Protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki

Choroba zwyrodnieniowa stawów jest jednym z najczęstszych zaburzeń wyniszczających wśród osób starszych. Obecnie nie ma jednoznacznego lekarstwa na podstawowe przyczyny choroby zwyrodnieniowej stawów. Ten protokół kliniczny opisuje innowacyjną procedurę obiecującego, minimalnie inwazyjnego i alternatywnego leczenia choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u ludzi poprzez regenerację tkanki przypominającej chrząstkę.

Choroba zwyrodnieniowa stawów jest jednym z najczęstszych zaburzeń wyniszczających wśród osób starszych. Obecnie nie ma definitywnego lekarstwa na podstawowe przyczyny choroby zwyrodnieniowej stawów. Ten protokół kliniczny jest innowacyjną procedurą obiecującego, minimalnie inwazyjnego i alternatywnego leczenia choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u ludzi poprzez regenerację tkanki przypominającej chrząstkę.

Przynieś pacjenta na salę operacyjną z kapturem klasy A zagrożenia biologicznego i ułóż go w pozycji leżącej. Oczyść okolice brzucha pacjenta 5% jodem betadyny-powidyny i udrapuj pacjenta techniką sterylną, odsłaniając czysty obszar brzucha do liposukcji. Około pięciu centymetrów w dolnej części pępka należy znieczulić dwa miejsca, jedno po lewej, a drugie po prawej stronie pępka nacięcia, które ma zostać wykonane.

Używając dwóch mililitrów 2% lidokainy bez epinefryny za pomocą igły o rozmiarze 25 1,5 cala w pięciomililitrowej strzykawce, wstrzykując każde miejsce na poziomie naskórka. Znieczulić miejsce nacięcia, które ma być wykonane, za pomocą pięciu mililitrów roztworu tumescencyjnego i 10-mililitrowej strzykawki oraz igły o rozmiarze 25 1,5 cala. Wykonaj dwa nacięcia po 0,5 centymetra około pięciu centymetrów poniżej pępka z boku, ściskając skórę, aby zwiększyć głębokość poziomu podskórnego.

Używając ostrza numer 11, pomóż uniesionej skórze przeniknąć do poziomu podskórnego, ale nie przeniknąć przez ścianę brzucha. Za pomocą 20-centymetrowej kaniuli o rozmiarze 60 znieczulij podskórny poziom całego dolnego obszaru brzucha, który ma być liposukowany za pomocą 700 do 800 mililitrów roztworu tumescencyjnego. Po zakończeniu infiltracji całego podbrzusza roztworem tumescencyjnym należy przygotować aparat do liposukcji, podłączając kaniulę o średnicy 3,0 milimetra podłączoną do strzykawki o średnicy 60 mililitrów lub 30 mililitrów do liposukcji manualnej lub specjalnie zaprojektowanej kaniuli o średnicy 3,0 milimetra podłączonej do zestawu wirówkowego.

Strzykawka z systemem zamkniętym opracowana przez nas i zatwierdzona przez FDA CDRH w celu utrzymania sterylności podłączona do maszyny próżniowej do liposukcji wspomaganej próżnią. Wykonaj liposukcję, aby uzyskać od 100 do 110 gramów tkanki tłuszczowej z wyłączeniem roztworu tumescencyjnego. Podczas wykonywania liposukcji tkanka tłuszczowa zostanie uzyskana wraz z roztworem tumescencyjnym, ale należy ją oddzielić i usunąć.

Aby najpierw oddzielić roztwór tumescencyjny grawitacyjnie, tkankę tłuszczową w zestawie wirówkowym można przenieść do strzykawki o pojemności 60 mililitrów i umieścić strzykawkę w dół. Na przykład otwierająca się część strzykawki znajduje się na dole. Odczekaj od pięciu do sześciu minut, tkanka tłuszczowa i roztwór tumescencyjny zostaną oddzielone.

Usunąć płyn z dna strzykawki, naciskając górną część tłoka strzykawki. Wykonuj powyższe kroki od 9 do 11, aż do zgromadzenia się całkowitej ilości od 100 gramów do 110 gramów aspiratu lipidowego tkanki tłuszczowej na kolano. Po oddzieleniu roztworu tumescencyjnego grawitacyjnie i zgromadzeniu od 50 gramów do 55 gramów aspiratu lipidowego na każdy 60-mililitrowy zestaw wirówkowy sterylnie zamknięty system, umieść dwa zestawy wirówek w wiadrze na pojemnik wirówkowy i wiruj z prędkością 1600 G przez pięć minut, kondensując aspirat lipidowy i oddzielając płyn od tkanki tłuszczowej.

Proces ten dodatkowo zagęszcza aspirat lipidowy i w niektórych przypadkach może wytwarzać olej tłuszczowy. Uważając, aby się nie potrząsnąć, zdejmij nasadkę zabezpieczającą i korek na spodzie zestawu wirówki. Usuń dolny płyn, powoli naciskając na górną część tłoka zestawu wirówki.

Na oddzielnej strzykawce o pojemności 60 mililitrów rozpuść 10 miligramów kolagenazy, pięć miligramów kolagenazy specyficznej dla tkanki łącznej i pięć miligramów kolagenazy specyficznej dla tkanki tłuszczowej z 50 miligramami soli fizjologicznej. Wymieszać około 25 do 30 mililitrów skondensowanego aspiratu lipidowego z rozpuszczoną kolagenazą, pięcioma miligramami kolagenazy specyficznej dla tkanki łącznej i pięcioma miligramami kolagenazy specyficznej dla tkanki tłuszczowej w stosunku jeden do jednego, objętość do objętości, podłączając 60-mililitrową strzykawkę do zestawu wirówkowego za pomocą specjalistycznego łącznika. Dokładnie wymieszaj, aby skondensować aspirat preparatu i kolagenazę, wpychając zawartość między 60-mililitrową strzykawkę a zestaw wirówki za pomocą pręta lub popychacza.

Przenieś mieszaninę aspiratu lipidowego i kolagenazy z powrotem do 60-mililitrowej strzykawki. Połączyć każdą 60-mililitrową strzykawkę zawierającą mieszaninę z homogenizatorem tkankowym, który zawiera ostrza. Podłącz pustą strzykawkę o pojemności 60 mililitrów do drugiego końca homogenizatora.

Przepchnij mieszaninę do drugiej 60-mililitrowej strzykawki przez homogenizator cztery do sześciu razy, co spowoduje przecięcie i rozdrobnienie aspiratu lipidowego. Przenieś homogenizowany aspirat lipidowy i mieszaninę kolagenową z powrotem do 60-mililitrowego zestawu wirówkowego przez specjalistyczne złącze. Umieść zestawy wirówek w pojemniku, który zostanie umieszczony w inkubatorze podgrzanym do 37 stopni Celsjusza.

Inkubować dwa zestawy wirówkowe z homogenizowaną mieszaniną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, obracając z prędkością 45 obr./min. Po 40 minutach inkubacji wyjąć pojemnik z inkubatora w sterylny sposób. Następnie wyjmij zestawy wirówek i umieść je w wirówce.

Odwirować mieszaniny o stężeniu 800 G przez pięć minut w celu oddzielenia SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej. Po odwirowaniu supernatant, który zawiera kolagenazę i strawioną tkankę tłuszczową, usuwa się z każdego zestawu wirówkowego, zdejmując nasadkę strzykawki z tłoka i umieszczając 30-mililitrową strzykawkę na otworze tłoka przez połączenie strzykawka-blokada. Powoli dociśnij część cylindryczną 30-mililitrowej strzykawki, aby supernatant napełnił się do 30-mililitrowej strzykawki.

Dociśnij 30-mililitrową lufę strzykawki aż do ostatnich trzech do czterech mililitrów dna zestawu wirówki, pozostawiając tylko ostatnie trzy do czterech mililitrów SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej. Supernatant jest odrzucany. Wyjąć 30-mililitrową strzykawkę z górnej części tłoka i napełnić strzykawkę 5% roztworem Ringera z dekstrozą, znanym również jako D5LR.

Mocując 30-mililitrową strzykawkę wypełnioną D5LR na górze otworu tłoka, napełnij zestawy wirówek zawierające od trzech do czterech mililitrów SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej D5LR do 55 mililitrów. Następnie wyjmij 30-mililitrową strzykawkę, zakryj otwór tłoka i ponownie odwiruj zestawy wirówek przy 300 G przez około cztery minuty. Powtórz kroki od 17 do 21, aby uzyskać łącznie cztery prania.

Po czwartej wirówce, w celu uzyskania końcowego SVF do wstrzykiwania, zdejmij nasadkę zabezpieczającą i korek w dolnym otworze zestawu wirówki, nie potrząsając ani nie obracając zestawu wirówki. Podłącz strzykawkę o pojemności 20 mililitrów do dolnego otworu zestawu wirówki za pomocą specjalnie zaprojektowanego łącznika. Pociągnij tłok 20-mililitrowej strzykawki kilka razy w przód i w tył, aby wstrząsnąć komórkami, które osiadły na dnie zestawu wirówkowego.

Usunąć żądaną całkowitą objętość SVF zawierającą zarówno AspAT, jak i ECM wraz z innymi komórkami i tkankami. Zwykle około trzech do czterech mililitrów z każdego zestawu wirówkowego do iniekcji stawu kolanowego. Przeprowadziliśmy 30 mililitrów krwi autologicznej wraz z 2,5 mililitra roztworu dekstrozy antykoagulantu cytrynianowego.

Następnie pobraną krew przeniesiono do 60-mililitrowych zestawów beczek wirówek. Następnie był odwirowywany przy grawitacji 730 przez pięć minut. Supernatant został usunięty i umieszczony w nowym zestawie cylindrów wirówki o pojemności 60 mililitrów.

Supernatant odwirowywano przy grawitacji 1350 przez cztery minuty, uzyskując 4,4 mililitra PRP. Oczyść kolano pacjenta 5% betadyną i ułóż je w sterylny sposób. Wykonaj badanie palpacyjne przedniej części kolana w celu uzyskania przestrzeni stawowej między kością piszczelową a udową.

Znieczulić miejsce wstrzyknięcia powierzchownie rozcieńczoną lidokainą, jednym mililitrem 1% lidokainy rozcieńczonym czterema mililitrami soli fizjologicznej, od skóry do tuż na zewnątrz torebki stawowej. Następnie znieczulić wnętrze kapsułki stawowej rozcieńczoną ropiwakainą, jednym mililitrem 0,75% ropiwakainy rozcieńczoną trzema mililitrami normalnej soli fizjologicznej. Wymieszaj dwa mililitry kwasu hialuronowego z sześcioma do ośmiu mililitrami SVF zawartymi w 20-mililitrowej strzykawce przez łącznik strzykawka-strzykawka.

Używając łącznika strzykawka-strzykawka, dodaj 0,4 mililitra chlorku wapnia do trzech do czterech mililitrów autologicznego PRP, który został już przygotowany i jest gotowy w pięciomililitrowej strzykawce. Połącz od 3,5 do 4,5 mililitra chlorku wapnia PRP w pięciomililitrowej strzykawce z ośmioma do 10 mililitrami mieszaniny HA-SVF w 20-mililitrowej strzykawce przez złącze strzykawka-strzykawka. Natychmiast wstrzyknąć mieszaninę, około 12 do 15 mililitrów, powoli do przedniego stawu piszczelowo-udowego kolana, za pomocą igły o średnicy 38 milimetrów w rozmiarze 18 z lub bez wskazówek USG.

Po wstrzyknięciu należy zabandażować miejsce wstrzyknięcia uciskiem, składając czterokrotnie bawełnianą gazę 4x4 i umieszczając taśmy na złożonej gazie 4x4. Poinstruuj pacjenta, aby pozostał nieruchomo przez 60 minut, aby umożliwić przyczepienie komórek. Poinstruuj pacjenta, aby ograniczył aktywność przez co najmniej tydzień po wypisie z kliniki.

Wróć do kliniki w celu wykonania trzech dodatkowych wstrzyknięć PRP aktywowanego chlorkiem wapnia w ciągu trzech tygodni. Pacjent z chorobą zwyrodnieniową stawów trzeciego stopnia otrzymał leczenie opisane w punkcie protokołu. Po drugim tygodniu od wstrzyknięcia mieszaniny ASV-ECM ból pacjenta i ROM uległy poprawie.

Do 16. tygodnia ból i ROM pacjenta znacznie się poprawiły o ponad 70% Rezonans magnetyczny po zabiegu, wykonany po 16. tygodniu, wykazał zwiększoną grubość tkanki przypominającej chrząstkę po przyśrodkowej stronie kolana. Inny pacjent z chorobą zwyrodnieniową stawów trzeciego stopnia otrzymał leczenie opisane w części protokołu. Po drugim tygodniu od wstrzyknięcia mieszaniny ASV-ECM ból pacjenta i ROM uległy poprawie.

Do 18. tygodnia ból i ROM znacznie się poprawiły do 80%Powtórzony rezonans magnetyczny wykonany po 18. tygodniu wykazał wzrost wysokości tkanki chrzęstnej po przedniej-środkowej stronie kolana. Trzeci pacjent z chorobą zwyrodnieniową stawów w trzecim stopniu otrzymał leczenie opisane w sekcji protokołu. Po drugim tygodniu wstrzyknięcia mieszaniny ASV-ECM ból pacjenta i ROM poprawiły się o około 50%Do 22. tygodnia ból i ROM znacznie się poprawiły o ponad 80%Powtórzony rezonans magnetyczny wykonany po 22. tygodniu wykazał wzrost wysokości tkanki przypominającej chrząstkę po przyśrodkowej stronie kolana.

Obecnie nie jest dostępna żadna terapia lecznicza w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów. Jednak przezskórne wstrzyknięcie terapii komórkami macierzystymi z ASC i homogenizowanym ECM wraz z HA i analogicznym PRP aktywowanym chlorkiem wapnia może stanowić alternatywę dla obecnej terapii leczenia choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego.