńczenia PI z kroku 3.1 do każdego dołka, opierając końcówkę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki. Inkubować płytkę HMCA przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnej atmosferze. Przejdź do kroku 7. 
	UWAGA: Można tu również zastosować inne barwniki, na przykład Hoechst do barwienia jąder, ester metylowy tetrametylorodaminy (TMRM) do barwienia potencjału błony mitochondrialnej, dioctan fluoresceiny (FDA) do wykrywania żywych komórek, Aneksyna V do wykrywania apoptozy i inne.</li>
</ol>
4. Przygotowanie mieszanki kolagenu
<ol>
	<li>Przygotować sterylną wodę podwójnie destylowaną (DDW) w autoklawie i zapasie 100 ml 1 M roztworu sterylizowanego filtrem NaOH. Utrzymuj materiały w temperaturze pokojowej temperatury, a końcówki używane do przygotowania mieszaniny kolagenowej zamrożone w temperaturze -20 °C, aż do użycia.</li>
	<li>10–20 minut przed użyciem umieść wszystkie mieszanki, w tym: sterylny DDW, 1 M sterylnego roztworu NaOH, sterylny 10x PBS, kolagen typu I ze szczurzego ogona (przechowywany w temperaturze 4 °C przez 3 miesiące) i sterylną probówkę do wiadra z lodem do całkowitego ostygnięcia. Umieść pojemnik na lód w okapie biologicznym.</li>
	<li>Przygotować 1,800 μl mieszaniny kolagenu o końcowym stężeniu 3 mg / ml na 6-dołkową płytkę do badania inwazji HMCA (300 μl na studzienkę) w następujący sposób. Dodaj międzyziarna do schłodzonej probówki w następującej kolejności: 515 μL DDW, 24,8 μL 1 M NaOH i 180 μL 10x PBS. Dobrze wymieszaj przez wir i umieść z powrotem w lodzie. Na koniec dodaj 1080 μl kolagenu do mieszanki, ponownie zwiruj i włóż z powrotem do lodu.</li>
</ol>
5. Przygotowanie mieszanki HA i kolagenu
<ol>
	<li>Rozpuścić 10 mg kwasu hialuronowego w 2 ml sterylnego DDW. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez kilka minut i delikatnie wirować, aż proszek całkowicie się rozpuści. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C przez okres nie dłuższy niż dwa lata.</li>
	<li>Tuż przed użyciem umieść roztwór podstawowy HA w pojemniku na lód wewnątrz okapu biologicznego.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę kolagenu o stężeniu 3 mg/ml zgodnie z opisem w kroku 4. Dodać 36 μg (7,2 μL) HA do 1 800 μL gotowej do użycia mieszanki kolagenowej, aby uzyskać końcowe stężenie 20 μg/ml. Następnie ponownie krótko zwiruj i włóż z powrotem do lodu.</li>
</ol>
6. Dodawanie mieszaniny ECM
<ol>
	<li>Przenieś płytkę HMCA ze sferoidami 48–72 h z inkubatora do kaptura biologicznego i umieść ją na lodzie. Inkubować przez 10 minut, aż płytka ostygnie. Podgrzej roztwór 1% LMA do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Usuń całe podłoże z okolic HMCA, opierając końcówkę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki obok układu hydrożelowego. Następnie, bardzo ostrożnie, usuń całe medium ze zbiornika matrycy za pomocą cienkiej końcówki/końcówki ładującej żel, opierając końcówkę o krawędź matrycy, delikatnie i powoli odsysając całe medium. 
	UWAGA: Po usunięciu całego medium z okolic układu hydrożelowego, zbiornik matrycy jest nadal wypełniony medium. Podłoże to musi być usunięte bardzo delikatnie, aby uniknąć zniszczenia hydrożelu MC i przemieszczenia sferoid.</li>
	<li>Weź 150 μl mieszaniny kolagenu lub mieszaniny HA i kolagenu (mieszanina ECM) z wstępnie zamrożoną drobną końcówką i dodaj do zbiornika matrycy, przymocowując końcówkę do krawędzi matrycy. Powoli uwalniaj mieszaninę, aby uniknąć zwichnięcia sferoidy. Powtórzyć ten krok z kolejną podwielokrotnością 150 μl, co daje w sumie 300 μl na studzienkę. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla każdej studzienki, aż wszystkie studzienki zostaną wypełnione. Następnie umieścić płytkę w inkubatorze na 1 godzinę w celu pełnego zżelowania ECM.</li>
	<li>Po osiągnięciu pełnego żelowania ECM odpipetować 400 μl wstępnie podgrzanego 1% LMA na wierzch żelu ECM. Przykryć płytkę pokrywką, inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 5–7 minut, a następnie przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu żelowania agarozy. Na koniec delikatnie dodaj 2 ml kompletnego podłoża, opierając końcówkę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki. 
	UWAGA: Warstwa agarozy zapobiega odklejaniu się matrycy kolagenowo-żelowej od HMCA.</li>
</ol>
7. Akwizycja i analiza testów inwazji
<ol>
	<li>Załaduj płytkę HMCA na zmotoryzowany stolik mikroskopu odwróconego wyposażonego w inkubator, wstępnie ustawiony na 37 °C, 5% CO2 i wilgotną atmosferę.</li>
	<li>Wstępnie określ pozycje do akwizycji obrazu w każdym dołku, tak aby pokryć cały obszar matrycy, i użyj obiektywów 10X lub 4X (ten krok jest wymagany w przypadku używanego tutaj oprogramowania do akwizycji obrazu, szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów poniżej). Alternatywnie, użyj dowolnego oprogramowania do akwizycji obrazu, aby ułatwić automatyczne skanowanie całego wymaganego obszaru, wybierając opcję "Stich". </li>
	<li>Obrazy w jasnym polu (BF) należy wykonywać co 2–4 godziny przez łączny okres 24–72 godzin, aby śledzić inwazję komórek z ciała sferoidalnego do otaczającego ECM.</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów fluorescencyjnych do detekcji PI za pomocą dedykowanej kostki fluorescencyjnej (filtr wzbudzający 530–550 nm, zwierciadło dichroiczne 565 nm długoprzepustowe i filtr emisyjny 600–660 nm).</li>
	<li>Eksportuj poklatkowe obrazy BF/fluorescencyjne z oprogramowania do akwizycji obrazów i zapisz je w formacie tagged image file (TIFF) do dedykowanego folderu, korzystając z zakładki "Baza danych" na pasku narzędzi, a następnie przycisku "Eksportuj pliki nagrań". 
	UWAGA: Opracowaliśmy specjalny wewnętrzny kod analizy w oprogramowaniu MATLAB, który zawiera zaprojektowany graficzny interfejs użytkownika (GUI), w którym analiza inwazji może być wykonywana szybciej i łatwiej. W tym kodzie analizy segmentacja sferoid i obszaru inwazji odbywa się półautomatycznie przy użyciu filtra Sobela, po którym następują operatory morfologiczne Erozja i Dylatacja. Po automatycznej segmentacji obszarów, w razie potrzeby dokonano ręcznych korekt w celu uzyskania lepszej dokładności. Po zakończeniu segmentacji zestaw parametrów został automatycznie obliczony przez oprogramowanie i wyeksportowany do pliku Excel w celu dalszej manipulacji. Lista parametrów to: podstawowy obszar przekroju sferoidy w czasie = 0, obszar inwazji komórek połączonych z ciałem sferoidalnym = główny obszar inwazji, obszar komórek oddzielonych od głównego obszaru inwazji, liczba komórek oddzielonych od głównego obszaru inwazji, średnia odległość inwazji od podstawowego sferoidalnego środka masy do obwodu głównego obszaru inwazji i oddzielonych komórek oraz parametr odległości inwazji zbiorowej = d (d = √ ((X2 - X1)2 + (Y2 - Y1)2) poza sferoidalnym środkiem współrzędnych masy X i Y, przed (X1, Y1) i po (X2, Y2) procesie inwazji zbiorowej). Alternatywnie, analizę obrazu można wykonać za pomocą dowolnego innego specjalistycznego oprogramowania.</li>
	<li>Otwórz GUI i naciśnij przycisk "Załaduj BF". Po otwarciu obrazu dostosuj parametry segmentacji (minimalny rozmiar: >1 i promień zamknięcia: >1), aby uzyskać precyzyjną segmentację sferoidy i jej obszaru inwazji, a następnie naciśnij przycisk "Segmentacja regionu zainteresowania (ROI)" w celu wykonania, a wokół każdej sferoidy pojawi się granica. Jeśli automatyczna segmentacja jest nieprawidłowa, naciśnij przycisk "Usuń" lub "Dodaj" i ręcznie wprowadź żądane poprawki. Powtórz te same kroki dla kolejnych obrazów.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Śledzenie", aby ponumerować sferoidy, a oprogramowanie przypisze ten sam numer dla każdej sferoidy na każdym z obrazów poklatkowych. Następnie naciśnij przycisk "Pomiar", który wygeneruje arkusz kalkulacyjny ze wszystkimi parametrami. Zapisz ten arkusz kalkulacyjny jako plik Excela do dalszego wykorzystania w przetwarzaniu wyników i statystykach w oprogramowaniu Excel.</li>
</ol>

<ol><li>Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastases%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+pharmaceutica+Sinica.+B%22%5BJournal%5D)">Cancer metastases: challenges and opportunities.</a> Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).</li>
<li>Sapudom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+of+cancer+cell+invasion+controlled+by+fibril+diameter+and+pore+size+of+3D+collagen+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks.</a> Biomaterials. 52, 367-375 (2015).</li>
<li>Portillo-Lara, R., Annabi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+cancer-on-a-chip+platforms+to+study+the+metastatic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment.</a> Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).</li>
<li>Gkountela, S., Aceto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+features+of+cancer+cells+on+their+way+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis.</a> Biology Direct. 11 (1), 33(2016).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FReviews+in+Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+in+vitro+metastasis+model+elucidates+differential+invasive+strategies+during+and+after+breaching+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane.</a> Biomaterials. 115, 19-29 (2017).</li>
<li>Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+on-a-chip+platforms+for+studying+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+engineering%22%5BJournal%5D)">Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis.</a> Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).</li>
<li>Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).</li>
<li>Evensen, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Throughput+Three-Dimensional+Invasion+Assay+for+Anti-Cancer+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery.</a> PLoS ONE. 8 (12), e82811(2013).</li>
<li>Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+tumor+invasion+front+using+long-term+fluidic+tumoroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10784(2017).</li>
<li>Mi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+system+for+cancer+migratory+analysis+and+anti-metastatic+drugs+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35544(2016).</li>
<li>Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).</li>
<li>Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Invasion%3A+Patterns+and+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+naturae%22%5BJournal%5D)">Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms.</a> Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).</li>
<li>Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanics+of+Single+Cell+and+Collective+Migration+of+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005(2017).</li>
<li>Afrimzon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microstructure+live-cell+array+for+multiplexed+analyses+of+cancer+stem+cells%2C+tumor+heterogeneity+and+differential+drug+response+at+single-element+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution.</a> Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).</li>
<li>Shafran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+is+cytoprotective+to+breast+cancer+spheroids+vulnerable+to+estrogen-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis.</a> Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).</li>
<li>Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabric+Vessels+for+Embryoid+Body+Formation+and+Rapid+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells.</a> Scientific Reports. 6 (1), 31063(2016).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity-oriented+microfluidic+device+for+uniform+and+massive+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation.</a> Biomicrofluidics. 6 (1), 14114(2012).</li>
<li>Zaretsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+dynamics+of+primary+T+cell+activation+and+differentiation+using+long+term+live+cell+imaging+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 5007(2012).</li>
<li>Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fisetin%3A+a+dietary+antioxidant+for+health+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+redox+signaling%22%5BJournal%5D)">Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion.</a> Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).</li>
<li>Lee, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Networked+concave+microwell+arrays+for+constructing+3D+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids.</a> Biofabrication. 10 (1), 15001(2017).</li>
<li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+tumor+spheroid+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686(2015).</li>
<li>Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Microfluidic+Model+to+Recapitulate+Cancer+Cell+Migration+and+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion.</a> Bioengineering. 5 (2), 29(2018).</li>
<li>Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropassage-embedding+composite+hydrogel+fibers+enable+quantitative+evaluation+of+cancer+cell+invasion+under+3D+coculture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions.</a> Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).</li>
<li>Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Vascular+Formed+Endothelial+Cell+Network+on+the+Invasive+Capacity+of+Melanoma+Using+the+In+Vitro+3D+Co-Culture+Patterning+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model.</a> PLoS ONE. 9 (7), e103502(2014).</li>
<li>Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li>
<li>Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+communication+networks%3A+epidermal+growth+factor+receptor+transactivation+as+the+paradigm+for+interreceptor+signal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission.</a> Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).</li>
<li>Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2016/ra/c6ra05691a">Microfluidic-based biomimetic models for life science research.</a> RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).</li>
<li>Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+three-dimensional+collagen+matrix+stiffness+independently+of+collagen+concentration+modulates+endothelial+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior.</a> Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).</li>
<li>Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+bulk+mechanical+properties+of+cellularized+collagen+gels+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy.</a> Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+Behaviors+in+Three-Dimensional+Collagen-Hyaluronan+Composite+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).</li>
<li>Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+concentration+within+a+3D+collagen+matrix+modulates+matrix+viscoelasticity%2C+but+not+fibroblast+response%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response.</a> Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).</li>
<li>Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%3A+A+modulator+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment.</a> Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+Three-Dimensional+Microenvironment+with+Hyaluronan+of+Different+Molecular+Weights+Alters+Breast+Cancer+Cell+Invasion+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+low+molecular+weight+hyaluronan+in+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis.</a> The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).</li>
<li>Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+resistance%2C+high+molecular+weight+hyaluronic+acid%2C+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+communication+and+signaling%22%5BJournal%5D)">Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity.</a> Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Jest dobrze udokumentowane, że żywe organizmy, charakteryzujące się złożoną organizacją wielokomórkową 3D, różnią się znacznie od powszechnie stosowanych jednowarstwowych komórek hodowlanych 2D, co podkreśla kluczową potrzebę wykorzystania modeli komórkowych, które lepiej naśladują funkcje i procesy żywego organizmu do badań przesiewowych leków. Ostatnio wprowadzono sferoidy wielokomórkowe, kultury organotypowe, organoidy i narządy na chipie8 do stosowania w standaryzowanym odkrywaniu leków. Jedna...

Śmierć z powodu raka przypisuje się głównie rozprzestrzenianiu się komórek przerzutowych do odległych miejsc. Wiele wysiłków w leczeniu raka koncentruje się na ukierunkowaniu lub zapobieganiu tworzeniu się kolonii przerzutowych i progresji układowej choroby przerzutowej1. Migracja komórek nowotworowych jest kluczowym etapem w procesie przerzutów nowotworowych, dlatego badania kaskady inwazji raka są bardzo ważne i stanowią warunek wstępny do znalezienia leków przeciwprzerzutowych.
Okazało się, że wykorzystanie modeli zwierzęcych jako narzędzi do badania chorób przerzutowych jest bardzo kosztowne i nie zawsze reprezentatywne dla nowotworu u ludzi. Co więcej, topologia, mechanika i skład mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego silnie wpływają na zachowanie komórek nowotworowych2. Ponieważ modele in vivo z natury nie mają możliwości wyodrębnienia i kontrolowania takich specyficznych parametrów, które przyczyniają się do inwazji raka i przerzutów, istnieje zapotrzebowanie na kontrolowane biomimetyczne modele in vitro.
Aby dać przerzuty do odległych organów, komórki rakowe muszą wykazywać migrujące i inwazyjne cechy fenotypowe, które mogą być celem terapii. Ponieważ jednak większość modeli raka in vitro nie naśladuje rzeczywistych cech guzów litych3, wykrycie fizjologicznie istotnych fenotypów jest bardzo trudne. Ponadto heterogeniczność fenotypowa, która istnieje w guzie, dyktuje potrzebę analizy migracji guza w rozdzielczości pojedynczego elementu w celu odkrycia terapii ukierunkowanych na fenotyp, na przykład poprzez celowanie w populację komórek inicjujących przerzuty w heterogennych nowotworach4.
Badanie ruchliwości komórek i migracji zbiorowej prowadzone jest głównie w jednowarstwowych hodowlach komórek nabłonkowych na jednorodnych powierzchniach płaskich. Te konwencjonalne modele komórkowe migracji komórek nowotworowych opierają się na analizie populacji pojedynczych komórek atakujących przez błony i komponenty ECM5, ale w takich systemach nie można badać wewnętrznych różnic między poszczególnymi komórkami. Generowanie sferoid 3D za pomocą rusztowań lub mikrostruktur wolnych od rusztowań jest uważane za lepszy sposób badania wzrostu komórek nowotworowych i inwazji raka6,7,8. Jednak większość systemów 3D nie nadaje się do formatów o wysokiej przepustowości, a interakcja międzysferoidalna zwykle nie może być osiągnięta, ponieważ izolowane pojedyncze sferoidy są generowane w każdej mikro-studzience9. Ostatnie badania dotyczące migracji nowotworów opierają się na urządzeniach mikroprzepływowych3,10,11,12, jednak te zaawansowane narzędzia mikroprzepływowe są trudne do wyprodukowania i nie mogą być używane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) leków przeciwinwazyjnych.
Wykazano dwa główne fenotypy, zbiorową i indywidualną migrację komórek, które odgrywają rolę w pokonywaniu przez komórki nowotworowe bariery ECM i inwazji na sąsiednie tkanki13,14, z których każdy wykazuje odrębne cechy morfologiczne, mechanizmy biochemiczne, molekularne i genetyczne. Ponadto w każdym fenotypie obserwuje się dwie formy migrujących komórek nowotworowych, fibroblasty i ameboidy. Ponieważ zarówno fenotypy inwazji, jak i tryby migracji są definiowane głównie przez właściwości morfologiczne, istnieje zapotrzebowanie na modele komórkowe, które umożliwiają wykrywanie i badanie oparte na obrazowaniu wszystkich form inwazji guza i komórek migrujących.
Ogólnym celem obecnej metody jest dostarczenie prostego i powtarzalnego biomimetycznego systemu 3D opartego na komórkach in vitro do analizy zdolności inwazji w dużych populacjach sferoid nowotworowych. Tutaj przedstawiamy 6-dołkową płytkę obrazową na bazie HMCA do badań nad inwazją guza i terapią przeciwprzerzutową. Technologia ta umożliwia tworzenie dużej liczby jednorodnych sferoid guza 3D (450 na dołek) w strukturze mikrokomór hydrożelowych (MC). Do matrycy sferoidalnej dodawane są różne komponenty ECM, aby umożliwić inwazję komórek do otaczającego środowiska. Proces inwazji jest stale monitorowany poprzez krótko- i długoterminową obserwację tych samych pojedynczych sferoid/inwazyjnych komórek i ułatwia charakterystykę morfologiczną, barwienie fluorescencyjne i odzyskiwanie określonych sferoid w dowolnym momencie. Ponieważ wiele sferoid dzieli przestrzeń i ośrodek, możliwa jest interakcja za pośrednictwem rozpuszczalnych cząsteczek między poszczególnymi sferoidami i ich wzajemne oddziaływanie. Półautomatyczna analiza obrazu odbywa się przy użyciu własnego kodu MATLAB, który umożliwia szybsze i wydajniejsze gromadzenie dużych ilości danych. Platforma umożliwia dokładny, jednoczesny pomiar wielu sferoidów/inwazyjnych komórek w sposób efektywny czasowo, umożliwiając średnioprzepustowe badania przesiewowe leków przeciwinwazyjnych.

<table><tbody><tr><td>6 szklanych płytek dolnych Micro-well ze szkłem osłonowym Micro-Well #1,5</td><td>mm Cellvis</td><td>P06-14-1.5-N</td><td>Komercyjne szklane płyty dolne, które są używane do wytłaczania</td></tr><tr><td>HMCA UltraPure Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>16520100</td><td>Roztwór 6% agarozy podgrzewa się do 80 stopni Celsjusza; C przed użyciem roztwór 1% agarozy ogrzewa się do 37 & stopni; C</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny EDTA B</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>03-052-1A</td><td>Podgrzany do 37 stopni C przed użyciem</td></tr><tr><td>DMEM pożywka, wysoka glukoza</td><td>Przemysł biologiczny</td><td>01-055-1A</td><td>Podgrzany do 37 & stopni; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Specjalna surowica dla noworodków cielęcych (NBCS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-122-1A</td><td>Inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>DPBS (10x), bez wapnia, bez magnezu</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-5A</td><td>Przechowywany na lodzie przed użyciem</td></tr><tr><td>NaOH, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Służy do przygotowania 1 M roztworu NaOH</td></tr><tr><td>Cultrex Kolagen typu I z ogona szczura, 5 mg/ml</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td>Przechowywany na lodzie przed użyciem</td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu hialuronowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5542-10MG</td><td>Przechowywany na lodzie przed użyciem</td></tr><tr><td>Fisetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F505-100MG</td><td>Dodany do pożywki, inhibitor inwazji</td></tr><tr><td>DETA/NO</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>alx-430-014-m005</td><td>Dodany do pożywki, donor tlenku azotu</td></tr><tr><td>PI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Stosowany przy bardzo niskim stężeniu bez konieczności mycia</td></tr><tr><td>Kompletny system lampy powodziowej UV Dymax 5000-EC z osłoną świetlną i Zasilacz Dymax 400 Watt EC</td><td>Dymax Corporation</td><td>PN 39823</td><td>Używany do sterylizacji płytek HMCA za pomocą</td></tr><tr><td>mikroskopu UV Odwrócony IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>Używany do automatycznej akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>Inkubator do mikroskopu</td><td>Usługi</td><td></td> obrazowania życia <td>Niezbędny do eksperymentów poklatkowych z akwizycją obrazu, wstępnie dostosowany do 37 & stopni; C, 5% CO2 i utrzymywanie nawilżonej atmosfery</td></tr><tr><td>Submikronowy zmotoryzowany stolik typu SCAN-IM</td><td>Marzhauser Wetzlar GmbH</td><td></td><td>Służy do wstępnego określania obszarów akwizycji obrazu, do automatycznej akwizycji obrazu</td></tr><tr><td>14-bitowa, ORCA II C4742-98 chłodzona kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>Bardzo czuły, używany do obrazowania</td></tr><tr><td>Kostka filtra fluorescencyjnego do wykrywania PI</td><td>Korporacja Chroma Technology</td><td></td><td>Specyfikacja kostki filtra: filtr wzbudzenia 530-550 nm, zwierciadło dichroiczne 565 nm długoprzepustowe i filtr emisyjny 600-660 nm</td></tr><tr><td>Oprogramowanie operacyjne Olympus Cell^P</td><td>Oprogramowanie Olympus</td><td></td><td>służące do sterowania mikroskopem, zmotoryzowanym stolikiem, kamerą i akwizycją obrazu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne Matlab R2014B</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Służy do tworzenia własnego graficznego interfejsu użytkownika do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>ExcelMicrosoft</td><td></td><td>Służy do zarządzania danymi, obliczeń, tworzenia wykresów i statystyk</td></tr></tbody></table>

analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (hmca)

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Przerzuty raka są znane z tego, że powodują 90% śmiertelności raka. Przerzuty to wieloetapowy proces, który rozpoczyna się od penetracji/inwazji komórek nowotworowych do sąsiedniej tkanki. Tak więc inwazja jest kluczowym krokiem w przerzutach, co sprawia, że badania i rozwój leków przeciwprzerzutowych w procesie inwazji są bardzo istotne. Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, konieczne jest opracowanie modeli 3D in vitro, które z jednej strony imitują architekturę guzów litych i ich mikrośrodowisko najbardziej zbliżone do stanu in vivo, ale jednocześnie są powtarzalne, wytrzymałe i nadają się do pomiarów z wysoką wydajnością i wysoką zawartością. Obecnie większość testów inwazji opiera się na zaawansowanych technologiach mikroprzepływowych, które są odpowiednie do badań, ale nie do badań przesiewowych na dużą skalę leków. Inne testy wykorzystujące urządzenia oparte na płytkach z izolowanymi pojedynczymi sferoidami w każdym dołku zużywają materiał i mają niską wielkość próbki w danym stanie. Celem obecnego protokołu jest dostarczenie prostego i powtarzalnego biomimetycznego systemu opartego na komórkach 3D do analizy zdolności do inwazji w dużych populacjach sferoid nowotworowych. Opracowaliśmy model 3D do testu inwazji w oparciu o płytkę obrazową HMCA do badań nad inwazją guza i odkrywaniem leków przeciwprzerzutowych. Urządzenie to umożliwia wytwarzanie wielu jednorodnych sferoid na studzienkę (duża wielkość próbki na warunek) otoczonych komponentami ECM, przy jednoczesnym obserwowaniu i pomiarze sferoid w rozdzielczości jednoelementowej w celu przeprowadzenia średnioprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych. Platforma ta jest tutaj prezentowana przez produkcję sferoid HeLa i MCF7 jako przykład inwazji pojedynczej komórki i zbiorowej. Porównujemy wpływ składnika ECM, kwasu hialuronowego (HA) na zdolność inwazyjną kolagenu otaczającego sferoidy HeLa. Na koniec wprowadzamy Fisetynę (inhibitor inwazji) do sferoid HeLa i tlenek azotu (NO) (aktywator inwazji) do sferoid MCF7. Wyniki są analizowane przez autorskie oprogramowanie, które umożliwia półautomatyczną, prostą i szybką analizę, co ułatwia badanie wieloparametrowe.

Wyjątkowa płytka obrazująca HMCA jest wykorzystywana do testu inwazji trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych. Cały proces, rozpoczynając od formowania sferoidów, a kończąc na procesie inwazji i dodatkowych manipulacjach, jest przeprowadzany w tej samej płytce. W celu formowania sferoidów komórki HeLa są wprowadzane do basenu macierzy i osiadają w mikrownękach (MCs) hydrożelowych pod wpływem grawitacji. Mikrownęki hydrożelowe, które charakteryzują się brakiem adhezji lub niskim przycze...

Płyta obrazowania oparta na HMCA jest prezentowana do wykonania testu inwazji. Płytka ta ułatwia tworzenie trójwymiarowych (3D) sferoid nowotworowych i pomiar inwazji komórek rakowych do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Kwantyfikacja testu inwazji odbywa się za pomocą analizy półautomatycznej.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Celem tego prostego, powtarzalnego, biomimetycznego systemu opartego na komórkach 3D jest ułatwienie analizy zdolności do inwazji w dużej populacji sferoidów nowotworowych w celu badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych. Główną zaletą naszego układu mikrokomór hydrożelowych jest to, że pozwala on na wytwarzanie dużej liczby jednorodnych sferoid, które wypełniają tę samą płaszczyznę ogniskową na studzienkę. Pozycja sferoidalna jest zachowywana dzięki hydrożelowej strukturze mikrokomory nawet po dodaniu macierzy zewnątrzkomórkowej, co ułatwia dokładne ciągłe monitorowanie sferoid i procesu inwazji.Co więcej, charakterystyka morfologiczna i barwienie fluorescencyjne licznych sferoid i inwazyjnych komórek mogą być przeprowadzane in situ i analizowane w rozdzielczości jednoelementowej w sposób efektywny czasowo. Procedurę produkcji sześciodołkowych płytek obrazowych z układem mikrokomór hydrożelowych zademonstruje Maria Sobolew z naszego laboratorium. Aby przygotować płytki z mikrokomorą hydrożelową, najpierw podgrzej sześć stempli polidimetylosiloksanu lub PDMS do 70 stopni Celsjusza i umieść sześciodołkową płytkę ze szklanym dnem na suchej kąpieli podgrzanej do 75 stopni Celsjusza przez kilka minut.Gdy płytka jest ciepła, wlej 400-mikrolitrową kroplę wstępnie podgrzanej, niskotopliwej agarozy na dno każdej studzienki sześciodołkowej płytki i delikatnie umieść jeden stempel na każdej kropli. Pozostaw zestaw do ostygnięcia przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać pełne żelowanie agarozy. Gdy agaroza stężeje, delikatnie oderwij PDMS od każdej studzienki, pozostawiając żele agarozowe z mikrokomorami.Po pozostawieniu, aby lampa UV osiągnęła najwyższą intensywność, umieść wytłoczoną płytkę w systemie utwardzania światłem na trzy minuty i napełnij wysterylizowane promieniami UV makrodołki sterylnym PBS. Następnie przykryj płytkę i owiń ją Parafilm, aby przechowywać ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby załadować ogniwa, wyjmij PBS z każdej studzienki i delikatnie załaduj 50 mikrolitrów interesujących komórek na wierzch każdej matrycy hydrożelowej.Po pozostawieniu komórek do osadzenia się grawitacyjnie przez 15 minut, ostrożnie dodaj sześć do ośmiu porcji po 500 mikrolitrów świeżej pożywki do krawędzi makrostudzienki z tworzywa sztucznego na zewnątrz pierścienia i układu hydrożelowego. Inkubuj komórki przez odpowiedni okres czasu w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla z wilgotnością do tworzenia sferoid. Następnie przenieś sferoidy do okapu bezpieczeństwa biologicznego na lodzie na 10 minut.Gdy płytka ostygnie, oprzyj końcówkę pipety o krawędź plastikowego dna makrostudzienki obok zestawu hydrożelowego i usuń całe medium z okolic matrycy. Następnie wyjmij pożywkę ze zbiornika matrycy, bardzo ostrożnie oprzyj końcówkę pipety z żelem na krawędzi zbiornika matrycy, uważając, aby nie naruszyć mikrokomór i sferoid. Następnie użyj wstępnie zamrożonej, cienkiej końcówki pipety, aby dodać dwie porcje po 150 mikrolitrów interesującej nas mieszaniny kolagenu na krawędzi matrycy, powoli uwalniając mieszaninę, aby uniknąć przemieszczenia sferoidy.Po dodaniu drugiej rundy kolagenu do każdej studzienki, należy umieścić sferoidy z powrotem w inkubatorze na jedną godzinę, aby uzyskać pełne zżelowanie macierzy zewnątrzkomórkowej. Gdy matryca zestala się, dodaj 400 mikrolitrów wstępnie podgrzanej 1% niskotopliwej agarozy na wierzch żelu i inkubuj płytkę, przykrytą temperaturą pokojową, przez pięć do siedmiu minut, a następnie schładzaj przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu żelowania agarozy. Następnie, opierając pipetę o krawędź plastikowego dna makrostudzienki, delikatnie dodaj dwa mililitry kompletnego podłoża do każdego dołka.Aby przeprowadzić test inwazji, załaduj hydrożelową płytkę matrycową mikrokomory na zmotoryzowany stolik mikroskopu odwróconego wyposażony w inkubator z 37 stopniami Celsjusza i 5% dwutlenkiem węgla z wilgotną atmosferą i użyj obiektywu z czterema lub 10 stopniami, aby wstępnie określić pozycje akwizycji obrazu w każdym dołku, tak aby oceniany był cały obszar matrycy. Następnie wykonuj obrazy w jasnym polu co dwie do czterech godzin, w sumie przez 24 do 72 godzin, aby śledzić inwazję komórek z ciała sferoidalnego do otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej. Pod koniec akwizycji obrazu wyeksportuj obrazy poklatkowe z oprogramowania do akwizycji obrazów w celu zapisania w formacie oznaczonego pliku obrazu do dedykowanego folderu.Następnie otwórz graficzny interfejs użytkownika i kliknij przycisk Załaduj jasne pole. Dostosuj parametry segmentacji obrazu, aby uzyskać precyzyjną segmentację sferoid i ich obszarów inwazji, a następnie kliknij opcję Segmentacja regionu zainteresowania, aby utworzyć obramowanie wokół każdej sferoidy. Jeśli automatyczna segmentacja jest nieprawidłowa, naciśnij Usuń lub Dodaj i wprowadź odpowiednie poprawki ręcznie.Kliknij opcję Śledzenie, aby ponumerować sferoidy na każdym ze zdjęć poklatkowych. Następnie kliknij przycisk Pomiar, aby wygenerować arkusz kalkulacyjny ze wszystkimi parametrami i zapisać arkusz kalkulacyjny w odpowiednim formacie do przetwarzania danych i analizy statystycznej. Aby zbadać wpływ kwasu hialuronowego na spontaniczny proces inwazji sferoidów HeLa, w tym eksperymencie dwudniowe dojrzewające sferoidy pokryto roztworem mieszaniny kolagenu i kwasu hialuronowego i porównano z dwudniowymi sferoidami pokrytymi samym roztworem kolagenu.Po 50 godzinach inkubacji sferoidy osadzone w kolagenie i kwasie hialuronowym wykazywały mniejszą dyspersję komórek w otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej w porównaniu ze sferoidami osadzonymi w samym kolagenie. Rzeczywiście, analiza kinetyki obszaru inwazji w czasie dla 99 sferoidów o rozdzielczości jednosferoidalnej wyraźnie wskazuje, że dodanie kwasu hialuronowego do kolagenu hamuje dyspersję komórek poza sferoidą, co skutkuje mniejszymi obszarami inwazji. Traktowanie hodowli sferoidów HeLa bioaktywnym flawonoidem o właściwościach cyto- i migracyjnych przez 24 godziny powoduje zahamowanie dyspersji komórek wokół sferoid w porównaniu ze sferoidami HeLa niepoddanymi działaniu zabiegu.Rzeczywiście, analiza obszarów inwazji 488 sferoidów pod koniec eksperymentu ujawniła znaczne zahamowanie po leczeniu zaledwie 10 mikromolami leku. Ze względu na niską przyczepność hydrożelu, ta technologia oparta na mikrokomorach ułatwia tworzenie sferoidy nawet w przypadku bardzo małej liczby komórek. Jest to szczególnie korzystne w przypadku cennych, ograniczonych próbek komórek pierwotnych podobnych do nowotworów lub pochodzących od pacjentów.Hydrożelowa płytka obrazowa w mikrokomorze umożliwia analizę dokładnego położenia przestrzennego sferoid podczas długotrwałych eksperymentów w celu oceny procesu inwazji na poziomie pojedynczego pierwiastka i zapewnia wysoki stopień odporności i dokładności statystycznej. Przyszłe zastosowania tej metodologii obejmują równoległą hodowlę wielokomórkową komórek nowotworowych i zrębowych w różnych regionach w obrębie makrostudzienki oraz pobieranie pojedynczych sferoid do dalszej analizy molekularnej.

analysis-cancer-cell-invasion-anti-metastatic-drug-screening-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Ten film opisuje test inwazji przy użyciu trzykomorowej matrycy opartej na impedancji elektrycznej. Technika ta mierzy potencjał inwazyjny komórek nowotworowych pod wpływem rozpuszczalnych czynników wydzielanych przez rezydentne komórki zrębu w mikrośrodowiskach guza.

Trójkomorowy test impedancji oparty na układzie: technika analizy w czasie rzeczywistym do oceny potencjału inwazyjnego komórek rakowych poprzez pomiar impedancji elektrycznej

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

Test inwazji komórkowej in vitro służy do pomiaru potencjału przerzutów raka poprzez ilościowe określenie potencjału komórkowego do inwazji i migracji za pomocą wkładek do hodowli komórkowych zawierających matrycę białkową. Komórki są zmuszane do migracji przez matrycę białkową i porowatą błonę w kierunku chemoatraktantu, a następnie określane ilościowo za pomocą mikroskopii świetlnej.

Zastosowanie mysich komórek nowotworowych sutka w teście inwazji in vitro jako miary zachowania komórek onkogennych

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Test CAM-Delam do oceny zdolności przerzutowej komórek nowotworowych jest stosunkowo szybki, łatwy i tani. Metoda ta może być stosowana do odkrywania mechanizmów molekularnych regulujących powstawanie przerzutów oraz do badań przesiewowych leków. Zoptymalizowany test do analizy próbek ludzkich nowotworów może być metodą kliniczną spersonalizowanego leczenia raka.

Test CAM-Delam w celu oceny właściwości przerzutowych poprzez ilościowe określenie zdolności delaminacji i inwazji komórek nowotworowych

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj analizę inwazji komórek nowotworowych w sferoidach 3D przy użyciu mikrokomorowej matrycy hydrożelowej. Ta metoda umożliwia ciągłe monitorowanie inwazji i przesiewowe badania leków przeciwprzerzutowych.

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA) (Wideo) | JoVE Journal

Analiza inwazji komórek nowotworowych i przesiewowych badań przesiewowych leków przeciwprzerzutowych przy użyciu płytek opartych na hydrożelowej matrycy mikrokomorowej (HMCA)

Przeglądaj więcej filmów