Name: Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji aksonów neuronów ruchowych w nogach Drosophila przy użyciu fluorescencyjnych białek. Technika umożliwia trójwymiarową rekonstrukcję struktur nerwowych w dorosłym owadzie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Robertowi Renardowi za przygotowanie podłoża do jedzenia na muchy. Praca ta była wspierana przez grant NIH NS070644 dla R.S.M. oraz finansowanie ze Stowarzyszenia ALS (#256), FRM (#AJE20170537445) i programu ATIP-Avenir dla J.E.

1. Sekcja i fiksacja nóg
<ol>
	<li>Weź szklaną płytkę wielodołkową i napełnij odpowiednią liczbę studzienek 70% etanolem. Dodaj 15-20 znieczulonych CO 2-znieczulonych muszek (dowolnej płci i w każdym wieku) do każdej studzienki i za pomocą pędzla delikatnie wtrzyj muchy w roztwór etanolu, aż muchy zostaną całkowicie zanurzone. 
	UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie hydrofobowości naskórka. Nie myj dłużej niż 1 minutę, ponieważ zwiększa to autofluorescencję naskórka.</li>
	<li>Opłucz muchy 3 razy 0,3% roztworem detergentu niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Trzymaj muchy w tym roztworze przez co najmniej 10 minut. 
	UWAGA: Nogi są lepiej zamocowane, gdy zawierają detergent, który prawdopodobnie zwiększy penetrację utrwalacza wewnątrz nogi.</li>
	<li>Umieść płytkę wielodołkową na lodzie wraz z rurką z 4% paraformaldehydem (PFA). 
	UWAGA: Przygotowanie świeżego 4% PFA z 16% roztworu podstawowego wolnego od etanolu PFA ma kluczowe znaczenie.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby usunąć głowę i brzuch much, nie uszkadzając odcinka piersiowego ani nóg. 
	UWAGA: Usunięcie brzucha ułatwia trzymanie rozporka i preparowanie nóg.</li>
	<li>Wyciąć nogi z odcinka piersiowego za pomocą kleszczy i umieścić nogi w studzienkach zawierających 4% PFA. W tym celu delikatnie, ale stanowczo naciskaj na połączenie kloksa i klatki piersiowej za pomocą końcówki cienkich kleszczy, aż noga się odczepi.</li>
	<li>Utrwalić nogi w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C (łącznie około 20 godzin).</li>
	<li>Umyj nogi 0,3% roztworem detergentu niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 1x PBS, 5x po 20 min każdy.</li>
	<li>Wymień bufor myjący na medium montażowe. Trzymaj nogę w podłożu montażowym przez co najmniej jeden dzień przed montażem, aby umożliwić jej całkowite wniknięcie w nogę. 
	UWAGA: Jeśli podłoże montażowe ma dużą lepkość, rozcieńczyć podłoże montażowe do 80% za pomocą 1x PBS, ponieważ nagła zmiana lepkości może spowodować zapadnięcie się naskórka i uszkodzenie całej struktury nogi. W zależności od sterownika Gal4, muchy mogą być przechowywane przez 1 do 3 tygodni w temperaturze 4 °C w mediach montażowych do momentu montażu.</li>
</ol>
2. Montaż nóg
<ol>
	<li>Umieść około 20 μl 70% glicerolu po lewej stronie szkiełka mikroskopowego i przykryj kwadratowym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm2 (Rysunek 2A, B). Odpipetować około 10 μl podłoża montażowego wzdłuż linii równoległej do prawej krawędzi szkiełka nakrywkowego i w niewielkiej odległości od niej. Dodaj kolejne 30 μl podłoża montażowego po prawej stronie szkiełka (Rysunek 2C). 
	UWAGA: Podczas nakładania szkiełka nakrywkowego na nogi (patrz poniżej) podłoże montażowe delikatnie rozprowadzi się pod szkiełkiem nakrywkowym i wokół nóg, nie przesuwając ich.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy wyjmij nogę z roztworu i delikatnie połóż ją na podłożu montażowym w pobliżu lewego szkiełka nakrywkowego. Zrób to samo dla każdej nogi i wyrównaj je od góry do dołu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).
	<ol>
		<li>Podnieś i przenieś nogi w kropli pożywki trzymanej między obiema końcówkami kleszczy. Ustaw nogi na dwa sposoby: zewnętrzną stroną do góry lub do dołu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy wszystkie nogi (można zamontować do 6–8 nóg) są prawidłowo wyrównane, nałóż drugie szkiełko nakrywkowe na nogi tak, aby szkiełko nakrywkowe lekko spoczywało na poprzednio umieszczonym szkiełku nakrywkowym (Rysunek 2E), aby zapewnić przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a tkanką i zapobiec uszkodzeniu nóg (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G). 
	UWAGA: Alternatywnie użyj dołków na naklejki lub wosku ortodontycznego, aby stworzyć przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.</li>
	<li>Użyj lakieru do paznokci, aby zabezpieczyć pozycję szkiełek nakrywkowych w każdym rogu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F). 
	UWAGA: Tkanka jest teraz gotowa do obrazowania.</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Ustaw pojedynczą ścieżkę za pomocą lasera 488 nm i dwóch detektorów jednocześnie, aby uzyskać zarówno fluorescencję GFP, jak i autofluorescencję naskórka. Za pomocą regulatora zasięgu lub suwaka w oknie widmowym okna ścieżki światła oprogramowania, ustaw zasięg wykrywania jednego detektora (detektora 1) w zakresie 498–535 nm, a drugiego detektora (detektora 2) w zakresie 566-652 nm. 
	UWAGA: Zazwyczaj detektor 1 powinien być detektorem GaAsP, a detektor 2 lampą fotopowielacza. Kanał 498-535 optymalnie wykrywa sygnał GFP, ale wykrywa również autofluorescencję z naskórka. Jednak kanał 566–652 wykrywa tylko autofluorescencję z naskórka (ryc. 3A).</li>
	<li>Użyj 20-krotnego lub 25-krotnego obiektywu immersyjnego z olejkiem, rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli, 12-bitowej głębi i ustaw odstępy Z na 1 μm. Ustaw czas zatrzymania pikseli na około 1,58 μs i średnio 2 klatki na obraz. Używaj obiektywów z dużą aperturą numeryczną.</li>
	<li>Skonfiguruj wszystkie inne ustawienia, w zależności od używanego mikroskopu konfokalnego i oprogramowania do obrazowania.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że uzyskujesz jaśniejszy sygnał naskórka z detektora 566–652, a nie z detektora 498–535. W tym celu należy użyć tej samej mocy lasera 488 dla obu detektorów. Korzystając ze znaczników nasycenia, najpierw wyreguluj wzmocnienie detektora 1, aby uzyskać wystarczająco jasny sygnał GFP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, D). Następnie wyreguluj wzmocnienie detektora 2, aby upewnić się, że niektóre obszary o wysokim sygnale naskórka (krawędzie nóg, stawy) wytwarzają sygnał nasycony w tym detektorze (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C, E).</li>
		<li>Jeśli noga jest wydłużona i zbyt duża, aby można ją było zobrazować w jednej klatce, użyj opcji Sąsiadująco lub Pozycja w oprogramowaniu do obrazowania mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zrekonstruuj końcowe obrazy za pomocą zastrzeżonego oprogramowania do obrazowania mikroskopowego lub za pomocą darmowego oprogramowania ImageJ/FIJI (patrz poniżej).</li>
</ol>
4. Przetwarzanie po obrazowaniu
<ol>
	<li>Otwórz stos konfokalny w ImageJ/FIJI.
	<ol>
		<li>Użyj wtyczki Bioformats (Wtyczki| Formaty biologiczne| Importer formatów biologicznych) na FIDŻI, aby otworzyć obrazy, które nie znajdują się w pliku . Format TIF z zastrzeżonych pakietów oprogramowania do obrazowania9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podziel kanały, wybierając opcję Obraz| Kolor| Podziel kanały. 
	UWAGA: Jeśli obrazy z kilku pozycji zostały wykonane i muszą zostać ponownie połączone, użyj wtyczki do łączenia parami w FIJI z (Plugins > Stitching > Pairwise Stitching)10,11.</li>
	<li>Aby odjąć sygnał naskórka od sygnału GFP, otwórz Kalkulator obrazów (Proces| Kalkulator obrazu): wybierz stos z detektora 1 jako obraz 1 (GFP + naskórek) (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4A), w oknie operacji wybierz odejmij i wybierz stos z detektora 2 jako Rysunek 2 (naskórek) (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 4B). W rezultacie uzyskuje się tylko endogenny sygnał GFP (GFP) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).
	<ol>
		<li>Połącz ten stos (GFP) ze stosem "tylko naskórek" uzyskanym z detektora 2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B| Kolor| Merge Channels), aby uzyskać obraz RGB składający się z specyficznego dla tkanki sygnału GFP, a także sygnału naskórka, który pomaga zidentyfikować altany aksonów w segmentach nóg (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4D).</li>
		<li>Dostosuj kontrast i jasność każdego obrazu (Obraz| Dostosuj| Jasność/Kontrast), a następnie wygeneruj pojedynczy obraz RGB (Obraz| Rodzaj| Kolor RGB). 
		UWAGA: Aby wygenerować maksymalną projekcję stosu Z (Image| Stosy| Z Project...), użyj projekcji maksymalnej intensywności dla sygnału GFP i średniej intensywności dla naskórka, którą można następnie dostosować pod kątem jasności przed połączeniem dwóch kanałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie można użyć makra do automatycznego odejmowania i przetwarzania obrazów w formacie ImageJ/FIJI. Skopiuj tekst z pliku uzupełniającego 1 w edytorze makr (Wtyczki| Nowość| Makro), zapisz makro w folderze Plugins i uruchom ponownie ImageJ/FIJI raz, aby móc korzystać z makra.
	<ol>
		<li>Aby użyć makro, otwórz stos konfokalny i otwórz okno Jasność/Kontrast (Obraz| Dostosuj| Jasność/Kontrast). Następnie uruchom makro (Wtyczka| Makro| Uruchom) i postępuj zgodnie z instrukcjami.</li>
		<li>Gdy pojawi się monit o określenie operacji (okno Kalkulator obrazów), wybierz Obraz 1 jako stos 1 (GFP), Obraz 2 jako stos 2 (naskórek) i Odejmij. 
		Uwaga: Makro generuje maksymalny obraz projekcji przetworzonego sygnału GFP (MAX_Result stosu1), średniego rzutu naskórka (AVG_stack2), wyniku odejmowania stosu naskórków od stosu GFP (wynik stosu1) oraz nieprzetworzonego stosu skórek (stos2).</li>
		<li>Gdy pojawi się monit o dostosowanie kontrastu, użyj elementów sterujących w oknie jasności/sterowania, aby dostosować jasność/kontrast maksymalnego obrazu projekcji GFP oraz średniej projekcji naskórka, aby wygenerować scalony obraz RGB obu sygnałów pokazujących GFP na zielono i naskórek na szaro. Scal wynik stosu1 i stosu2, aby podobnie wygenerować połączony stos GFP i naskórka, który można użyć w następnym etapie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zobrazować nogi w trzech wymiarach, użyj specjalistycznego oprogramowania 3D z nowo wygenerowanymi stosami (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E).
	<ol>
		<li>Otwórz stos RGB za pomocą oprogramowania 3D (patrz Tabela materiałów). W wyskakującym oknie dialogowym wybierz wszystkie kanały w sekcji konwersji trybu i wprowadź rozmiar woksela (objętość piksela). 
		Uwaga: Wszystkie niezbędne informacje są zawarte w plikach obrazów pochodzących z dowolnego zastrzeżonego oprogramowania mikroskopowego, które jest używane.</li>
		<li>Na module kanału 2 (sygnał GFP) kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wyświetl | volren. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy moduł volren. W sekcji właściwości (w lewym dolnym rogu ekranu) kliknij w lewo edytuj i wybierz volrengreen.col. Na module kanału 1 (sygnał naskórka) kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wyświetl | volren. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy moduł volren. W sekcji Właściwości kliknij lewym przyciskiem myszy na zaawansowane i wybierz ddr (przezroczysty wyświetlacz przypominający radiogram), a następnie dostosuj wartość gamma, aby zobaczyć tło naskórka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4E).</li>
		<li>Aby wygenerować obrót 3D, kliknij prawym przyciskiem myszy moduł stosu projektu. Następnie wybierz opcję animacja| Obróć. Kliknij lewym przyciskiem myszy moduł obracania.</li>
		<li>W sekcji właściwości kliknij użyj bbox center. W module obracania kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie compute| movie maker. W module programu Movie Maker kliknij lewym przyciskiem myszy. W sekcji właściwości kliknij lewym przyciskiem myszy w lewo Zaawansowane (w prawym górnym rogu sekcji właściwości).</li>
		<li>W polu Nazwa pliku wpisz nazwę obrotu filmu. W polu jakości wpisz 1 (maksymalna jakość). Pozostaw klatkę na 200, jeśli pożądany jest obrót o 8,3 s (liczbę tę można zmniejszyć lub zwiększyć, aby zmodyfikować prędkość obrotu). Następnie naciśnij Zastosuj (zielony przycisk, w lewym dolnym rogu sekcji właściwości (patrz Wideo 1)).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+A+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. New York, NY. 420-531 (1950).</li>
<li>Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li>
<li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+and+Birth+Date+Specify+Motor+Neuron+Targeting+and+Dendritic+Architecture+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li>
<li>Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+origins+and+architecture+of+Drosophila+leg+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).</li>
<li>Enriquez, J., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+Individual+Adult+Motor+Neuron+Morphologies+by+Combinatorial+Transcription+Factor+Codes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li>
<li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter%3A+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
<li>Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+Strategies+Despite+Shared+Lineages+of+Motor+Neurons+and+Glia+to+Achieve+Robust+Development+of+an+Adult+Neuropil+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila.</a> Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).</li>
<li>ImageJ. Bio-Formats. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Bio-Formats">http://imagej.net/Bio-Formats</a> (2018).</li>
<li>ImageJ. Image Stitching. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://imagej.net/Image_Stitching">http://imagej.net/Image_Stitching</a> (2018).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li>
<li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila%3A+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Naskórek dorosłej Drosophila i innych stawonogów, który zawiera wiele ciemnych pigmentów, jest główną przeszkodą w oglądaniu struktur wewnątrz ich ciała. Ponadto jest silnie autofluorescencyjny, co pogarsza się w wyniku fiksacji. Te dwie cechy są bardzo problematyczne dla obserwacji barwników fluorescencyjnych lub cząsteczek wewnątrz ciała zwierząt z egzoszkieletem.
Procedura, którą opisaliśmy i którą rutynowo stosujemy w laboratorium, daje czyste i szczegółowe obrazy trajektorii aksonów i ich...

Podobnie jak kończyna kręgowca, noga dorosłego Drosophila jest podzielona na segmenty. Każda noga muchy zawiera 14 mięśni, z których każdy składa się z wielu włókien mięśniowych1,2. Ciała komórkowe MN dorosłej nogi znajdują się w zwojach T1 (przedpiersiowych), T2 (mezotorakologicznych) i T3 (śródpiersiowych) po obu stronach brzusznego rdzenia nerwowego (VNC), struktury analogicznej do rdzenia kręgowego kręgowców (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). W każdym zwoju znajduje się około 50 MN, które celują w mięśnie w czterech segmentach nogi ipsilateralnej (koksa, krętarz, kość udowa i piszczel) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)3. Co ważne, każda osobnika dorosłego nogi MN ma unikalną tożsamość morfologiczną, która jest wysoce stereotypowa wśród zwierząt3,4. Wszystkie te unikalne MN pochodzą z 11 komórek macierzystych, zwanych neuroblastami (NB), wytwarzającymi MN nóg w stadiach larwalnych3,4. Pod koniec stadiów larwalnych wszystkie niedojrzałe postmitotyczne MN różnicują się podczas metamorfozy, aby uzyskać swoje specyficzne dendrytyczne trzpienie i aksonalne cele końcowe, które definiują ich unikalną morfologię3,4. Wcześniej przetestowaliśmy hipotezę, że kombinatoryczny kod czynników transkrypcyjnych (TF) określa unikalną morfologię każdej dorosłej nogi Drosophila MN5. Jako model wykorzystaliśmy linię B, jedną z 11 linii NB, która wytwarza siedem z MN i wykazaliśmy, że kombinatoryczny kod TF wyrażony w postmitotycznych MN dorosłych nóg dyktuje ich indywidualne morfologie. Dzięki przeprogramowaniu kodu TF MN byliśmy w stanie przełączać morfologie MN w przewidywalny sposób. Nazywamy te TFs: mTFs (morfologiczne TFs)5.
Jednym z najtrudniejszych elementów analiz morfologicznych dorosłych MN jest wizualizacja aksonów przez gruby i autofluorescencyjny naskórek z wysoką rozdzielczością. Zwykle oznaczamy aksony za pomocą GFP znakowanego błoną, który jest wyrażany w MN za pomocą binarnego systemu wyrażeń, takiego jak DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP lub DVglut-QF/ QUAS mCD8::GFP, gdzie DVglut jest silnym sterownikiem wyrażonym w motoneurons6. Łącząc te narzędzia z innymi technikami klonalnymi, takimi jak analiza mozaiki z markerem represjonowanym (MARCM)7, cis-MARCM8, lub MARCMbow5, możemy ograniczyć ekspresję GFP do subpopulacji MN, ułatwiając analizę fenotypową aksonów. Opracowaliśmy protokół w celu utrzymania nienaruszonej morfologii aksonów nogi MN do obrazowania i późniejszej rekonstrukcji 3D, rozwiązując określone problemy nieodłącznie związane z dorosłą nogą Drosophila, takie jak (1) utrwalenie wewnętrznych struktur dorosłej nogi bez wpływu na morfologię aksonów, endogenną ekspresję fluorescencyjną i muskulaturę nogi, (2) montaż nogi w celu zachowania ogólnej struktury pod szkiełkiem nakrywkowym i w odpowiedniej orientacji do obrazowania, oraz (3) przetwarzanie obrazu w celu uzyskania tła naskórka, a także aksonalnego sygnału fluorescencyjnego. Chociaż protokół ten został szczegółowo opisany w celu wykrywania ekspresji fluorescencyjnej w aksonach MN, można go zastosować do wizualizacji innych składników nerwowo-mięśniowej nóg u stawonogów.

<table><tbody><tr><td>Absolut etanolu</td><td>Fisher</td><td>E/6550DF/17</td><td>Absolutny odczynnik analityczny</td></tr><tr><td>klasy niejonowy detergent powierzchniowo czynny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100, do biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Kleszczyki drobnoziarniste</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td>Kleszcze jubilerskie, Dumont No. 5</td></tr><tr><td>Szklana płytka wielodołkowa</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71563-01</td><td>9 wnęka Pyrex, 100 mm x 85 mm</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Thermofisher</td><td>28908</td><td>Pierc 16% Formaldehyd (w/v), Bez metanolu</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 229-1</td><td>Glicerol (Biologia molekularna)</td></tr><tr><td>Przekładki</td><td>Sun Jin Lab Co</td><td>IS006</td><td>iSpacer, cztery dołki, około 12 &mu; L objętość robocza na studzienkę, średnica 7 mm, głębokość 0,18 mm</td></tr><tr><td>Kwadrat 22 mm x 22 mm szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>FIS#12-541-B</td><td>Nr 1,5-0,16 do 0,19 mm</td></tr><tr><td>grubości Medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zobacz materiał LSM780; obiektyw używany LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (olej/ krzem/glicerol/woda zanurzenie) (420852-9871-000)</td></tr> oprogramowanie <tr>do <td>obrazowania</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>ZEN 2011</td></tr><tr><td>3D-Image</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Amira 6.4</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowe Instytuty Zdrowia</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>ImageJ/FIJI</td></tr></tbody></table>

wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Większość prac nad specyfikacją neuronów została przeprowadzona w genetycznie i fizjologicznie wykonalnych modelach, takich jak C. elegans, larwy Drosophila i ryby, które angażują się w ruchy falujące (takie jak pełzanie lub pływanie) jako podstawowy sposób poruszania się. Jednak bardziej wyrafinowane zrozumienie specyfikacji indywidualnego neuronu ruchowego (MN) – przynajmniej pod względem informowania o terapiach chorób – wymaga równie elastycznego systemu, który lepiej modeluje złożone schematy lokomocji kręgowców oparte na wyrostkach. Dorosły układ lokomotoryczny Drosophila odpowiedzialny za chodzenie z łatwością spełnia wszystkie te kryteria, ponieważ w tym modelu możliwe jest zbadanie specyfikacji niewielkiej liczby łatwych do odróżnienia MN nóg (około 50 MN na nogę) zarówno przy użyciu szerokiej gamy potężnych narzędzi genetycznych, jak i w fizjologicznym kontekście schematu lokomocji opartego na wyrostkach. Tutaj opisujemy protokół wizualizacji unerwienia mięśni nóg u dorosłej muchy.

Jak pokazano na Rysunku 4, procedura ta pozwala na doskonałe obrazowanie aksonów znakowanych GFP w odnóżach dorosłych Drosophila, wraz z ich drzewkami końcowymi. Co ważne, uzyskuje się czysty sygnał GFP bez żadnych zanieczyszczeń z fluorescencji emitowanej przez kutykulę odnóża. Sygnał z kutykuli może być następnie połączony z sygnałem GFP w celu zidentyfikowania położenia aksonów w odnóżach (Rysunek 4E, <strong class="x...

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji celowania aksonalnego za pomocą białka fluorescencyjnego w odnóżach dorosłych Drosophila poprzez etapy fiksacji, montażu, obrazowania i po obrazowaniu.

Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do obserwacji sygnałów z innych białek fluorescencyjnych lub może być wykorzystana do obrazowania aksonów u innych dorosłych Główną zaletą tej techniki jest doskonała trójwymiarowa rekonstrukcja i wizualizacja aksonów i ich końcowych trzpieni. Zacznij od napełnienia odpowiedniej liczby studzienek w szklanej płytce wielodołkowej 70% etanolem. Użyj pędzla, aby dodać 15 do 20 znieczulonych dwutlenkiem węgla much w każdym wieku i płci do każdej studzienki i delikatnie wmasuj muchy w etanol, aż zostaną całkowicie zanurzone.Po nie więcej niż jednej minucie spłucz muchy trzykrotnie 0,3% roztworem detergentu niejonowego środka powierzchniowo czynnego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez co najmniej 10 minut na pranie. Po ostatnim umyciu użyj kleszczy, aby usunąć głowę i brzuch każdej muchy bez uszkadzania odcinka piersiowego lub nóg i użyj końcówki cienkich kleszczy, aby delikatnie, ale stanowczo wywrzeć nacisk na połączenie koksy i klatki piersiowej, aby odłączyć jedną nogę od odcinka piersiowego. Umieścić nogi w jednym dołku nowej płytki wielodołkowej zawierającej świeżo przygotowany 4% paraformaldehyd na lodzie w celu inkuba

visualize-drosophila-leg-motor-neuron-axons-through-the-adult-cuticle

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Drosophila melanogaster larwy stanowią idealny model badawczy do analizy mechanizmów transportu aksonalnego w nerwach segmentowych larw. Stosując tę procedurę, 3Badania i rozwój larwy w stadium poczwarki niosące różne mutacje można porównać z larwami typu dzikiego.

Wizualizacja nerwów segmentowych larw w preparatach larw Drosophila w 3rd stadium zasiedlenia

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

In situ rejestracje metodą patch clamp są wykorzystywane do charakterystyki elektrofizjologicznej neuronów w nienaruszonych obwodach. W modelu genetycznym Drosophila technika patch clamp jest trudna, ponieważ OUN jest mały i otoczony wytrzymałą osłoną. Niniejszy artykuł opisuje procedurę usuwania osłony oraz oczyszczania neuronów w celu przeprowadzenia późniejszych rejestracji metodą patch clamp.

Przygotowanie neuronów ośrodkowych Drosophila do metody in situ patch clamp

Ten film opisuje metodę preparowania, naprawiania i montowania dorosłej nogi Drosophila przy jednoczesnym zachowaniu jej nerwowo-mięśniowej nienaruszonej do analizy obrazowej.

Przetwarzanie nóg owadów do mikroskopii fluorescencyjnej: metoda zachowania struktur nerwowo-mięśniowych do obrazowania

Źródło: Guan, W., et. al. Wizualizuj Drosophila Aksony neuronu ruchowego nóg przez dorosły naskórek. J. vis. exp. (2018) Ten film pokazuje obrazowanie Drosophila z zielonymi fluorescencyjnymi neuronami ruchowymi eksprymującymi białko za pomocą mikroskopii konfokalnej. Laser i dwa detektory wychwytują GFP i autofluorescencję naskórków. Obrazy są przetwarzane przez dzielenie kanałów, odejmowanie autofluorescencji i łączenie w kolorowy obraz kompozytowy w celu wizualizacji aksonów w segmencie nogi.

Obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila

Źródło: Jeong, S. Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje wizualizację projekcji aksonalnych w zarodkach Drosophila. Znakowanie immunologiczne neuronów ruchowych, precyzyjna sekcja w celu odsłonięcia struktur neuronalnych oraz mikroskopia kontrastowa z różnicową interferencją łącznie ujawniają szczegółową architekturę neuronów, podkreślając wzorce projekcji aksonalnej.

Wizualizacja wzorców projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Opisujemy technikę sekcji, która zachowuje architekturę połączenia nerwowo-mięśniowego i umożliwia szczegółowe badanie immunocytochemiczne neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila.

Rozwarstwienie i immunohistochemia dorosłej nogi Drosophila w celu wykrycia zmian w połączeniu nerwowo-mięśniowym dla zidentyfikowanego neuronu ruchowego

Poznaj metodę wizualizacji aksonów neuronów ruchowych w nogach Drosophila przy użyciu fluorescencyjnych białek. Technika umożliwia trójwymiarową rekonstrukcję struktur nerwowych w dorosłym owadzie.

Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

Przeglądaj więcej filmów