Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do obserwacji sygnałów z innych białek fluorescencyjnych lub może być wykorzystana do obrazowania aksonów u innych dorosłych Główną zaletą tej techniki jest doskonała trójwymiarowa rekonstrukcja i wizualizacja aksonów i ich końcowych trzpieni. Zacznij od napełnienia odpowiedniej liczby studzienek w szklanej płytce wielodołkowej 70% etanolem. Użyj pędzla, aby dodać 15 do 20 znieczulonych dwutlenkiem węgla much w każdym wieku i płci do każdej studzienki i delikatnie wmasuj muchy w etanol, aż zostaną całkowicie zanurzone.

Po nie więcej niż jednej minucie spłucz muchy trzykrotnie 0,3% roztworem detergentu niejonowego środka powierzchniowo czynnego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez co najmniej 10 minut na pranie. Po ostatnim umyciu użyj kleszczy, aby usunąć głowę i brzuch każdej muchy bez uszkadzania odcinka piersiowego lub nóg i użyj końcówki cienkich kleszczy, aby delikatnie, ale stanowczo wywrzeć nacisk na połączenie koksy i klatki piersiowej, aby odłączyć jedną nogę od odcinka piersiowego. Umieścić nogi w jednym dołku nowej płytki wielodołkowej zawierającej świeżo przygotowany 4% paraformaldehyd na lodzie w celu inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ważne jest, aby delikatnie wepchnąć nogi do bufora mocowania, nie pozwalając im unosić się na wodzie, aby uzyskać dobrze zamocowane nogi. Następnego dnia umyj nogi pięć razy w świeżym 0,3% roztworze detergentu z niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym przez 20 minut na pranie. Po ostatnim praniu wymień detergent na medium montażowe i trzymaj nogi w podłożu montażowym przez co najmniej 24 godziny.

Następnego dnia dodaj około 20 mikrolitrów 70% glicerolu obok powlekanego końca szklanego szkiełka mikroskopowego i przykryj glicerol szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 na 22 milimetry. Następnie dodaj około 10 mikrolitrów linii podłoża montażowego po prawej stronie szkiełka nakrywkowego i nałóż drugą linię pożywki montażowej o pojemności 30 mikrolitrów po prawej stronie linii 10 mikrolitrów. Za pomocą drobnych kleszczy przenieś jedną nogę z płytki wielodołkowej w kropli pożywki na 10-mikrolitrowy pasek podłoża montażowego w orientacji zewnętrznej stroną do góry lub do dołu.

Powtarzać tę czynność, aż sześć do ośmiu nóg zostanie zamontowanych i wyrównanych, a następnie umieścić drugie szkiełko nakrywkowe na nogach tak, aby drugie szkiełko nakrywkowe lekko spoczywało na pierwszym szkiełku nakrywkowym. Następnie użyj lakieru do paznokci w każdym rogu szkiełek nakrywkowych, aby zabezpieczyć je na miejscu. Aby zobrazować nogi, użyj lasera o długości 488 nanometrów i dwóch detektorów jednocześnie, aby ustawić pierwszą ścieżkę do uzyskania zarówno GFP, jak i automatycznej fluorescencji naskórka.

Wybierz obiektyw zanurzeniowy z olejkiem od 20 do 25x i ustaw rozdzielczość na 1024 na 1024 piksele z 12-bitową głębią i ustaw odstęp z na jeden mikrometr. Załaduj szkiełko na stolik mikroskopu i używając tej samej mocy lasera dla obu detektorów, wyreguluj wzmocnienie pierwszego detektora, aby uzyskać jasny sygnał GFP i wyreguluj drugi detektor, aby upewnić się, że niektóre obszary o wysokim sygnale naskórka wytwarzają nasycony sygnał w tym detektorze. Następnie zobrazuj nogi za pomocą opcji kafelka lub pozycji, aby uchwycić całe ramię, jeśli ramię jest wydłużone lub zbyt duże, aby można je było sfotografować w jednej klatce.

Aby przetworzyć obraz, otwórz stos konfokalny w ImageJ Fiji i użyj wtyczki Bio-Formats, aby otworzyć wszystkie obrazy, które nie są w formacie TIFF. Aby podzielić kanały, wybierz opcję Obraz, Kolor i Podziel kanały. Aby odjąć sygnał naskórka od sygnału GFP, otwórz Kalkulator procesów i obrazów i wybierz stos z pierwszego detektora jako pierwszy obraz.

W oknie operacji wybierz odejmowanie i wybierz ścieżkę z detektora drugiego jako obraz drugi, tak aby uzyskany został tylko endogenny sygnał GFP. Użyj Image, Stacks, Z Protect, aby wygenerować projekcję maksymalnej intensywności dla endogennego sygnału GFP. Użyj elementów sterujących w oknie sterowania jasnością, aby dostosować jasność i kontrast.

Następnie wygeneruj średnią intensywność dla naskórka, a następnie kanały obrazu, koloru i łączenia, aby połączyć stos GFP z powrotem ze stosem tylko naskórka uzyskanym z detektora drugiego. Spowoduje to uzyskanie obrazu RGB składającego się ze specyficznego dla tkanki sygnału GFP, a także sygnału naskórka, aby pomóc zidentyfikować altany aksonów w segmentach nóg. Aby użyć makro, otwórz stos konfokalny i kliknij opcję Obraz, Dopasuj i Jasność/Kontrast.

Następnie kliknij Wtyczka i Uruchom makro, aby uruchomić makro i postępuj zgodnie z instrukcjami. Gdy pojawi się monit o określenie operacji w oknie kalkulatora obrazów, wybierz obraz pierwszy jako stos jeden. W oknie operacji wybierz pozycję odejmij.

Wybierz obraz drugi jako stos drugi. Gdy zostaniesz poproszony o dostosowanie kontrastu, użyj elementów sterujących w oknie sterowania jasnością, aby dostosować kontrast jasności maksymalnego obrazu projekcji GFP i średniej projekcji naskórka, aby wygenerować scalony obraz RGB obu sygnałów pokazujących GFP na zielono, a naskórek na szaro. Następnie połącz wyniki stosu pierwszego i stosu drugiego, aby wygenerować połączony stos GFP i naskórek, który można wykorzystać w następnym etapie.

Aby zobrazować nogi w trzech wymiarach, otwórz stos RGB w odpowiednim oprogramowaniu 3D. W wyskakującym oknie dialogowym wybierz wszystkie kanały w sekcji konwersji trybu i wprowadź rozmiar woksela uzyskany z poprzedniej analizy. W module kanału pierwszego kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wyświetlacz i Volren.

Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy moduł Volren. W sekcji Właściwości kliknij lewym przyciskiem myszy Zaawansowane i wybierz DDR. Następnie dostosuj wartość gamma, aby zobaczyć tło naskórka.

W module kanału drugiego kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wyświetl Volren. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy na moduł Volren, Edytuj i wybierz volrenGreen.col. Korzystając z tej procedury, sygnał z naskórka można połączyć z sygnałem GFP, aby zidentyfikować położenie aksonów w nogach.

Niezwykle ważne jest, aby uzyskać dobrze zamocowane nogi. W prawidłowo zamocowanych nogach struktury wewnętrzne w nogach mają jednolity kolor, a tchawice, które są ciemne, są widoczne. W źle zamocowanych nogach ciemny materiał jest obecny w stępie i kości piszczelowej, a układ tchawicy nie jest wyraźnie widoczny w kości udowej i koksowej.

Opisana tutaj procedura pokonuje wyzwanie polegające na wykrywaniu ekspresji fluorescencyjnej w aksonach neuronów ruchowych przez gruby i autofluorescencyjny naskórek o wysokiej rozdzielczości. Tak więc uzyskany czysty i szczegółowy sygnał fluorescencyjny pozwala nam na wizualizację i ilościowe określenie trójwymiarowej cechy altanek aksonów za pomocą programów do obrazowania 3D. Tak więc ta technika pozwoli nam wykorzystać dorosłego Drosophila jako model nie tylko do badania rozwoju neuronu ruchowego, ale także do badania, aby zrozumieć wpływ choroby zwyrodnieniowej, takiej jak ERAS, na zintegrowany układ ruchu.