Name: Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Poznaj metodę intubacji doustnej dorosłych danio pręgowanych w celu oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach i badania lokalnych odpowiedzi immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z hiszpańskiego Ministerstwa Nauki, Komisji Europejskiej i funduszy AGAUR dla NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER i 2014SGR-345 AGAUR). RT jest stypendystą AGAUR (Hiszpania), JJ był wspierany przez stypendium doktoranckie od Chińskiej Rady Stypendialnej (Chiny), a NR jest wspierany przez program Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Dziękujemy dr Torrealba za fachowe doradztwo w zakresie produkcji białka, N. Barba z "Servei de Microscopia" i dr M. Costa z "Servei de Citometria" Universitat Autònoma de Barcelona za pomocną pomoc techniczną.

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem danio pręgowanego (Danio rerio) zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Universitat Autònoma de Barcelona (numer CEEH 1582) zgodnie z Międzynarodowymi Zasadami Kierunkowymi dotyczącymi badań z udziałem zwierząt (EU 2010/63). Wszystkie eksperymenty z żywymi rybkami danio przeprowadzono w temperaturze 26–28 °C.
1. Przygotowanie sprzętu do intubacji przezريق usta
<ol>
	<li>Nałóż około 1 cm cienkiej rurki silikonowej na igłę 31 G typu Luer lock, aby zakryć jej czubek.</li>
	<li>Odetnij końcówkę sterylnej pipety filtrującej 10 µL (około 2 cm), weź węższy koniec i nałóż go na rurkę silikonową w formie osłony. Upewnij się, że pipeta wystaje poza czubek igły, aby uniknąć zranienia zwierzęcia.</li>
	<li>Przymocuj igłę do strzykawki 100 µL typu Luer lock. 
	UWAGA: Zawsze dokładnie płucz strzykawkę etanolem, a następnie solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS, patrz Materiały) pomiędzy zabiegami.</li>
</ol>
2. Wymagane roztwory
<ol>
	<li>Przygotować roztwór metanosulfonianu etylu 3-aminobenzojanu (MS-222) o stężeniu 150 mg/L (do znieczulenia) lub 300 mg/L (do eutanazji), wykorzystując wodę z akwarium, w którym utrzymywane są danio pręgowane. Napełnić mały zbiornik 1 L roztworu znieczulającego i zapewnić w nim napowietrzanie.</li>
	<li>Napełnić drugi mały zbiornik 1 L wody akwariowej bez MS-222 w celu rekonwalescencji ryb i zapewnić w nim napowietrzanie.</li>
	<li>Przygotować 50 mL 1x PBS z jałowego roztworu stokowego 10x.</li>
	<li>Do analizy cytometrycznej/izolacji komórek jelitowych przygotować świeży roztwór 0,15% kolagenazy typu IV w ilości 1 mL na rybę, sporządzając go z roztworu stokowego lub z proszku w podłożu DMEM z dodatkiem 1% v/v penicyliny i streptomycyny (patrz materiały). Rozdzielić roztwór na aliquoty po 1 mL (jedna na rybę) w probówkach wirówkowych o pojemności 2 mL. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia etapu sekcji (wyjąć na 30 min przed).</li>
	<li>Do mikroskopii konfokalnej/utrwalania próbek przygotować 50 mL świeżego 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) w PBS lub rozmrozić roztwór stokowy z zamrażarki -20 °C w dygestorium. 
	UWAGA: PFA jest toksyczny. Przed rozpoczęciem pracy należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji. Należy używać rękawic oraz okularów ochronnych, a roztwory zawsze pozostawiać wewnątrz dygestorium.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny fluorescencyjnych nanocząsteczek
<ol>
	<li>Oznakuj nanocząstki białkowe estrem NHS Atto-488 (patrz Tabela materiałów) lub odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Resuspenduj nanocząstki w 0,1 M buforze wodorowęglanu sodu do stężenia 2 mg/mL.</li>
	<li>Rozpuść ester NHS Atto 488 w bezaminowym dimetylosulfoksydzie (DMSO) w stężeniu 2 mg/mL. Odstaw alikwot 10 µL w celu sprawdzenia wydajności znakowania (krok 3.7–3.8).</li>
	<li>Wymieszaj nanocząstki i ester NHS Atto 488 w stosunku molowym 1:2 (białko:barwnik), mieszając w ciemności.</li>
	<li>Odwiruj znakowane nanocząstki w wirówce przy 8,000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej, usuń nadsącz i zachowaj go do sprawdzenia wydajności znakowania (krok 3.7–3.8).</li>
	<li>Przemyj znakowane nanocząstki, resuspendując je w 1 mL 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu za pomocą wortexowania oraz pipetowania w górę i w dół. Następnie usuń nadsącz poprzez wirowanie przy 8,000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Powtórz krok 3.6 pięciokrotnie.</li>
	<li>Resuspenduj osad w 5 mL 0,1 M buforu wodorowęglanu sodu w probówce wirówkowej 15 mL i rozdziel fluorescencyjne nanocząstki na alikwoty w probówkach wirówkowych 1,5 mL (30 alikwotów). Odwiruj przy 8,000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej, usuń nadsącz i przechowuj w -80 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Zmierz wydajność znakowania za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru.
	<ol>
		<li>Pobierz 1 µL pierwotnego roztworu Atto 488 zachowanego z kroku 3.3 i rozcieńcz go w DMSO (np. w stosunku objętościowym 1:20). Jest to objętość wykorzystana do uzyskania stosunku molowego mieszaniny nanocząstek białkowych i Atto 488 w kroku 3.4.</li>
		<li>Pobierz 1 µL zachowanego nadsączu z reakcji znakowania z kroku 3.5. Zmierz absorbancję (abs) przy = 501 nm. Procent znakowania wynosi: 
		(<img alt="Wzór na obliczanie procentowej absorbancji w eksperymencie spektroskopowym." src="/files/ftp_upload/58366/58366eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed eksperymentem przygotuj zawiesinę nanocząstek o pożądanym stężeniu, używając roztworu 1x PBS.</li>
</ol>
4. Znieczulanie i intubacja doustna rybek danio pręgowanych
<ol>
	<li>Ryby (&gt;0,5 g) należy zagłodzić przez co najmniej 48 h przed eksperymentem, aby opróżnić jelita.</li>
	<li>Przenieść ryby (12 osobników) do zbiorników eksperymentalnych (6 L) jedną noc przed eksperymentem w celu aklimatyzacji12.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać roztwór nanocząsteczek w wortexie (np. 2 500 obr./min przez 30 s) i pobrać pożądaną objętość zawiesiny nanocząsteczek (np. 20–50 µL) do strzykawki z założoną osłoniętą igłą.</li>
	<li>Umieścić ryby w napowietrzonym roztworze MS-222 o stężeniu 150 mg/L (patrz sekcja 2), aż opadną na dno zbiornika i przestaną reagować na uciśnięcie płetwy ogonowej; proces ten trwa mniej niż 5 min.</li>
	<li>Szybko przenieść znieczulone ryby za pomocą siatki na mokrą plastikową tackę, ułożyć zwierzę poziomo przodem do igły i natychmiast rozpocząć intubację doustną.</li>
	<li>Ostrożnie podtrzymać rybę jedną ręką i otworzyć pysk drugą ręką, używając osłoniętej igły. Delikatnie wprowadzić igłę do przełyku na głębokość około 1 cm od otworu pyska. 
	UWAGA: Operator może odczuć lekki opór, gdy koniec końcówki pipety minie skrzela. Należy uważać, aby nie wprowadzać igły pod zbyt dużym kątem, co mogłoby doprowadzić do perforacji skrzeli.</li>
	<li>Powoli wstrzyknąć zawiesinę nanocząsteczek do ryby. Upewnić się, że zawiesina nie wypływa na zewnątrz przez skrzela lub pysk.</li>
	<li>Delikatnie wyjąć igłę i umieścić rybę w zbiorniku do rekonwalescencji (patrz sekcja 2). Wybudzenie zazwyczaj trwa do 1 min.</li>
	<li>Dokładnie sprawdzić rybę pod kątem wszelkich nieprawidłowości (np. krwawienie ze skrzeli jest oznaką perforacji).</li>
	<li>Po wybudzeniu ryb należy przenieść je z powrotem do zbiorników eksperymentalnych.</li>
</ol>
5. Disekcja jelit danio pręgowanego
<ol>
	<li>Po określonym czasie od intubacji (np. 5 h i/lub 24 h), za pomocą siatki przenieś ryby do roztworu MS-222 o stężeniu 300 mg/L w celu eutanazji (patrz sekcja 2). Upewnij się, że ruchy pokrywy skrzelowej ustały i nie występuje odruch zaciskania ogona. Zazwyczaj pięć minut jest wystarczające.</li>
	<li>Wyłów uśpione zwierzę siatką i połóż je na papierze filtracyjnym. 
	UWAGA: Papier filtracyjny jest bardzo przydatny do usuwania tkanki łącznej wzdłuż jelita.</li>
	<li>Używając ostrych nożyczek sekcyjnych, wykonaj półkoliste nacięcie od odbytu do pokrywy skrzelowej, a następnie rozszerz nacięcie za pomocą precyzyjnej pęsety. Przetnij oba końce jelita, wyjmij wszystkie organy wewnętrzne i połóż je na papierze filtracyjnym. 
	OSTRZEŻENIE: Pracuj szybko, aby ograniczyć metabolizm komórkowy i obumieranie komórek. 
	UWAGA: Alternatywnie tkankę łączną można usuwać w PBS na lodzie.</li>
	<li>Oddziel jelito od organów wewnętrznych, dbając o zachowanie jego orientacji (od przedniego do tylnego odcinka jelita) i rozprostuj je. Zazwyczaj przedni odcinek jelita jest szerszy niż odcinek tylny. Podczas sekcji dopilnuj, aby pozyskać cały odcinek jelita. 
	UWAGA: Tylny koniec u małych ryb jest dość cienki i kruchy i może ulec przerwaniu, szczególnie u zwierząt o masie &lt;0,7 g.</li>
	<li>Przetaczaj jelito pęsetą po papierze filtracyjnym, aby oddzielić od niego tkankę łączną.</li>
	<li>Przejdź do przygotowania jelita do dalszych analiz (sekcje 6, 7 i 8).</li>
</ol>
6. Przygotowanie komórek jelitowych do cytometrii
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej alikwoty 0,15% roztworu kolagenazy (patrz sekcja 2.4). 
	UWAGA: Alikwoty powinny osiągnąć temperaturę pokojową przed kontynuacją.</li>
	<li>Opcjonalnie: Kontynuując krok 5.5, rozetnij jelito wzdłuż i przemyj 1x PBS.</li>
	<li>Za pomocą pęsety umieść jelito w probówce wirówkowej o pojemności 2 mL wypełnionej 0,15% roztworem kolagenazy.</li>
	<li>Umieść probówki na pionowym rotatorze laboratoryjnym na 1 h w temperaturze pokojowej, w ciemności.</li>
	<li>Umieść jelito na sitku komórkowym 100 µm opartym nad probówką wirówkową 50 mL. Rozdrobnij jelito tłokiem strzykawki 5 mL, przemywając 3 razy 1x PBS i zbierając przesącz do probówki wirówkowej 50 mL.</li>
	<li>Wirowarkuj probówkę 50 mL przy 400 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetuj większość supernatantu, uważając, aby nie zgubić komórek, z których część może być związana z śluzem.</li>
	<li>Resuspenduj komórki jelitowe z dna probówki wirówkowej w 500 µL 1x PBS i przechowuj w lodzie do czasu analizy cytometrycznej.</li>
	<li>Przefiltruj próbki przez filtr komórkowy 30 µm do probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 mL do analizy cytometrycznej.</li>
	<li>Ustaw parametry (np. liczbę komórek do analizy, obszar zainteresowania, napięcie i kompensację, wybór detektorów) w urządzeniu do cytometrii (patrz materiały).</li>
	<li>Niezwłocznie przeanalizuj komórki w cytometrze, zgodnie z instrukcją używania13.</li>
</ol>
7. Przygotowanie mrożonych przekrojów jelita do mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Wypełnij plastikową formę (patrz Tabela materiałów) do połowy objętości związkiem O.C.T. (optimum cutting temperature compound).</li>
	<li>Kontynuując krok 5.5 i bezpośrednio po sekcji, ostrożnie umieść jelito w plastikowej formie. Upewnij się, że jelito jest całkowicie zanurzone w związku O.C.T. W razie potrzeby dodaj do plastikowej formy więcej związku O.C.T. 
	UWAGA: Zaleca się ułożenie jelita w kształcie litery „Z” w związku O.C.T., aby łatwiej było śledzić jego naturalną orientację.</li>
	<li>Umieść plastikową formę na suchym lodzie, aż stanie się nieprzezroczysta (mniej niż minuta).</li>
	<li>Przechowuj plastikową formę w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytku lub przetwórz ją natychmiast zgodnie z poniższą procedurą. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.</li>
	<li>Pokrój zamrożone jelito na sekcje o grubości 10 µm lub odpowiedniej grubości, używając kriotomu w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zbierz sekcję jelita za pomocą cienkiego pędzelka na szkiełko.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w 4% PFA na 15 min w temperaturze pokojowej, aby utrwalić próbkę. 
	OSTROŻNIE: PFA jest toksyczny. Przed rozpoczęciem pracy należy zapoznać się z kartą charakterystyki materiału. Należy nosić rękawiczki i okulary ochronne, a roztwory zawsze pozostawiać w dygestorium.</li>
	<li>Przemyj szkiełko 3 razy w 1x PBS, po 10 min za każdym razem.</li>
	<li>Dodaj kroplę medium montażowego i przykryj preparat szkiełkiem podstawowym. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać.</li>
	<li>Obserwuj próbkę pod mikroskopem konfokalnym przy odpowiednim powiększeniu.</li>
</ol>
8. Przygotowanie jelita do ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
<ol>
	<li>Kontynuując krok 5.5, umieść jelito w probówce kriogenicznej, szybko zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
	UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę.</li>
	<li>W celu homogenizacji dodaj do próbki jelita 200 µL schłodzonego 2% (v/v) roztworu 1-tiogliceryny/roztworu do homogenizacji (patrz Tabela materiałów) lub alternatywnego roztworu do homogenizacji.</li>
	<li>Pracuj szybko, homogenizuj próbkę jelita na lodzie za pomocą homogenizatora laboratoryjnego z wysoką prędkością (ustawioną na 25–30 000 rpm), aż do całkowitego zniknięcia widocznych fragmentów tkanki. Zazwyczaj wystarczające jest 3 cykle po 5 s.</li>
	<li>Wyizoluj RNA za pomocą komercyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta14 lub inną odpowiednią metodą. W razie potrzeby przechowuj RNA w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytku. 
	UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę.</li>
	<li>Oznacz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru15 i oceń jego jakość za pomocą analizatora RNA16.</li>
	<li>Przygotuj 1 µg lub odpowiednią ilość cDNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA zgodnie z instrukcją producenta. 
	UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę. W przypadku analizy qPCR należy stosować się do wytycznych MIQE17.</li>
	<li>Zaprojektuj odpowiednie pary starterów dla interesujących genów.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni gen referencyjny i przeanalizuj ekspresję każdego genu za pomocą systemu detekcji RT-qPCR z użyciem komercyjnego zestawu (patrz materiały). 
	UWAGA: Na przykład, do każdego dołka płytki qPCR dodaj 5 µL supermixu SYBR green, 0,5 µM starterów, 2,5 µL rozcieńczonego cDNA i 1,5 µL wody, tak aby końcowa objętość wyniosła 10 µL.</li>
</ol>

<ol><li>Harriff, M. J., Bermudez, L. E., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+exposure+of+zebrafish%2C+Danio+rerio+%28Hamilton%29%2C+to+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+peregrinum+reveals+the+gastrointestinal+tract+as+the+primary+route+of+infection%3A+A+potential+model+for+environmental+mycobacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fish+Diseases%22%5BJournal%5D)">Experimental exposure of zebrafish, Danio rerio (Hamilton), to Mycobacterium marinum and Mycobacterium peregrinum reveals the gastrointestinal tract as the primary route of infection: A potential model for environmental mycobacterial infection.</a> Journal of Fish Diseases. 30 (10), 587-600 (2007).</li>
<li>Lovmo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+nanoparticles+and+Mycobacterium+marinum+across+the+intestinal+epithelium+in+zebrafish+and+the+role+of+the+mucosal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+and+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Translocation of nanoparticles and Mycobacterium marinum across the intestinal epithelium in zebrafish and the role of the mucosal immune system.</a> Developmental and Comparative Immunology. 67, 508-518 (2017).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Sized+mPEG-PLGA+Nanoparticles+of+Schisantherin+A+with+Sustained+Release+for+Enhanced+Brain+Uptake+and+Anti-Parkinsonian+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Small-Sized mPEG-PLGA Nanoparticles of Schisantherin A with Sustained Release for Enhanced Brain Uptake and Anti-Parkinsonian Activity.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 9 (11), 9516-9527 (2017).</li>
<li>Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gavaging+Adult+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gavaging Adult Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50691-e50691 (2013).</li>
<li>Kim, S. H., Jang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+targeting+to+M+cells+for+enhancing+the+efficacy+of+mucosal+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antigen targeting to M cells for enhancing the efficacy of mucosal vaccines.</a> Experimental and Molecular Medicine. 46 (3), 85(2014).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20075244">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327 (5963), 291-295 (2010).</li>
<li>Kunisawa, J., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+marvel+of+mucosal+T+cells+and+secretory+antibodies+for+the+creation+of+first+lines+of+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A marvel of mucosal T cells and secretory antibodies for the creation of first lines of defense.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1308-1321 (2005).</li>
<li>Rombout, J. H., Yang, G., Kiron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immune+responses+at+mucosal+surfaces+of+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adaptive immune responses at mucosal surfaces of teleost fish.</a> Fish Shellfish Immunology. 40 (2), 634-643 (2014).</li>
<li>Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mucosal+Immune+System+of+Teleost+Fish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">The Mucosal Immune System of Teleost Fish.</a> Biology. 4, 525-539 (2015).</li>
<li>Munang'andu, H. M., Mutoloki, S., Evensen, O. ø <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+challenges+limiting+the+design+of+protective+mucosal+vaccines+for+finfish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">An overview of challenges limiting the design of protective mucosal vaccines for finfish.</a> Frontiers in Immunology. 6, 542(2015).</li>
<li>Lickwar, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+dissection+of+conserved+transcriptional+regulation+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells.</a> PLoS Biology. 15 (8), 2002054(2017).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/41833112_Keeping_and_raising_zebrafish">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish. 261, 7-37 (2002).</li>
<li>Rességuier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+efficient+uptake+of+surfactant-free+poly%28lactic+acid%29+nanovaccine+vehicles+by+mucosal+dendritic+cells+in+adult+zebrafish+after+bath+immersion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Specific and efficient uptake of surfactant-free poly(lactic acid) nanovaccine vehicles by mucosal dendritic cells in adult zebrafish after bath immersion.</a> Frontiers in Immunology. 8, 190(2017).</li>
<li>Kephart, D., Terry, G., Krueger, S., Hoffmann, K., Shenoi, H. <a target="_blank" href="https://www.promega.com/resources/pubhub/promega-notes-2006/high-performance-rna-isolation-using-the-maxwell-16-total-rna-purification-kit/">High-Performance RNA Isolation Using the Maxwell 16 Total RNA Purification Kit.</a> Promega Notes. , (2006).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific NanoDrop 1000 spectrophotometer V3.8 user's manual. <a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/159058219/NanoDrop-1000-Spectrophotometer">Thermo Fisher Scientific Incorporation</a>. , (2010).</li>
<li>Lightfoot, S. Quantitation comparison of total RNA using the Agilent 2100 bioanalyzer, ribogreen analysis, and UV spectrometry. <a target="_blank" href="https://www.chem-agilent.com/pdf/5988-7650EN.pdf">Agilent Application Note</a>. , (2002).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+MIQE+guidelines%3A+Minimum+information+for+publication+of+quantitative+digital+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The digital MIQE guidelines: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Renshaw, S., Loynes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Protokół ten jest ulepszeniem wcześniej opisanej techniki intubacji doustnej przez Collymore'a i wsp.4 Nasz protokół szczegółowo opisuje metodę intubacji doustnej i obejmuje przygotowanie jelita do dalszych analiz. Nasza metoda poprawia szybkość manipulacji rybami, umożliwiając jednej osobie szybkie wykonanie całego protokołu, bez większych różnic między operatorami. Główną różnicą między naszym protokołem a poprzednim jest to, że oceniamy powodzenie eksperymentu z intubacją doustną nie t...

Celem tego artykułu jest dogłębne opisanie prostej metody doustnej intubacji danio pręgowanego, wraz z użytecznymi procedurami towarzyszącymi. Intubacja doustna z użyciem danio pręgowanego stała się praktycznym modelem w badaniach nad dynamiką chorób zakaźnych, doustną szczepionką/immunostymulantem, wychwytem i skutecznością leków/nanocząstek oraz odpornością błony śluzowej jelit. Na przykład doustna intubacja danio pręgowanego została wykorzystana w badaniu infekcji Mycobacterium marinum i Mycobacterium peregrinum1. Lovmo i wsp. Z powodzeniem wykorzystano również ten model do dostarczania nanocząsteczek i M. marinum do przewodu pokarmowego dorosłego danio pręgowanego2. Ponadto Chen i wsp. wykorzystali doustną intubację danio pręgowanego, aby wykazać, że leki zamknięte w nanocząsteczkach, gdy są podawane przez przewód pokarmowy, są transportowane przez barierę krew-mózg3. Autorzy ci przeprowadzili intubację w oparciu o metodę gauvage opisaną przez Collymore'a i wsp.4 z pewnymi modyfikacjami. Nie dostarczyli jednak bardzo szczegółowego protokołu opisującego procedurę intubacji ustnej. W tym miejscu przedstawiamy metodę doustnej intubacji dorosłych ryb danio pręgowanego na podstawie Collymore i wsp.4 Dołączamy również przygotowanie jelita do odpowiedniej analizy za pomocą cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR.
Jelito, a szczególnie jego błona śluzowa, jest pierwszą linią obrony przed infekcją i głównym miejscem pobierania składników odżywczych5. Kiedy komórki nabłonkowe i komórki prezentujące antygen w barierach błony śluzowej dostrzegają sygnały niebezpieczeństwa, wyzwalana jest natychmiastowa wrodzona odpowiedź immunologiczna. Następnie wysoce specyficzna adaptacyjna odpowiedź immunologiczna jest ustalana przez limfocyty T i B6,7. Opracowywanie szczepionek doustnych jest obecnie jednym z obszarów zainteresowania wakcynologii. Takie szczepionki byłyby skutecznym narzędziem do ochrony organizmu w miejscach narażonych ze względu na specyficzną odpowiedź komórek odpornościowych w tkankach limfatycznych związanych z błoną śluzową (MALT)8,9. W akwakulturze szczepionki błony śluzowej mają oczywiste zalety w porównaniu ze szczepionkami do wstrzykiwań. Są praktyczne do masowych szczepień, mniej pracochłonne, są mniej stresujące dla ryb i mogą być podawane młodym rybom. Niemniej jednak kandydaci na szczepionkę błonową muszą dotrzeć do drugiego segmentu jelita bez denaturacji w środowisku jamy ustnej. Muszą również przekroczyć bariery błony śluzowej, aby uzyskać dostęp do komórek prezentujących antygen (APC) w celu wywołania odpowiedzi miejscowej i/lub ogólnoustrojowej10. W związku z tym badanie wychwytu błony śluzowej przez kandydujące antygeny doustne i ich systemy dostarczania, a także wywołanej odpowiedzi immunologicznej, ma zasadnicze znaczenie dla opracowania szczepionek doustnych.
W kontekście biomedycznym, rozwijanie modelu do testowania biologicznych efektów związków po intubacji doustnej jest coraz bardziej interesujące. Wiele anatomicznych i fizjologicznych cech jelita zachowało się między liniami obustronnymi, z ssakami i rybami kostnoszkieletowymi11. Ten model intubacji jamy ustnej połączony z dalszą analizą może być narzędziem zapewniającym wgląd w biologię człowieka, a także poligonem doświadczalnym dla leków biologicznych lub innych związków in vivo.
Protokół intubacji ustnej może być wykonany przez jednego operatora, np. skutecznie podając do 50 μL zawiesiny nanocząstek białkowych rybom o wadze 1 g, z wysokim wskaźnikiem przeżywalności. Procedura jest prosta w konfiguracji i szybka; W ciągu 1 godziny można zaintubować 30 ryb. Protokół przygotowania jelit ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wysokiej jakości próbek komórek i tkanek do późniejszej analizy. Podano przykłady dalszych wyników, które pokazują przydatność protokołu w uzyskiwaniu danych związanych z wychwytem jelitowym i izolowaniem wysokiej jakości RNA do qPCR. Protokół byłby bardzo przydatny dla tych, którzy potrzebują odpowiedniego modelu do testowania dynamiki doustnych środków profilaktycznych lub innych związków w jelicie.

<table><tbody><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>Dow Corning</td><td>508-001</td><td>0,30 mm średnica wewnętrzna i 0,64 mm średnica zewnętrzna</td></tr><tr><td>igła Luer lock</td><td>Hamilton</td><td>7750-22</td><td>31 G, Kel-F Hub</td></tr><tr><td>Luer lock strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>81020/01</td><td>100 &mu; L, Kel-F Hub</td></tr><tr><td>Filtrowana końcówka do pipet</td><td>Nerbe Plus</td><td>07-613-8300</td><td>10 &mu; L</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>proszek</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna&nbsp;</td><td>Filter-Lab</td><td>RM14034252</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Zmodyfikowana pożywka orła firmy Dulbecco</td></tr><tr><td>Penicylina i streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15240</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Filtry CellTrics&nbsp;</td><td>Sysmex Partec</td><td>04-004-2326 (Wolflabs)</td><td>30 &micro; m Filtry o wielkości oczek z zbiornikiem 2 ml</td></tr><tr><td>Związek Tissue-Tek O.C.T.</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe formy do kriosekcji</td><td>SAKURA</td><td>4557</td><td>Jednorazowe formy winylowe. 25 mm x 20 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>10149870</td><td>SuperFrost Plus</td></tr><tr><td>slide Okulary nakrywkowe</td><td>Labbox&nbsp;</td><td>COVN-024-200</td><td>24&acute; 24 mm</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Atto-488 Ester NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41698</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>Promega</td><td>AS1340</td><td></td></tr><tr><td>1-tioglicerol/Homogenizacja roztwór</td><td>Promega</td><td>Inside of Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit</td><td>dodając 20 &mu; l 1-tioglicerol do 1 ml roztworu homogenizacyjnego (2%)</td></tr><tr><td>pionowy rotator laboratoryjny&nbsp;</td><td>Suministros Grupo Esper</td><td>10000-01062</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>CM3050S</tr><tr><td>Homogenizator</td><td>KINEMATICA</td><td>Polytron PT1600E</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>FACS Canto</td><td></td></tr><tr><td>5 ml okrągłodenna rurka</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Wyciąg</td><td>Kottermann</td><td>2-447 BST</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>Spektrofotometr</td></tr><tr><td>Agilent 2100 System bioanalizatora</td><td>Agilent</td><td>G2939A</td><td>Bioanalizator RNA</td></tr><tr><td>Instrument Maxwell</td><td>Promega</td><td>AS4500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA iScript&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>CFX384 PCR w czasie rzeczywistym&nbsp; System detekcji</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr><tr><td>iTaq uniwersalny zestaw SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>Woda&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375418</td><td>Fiolka CryoTube</td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td>Fluoroshield z DAPI</td></tr></tbody></table>

doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Większość patogenów atakuje organizmy przez ich błony śluzowe. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku ryb, ponieważ są one stale narażone na działanie bogatego w mikroorganizmy środowiska wodnego. Opracowanie skutecznych metod doustnego podawania immunostymulantów lub szczepionek, które aktywują układ odpornościowy przeciwko chorobom zakaźnym, jest wysoce pożądane. Opracowując narzędzia profilaktyczne, potrzebne są dobre modele eksperymentalne, aby przetestować ich skuteczność. Tutaj pokazujemy metodę doustnej intubacji dorosłego danio pręgowanego oraz zestaw procedur do preparowania i przygotowania jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR). Dzięki temu protokołowi możemy precyzyjnie podawać objętości do 50 μl rybom o wadze około 1 g w prosty i szybki sposób, bez szkody dla zwierząt. Metoda ta pozwala nam na zbadanie bezpośredniego wychwytu in vivo związków znakowanych fluorescencyjnie przez błonę śluzową jelit oraz zdolności immunomodulacyjnej takich leków biologicznych w miejscu lokalnym po intubacji. Łącząc dalsze metody, takie jak cytometria przepływowa, histologia, qPCR i mikroskopia konfokalna tkanki jelitowej, możemy zrozumieć, w jaki sposób immunostymulanty lub szczepionki są w stanie przekroczyć bariery błony śluzowej jelit, przejść przez blaszkę właściwą i dotrzeć do mięśnia, wywierając wpływ na układ odpornościowy błony śluzowej jelit. Model ten może być wykorzystany do testowania potencjalnych doustnych środków profilaktycznych i systemów podawania lub miejscowego działania dowolnego związku bioaktywnego podawanego doustnie.

Danio pręgowane (średnia masa: 1,03 ± 0,16 g) obu płci zostały pomyślnie poddane intubacji z użyciem różnych nanocząsteczek białek rekombinowanych (bakteryjnych ciałek inkluzyjnych) przy wykorzystaniu naszego autorskiego urządzenia do intubacji doustnej (Rysunek 1). Pomyślnie przeprowadziliśmy intubację doustną, uzyskując niską średnią śmiertelność (6,8%) (Tabela 1). Ryby poddano intubacji z użyciem 30 µL lub 50 µL zawiesiny nanocząsteczek, a...

Protokół opisuje intubację dorosłego danio pręgowanego za pomocą leku biologicznego; następnie preparację i przygotowanie jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR. Metoda ta pozwala na podawanie związków bioaktywnych w celu monitorowania wychwytu jelitowego i wywołanego miejscowego bodźca immunologicznego. Ma to znaczenie dla badania dynamiki jelit w profilaktyce doustnej.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wakcynologii błony śluzowej, takie jak to, w jaki sposób błona śluzowa jelit wchłania związki biologiczne i jak takie leki biologiczne modulują układ odpornościowy w miejscu lokalnym po intubacji. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta w konfiguracji, szybka i wykazuje niską śmiertelność. Ta metoda może dostarczyć informacji na temat wakcynologii błon śluzowych.Może być również stosowany do innych związków, takich jak chemikalia, toksyny lub patogeny. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ na etapach intubacji doustnej i sekcji jelit należy zachować ostrożność, ponieważ podczas intubacji można zranić danio pręgowanego i spowodować śmierć. Podczas rozwarstwiania koniec jelita jest bardzo cienki i delikatny.Umieść około jednego centymetra cienkiej silikonowej rurki na igle Luer-lock o rozmiarze 31. Wytnij sterylną końcówkę pipety filtracyjnej o pojemności 10 mikrolitrów, weź cieńszy koniec i umieść go na silikonowej rurce jako osłonę. Aby rozpocząć, przymocuj aparat igłowy do 100-mikrolitrowej strzykawki Luer-lock.Po pierwsze, przenieś ryby do zbiorników eksperymentalnych na noc przed eksperymentem. Przygotowany roztwór nanocząstek dobrze zwirować i nabrać żądaną objętość zawiesiny. Po bezpiecznym znieczuleniu ryby użyj siatki, aby szybko przenieść rybę na mokrą plastikową tacę.Ustaw zwierzę poziomo, aby było zwrócone w stronę igły. Ostrożnie podeprzyj rybę jedną ręką i otwórz usta chronioną igłą. Następnie delikatnie wbij igłę w dół przełyku na około jeden centymetr od otworu ustnego.Trudno jest zobaczyć, jak daleko powinna sięgać igła i jest to kwestia praktyki. Poczujesz igłę, gdy się zatrzyma, a następnie, manipulując igłą, znajdziesz odpowiedni kąt, aby włożyć urządzenie trochę bardziej. Powoli wstrzyknąć zawiesinę nanocząstek do ryby, upewniając się, że zawiesina nie wypływa na zewnątrz przez skrzela lub otwór gębowy.Następnie delikatnie wyjmij igłę i umieść rybę w zbiorniku regeneracyjnym. Podczas gdy ryba wraca do zdrowia, monitoruj ją pod kątem wszelkich nieprawidłowości. Gdy ryba wyzdrowieje, włóż ją z powrotem do jednego z eksperymentalnych zbiorników.Po uśpieniu ryby zgodnie z protokołem tekstowym umieść rybę na kawałku bibuły filtracyjnej. Za pomocą ostrych nożyczek preparacyjnych wykonaj półokrągłe nacięcie od odbytu do wieczka i otwórz nacięcie drobną pęsetą. Następnie odetnij oba końce jelita, wyjmij wszystkie narządy wewnętrzne i umieść je na bibule filtracyjnej.Następnie oddziel jelito od narządów wewnętrznych i rozciągnij je, uważając, aby uzyskać całe jelito. Na koniec za pomocą pęsety zwiń jelito na bibułę filtracyjną, aby usunąć tkankę klejącą. Korzystając z tego protokołu, danio pręgowanego różnej płci udało się zaintubować różnymi rekombinowanymi nanocząstkami białkowymi.Stosując domowe urządzenie do intubacji doustnej, osiągnięto niski średni odsetek śmiertelności. Aby ocenić dostarczanie ciał inkluzyjnych nanocząstek fluorescencyjnych wykonanych z rekombinowanego TNF alfa, przeprowadzono analizę cytometryczną. Całkowita ilość komórek fluorescencyjnych była istotnie wyższa w grupie zaintubowanej nanocząstkami niż w grupie kontrolnej zarówno po pięciu, jak i 24 godzinach od intubacji.Sprzęt do intubacji jest niedrogi, precyzyjny i wielokrotnego użytku. Cała procedura intubacji może być wykonana bardzo szybko przez jednego operatora, a co ważne, metoda jest spójna u różnych operatorów. Połączenie naszej metody intubacji z dalszą analizą może być idealne do opracowania szczepionki doustnej.

oral-intubation-adult-zebrafish-model-for-evaluating-intestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentujemy technikę wstrzykiwania dosytniewnego u dorosłych rybek danio-ostrobramkowych. Używamy mikrosyringi NanoFil o pojemności 10 μl, sterowanej za pomocą kontrolera Micro4 oraz pompy UltraMicroPump III. Demonstracja obejmuje wykorzystanie zimnej wody jako środka znieczulającego.

Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Przedstawiamy nowatorską metodę mikrozgavage u larw danio pręgowanego, wykorzystującą standardowy sprzęt do mikroiniekcji embrionów oraz stereomikroskopię. Wykazujemy, że mikrozgavage jest bezpieczną i wydajną techniką, przydatną do dostarczania kontrolowanych ilości różnorodnych materiałów bezpośrednio do światła jelita larw danio pręgowanego.

Mikrogaważ larw danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę izolowania jelita w celu oceny wchłaniania przez jelita związków bioaktywnych. W tej próbce wyizolujemy jelito od dorosłego danio pręgowanego, aby przeanalizować wychwyt immunostymulantów.

Sekcja jelit dorosłego danio pręgowanego: technika analizy wchłaniania związków

Ten film demonstruje technikę doustnej intubacji dorosłego danio pręgowanego w celu podania eksperymentalnych związków do przełyku i monitorowania ich wchłaniania w jelitach. Metoda ta stanowi cenny model do badania dynamiki doustnych środków profilaktycznych lub innych związków w jelicie.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego w celu podania związków eksperymentalnych

Coraz częstsze wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego wymaga opracowania skutecznych metod dostarczania znanych ilości związków i roztworów. Opisana poniżej procedura zgłębnika pozwala na doustne podawanie precyzyjnych objętości roztworu dorosłym rybom danio pręgowanym.

Dorastający dorosły danio pręgowany

Metoda generowania modelu kardiomiopatii wywołanej doksorubicyną u dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) jest opisana tutaj. Przedstawiono dwa alternatywne sposoby iniekcji dootrzewnowej i omówiono warunki zmniejszania różnic między różnymi grupami eksperymentalnymi.

Model kardiomiopatii indukowanej doksorubicyną u dorosłych danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest zmierzenie czasu przejścia fluorescencyjnie znakowanego pokarmu przez jelita larw danio pręgowanego w sposób wysokoprzepustowy.

Wysokoprzepustowy pomiar czasu pasażu jelitowego przy użyciu larw danio pręgowanego

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany i skuteczny protokół dożylnego wstrzykiwania komórek lub środków farmakologicznych dorosłemu danio pręgowanemu, co skutkuje zwiększonym wszczepieniem komórek i zwiększonymi wskaźnikami przeżycia leczonego danio pręgowanego.

Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym

Protokół ten przedstawia dostępną metodę tworzenia gazoszczelnego środowiska do podawania lotnych środków znieczulających larwom danio pręgowanego w eksperymentach behawioralnych.

Podawanie lotnych środków znieczulających larwom danio pręgowanego w celu obserwacji behawioralnej

Niniejsze badanie przedstawia metodę karmienia opartą na żelatynie, która umożliwia precyzyjne, nieinwazyjne podawanie leków doustnych u dorosłych rybek zebra z uwzględnieniem masy ciała. Protokół wykazuje niezawodną akceptację pokarmu i, jako dowód zasady, pomyślne podanie MK-801, które zaowocowało oczekiwanymi efektami behawioralnymi.

Proste i precyzyjne podejście oparte na karmieniu doustnego podawania leków rybom

Poznaj metodę intubacji doustnej dorosłych danio pręgowanych w celu oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach i badania lokalnych odpowiedzi immunologicznych.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Przeglądaj więcej filmów