Name: Protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Poznaj protokół wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej z tkanki tłuszczowej do regeneracji chrząstki u pacjentów z osteoartrzitem kolana. Ta metoda oferuje obiecującą, małoinwazyjną alternatywę dla tradycyjnych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje za wsparcie ze strony personelu Kliniki Medycznej Mipro oraz projekt figurki autorstwa Jaepil/David Lee. Prace te były wspierane przez granty badawcze z Programu Rozwoju Bio i Technologii Medycznych NRF finansowane przez MSIT (numer NRF-2017M3A9E4078014); oraz Narodowa Fundacja Badawcza Korei (NRF) finansowana przez Ministerstwo Nauki i Technologii Informacyjnych i Komunikacyjnych (numery NRF-2017R1A2B4002315 i NRF-2016R1C1B2010308).

Zgoda i zgoda na zgłaszanie następujących opisów przypadków została uchylona przez komisję Myongji University Institutional Review Board (MJUIRB). Co więcej, ten protokół kliniczny był zgodny z Deklaracją Helsińską i wytycznymi KFDA. Na zabiegi uzyskano świadome zgody pacjentów.
1. Liposukcja
UWAGA: Występuj techniką sterylną.
<ol>
	<li>Należy zastosować następujące kryteria włączenia: (1) dowód MRI na chorobę zwyrodnieniową stawów 3; 2) mężczyzna lub kobieta; 3) ukończyła 18 rok życia; (4) wystarczająca (100-110 g) tkanka tłuszczowa do liposukcji; (5) niechęć do przystąpienia do interwencji chirurgicznej; (6) brak konserwatywnego zarządzania; oraz (7) ciągły ból powodujący niepełnosprawność.</li>
	<li>Należy stosować następujące kryteria wyłączenia: (1) aktywna choroba zapalna lub choroba tkanki łącznej, o której sądzi się, że wpływa na stan bólu (tj. toczeń, reumatoidalne zapalenie stawów, fibromialgia); (2) czynne zaburzenie endokrynologiczne, które może wpływać na stan bólowy (np. niedoczynność tarczycy, cukrzyca); (3) aktywne zaburzenie neurologiczne, które może wpływać na stan bólowy (np. neuropatia obwodowa, stwardnienie rozsiane); (4) czynna choroba płuc wymagająca stosowania leków; oraz (5) brak historii zastrzyków steroidowych do stawów w ciągu ostatnich 3 miesięcy.</li>
	<li>Przynieś pacjenta na salę operacyjną z kapturem klasy A zagrożenia biologicznego i ułóż go (lub ją) w pozycji leżącej.</li>
	<li>Oczyść okolice brzucha pacjenta 5% betadyną (powidon-jodem) i ułóż pacjenta techniką sterylną, odsłaniając oczyszczony obszar brzucha do liposukcji.</li>
	<li>Około 5 cm w dolnej części pępka należy znieczulić dwa miejsca (jedno po lewej i drugie po prawej stronie pępka) nacięcia, które należy wykonać przy użyciu 2 ml 2% lidokainy bez epinefryny za pomocą igły (25 gauge, 11/2 cala) w strzykawce o pojemności 5 ml, wstrzykując każde miejsce na poziomie naskórka.</li>
	<li>Znieczulić miejsce nacięcia, które ma być wykonane, za pomocą 5 ml roztworu tumescencyjnego (500 ml soli fizjologicznej, 40 ml 2% lidokainy, 20 ml 0,5% bupiwakainy, 0,5 ml epinefryny 1:1000) w strzykawce o pojemności 10 ml z igłą (25 rozmiarów, 11/2 cala).</li>
	<li>Wykonaj 2 nacięcia po 0,5 cm około 5 cm poniżej pępka z boku, ściskając skórę, aby zwiększyć głębokość poziomu podskórnego.</li>
	<li>Za pomocą ostrza nr 11 szturchnij uniesioną skórę, aby przeniknęła do poziomu podskórnego, ale nie przeniknęła przez ścianę brzucha.</li>
	<li>Za pomocą kaniuli o średnicy 20 cm w rozmiarze 16 należy znieczulić podskórny poziom całego dolnego obszaru brzucha, który ma być poddany liposukcji, za pomocą 700 do 800 ml roztworu tumescencyjnego.</li>
	<li>Po zakończeniu naciekania całego podbrzusza roztworem tumescencyjnym, należy przygotować aparat do liposukcji, podłączając kaniulę 3,0 mm podłączoną do strzykawki o pojemności 60 ml (lub 30 ml) do liposukcji manualnej lub specjalnie zaprojektowanej kaniuli 3,0 mm podłączonej do zestawu wirówkowego, strzykawki z systemem zamkniętym w celu zachowania sterylności, Podłączony do maszyny próżniowej do liposukcji wspomaganej próżnią.</li>
	<li>Wykonaj liposukcję w celu uzyskania 100-110 g tkanki tłuszczowej z wyłączeniem roztworu tumescencyjnego. Podczas wykonywania liposukcji zostanie uzyskana tkanka tłuszczowa wraz z roztworem tumescencyjnym, którą należy oddzielić i usunąć.</li>
	<li>Aby oddzielić roztwór tumescencyjny, najpierw grawitacyjnie przenieś tkankę tłuszczową z zestawu wirówkowego do strzykawki o pojemności 60 ml i umieść strzykawkę w dół (tj. część strzykawki znajduje się na dole). Odczekanie 5-6 minut spowoduje oddzielenie tkanki tłuszczowej i płynu tumescencyjnego. Usunąć płyn z dolnej części strzykawki, naciskając górną część tłoka strzykawki.</li>
	<li>Wykonaj powyższe kroki 1.9-1.11, aż do zgromadzenia się łącznie 100-110 g tkanki tłuszczowej (lipoaaspiratów) na kolano.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszaniny ASC/ECM ze sterylnym systemem zamkniętym
<ol>
	<li>Po oddzieleniu roztworu tumescencyjnego grawitacyjnie i zgromadzeniu 50-55 g lipoaspiratów na każdy zestaw wirówkowy o pojemności 60 ml, sterylny system zamknięty, umieść 2 zestawy wirówek w wiadrze na pojemnik wirówkowy i wiruj z prędkością 1600 x g przez 5 minut, kondensując lipoaspiraty i oddzielając płyn od tkanki tłuszczowej. W tym procesie dalszej kondensacji lipoaspiraty mogą w niektórych przypadkach wytwarzać olej tłuszczowy.</li>
	<li>Uważając, aby nie potrząsnąć, zdejmij nasadkę zabezpieczającą i zatyczkę na spodzie zestawu wirówki.</li>
	<li>Usuń dolny płyn, powoli naciskając górną część tłoka zestawu wirówki.</li>
	<li>Na oddzielnej strzykawce o pojemności 60 ml rozpuść 10 mg kolagenazy (5 mg kolagenazy specyficznej dla tkanki łącznej24 i 5 mg kolagenazy specyficznej dla tkanki tłuszczowej25) w 50 ml soli fizjologicznej.</li>
	<li>Wymieszać około 25-30 ml skondensowanego lipoaspiratu z rozpuszczoną kolagenazą (5 mg kolagenazy specyficznej dla tkanki łącznej i 5 mg kolagenazy specyficznej dla tkanki tłuszczowej) w stosunku 1:1 (v:v), podłączając strzykawkę o pojemności 60 ml do zestawu wirówkowego za pomocą specjalistycznego łącznika.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać skondensowany lipoaspirat i kolagenazę, wpychając zawartość między strzykawkę 60 ml a zestawy wirówkowe za pomocą pręta lub popychacza.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę lipoaspiratu i kolagenazy z powrotem do strzykawek o pojemności 60 ml.</li>
	<li>Połączyć każdą strzykawkę o pojemności 60 ml zawierającą mieszaninę z homogenizatorem tkankowym zawierającym ostrza.</li>
	<li>Podłączyć pustą strzykawkę o pojemności 60 ml do drugiego końca homogenizatora.</li>
	<li>Przepchnij mieszaninę do drugiej strzykawki o pojemności 60 ml przez homogenizator 4 -6 razy, co spowoduje przecięcie i rozdrobnienie lipoaaspiratu.</li>
	<li>Przenieś homogenizowany lipoaspirat i mieszaninę kolagenazy z powrotem do zestawów wirówkowych o pojemności 60 ml przez specjalistyczne złącze</li>
	<li>Umieścić zestawy wirówek w pojemniku, który ma być umieszczony w inkubatorze podgrzanym do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Inkubować oba zestawy wirówkowe z homogenizowaną mieszaniną w temperaturze 37 °C przez 40 minut, obracając z prędkością 45 obr./min.</li>
	<li>Po 40 minutach inkubacji wyjąć pojemnik z inkubatora w sterylny sposób. Następnie wyjmij zestawy wirówek i umieść je w wirówce.</li>
	<li>Odwirować mieszaniny o sile 800 x g przez 5 minut w celu oddzielenia SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant (który zawiera kolagenazę i strawioną tkankę tłuszczową) z każdego zestawu wirówek, zdejmując nasadkę strzykawki z górnej części tłoka i umieszczając strzykawkę o pojemności 30 ml w otworze tłoka za pomocą połączenia z blokadą strzykawki.</li>
	<li>Powoli docisnąć część cylindryczną strzykawki o pojemności 30 ml, aby supernatant napełnił się do strzykawki o pojemności 30 ml.</li>
	<li>Dociśnij cylinder strzykawki o pojemności 30 ml do ostatnich 3-4 ml dna zestawu wirówki, pozostawiając tylko ostatnie 3-4 ml SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej. Supernatant jest odrzucany.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę o pojemności 30 ml z górnej części tłoka i napełnić strzykawkę 5% dekstrozą w roztworze Ringera z mleczanami (D5LR).</li>
	<li>Umieszczając strzykawkę o pojemności 30 ml wypełnioną D5LR na górze otworu tłoka, napełnij zestawy wirówek, zawierające 3-4 ml SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej, D5LR do 55 ml.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę o pojemności 30 ml, zakryć tłok i ponownie odwirować zestawy wirówek przy 300 x g przez 4 minuty.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.17-2.21, aby uzyskać łącznie 4 prania. Zastosowana kolagenaza jest ksenogenna. Dlatego większość kolagenazy usuwa się przez 4 prania. Jednak w celu zatwierdzenia przez FDA może być konieczne dopracowanie protokołu, aby całkowicie usunąć pozostałości kolagenazy w końcowej objętości, chociaż obecna ilość pozostałości kolagenazy może być wystarczająco znikoma dla pacjentów, którzy nie mają żadnych klinicznych skutków ubocznych.</li>
	<li>Po 4 odwirowaniu, w celu uzyskania końcowego SVF do wstrzykiwania, należy zdjąć nasadkę zabezpieczającą i korek w dolnym otworze zestawu wirówki, nie potrząsając ani nie obracając zestawu wirówki.</li>
	<li>Podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml do dolnego otworu zestawu wirówki za pomocą specjalnie zaprojektowanego łącznika.</li>
	<li>Pociągnąć tłok strzykawki kilka razy w przód i w tył, aby wstrząsnąć komórkami, które osiadły na dnie zestawu wirówkowego.</li>
	<li>Usuń pożądaną całkowitą objętość SVF zawierającą zarówno ASC, jak i ECM wraz z innymi komórkami i tkankami (zwykle około 3-4 ml z każdego zestawu wirówkowego do wstrzykiwań do stawu kolanowego).</li>
</ol>
3. Przygotowanie PRP techniką sterylną
<ol>
	<li>Przygotowując ASC i ECM, pobierz 30 ml krwi autologicznej z 2,5 ml roztworu dekstrozy antykoagulantu cytrynianowego.</li>
	<li>Przenieś pobraną krew do zestawów wirówek o pojemności 60 ml.</li>
	<li>Odwirować pobraną krew o stężeniu 730 x g przez 5 minut i usunąć supernatant do nowego zestawu wirówkowego o pojemności 60 ml. Odwirować supernatant przy 1300 x g przez 4 minuty, otrzymując 3-4 ml PRP.</li>
	<li>Bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy dodać 3% (w/v) chlorku wapnia w stosunku 10:2 (PRP: chlorek wapnia, v:v) do PRP, aby go aktywować.</li>
	<li>Dodać 0,5% (w/v) HA, jako rusztowanie, do PRP aktywowanego chlorkiem wapnia. Te ASC z ECM, wraz z PRP, aktywowanym chlorkiem wapnia i HA, oznaczają mieszaninę ASC/ECM.</li>
</ol>
4. Leczenie na bazie mieszaniny ASC/ECM
<ol>
	<li>Oczyść kolano pacjenta 5% betadyną i ułóż je w sterylny sposób.</li>
	<li>Wykonaj badanie palpacyjne przedniej części kolana w celu uzyskania przestrzeni stawowej między kością piszczelową a udową.</li>
	<li>Znieczulić miejsce wstrzyknięcia powierzchownie rozcieńczoną lidokainą (1 ml 1% lidokainy rozcieńczonej 4 ml soli fizjologicznej) od skóry do tuż poza torebką stawową.</li>
	<li>Znieczulić wnętrze torebki stawowej rozcieńczoną ropiwakainą (1 ml 0,75% ropiwakainy rozcieńczonej 3 ml soli fizjologicznej).</li>
	<li>Wymieszać 2 ml kwasu hialuronowego z 6-8 ml SVF znajdującego się w strzykawce o pojemności 20 ml przez łącznik strzykawka-strzykawka.</li>
	<li>Używając łącznika strzykawka-strzykawka, dodaj 0,4 ml chlorku wapnia do 3-4 ml autologicznego PRP, który został już przygotowany i jest gotowy w strzykawce o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Połączyć 3,5 - 4,5 ml PRP/chlorek wapnia w strzykawce o pojemności 5 ml z 8-10 ml mieszaniny HA/SVF w strzykawce o pojemności 20 ml za pomocą łącznika strzykawka-strzykawka.</li>
	<li>Natychmiast wstrzyknąć mieszaninę (około 12-15 ml) powoli do przedniego stawu piszczelowo-udowego kolan za pomocą igły 38 mm o rozmiarze 18 z lub bez kontroli ultrasonograficznej.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy zabandażować miejsce wstrzyknięcia za pomocą nacisku, składając 4x4 bawełnianą gazę 4x4 i umieszczając taśmy na złożonej gazie 4x4.</li>
	<li>Poinstruuj pacjenta, aby pozostał nieruchomo przez 60 minut, aby umożliwić przyczepienie komórek.</li>
	<li>Poinstruuj pacjenta, aby ograniczył aktywność przez co najmniej 1 tydzień po wypisie z kliniki.</li>
	<li>Wróć do kliniki na trzy dodatkowe wstrzyknięcia PRP aktywowanego chlorkiem wapnia w ciągu 3 tygodni.</li>
</ol>
5. Kontynuacja po leczeniu
<ol>
	<li>Oceń pacjenta w 2., 4. i 16. tygodniu (18 lub 22) pod kątem poprawy bólu pod względem wizualnej skali analogowej (VAS) i poprawy funkcji pod względem parametrów fizjoterapii. Określ funkcjonalny wskaźnik oceny (FRI), VAS i zakres ruchu (ROM) zgodnie z wcześniejszym opisem26,27.</li>
	<li>Obserwuj pacjenta za pomocą rezonansu magnetycznego po zabiegu 3 miesiące po zabiegu.</li>
</ol>

<ol><li>Arnoczky, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+meniscus.+Biologic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Building a meniscus. Biologic considerations.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. (367 Suppl), S244-S253 (1999).</li>
<li>Barry, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell+therapy+in+joint+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Novartis+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell therapy in joint disease.</a> Novartis Foundation Symposium. 249, 86-241 (2003).</li>
<li>Usuelli, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+in+orthopaedic+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells in orthopaedic pathologies.</a> British Medical Bulletin. 124 (1), 31-54 (2017).</li>
<li>Zhang, H. N., Li, L., Leng, P., Wang, Y. Z., Lv, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uninduced+adipose-derived+stem+cells+repair+the+defect+of+full-thickness+hyaline+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Traumatology%22%5BJournal%5D)">Uninduced adipose-derived stem cells repair the defect of full-thickness hyaline cartilage.</a> Chinese Journal of Traumatology. 12 (2), 92-97 (2009).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%3A+tissue+localization%2C+characterization%2C+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. 2012, 812693(2012).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cell%3A+a+better+stem+cell+than+BMSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Function%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC.</a> Cell Biochemistry and Function. 26 (6), 664-675 (2008).</li>
<li>Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+non-enzymatic+methods+for+harvesting+adipose-derived+stem+from+lipoaspirate%3A+technical+considerations+and+clinical+implications+for+regenerative+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10015(2017).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Park, K. S., Jeong, B. C., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Cartilage+in+Human+Knee+Osteoarthritis+with+Autologous+Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+and+Autologous+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Cartilage in Human Knee Osteoarthritis with Autologous Adipose Tissue-Derived Stem Cells and Autologous Extracellular Matrix.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 192-200 (2016).</li>
<li>Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+Adipose-derived+Stromal+Vascular+Fraction+%28AD-SVF%29+Cell+Biology+and+Use+on+the+Basis+of+Cellular%2C+Chemical%2C+Structural+and+Paracrine+Components%3A+A+Concise+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Prolotherapy%22%5BJournal%5D)">Understanding Adipose-derived Stromal Vascular Fraction (AD-SVF) Cell Biology and Use on the Basis of Cellular, Chemical, Structural and Paracrine Components: A Concise Review.</a> Journal of Prolotherapy. 4, e855-e869 (2012).</li>
<li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li>
<li>Korean Food and Drug Administration (KFDA). Cell therapy: Rules and Regulations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22KFDA%22">KFDA</a>. , (2009).</li>
<li>Pak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+bones+in+hip+osteonecrosis+and+human+cartilage+in+knee+osteoarthritis+with+autologous+adipose-tissue-derived+stem+cells%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Case+Reports%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human bones in hip osteonecrosis and human cartilage in knee osteoarthritis with autologous adipose-tissue-derived stem cells: a case series.</a> Journal of Medical Case Reports. 5, 296(2011).</li>
<li>Pak, J., Chang, J. J., Lee, J. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+reporting+on+implantation+of+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells+with+platelet-rich+plasma+into+human+articular+joints%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskeletal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Safety reporting on implantation of autologous adipose tissue-derived stem cells with platelet-rich plasma into human articular joints.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 14, 337(2013).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Kartolo, W. A., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+Regeneration+in+Human+with+Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells%3A+Current+Status+in+Clinical+Implications%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Cartilage Regeneration in Human with Adipose Tissue-Derived Stem Cells: Current Status in Clinical Implications.</a> BioMed Research International. 2016, 4702674(2016).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biological+approach+to+treat+chondromalacia+patellae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel biological approach to treat chondromalacia patellae.</a> PLoS One. 8 (5), e64569(2013).</li>
<li>Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+repair+of+damaged+meniscus+with+autologous+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells.</a> BioMed Research International. 2014, 436029(2014).</li>
<li>Aust, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yield+of+human+adipose-derived+adult+stem+cells+from+liposuction+aspirates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates.</a> Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).</li>
<li>De Ugarte, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multi-lineage+cells+from+human+adipose+tissue+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow.</a> Cells Tissues Organs. 174 (3), 101-109 (2003).</li>
<li>Guilak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+differentiation+potential+of+human+adipose-derived+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the differentiation potential of human adipose-derived adult stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 206 (1), 229-237 (2006).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).</li>
<li>Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+yield+and+growth+characteristics+are+affected+by+the+tissue-harvesting+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure.</a> Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).</li>
<li>Liberase TL information available from Sigma Millipore online. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US</a> (2018).</li>
<li>Liberase TM information available from Sigma Millipore online. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/Libtmro?lang=en&region=US">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/Libtmro?lang=en&region=US</a> (2018).</li>
<li>Childs, J. D., Piva, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychometric+properties+of+the+functional+rating+index+in+patients+with+low+back+pain%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Psychometric properties of the functional rating index in patients with low back pain.</a> European Spine Journal. 14 (10), 1008-1012 (2005).</li>
<li>Price, D. D., McGrath, P. A., Rafii, A., Buckingham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+validation+of+visual+analogue+scales+as+ratio+scale+measures+for+chronic+and+experimental+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">The validation of visual analogue scales as ratio scale measures for chronic and experimental pain.</a> Pain. 17 (1), 45-56 (1983).</li>
<li>Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+highly+defined+proteases+for+the+isolation+of+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells.</a> Regenerative Medicine. 3 (5), 705-715 (2008).</li>
<li>D'Ambrosi, R., Indino, C., Maccario, C., Manzi, L., Usuelli, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Microfractured+and+Purified+Adipose+Tissue+for+Arthroscopic+Management+of+Osteochondral+Lesions+of+the+Talus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Autologous Microfractured and Purified Adipose Tissue for Arthroscopic Management of Osteochondral Lesions of the Talus.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56395(2018).</li>
<li>Packer, J. D., Chang, W. T., Dragoo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vibrational+energy+to+isolate+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+Reconstructive+Surgery-Global+Open%22%5BJournal%5D)">The use of vibrational energy to isolate adipose-derived stem cells.</a> Plastic Reconstructive Surgery-Global Open. 6 (1), e1620(2018).</li>
<li>Hanke, C. W., Bernstein, G., Bullock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+tumescent+liposuction+in+15%2C336+patients.+National+survey+results%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Safety of tumescent liposuction in 15,336 patients. National survey results.</a> Dermatologic Surgery. 21 (5), 459-462 (1995).</li>
<li>Illouz, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+of+liposuction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Complications of liposuction.</a> Clinics in Plastic Surgery. 33 (1), 129-163 (2006).</li>
<li>Dixit, V. V., Wagh, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfavourable+outcomes+of+liposuction+and+their+management%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Unfavourable outcomes of liposuction and their management.</a> Indian Journal of Plastic Surgery. 46 (2), 377-392 (2013).</li>
<li>Lehnhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+and+lethal+complications+of+liposuction%3A+a+review+of+72+cases+in+Germany+between+1998+and+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Major and lethal complications of liposuction: a review of 72 cases in Germany between 1998 and 2002.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 121 (6), 396e-403e (2008).</li>
<li>Iyer, S. S., Rojas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effects+of+mesenchymal+stem+cells%3A+novel+concept+for+future+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells: novel concept for future therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (5), 569-581 (2008).</li>
<li>Zhang, J., Middleton, K. K., Fu, F. H., Im, H. J., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HGF+mediates+the+anti-inflammatory+effects+of+PRP+on+injured+tendons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">HGF mediates the anti-inflammatory effects of PRP on injured tendons.</a> PLoS One. 8 (6), e67303(2013).</li>
<li>Li, N. Y., Yuan, R. T., Chen, T., Chen, L. Q., Jin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platelet-rich+plasma+and+latissimus+dorsi+muscle+flap+on+osteogenesis+and+vascularization+of+tissue-engineered+bone+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Effect of platelet-rich plasma and latissimus dorsi muscle flap on osteogenesis and vascularization of tissue-engineered bone in dogs.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 67 (9), 1850-1858 (2009).</li>
<li>Parsons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+effect+of+platelet+rich-plasma+on+the+fracture+healing+process%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+bone+and+joint+surgery.+British+volume%22%5BJournal%5D)">The biological effect of platelet rich-plasma on the fracture healing process.</a> The Journal of bone and joint surgery. British volume. 91-B, 293(2009).</li>
<li>Wu, W., Chen, F., Liu, Y., Ma, Q., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+injectable+tissue-engineered+cartilage+by+using+platelet-rich+plasma%3A+experimental+study+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Autologous injectable tissue-engineered cartilage by using platelet-rich plasma: experimental study in a rabbit model.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 65 (10), 1951-1957 (2007).</li>
<li>Cooper, T. W., Eisen, A. Z., Stricklin, G. P., Welgus, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+collagenase+inhibitor%3A+characterization+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived collagenase inhibitor: characterization and subcellular localization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2779-2783 (1985).</li>
<li>Uzuki, M., Sawai, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+affinity+of+sodium+hyaluronate+of+various+molecular+weights+for+degenerated+cartilage%3A+a+histochemical+study+using+hyaluronic+acid+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Congress+Series%22%5BJournal%5D)">A comparison of the affinity of sodium hyaluronate of various molecular weights for degenerated cartilage: a histochemical study using hyaluronic acid binding protein.</a> International Congress Series. 1223, 279-284 (2001).</li>
<li>Pagano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+morphometric+description+of+adipose+tissue+during+weight+changes%3A+a+quantitative+tool+for+assessment+of+tissue+texture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular and morphometric description of adipose tissue during weight changes: a quantitative tool for assessment of tissue texture.</a> International Journal of Molecular Medicine. 14 (5), 897-902 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W 2001 roku Zuk i wsp. Wyizolowane komórki macierzyste z tkanki tłuszczowej poprzez rozbicie macierzy kolagenowej za pomocą kolagenazy6. Następnie grupa wykazała, że te komórki macierzyste wyizolowane z tkanki tłuszczowej mogą przekształcić się w chrząstkę i inne tkanki pochodzenia mezodermy, udowadniając, że te komórki macierzyste są pochodzenia mezenchymalnego.
Podobnie procedura przedstawiona w tym artykule jest zmodyfikowanym protokołem w celu zastosowania ...

Wiadomo, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają zdolność do regeneracji chrząstki1,2,3,4,5,6. Można je łatwo pozyskać z różnych źródeł, m.in. z szpiku kostnego, krwi pępowinowej i tkanki tłuszczowej. Wśród tych źródeł tkanka tłuszczowa jest jedynym, z którego można uzyskać wystarczającą liczbę MSC bez konieczności ekspansji hodowlanej w celu regeneracji chrząstki w warunkach klinicznych7,8. Można również łatwo uzyskać autologiczną frakcję naczyniowo-stromalną (SVF) ze szpiku kostnego. Jednak liczba komórek macierzystych zawartych w szpiku niepoddanym ekspansji hodowlanej jest bardzo niska7,8. Krew pępowinowa może zawierać wystarczającą liczbę MSC, jednak nie jest ona łatwo dostępnym źródłem autologicznej SVF.
W zastosowaniach klinicznych dostępnych jest wiele metod przetwarzania tkanki tłuszczowej w celu uzyskania frakcji naczyniowo-śródmiąższowej (SVF). Wśród nich bardzo dobrze przyjęta jest metoda pozyskiwania mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) z tkanki tłuszczowej przy użyciu kolagenazy, opracowana i potwierdzona przez Zuka et al.5,6. Metoda ta, oparta na zastosowaniu kolagenazy, została zmodyfikowana na potrzeby zastosowań klinicznych w ortopedii. Aby system mógł być wykorzystany w warunkach klinicznych, musi być to układ zamknięty, który zapewni sterylność przy jednoczesnym zachowaniu wygody użytkowania. Jedna ze szczególnych modyfikacji przedstawionych w niniejszym artykule dotyczy homogenizacji lipoaspiratów. Małe fragmenty lipoaspiratów są trawione stosunkowo szybciej niż fragmenty większe, co zapobiega nierównomiernemu rozpadowi tkanki tłuszczowej. Co więcej, większe fragmenty lipoaspiratów mogą tworzyć tkanki włókniste, które mogą zapychać strzykawki i igły podczas wykonywania zastrzyków do stawów9,10. Aby zapobiec tym problemom, lipoaspiraty można homogenizować poprzez ich cięcie i rozdrabnianie przed inkubacją z kolagenazą. Otrzymana SVF pochodząca z tkanki tłuszczowej może zawierać bardziej jednorodną macierz pozakomórkową (ECM) w porównaniu do lipoaspiratów niehomogenizowanych1. Rozłożona ECM zawarta w SVF może pełnić funkcję rusztowania (scaffold)12.
W 209 roku Koreańska Agencja ds. Żywności i Leków (KFDA) zezwoliła na stosowanie autologicznej frakcji naczyniowej (SVF) pochodzącej z tkanki tłuszczowej, pod warunkiem że zostanie ona przetworzona w placówce medycznej przez lekarza przy zastosowaniu minimalnego przetwarzania13. Następnie autologiczna SVF pochodząca z tkanki tłuszczowej była wykorzystywana jako potencjalny środek do poprawy funkcji kolana u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów (OA) poprzez potencjalną regenerację tkanki przypominającej chrząstkę10,14,15,16,17,18. 
W 201 roku Pak wykazał po raz pierwszy, że komórki macierzyste pochodzenia tłuszczowego (ASCs) zawarte w frakcji naczyniowo-śródmiąższowej (SVF) pochodzenia tłuszczowego mogą poprawić funkcje kolana, potencjalnie regenerując tkankę podobną do chrząstki u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową (OA) stawu kolanowego, gdy zostaną wstrzyknięte wraz z osoczem bogatopłytkowym (PRP) 14. Ponadto, Pak et al. przedstawili w 2013 roku dane dotyczące bezpieczeństwa obejmujące 91 pacjentów. Średni wskaźnik skuteczności raportowany w tych danych dotyczących bezpieczeństwa wyniósł 67%15. W kolejnych badaniach przeprowadzonych przez Pak et al. wykazano poprawę funkcji kolana, prawdopodobnie w wyniku regeneracji tkanki podobnej do chrząstki, u pacjentów z pęknięciem łąkotki oraz chondromalacją rzepki10,16,17,18. Na podstawie opublikowanych artykułów wiadomo, że liczba komórek macierzystych zawartych w 10 g tkanki tłuszczowej przetworzonej zgodnie z protokołem przedstawionym w niniejszym artykule może wynosić od 1 0 0 do 40 0 0 w zależności od charakterystyki pacjentów8,19,20,21,2,23.
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół kliniczny leczenia choroby zwyrodnieniowej (OA) stawu kolanowego u ludzi z wykorzystaniem autologicznej frakcji naczyniowej stromy (SVF) pochodzącej z tkanki tłuszczowej, w połączeniu z kwasem hialuronowym (HA) oraz bogatopłytkowym osoczem (PRP) aktywowanym chlorkiem wapnia. Pierwsza wersja tego protokołu klinicznego, obejmująca zamknięty system manualny w celu zachowania sterylności, została opisana w 201 roku14. Ten sam protokół został zoptymalizowany pod kątem zachowania sterylności i opisany w 2013 oraz 2016 roku10,15. W niniejszej pracy zaprezentowano zoptymalizowany protokół. Schematyczny przegląd procedury przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Schemat liposukcji i przetwarzania przedstawiający wstrzykiwanie mieszaniny ASC/ECM w medycynie regeneracyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58363/58363fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58363/58363fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% Betadine (powidon-jod)&nbsp;</td><td>Firson Co., Sp. z o.o.</td><td></td><td></td>657400260</tr><tr><td>2% lidokainy&nbsp;</td><td>Daehan Pharmaceutical Co.</td><td></td><td></td>670603480</tr><tr><td>Roztwór tumescencyjny&nbsp;</td><td>Myungmoon Pharm. Co., Ltd.</td><td>N01BB01</td><td>Roztwór składał się z 500 ml soli fizjologicznej, 40 ml 2% lidokainy, 20 ml 0,5% marcainy i 0,5 ml epinefryny w stosunku 1:1000.</td></tr><tr><td>Klasa badawcza Liberase TL i TM&nbsp;</td><td>Nauki stosowane Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>D5LR</td><td>Dahan Pharm. Co., Ltd.</td><td>645101072</td><td>Dekstroza 5% w roztworze Ringera z mleczanami&nbsp;</td></tr><tr><td>Antykoagulant cytrynian roztwór dekstrozy&nbsp;</td><td>Fenwal, Inc.</td><td>NDC: 0942-0641</td><td>Roztwór składał się z 0,8% kwasu cytrynowego, 0,22% cytrynianu sodu i 0,223% dekstrozy.</td></tr><tr><td>3% (w/v) Chlorek wapnia&nbsp;</td><td>Choongwae Pharmaceutical Co.</td><td></td><td></td>644902101</tr><tr><td>0,5% (w/v) HA (kwas hialuronowy)</td> <td>Dongkwang pharm. Co., Ltd.</td><td></td><td></td>645902030</tr><tr><td>0,25% ropiwakainy</td><td>Huons Co., Ltd.</td><td>670600150</td><td></td></tr><tr><td><mocna>Sprzęt</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,0 mm Kaniula&nbsp;</td><td>WOOJU Instrumenty medyczne Co.</td><td></td><td></td>ML30200</tr><tr><td>Strzykawka Luer-Lock 60 ml</td><td>BD (Becton Dickinson)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>309653 Zestaw bębnowy wirówki&nbsp;</td><td>CPL Sp. z o.o.</td><td>30-0827044</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy zawierający ostrza</td><td>CPL Co., Ltd.</td><td>30-0827045</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik z inkubatorem obrotowym</td><td>Medikan Co., Ltd</td><td>MS02060092</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Hanil Scientific Inc.</td><td>CE1133</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego</td><td>Philips Medical Systems Inc.</td><td>18068</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania ultrasonograficznego</td><td>Samsung Medison co., Ltd</td><td>CT-LK-V10-ICM-09.05.2007</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) jest jednym z najczęstszych zaburzeń powodujących wyniszczanie. Ostatnio podjęto liczne próby poprawy funkcji kolan poprzez zastosowanie różnych form mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). W Korei koncentraty szpiku kostnego i komórki macierzyste pochodzące z krwi pępowinowej zostały zatwierdzone przez Koreańską Agencję ds. Żywności i Leków (KFDA) do regeneracji chrząstki. Ponadto KFDA zezwoliła na stosowanie frakcji zrębu naczyniowego pochodzącej z tkanki tłuszczowej (SVF) do wstrzykiwań do stawów u ludzi. Autologiczny SVF pochodzący z tkanki tłuszczowej oprócz mezenchymalnych komórek macierzystych zawiera macierz zewnątrzkomórkową (ECM). ECM wydziela różne cytokiny, które wraz z kwasem hialuronowym (HA) i osoczem bogatopłytkowym (PRP) aktywowanym przez chlorek wapnia mogą pomóc MSCs w regeneracji chrząstki i poprawie funkcji kolana. W tym artykule przedstawiliśmy protokół poprawy funkcji kolana poprzez regenerację tkanki przypominającej chrząstkę u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów. Wynik protokołu został po raz pierwszy opisany w 2011 r., a następnie w kilku dodatkowych publikacjach. Protokół obejmuje liposukcję w celu uzyskania autologicznych lipoaspiratów, które są mieszane z kolagenazą. Ta mieszanina lipoazjatów i kolagenazy jest następnie cięta i homogenizowana w celu usunięcia dużej tkanki włóknistej, która może zatkać igłę podczas wstrzyknięcia. Następnie mieszanina jest inkubowana w celu uzyskania SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej. Powstały SVF pochodzący z tkanki tłuszczowej, zawierający zarówno MSC pochodzące z tkanki tłuszczowej, jak i pozostałości ECM, jest wstrzykiwany do kolan pacjentów w połączeniu z HA i PRP aktywowanym chlorkiem wapnia. Uwzględniono trzy przypadki pacjentów, którzy byli leczeni naszym protokołem, co spowodowało poprawę bólu kolana, obrzęku i zakresu ruchu wraz z dowodami MRI tkanki przypominającej chrząstkę szklistą.

Trzech pacjentów (kobieta w wieku 87 lat z OA stopnia 3, mężczyzna w wieku 68 lat z OA stopnia 3 oraz kobieta w wieku 60 lat z OA stopnia 3) bez istotnej historii chorób w wywiadzie zgłosiło się do kliniki z powodu uporczywego bólu kolana w celu rozważenia potencjalnego leczenia SVF pochodzącym z autologicznej tkanki tłuszczowej. U wszystkich trzech pacjentów kolano zostało zbadane przez chirurga ortopedę, który zaproponował całkowitą endoprotezoplastykę stawu kolanowego (TKR), jednak pac...

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania frakcji zrębowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej i jej zastosowanie do poprawy funkcji kolana poprzez regenerację tkanki chrzęstnej u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.

Protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Choroba zwyrodnieniowa stawów jest jednym z najczęstszych zaburzeń wyniszczających wśród osób starszych. Obecnie nie ma jednoznacznego lekarstwa na podstawowe przyczyny choroby zwyrodnieniowej stawów. Ten protokół kliniczny opisuje innowacyjną procedurę obiecującego, minimalnie inwazyjnego i alternatywnego leczenia choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u ludzi poprzez regenerację tkanki przypominającej chrząstkę.Choroba zwyrodnieniowa stawów jest jednym z najczęstszych zaburzeń wyniszczających wśród osób starszych. Obecnie nie ma definitywnego lekarstwa na podstawowe przyczyny choroby zwyrodnieniowej stawów. Ten protokół kliniczny jest innowacyjną procedurą obiecującego, minimalnie inwazyjnego i alternatywnego leczenia choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego u ludzi poprzez regenerację tkanki przypominającej chrząstkę.Przynieś pacjenta na salę operacyjną z kapturem klasy A zagrożenia biologicznego i ułóż go w pozycji leżącej. Oczyść okolice brzucha pacjenta 5% jodem betadyny-powidyny i udrapuj pacjenta techniką sterylną, odsłaniając czysty obszar brzucha do liposukcji. Około pięciu centymetrów w dolnej części pępka należy znieczulić dwa miejsca, jedno po lewej, a drugie po prawej stronie pępka nacięcia, które ma zostać wykonane.Używając dwóch mililitrów 2% lidokainy bez epinefryny za pomocą igły o rozmiarze 25 1,5 cala w pięciomililitrowej strzykawce, wstrzykując każde miejsce na poziomie naskórka. Znieczulić miejsce nacięcia, które ma być wykonane, za pomocą pięciu mililitrów roztworu tumescencyjnego i 10-mililitrowej strzykawki oraz igły o rozmiarze 25 1,5 cala. Wykonaj dwa nacięcia po 0,5 centymetra około pięciu centymetrów poniżej pępka z boku, ściskając skórę, aby zwiększyć głębokość poziomu podskórnego.Używając ostrza numer 11, pomóż uniesionej skórze przeniknąć do poziomu podskórnego, ale nie przeniknąć przez ścianę brzucha. Za pomocą 20-centymetrowej kaniuli o rozmiarze 60 znieczulij podskórny poziom całego dolnego obszaru brzucha, który ma być liposukowany za pomocą 700 do 800 mililitrów roztworu tumescencyjnego. Po zakończeniu infiltracji całego podbrzusza roztworem tumescencyjnym należy przygotować aparat do liposukcji, podłączając kaniulę o średnicy 3,0 milimetra podłączoną do strzykawki o średnicy 60 mililitrów lub 30 mililitrów do liposukcji manualnej lub specjalnie zaprojektowanej kaniuli o średnicy 3,0 milimetra podłączonej do zestawu wirówkowego.Strzykawka z systemem zamkniętym opracowana przez nas i zatwierdzona przez FDA CDRH w celu utrzymania sterylności podłączona do maszyny próżniowej do liposukcji wspomaganej próżnią. Wykonaj liposukcję, aby uzyskać od 100 do 110 gramów tkanki tłuszczowej z wyłączeniem roztworu tumescencyjnego. Podczas wykonywania liposukcji tkanka tłuszczowa zostanie uzyskana wraz z roztworem tumescencyjnym, ale należy ją oddzielić i usunąć.Aby najpierw oddzielić roztwór tumescencyjny grawitacyjnie, tkankę tłuszczową w zestawie wirówkowym można przenieść do strzykawki o pojemności 60 mililitrów i umieścić strzykawkę w dół. Na przykład otwierająca się część strzykawki znajduje się na dole. Odczekaj od pięciu do sześciu minut, tkanka tłuszczowa i roztwór tumescencyjny zostaną oddzielone.Usunąć płyn z dna strzykawki, naciskając górną część tłoka strzykawki. Wykonuj powyższe kroki od 9 do 11, aż do zgromadzenia się całkowitej ilości od 100 gramów do 110 gramów aspiratu lipidowego tkanki tłuszczowej na kolano. Po oddzieleniu roztworu tumescencyjnego grawitacyjnie i zgromadzeniu od 50 gramów do 55 gramów aspiratu lipidowego na każdy 60-mililitrowy zestaw wirówkowy sterylnie zamknięty system, umieść dwa zestawy wirówek w wiadrze na pojemnik wirówkowy i wiruj z prędkością 1600 G przez pięć minut, kondensując aspirat lipidowy i oddzielając płyn od tkanki tłuszczowej.Proces ten dodatkowo zagęszcza aspirat lipidowy i w niektórych przypadkach może wytwarzać olej tłuszczowy. Uważając, aby się nie potrząsnąć, zdejmij nasadkę zabezpieczającą i korek na spodzie zestawu wirówki. Usuń dolny płyn, powoli naciskając na górną część tłoka zestawu wirówki.Na oddzielnej strzykawce o pojemności 60 mililitrów rozpuść 10 miligramów kolagenazy, pięć miligramów kolagenazy specyficznej dla tkanki łącznej i pięć miligramów kolagenazy specyficznej dla tkanki tłuszczowej z 50 miligramami soli fizjologicznej. Wymieszać około 25 do 30 mililitrów skondensowanego aspiratu lipidowego z rozpuszczoną kolagenazą, pięcioma miligramami kolagenazy specyficznej dla tkanki łącznej i pięcioma miligramami kolagenazy specyficznej dla tkanki tłuszczowej w stosunku jeden do jednego, objętość do objętości, podłączając 60-mililitrową strzykawkę do zestawu wirówkowego za pomocą specjalistycznego łącznika. Dokładnie wymieszaj, aby skondensować aspirat preparatu i kolagenazę, wpychając zawartość między 60-mililitrową strzykawkę a zestaw wirówki za pomocą pręta lub popychacza.Przenieś mieszaninę aspiratu lipidowego i kolagenazy z powrotem do 60-mililitrowej strzykawki. Połączyć każdą 60-mililitrową strzykawkę zawierającą mieszaninę z homogenizatorem tkankowym, który zawiera ostrza. Podłącz pustą strzykawkę o pojemności 60 mililitrów do drugiego końca homogenizatora.Przepchnij mieszaninę do drugiej 60-mililitrowej strzykawki przez homogenizator cztery do sześciu razy, co spowoduje przecięcie i rozdrobnienie aspiratu lipidowego. Przenieś homogenizowany aspirat lipidowy i mieszaninę kolagenową z powrotem do 60-mililitrowego zestawu wirówkowego przez specjalistyczne złącze. Umieść zestawy wirówek w pojemniku, który zostanie umieszczony w inkubatorze podgrzanym do 37 stopni Celsjusza.Inkubować dwa zestawy wirówkowe z homogenizowaną mieszaniną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, obracając z prędkością 45 obr./min. Po 40 minutach inkubacji wyjąć pojemnik z inkubatora w sterylny sposób. Następnie wyjmij zestawy wirówek i umieść je w wirówce.Odwirować mieszaniny o stężeniu 800 G przez pięć minut w celu oddzielenia SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej. Po odwirowaniu supernatant, który zawiera kolagenazę i strawioną tkankę tłuszczową, usuwa się z każdego zestawu wirówkowego, zdejmując nasadkę strzykawki z tłoka i umieszczając 30-mililitrową strzykawkę na otworze tłoka przez połączenie strzykawka-blokada. Powoli dociśnij część cylindryczną 30-mililitrowej strzykawki, aby supernatant napełnił się do 30-mililitrowej strzykawki.Dociśnij 30-mililitrową lufę strzykawki aż do ostatnich trzech do czterech mililitrów dna zestawu wirówki, pozostawiając tylko ostatnie trzy do czterech mililitrów SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej. Supernatant jest odrzucany. Wyjąć 30-mililitrową strzykawkę z górnej części tłoka i napełnić strzykawkę 5% roztworem Ringera z dekstrozą, znanym również jako D5LR.Mocując 30-mililitrową strzykawkę wypełnioną D5LR na górze otworu tłoka, napełnij zestawy wirówek zawierające od trzech do czterech mililitrów SVF pochodzącego z tkanki tłuszczowej D5LR do 55 mililitrów. Następnie wyjmij 30-mililitrową strzykawkę, zakryj otwór tłoka i ponownie odwiruj zestawy wirówek przy 300 G przez około cztery minuty. Powtórz kroki od 17 do 21, aby uzyskać łącznie cztery prania.Po czwartej wirówce, w celu uzyskania końcowego SVF do wstrzykiwania, zdejmij nasadkę zabezpieczającą i korek w dolnym otworze zestawu wirówki, nie potrząsając ani nie obracając zestawu wirówki. Podłącz strzykawkę o pojemności 20 mililitrów do dolnego otworu zestawu wirówki za pomocą specjalnie zaprojektowanego łącznika. Pociągnij tłok 20-mililitrowej strzykawki kilka razy w przód i w tył, aby wstrząsnąć komórkami, które osiadły na dnie zestawu wirówkowego.Usunąć żądaną całkowitą objętość SVF zawierającą zarówno AspAT, jak i ECM wraz z innymi komórkami i tkankami. Zwykle około trzech do czterech mililitrów z każdego zestawu wirówkowego do iniekcji stawu kolanowego. Przeprowadziliśmy 30 mililitrów krwi autologicznej wraz z 2,5 mililitra roztworu dekstrozy antykoagulantu cytrynianowego.Następnie pobraną krew przeniesiono do 60-mililitrowych zestawów beczek wirówek. Następnie był odwirowywany przy grawitacji 730 przez pięć minut. Supernatant został usunięty i umieszczony w nowym zestawie cylindrów wirówki o pojemności 60 mililitrów.Supernatant odwirowywano przy grawitacji 1350 przez cztery minuty, uzyskując 4,4 mililitra PRP. Oczyść kolano pacjenta 5% betadyną i ułóż je w sterylny sposób. Wykonaj badanie palpacyjne przedniej części kolana w celu uzyskania przestrzeni stawowej między kością piszczelową a udową.Znieczulić miejsce wstrzyknięcia powierzchownie rozcieńczoną lidokainą, jednym mililitrem 1% lidokainy rozcieńczonym czterema mililitrami soli fizjologicznej, od skóry do tuż na zewnątrz torebki stawowej. Następnie znieczulić wnętrze kapsułki stawowej rozcieńczoną ropiwakainą, jednym mililitrem 0,75% ropiwakainy rozcieńczoną trzema mililitrami normalnej soli fizjologicznej. Wymieszaj dwa mililitry kwasu hialuronowego z sześcioma do ośmiu mililitrami SVF zawartymi w 20-mililitrowej strzykawce przez łącznik strzykawka-strzykawka.Używając łącznika strzykawka-strzykawka, dodaj 0,4 mililitra chlorku wapnia do trzech do czterech mililitrów autologicznego PRP, który został już przygotowany i jest gotowy w pięciomililitrowej strzykawce. Połącz od 3,5 do 4,5 mililitra chlorku wapnia PRP w pięciomililitrowej strzykawce z ośmioma do 10 mililitrami mieszaniny HA-SVF w 20-mililitrowej strzykawce przez złącze strzykawka-strzykawka. Natychmiast wstrzyknąć mieszaninę, około 12 do 15 mililitrów, powoli do przedniego stawu piszczelowo-udowego kolana, za pomocą igły o średnicy 38 milimetrów w rozmiarze 18 z lub bez wskazówek USG.Po wstrzyknięciu należy zabandażować miejsce wstrzyknięcia uciskiem, składając czterokrotnie bawełnianą gazę 4x4 i umieszczając taśmy na złożonej gazie 4x4. Poinstruuj pacjenta, aby pozostał nieruchomo przez 60 minut, aby umożliwić przyczepienie komórek. Poinstruuj pacjenta, aby ograniczył aktywność przez co najmniej tydzień po wypisie z kliniki.Wróć do kliniki w celu wykonania trzech dodatkowych wstrzyknięć PRP aktywowanego chlorkiem wapnia w ciągu trzech tygodni. Pacjent z chorobą zwyrodnieniową stawów trzeciego stopnia otrzymał leczenie opisane w punkcie protokołu. Po drugim tygodniu od wstrzyknięcia mieszaniny ASV-ECM ból pacjenta i ROM uległy poprawie.Do 16. tygodnia ból i ROM pacjenta znacznie się poprawiły o ponad 70% Rezonans magnetyczny po zabiegu, wykonany po 16. tygodniu, wykazał zwiększoną grubość tkanki przypominającej chrząstkę po przyśrodkowej stronie kolana. Inny pacjent z chorobą zwyrodnieniową stawów trzeciego stopnia otrzymał leczenie opisane w części protokołu. Po drugim tygodniu od wstrzyknięcia mieszaniny ASV-ECM ból pacjenta i ROM uległy poprawie.Do 18. tygodnia ból i ROM znacznie się poprawiły do 80%Powtórzony rezonans magnetyczny wykonany po 18. tygodniu wykazał wzrost wysokości tkanki chrzęstnej po przedniej-środkowej stronie kolana. Trzeci pacjent z chorobą zwyrodnieniową stawów w trzecim stopniu otrzymał leczenie opisane w sekcji protokołu. Po drugim tygodniu wstrzyknięcia mieszaniny ASV-ECM ból pacjenta i ROM poprawiły się o około 50%Do 22. tygodnia ból i ROM znacznie się poprawiły o ponad 80%Powtórzony rezonans magnetyczny wykonany po 22. tygodniu wykazał wzrost wysokości tkanki przypominającej chrząstkę po przyśrodkowej stronie kolana.Obecnie nie jest dostępna żadna terapia lecznicza w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów. Jednak przezskórne wstrzyknięcie terapii komórkami macierzystymi z ASC i homogenizowanym ECM wraz z HA i analogicznym PRP aktywowanym chlorkiem wapnia może stanowić alternatywę dla obecnej terapii leczenia choroby zwyrodnieniowej stawu kolanowego.

clinical-protocol-producing-adipose-tissue-derived-stromal-vascular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Celem tego badania jest przedstawienie protokołu artroskopowego leczenia uszkodzeń kostno-chrzęstnych kości skokowej przy użyciu mikrozłamanych i oczyszczonych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Autologiczna mikropęknięta i oczyszczona tkanka tłuszczowa do artroskopowego leczenia zmian kostno-chrzęstnych kości skokowej

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania frakcji naczyniowej zrębu z tkanki tłuszczowej poprzez szereg procesów mechanicznych, które obejmują emulgację i wielokrotne wirowanie.

Mikronizacja mechaniczna lipoaspiratów w terapii regeneracyjnej

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu (SVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje łatwy i skuteczny nośnik dla żywotnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej dla różnych wskazań, w tym inżynierii tkankowej i/lub gojenia się ran. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie mechanicznego konstruktu hydrożelowego SVF (mSVF)-fibryna do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.

Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

Tutaj prezentujemy protokół, który może przekształcić autologiczną tkankę tłuszczową w różne substancje składowe tkanki tłuszczowej o różnych właściwościach i funkcjach fizykochemicznych.

Innowacyjne frakcjonowanie tkanki tłuszczowej do przekształcania tłuszczu w specjalistyczne składniki

Fibroblasty związane z rakiem (CAFs), bogate w myofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenoprzeszczepu guza z jednoczesną implantacją w celu eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. Protokół opisuje sposób tworzenia myofibroblastów CAF, które nabywają zdolności do promowania tumorigennezy.

Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.

Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych

Poznaj protokół wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej z tkanki tłuszczowej do regeneracji chrząstki u pacjentów z osteoartrzitem kolana. Ta metoda oferuje obiecującą, małoinwazyjną alternatywę dla tradycyjnych terapii.

Protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki (Wideo) | JoVE Journal

Protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki

Przeglądaj więcej filmów