Name: Peptyd MUB40 do stosowania w wykrywaniu zdarzeń zapalnych za pośrednictwem neutrofili (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę detekcji neutrofili za pomocą peptydu MUB40 wiążącego laktoferynę w ziarnistościach komórkowych. Technika umożliwia specyficzne oznaczanie neutrofili w próbkach żywych i utrwalonych, wspierając badania nad stanami zapalnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Fondation Laurette Fugain (LF-2015-15) (B.S.M.) i ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały sprawdzone i zatwierdzone przez francuskie organizacje CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) i CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).
1. Barwienie neutrofili w tkance histopatologicznej za pomocą znakowanego fluorescencyjnie MUB40
<ol>
	<li>Aby uzyskać tkankę do histopatologii, należy utrwalić skrawki tkanki/biopsji w odpowiedniej objętości 4% paraformaldehydu (PFA) przez 30 minut do 4 godzin, w zależności od grubości próbki. Umieścić próbki w lodówce o temperaturze 4 °C podczas utrwalania. 
	Uwaga: Alternatywne metody/czasy mocowania można zastąpić w zależności od unikalnych potrzeb użytkownika.
	<ol>
		<li>Usunąć PFA, dodać 16% roztwór sacharozy o objętości wystarczającej do całkowitego pokrycia próbki i umieścić próbkę w temperaturze 4 °C na 4 godziny do nocy.</li>
		<li>Usunąć 16% roztwór sacharozy i dodać 30% roztwór sacharozy w wystarczająco dużej objętości, aby całkowicie pokryć próbkę, i umieścić ją w temperaturze 4 °C na 4 godziny do nocy.</li>
		<li>Usuń 30% roztwór sacharozy i zetrzyj nadmiar roztworu z tkanki ręcznikiem papierowym. Umieścić wycinek tkanki w pożywce o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrozić błyskawicznie w 2-metylobutanie schłodzonym w suchej kąpieli lodowo-etanolowej (-72 °C). Po zamrożeniu ciała stałego (po ~2 min) usuń bloki z 2-metylobutanu i umieść je na suchym lodzie, aż wszystkie bloki będą gotowe i gotowe do długotrwałego przechowywania. Zamrożone bloki należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W noc poprzedzającą cięcie bloków tkanek należy je wyjąć z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieścić w temperaturze -20 °C na noc w celu zrównoważenia.
	<ol>
		<li>Za pomocą kriostatu pokrój tkankę zatopioną w OCT na plastry o grubości od 10 do 30 μm i zaadsorbuj do wysokiej jakości szkiełek szkiełkowych. 
		Uwaga: W zależności od wymagań eksperymentalnych można użyć grubszych lub cieńszych plastrów.</li>
		<li>Za pomocą pisaka woskowego lub innej metody hydrofobowej narysuj pudełko wokół plasterka chusteczki na szklanym szkiełku i pozostaw do wyschnięcia.</li>
		<li>Przygotować roztwór barwiący, wykonując rozcieńczenie MUB40-Cy5 (lub innej fluorescencyjnej wersji MUB40, 1 mg/ml roztworu podstawowego) w 0,1% roztworze saponiny-PBS w stosunku 1:1000. Optymalne stężenie końcowe MUB40 powinno wynosić 1 μg/ml. 
		Uwaga: Można stosować niższe stężenia końcowe (0,1-0,01 μg/ml), ale może to prowadzić do niższej intensywności sygnału. 
		UWAGA: Saponina w proszku może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Upewnij się, że ważysz saponinę w szafce lub chronionym obszarze. Można zastosować alternatywne metody przepuszczalności, takie jak Triton. Dodaj dodatkowe markery w stężeniach zalecanych przez producenta (np. 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), falloidyna, przeciwciała fluorescencyjne).</li>
		<li>Delikatnie zanurzyć szkiełko w roztworze 0,1% saponiny-PBS trzy razy.</li>
		<li>Ostrożnie zetrzyj nadmiar płynu wokół sekcji tkanki i dodaj tyle roztworu barwiącego, aby całkowicie pokryć odcinek tkanki. Umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej, aby uniknąć parowania i inkubuj je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chroń go przed światłem.</li>
		<li>Delikatnie zanurzyć szkiełko w 0,1% roztworze saponiny-PBS 3x. Następnie delikatnie zanurz szkiełko w roztworze PBS 3x. Na koniec delikatnie zanurz szkiełko w destylowanymH2O3x. Ostrożnie osusz nadmiar płynu ze szkiełka.</li>
		<li>Dodaj niewielką ilość (~20 μL) podłoża mocującego (20 mM Tris pH 8,0, 0,5% galusanu N-propylu, 90% glicerolu) obok wycinka chusteczki i delikatnie połóż szklane szkiełko nakrywkowe na szklanym szkiełku. Delikatnie i równomiernie dociśnij szkiełko nakrywkowe do części chusteczki i za pomocą ręcznika papierowego ostrożnie usuń wszelkie media montażowe, które wystają wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Umieść zamontowany suwak w ciemnej szafce na 24 godziny, aby umożliwić zastygnięcie nośnika montażowego. Alternatywnie można umieścić zamontowaną prowadnicę w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zobrazuj wycinki tkanki pod mikroskopem fluorescencyjnym zgodnie z żądaną metodą akwizycji.</li>
</ol>
2. Wizualizacja aktywacji neutrofili za pomocą peptydu Retro-Inverso-MUB40-Cy5
<ol>
	<li>Uzyskać ludzkie neutrofile przy użyciu następującego protokołu. Przygotuj następujące roztwory i umieść je na noc w szafce beztlenowej. Wystawienie na działanie tlenu zacznie aktywować neutrofile i dalej indukować śmierć komórki16,17. 
	Uwaga: Neutrofile mogą być alternatywnie oczyszczane "na stole" do eksperymentów znakowania MUB40; Należy jednak pamiętać, że ekspozycja na tlen zacznie wpływać na aktywację neutrofili.
	<ol>
		<li>Przygotuj następujące rozwiązanie: 
		Roztwór 1 [chlorek sodu (NaCl) 0,9%]: dodać 4,5 g NaCl do 500 mlH2O. Przefiltrować roztwór. 
		Roztwór 2 (dekstran 6%): dodać 6 g dekstranu w 0,9% roztworze NaCl do 100 ml. 
		Roztwór 3 (bufor do przemywania ): rozpuścić kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) w PBS o pH 7,2 do końcowego stężenia EDTA 2 mM. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w roztworze PBS/EDTA tak, aby końcowe stężenie BSA wynosiło 10% w/v.</li>
		<li>Odwirować probówki do pobierania krwi o masie 650 x g przez 20 minut bez przerw.</li>
		<li>Nie przerywając oddzielania krwi, przenieś probówki do pobierania krwi do szafki beztlenowej i zbierz frakcje osocza (na górze) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wyjąć probówkę zawierającą osocze z szafki beztlenowej i odwirować przy 2 900 x g przez 20 minut z przerwami na osadzanie płytek krwi.</li>
		<li>Nie przerywając pracy granulowanych płytek krwi, delikatnie przenieść probówkę osocza z powrotem do szafki beztlenowej i odpipetować osocze ubogie w płytki krwi do świeżej probówki o pojemności 50 ml (zwanej dalej "osoczem").</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielenie czerwonych krwinek od leukocytów
	<ol>
		<li>Używając probówek zawierających krwinki czerwone (RBC) z kroku 2.1.3., połączyć erytrocyty w stożkową probówkę o pojemności 50 ml (5 probówek do pobierania krwi na probówkę o pojemności 50 ml).</li>
		<li>Dodaj NaCl 0,9%, aż całkowita objętość osiągnie 44 ml. Dodaj 6 ml dekstranu 6% (ostatniego).</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj mieszaninę krwi i dekstranu, odwracając probówkę 10-20 razy. Pozostaw probówkę na osadzanie się przez co najmniej 30 minut.</li>
		<li>Podczas sedymentacji należy przygotować gradient Percoll, dodając 4,2 ml roztworu Percollu do 5,8 ml osocza w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i dobrze wymieszać, odwracając probówkę.</li>
		<li>Zebrać górną frakcję dekstranu, starając się unikać pipetowania czerwonych krwinek.</li>
		<li>Dokręcić nakrętkę, wyjąć probówkę z dekstranem z komory beztlenowej i odwirować probówkę o sile 300 x g przez 10 minut z przerwami.</li>
		<li>Ostrożnie umieścić probówkę z powrotem w komorze beztlenowej bez naruszania granulowanych komórek i usunąć płyn za pomocą pipetowania.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml osocza i bardzo powoli dodawać do górnej części roztworu Percoll. Należy uważać, aby nie doprowadzić do wymieszania warstw podczas pipetowania komórek znajdujących się na wierzchu.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij probówkę z roztworem Percoll z komory beztlenowej (unikając mieszania) i odwiruj przy 800 x g przez 20 minut bez przerw. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) pozostaną na powierzchni roztworu Percollu, a neutrofile będą osadzać się z krwinkami czerwonymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie zanieczyszczających erytrocytów
	<ol>
		<li>Przygotować 14 ml roztworu buforowego do mycia, dodając 700 μl PBS + 10% BSA do 14 ml buforu do przemywania .</li>
		<li>Umieść probówkę z roztworem Percoll z powrotem w komorze beztlenowej. Usunąć Percoll i PBMC za pomocą pipetowania i ponownie zawiesić granulowane komórki w 1 ml roztworu buforowego do mycia. Granulka, która ma być ponownie zawieszona, będzie miała czerwony kolor z powodu zanieczyszczenia erytrocytów.</li>
		<li>Dodać 200 μl kulek magnetycznych anty-CD235a (glikoforyny) do ponownie zawieszonych komórek, delikatnie wymieszać i inkubować przez co najmniej 15 minut. Ten etap ładuje zanieczyszczające erytrocyty kulkami magnetycznymi, aby można je było usunąć.</li>
		<li>Przemyć kolumnę separacyjną 2 ml buforu płuczącego 3x.</li>
		<li>Trzymając stożkową probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną separacyjną, powoli pipetuj mieszaninę neutrofili/RBC do górnej części kolumny. Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml podczas ich przepływu. Przepływ powinien być mętny i tracić swój czerwony kolor, ponieważ erytrocyty pozostają związane z kolumną.</li>
		<li>Dodać 2 ml buforu płuczącego na górę kolumny i zebrać w tej samej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Pod koniec płukania o objętości 2 ml przepływ powinien być czysty, co oznacza, że wszystkie neutrofile zostały zebrane.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj probówkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie neutrofili i zbierz 10 μl do zliczenia komórek. Zanotuj ostateczną objętość do celów zliczania komórek. Wylicz łączną liczbę komórek za pomocą dowolnej standardowej metody zliczania komórek.</li>
		<li>Wyjąć probówkę z neutrofilami z komory beztlenowej i odwirować neutrofile w stężeniu 300 x g przez 20 minut z przerwami.</li>
		<li>Umieścić osadzone neutrofile z powrotem w komorze beztlenowej i usunąć bufor płuczący za pomocą pipetowania. Ponownie zawiesić osad neutrofili w osoczu o maksymalnej gęstości komórek 107 PMN/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie liczby oczyszczonych neutrofili i wizualizacja za pomocą MUB40
	<ol>
		<li>Dodaj 1 μl RI-MUB40-Cy5 (1 mg/ml) do 1 ml pożywki Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 bez czerwieni fenolowej. Dobrze wymieszać pipetując.</li>
		<li>Do celów niniejszego protokołu wynik został przedstawiony tak, jakby dodano silny odczynnik aktywujący neutrofile, N-formylometylo-leucylo-fenyloalaninę (FMLP). Dodać 1 μm FMLP do probówki RPMI/RI-MUB40-Cy5 i mieszać przez pipetowanie w górę i w dół. 
		UWAGA: Od tego momentu każda procedura eksperymentalna będzie inna, w zależności od poruszanych pytań.</li>
		<li>Przenieś mieszaninę 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP do naczynia mikroskopowego ze szklanym dnem. Do tego naczynia dodaj objętość oczyszczonych komórek odpowiadającą 106 całkowitym neutrofilom. Wymieszać delikatnie pipetując.</li>
		<li>Umieść naczynie w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym i rozpocznij akwizycję obrazu. Na przykład zaleca się uzyskanie obrazów wyjściowych przed dodaniem odczynnika aktywującego neutrofile, takiego jak FMLP lub bakterii. W tym przykładzie rozpocznij akwizycję RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrofili, a następnie odpipetuj odczynnik aktywujący neutrofile do szklanego naczynia i kontynuuj akwizycję obrazu. 
		UWAGA: Modyfikacje tych kroków mogą być wprowadzane w oparciu o potrzeby naukowe.</li>
		<li>Przetwarzaj pozyskane obrazy/filmy poklatkowe w odniesieniu do konkretnego używanego mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+Homeostasis%2C+Immunity%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li>
<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%3A+neutral+no+more%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li>
<li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li>
<li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology & Medicine. , (2018).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9160655">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6G%2B+neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li>
<li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li>
<li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+biology%22%5BJournal%5D)">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li>
<li>Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li>
<li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).</li>
<li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).</li>
<li>Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc%CE%B3RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li>
<li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li>
<li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li>
</ol>

B.S.M. jest wymieniony jako wynalazca w patentach MUB40:
MUB40: Patent europejski EP11290403.2, 09/09/2011.
RI-MUB40: Patent europejski EP nr 17306746.3, 11/12/17.

Tutaj opisano dwa testy, w których peptyd MUB40 jest używany do badania zapalenia i aktywacji neutrofili. Pokazujemy, w jaki sposób MUB40 może ujawnić neutrofile obecne w skrawkach histopatologicznych lub pokazać ich stan aktywacji za pomocą żywych oczyszczonych neutrofili. Krytyczne etapy stosowania MUB40 jako odczynnika barwiącego są takie same, jak w przypadku każdej innej metody wykrywania fluorescencyjnego. Należy dołożyć starań, aby zapewnić kompatybilność sygnałów fluorescencyjnych...

Neutrofile są jednym z głównych ramion wrodzonego układu odpornościowego i są rutynowo rekrutowane do miejsc zapalnych w całym ciele. Badania neutrofili były w znacznym stopniu utrudnione przez ich krótki czas życia in vitro (mniej niż 8 godzin) oraz przez ograniczone narzędzia wykrywania w warunkach podstawowych lub po aktywacji. W tym miejscu przedstawiamy dobrze przetestowany protokół szerokiego i specyficznego wykrywania neutrofili ssaków w stałych/przepuszczalnych próbkach. Udostępniamy również szczegółowy protokół barwienia żywych neutrofili za pomocą MUB40. Korzystając z protokołu barwienia żywymi neutrofilami, można określić czas i miejsce aktywacji neutrofili. Protokół ten jest idealny dla badaczy, którzy chcą badać aktywację neutrofili lub uwalnianie granulek. Poza funkcjami przeciwdrobnoustrojowymi, neutrofile są obecnie doceniane jako komórki immunomodulujące zaangażowane w szeroki zakres chorób i odpowiedzi immunologicznych (wrodzonych i adaptacyjnych)1,2. Neutrofile są obecne w większości tkanek zapalnych, w dużych ilościach w zakażonych tkankach, w guzach zapalnych3, podczas IBS i zaostrzeń choroby Leśniowskiego-Crohna4, oraz w obszarach niezakaźnego zapalenia, takich jak błona maziowa pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (RZS)5. Neutrofile zawierają cztery klasy wstępnie uformowanych granulek o nazwach azurofile (α), specyficzne (β1), trzeciorzędowe (β2) granulki i pęcherzyki wydzielnicze (γ)6. Po migracji do miejsca zapalnego, zrekrutowane neutrofile ulegają aktywacji i sekwencyjnie wydzielają ziarnistość (składającą się z adhezji, związków przeciwdrobnoustrojowych i cząsteczek immunomodulujących), co sprzyja dalszej rekrutacji i przyczynia się do ustąpienia infekcji (ale także do uszkodzenia tkanki gospodarza)7. Chociaż neutrofile są uważane za krytyczny aspekt odporności wrodzonej, do tej pory dostępnych jest niewiele odczynników wykrywających do ich badania, a jeszcze mniej takich, które można wykorzystać do oceny stanu aktywacji żywych neutrofili.
Obecne metody wykrywania neutrofili opierają się na przeciwciałach monoklonalnych generowanych przeciwko antygenom eksponowanym na powierzchni komórki, takim jak Ly-6G2 lub białkach specyficznie przechowywanych w granulkach neutrofili w warunkach podstawowych (np. mieloperoksydaza, laktoferyna). Zalety przeciwciał monoklonalnych obejmują ich silne wiązanie, czułość i wszechstronność w różnych warunkach testowych. Istnieje jednak kilka wad stosowania przeciwciał monoklonalnych, a w szczególności anty-Ly-6G. Te wady obejmują specyficzność, ponieważ Ly-6G jest obecny na większości komórek szpikowych w szpiku kostnym i na wszystkich granulocytach, w tym eozynofilach; Tak więc rozszyfrowanie neutrofili od eozynofili za pomocą tego markera wymaga bardziej złożonych podejść<Klasa SUP="xref">8. Innym częstym kompromisem w stosunku do przeciwciał monoklonalnych jest ich często ograniczony zakres swoistości gospodarza, co utrudnia badania porównawcze z więcej niż jednym gatunkiem zwierząt. Trzecią wadą metod wykrywania przeciwciał, zwłaszcza przy użyciu żywych komórek lub in vivo, jest ich potencjał do zakłócania funkcji komórek lub prowadzenia do aktywacji komórek. Na przykład podawanie anty-Ly-6G myszom jest powszechnie stosowane w przypadku zubożenia neutrofili i przejściowej neutropenii9. Dodatkowo wykazano, że wstrzyknięcie przeciwciała może stymulować funkcję przeciwnowotworową neutrofili10. Wreszcie, wykrywanie przeciwciał neutrofili nie ujawnia stanu aktywacji komórki.
Zidentyfikowaliśmy 40-aminokwasowy peptyd o nazwie MUB40, który może być używany w wielu testach do oznaczania neutrofili w warunkach in vitro lub in vivo, a także do oznaczania statusu aktywacji żywych neutrofili11. MUB40 wywodzi się z MUB7012, domeny białka wiążącego śluz powierzchniowy Lactobacillus reuteri, pierwotnie opisanej ze względu na jego zdolność do wiązania śluzu13,14. MUB40 oddziałuje z glikozylowaną laktoferyną, która jest obecna w wysokich stężeniach w granulkach specyficznych dla neutrofili i trzeciorzędowych. MUB40 może być wystawiony na działanie tych granulek poprzez standardowe etapy przepuszczalności obecne w histopatologii lub protokołach sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu solidnego barwienia utrwalonych neutrofili. Gdy żywe neutrofile są utrzymywane w stanie inaktywowanym, peptyd MUB40 jest wykluczany z zawartości granulek, a komórki nie barwią się dodatnio markerem. Po aktywacji MUB40 może wiązać się z odsłoniętą laktoferyną i prowadzić do silnego zabarwienia peptydem. W ten sposób MUB40 może być używany do określania stanu aktywacji oczyszczonych neutrofili, co czyni go atrakcyjnym markerem do śledzenia procesu zakaźnego. Zdolność do wiązania się z żywymi aktywowanymi neutrofilami pozwala również na wykorzystanie MUB40 jako narzędzia do wykrywania obszarów zapalenia neutrofili w żywych modelach zwierzęcych (np. mysim modelu zapalenia stawów15). Protokoły zawarte w tym manuskrypcie szczegółowo opisują, w jaki sposób znakowany fluorescencyjnie MUB40 może być użyty do ujawnienia neutrofili w tkankach histologicznych i jak oznaczyć aktywację żywych, oczyszczonych neutrofili in vitro.

<table><tbody><tr><td>MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Fluorescencyjny peptyd MUB40 (dostępny z innymi sprzężonymi fluoroforami)</td></tr><tr><td>RI-MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Retro-inverso fluorescencyjny peptyd MUB40. Syntetyzowany z D-aminokwasami i odporny na proteazy (dostępny z innymi sprzężonymi fluoroforami)</td></tr><tr><td>Parformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Utrwalacz do histologii</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>Roztwór stosowany do usuwania nadmiaru PFA</td></tr><tr><td>Związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>Służy do zamrażania tkanek przed sekcją kriostatu</td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td>Służy do zamrażania tkanek przed sekcją kriostatu</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00974</td><td>Używany do kąpieli w suchym lodzie do zamrażania tkanek</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1520</td><td>Służy do cięcia tkanek</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-101</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>Szkiełko nakrywkowe Hi precision</td></tr><tr><td>Dako długopis&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Służy do zapobiegania utracie płynów podczas barwienia tkanek</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Służy do przepuszczalności komórek do barwienia IF</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>Barwie DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Falloidyna&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Wiąże aktynę</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Przedłuża sygnał IF i odporność na fotowybielanie</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Różne</td><td></td><td>Różne Używane do obrazowania szkiełek IF</td></tr><tr><td>Szafka anoksykowa</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td>Używane do oczyszczania żywych inaktywowanych neutrofili</td></tr><tr><td>Chlorek sodu NaCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Składnik buforowy do płukania</td></tr><tr><td>MACS Bas bufor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>Składnik buforowy do płukania</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td>Gradient do oczyszczania neutrofili</td></tr><tr><td>CD235a glikoforyna mikrokulki magnetyczne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td>Służy do usuwania zanieczyszczających erytrocytów</td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Stosowany do usuwania erytrocytów czerwonych z neutrofili</td></tr><tr><td>RPMI-1640 bez Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8755</td><td>Używany do oznaczania neutrofili</td></tr></tbody></table>

peptyd mub40 do stosowania w wykrywaniu zdarzeń zapalnych za pośrednictwem neutrofili

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Tutaj oferujemy protokół obejmujący użycie MUB40, syntetyzowanego peptydu o zdolności wiązania glikozylowanej laktoferyny przechowywanej w wysokich stężeniach w specyficznych i trzeciorzędowych granulkach neutrofili. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób MUB40 sprzężony bezpośrednio z fluoroforem może być wykorzystany do barwienia neutrofili w utrwalonych/przepuszczalnych tkankach, a także jak można to wykorzystać w obrazowaniu żywych komórek do oznaczania aktywacji i degranulacji neutrofili. Metody wykrywania neutrofili są ograniczone do specyficznych dla gatunku przeciwciał monoklonalnych, które nie zawsze są odpowiednie do niektórych zastosowań. MUB40 nie przenika przez błonę komórkową i w ten sposób jest wykluczony z laktoferyny magazynowanej w nieaktywowanych/nieprzepuszczalnych neutrofilach. MUB40 ma dodatkową zaletę polegającą na rozpoznawaniu laktoferyny z szerokiego zakresu gospodarza, co czyni go szczególnie przydatnym do porównywania wyników w badaniach obejmujących wiele modeli badawczych, zmniejszania liczby zduplikowanych odczynników i upraszczania protokołów poprzez barwienie jednoetapowe.

Wyniki barwienia tkanek przeciwciałem MUB40 na preparatach histopatologicznych zazwyczaj ukazują pojedyncze komórki rozproszone w całej tkance. MUB40 barwi laktoferrynę, która występuje w granulach neutrofili i jest w nich przedzielona. W związku z tym typowo widoczne jest barwienie punktowe lub kilka dużych, rozdzielonych obszarów sygnału pochodzących od pojedynczych neutrofili (Rysunek 1). Pomocne jest dodanie drugiego markera komórkow...

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania obecności neutrofili w stałych/permeabilizowanych odcinkach histologicznych i oceny stanu aktywacji żywych, oczyszczonych neutrofili. W szczególności peptyd MUB40 wiąże laktoferynę obecną w ziarnistościach specyficznych dla neutrofili i trzeciorzędowych. Ekspozycja zawartości granulek poprzez przepuszczalność lub aktywację neutrofili pozwala na znakowanie neutrofili.

Peptyd MUB40 do stosowania w wykrywaniu zdarzeń zapalnych za pośrednictwem neutrofili

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 jest nowym markerem neutrofili, który wiąże się z laktoferyną i umożliwia specyficzne wykrywanie w testowanych do tej pory próbkach tkanek ludzkich i wszystkich ssaków. Znakowanie neutrofili za pomocą MUB40 jest łatwe, szybkie i specyficzne. Obecnie jest szeroko stosowany w naszym laboratorium, a implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę chorób zapalnych.Na początek przygotuj roztwory pierwsze, drugie i trzecie zgodnie z protokołem tekstowym i umieść je na noc w komorze beztlenowej. Następnie odwirować probówki z zebraną krwią o masie 650 g przez 20 minut, aby oddzielić komórki od frakcji osocza. Nie naruszając oddzielonej krwi, przenieś probówki do szafki beztlenowej i przenieś frakcje osocza do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Następnie wyjmij probówkę z osoczem z szafki beztlenowej i odwiruj ją przy 2900 g przez 20 minut. Uważając, aby nie zakłócić granulowanych płytek krwi, przenieś probówkę do szafki beztlenowej i odpipetuj osocze ubogie w płytki krwi do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów. Korzystając z probówek do pobierania krwi, połącz czerwone krwinki w stożkową probówkę o pojemności 50 mililitrów.Następnie dodaj 0,9% roztwór chlorku sodu, aż całkowita objętość osiągnie 44 mililitry, i dodaj sześć mililitrów 6% dekstranu. Odwróć probówkę 10 do 20 razy, aby delikatnie wymieszać mieszaninę krwi i dekstranu, i pozwól probówce osiąść przez co najmniej 30 minut. Podczas gdy probówka opada, przygotuj gradient Percoll, dodając 4,2 mililitra roztworu Percoll do 5,8 mililitra osocza i odwróć probówkę, aby wymieszać.Następnie należy pobrać neutrofile zawierające górną frakcję dekstranu, uważając, aby nie pipetować czerwonych krwinek. Dokręcić nakrętkę, wyjąć probówkę z dekstranem z szafki beztlenowej i odwirować probówkę o masie 300 g przez 10 minut. Uważając, aby nie naruszyć granulowanych komórek, umieść rurkę z powrotem w szafce beztlenkowej.Następnie usunąć płyn za pomocą pipetowania. Delikatnie ponownie zawiesić granulkę w jednym mililitrze osocza. Powoli dodawać ponownie zawieszone komórki do wierzchów roztworu Percoll.Ostrożnie wyjąć probówkę z roztworem Percoll z szafki beztlenowej i odwirować ją przy 800 g przez 20 minut, aby oddzielić PBMC od neutrofili. Następnie przygotuj 14 mililitrów roztworu buforowego do mycia zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie umieść rurkę Percoll w szafce beztlenkowej.Za pomocą pipety usunąć Percoll i PBMC i ponownie zawiesić osad zawierający neutrofile w jednym mililitrze roztworu buforowego do mycia. Następnie dodaj 200 mikrolitrów kulek magnetycznych do zawieszonych komórek. Delikatnie wymieszaj i inkubuj komórki i kulki przez co najmniej 15 minut.Następnie dwukrotnie umyć kolumnę separacyjną dwoma mililitrami buforu myjącego. Trzymając nową, 15-mililitrową stożkową probówkę pod kolumną, powoli pipetuj mieszaninę czerwonych krwinek obojętnochłonnych przez kolumnę. Przepływ z kolumny powinien być mętny i tracić swój czerwony kolor, potwierdzając całkowite oddzielenie neutrofili od pozostałych czerwonych krwinek.Dodaj dwa mililitry buforu płuczącego do górnej części kolumny i zbierz przepływ do tej samej probówki. Pod koniec tego prania przepływ powinien być czysty. Delikatnie wymieszaj probówkę zbiorczą, aby upewnić się, że neutrofile są równomiernie rozprowadzone.Następnie pobrano 10 mikrolitrów przepływu z liczenia komórek. Następnie wyjmij probówkę z neutrofilami z szafki beztlenowej i odwiruj probówkę o masie 300 g przez 20 minut. Umieścić osadzone neutrofile z powrotem w komorze beztlenowej i usunąć bufor płuczący za pomocą pipetowania.Następnie ponownie zawieś osad w osoczu. Dodaj jeden mikrolitr RI-MUB40-Cy5 do jednego mililitra pożywki RPMI-1640, bez czerwieni fenolowej, i wymieszaj przez pipetowanie. Następnie dodaj jeden mikrolitr roztworu FMLP i odpipetuj do wymieszania.Przenieść mieszaninę do naczynia mikroskopowego ze szklanym dnem. Następnie dodaj odpowiednią objętość oczyszczonych komórek do naczynia. Na koniec umieść naczynie w odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym i rozpocznij akwizycję obrazu.W tym protokole MUB40 został użyty na żywych komórkach do wykrycia wydzielania neutrofili podczas symulacji za pomocą FMLP. Dynamika uwalniania granulek, w tym laktoferyny, może być wizualizowana w czasie, tutaj w kolorze magenta. MUB40 może być dodatkowo stosowany na utrwalone neutrofile.Tutaj fagocytyzacja koralików fluorescencyjnych w serii czasowej. Zawartość granulek neutrofili jest oznaczona tutaj na niebiesko. Neutrofile wykazywały niewielkie lub żadne barwienie komórek we wczesnych punktach czasowych i stopniowo, znakowanie RI-MUB40 zwiększało się z czasem, zarówno na błonie plazmatycznej, jak i na powierzchni kulki.MUB40 może być również stosowany na utrwalonych tkankach zapalnych w celu specyficznego wykrywania neutrofili, jak pokazano na rysunkach tekstowych. Opisujemy tutaj procedurę oczyszczania neutrofili, stosowaną rutynowo w naszym laboratorium. Każda inna metoda jest odpowiednia, etykietowanie MUB40-Cy5 nadal będzie działać.Neutrofile mogą być specyficznie znakowane MUB40 po oczyszczeniu lub bezpośrednio w tkance objętej stanem zapalnym od pacjentów lub modeli zwierzęcych. Kilka pochodnych MUB40 zostało zaprojektowanych w celu poszerzenia jego zastosowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie zapalenia do zbadania rekrutacji i aktywacji neutrofili w chorobach zapalnych.

the-mub40-peptide-for-use-detecting-neutrophil-mediated-inflammation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test degranulacji granulek azurofilowych u neutrofili myszy, polegający na stymulacji neutrofili do uwalniania granulek azurofilowych zawierających mieloperoksydazę. Następująca po niej reakcja enzymatyczna jest wykorzystywana do ilościowego określenia poziomów mieloperoksydazy, dostarczając informacji na temat aktywacji neutrofili.

Test do monitorowania degranulacji granulek azurofilowych w neutrofilach po aktywacji

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Wiadomo, że lipidy odgrywają ważną rolę w funkcjach komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę określania składu lipidowego neutrofili, z naciskiem na poziom cholesterolu, przy użyciu zarówno HPTLC, jak i HPLC, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Metody badania zmian lipidowych w neutrofilach i późniejszego tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Tutaj prezentujemy trzy metody oceny migracji i infiltracji neutrofili zarówno in vivo, jak i in vitro. Metody te mogą być wykorzystane do odkrycia obiecujących terapii ukierunkowanych na migrację neutrofili.

Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy

Opisane tutaj protokoły dostarczają przewodnika do wizualizacji i ilościowego określenia aktywności proteaz neutrofilowych w ludzkiej plwocinie. Zastosowania takiej analizy obejmują zarówno ocenę leczenia przeciwzapalnego, jak i walidację biomarkerów, badania przesiewowe leków i badania kliniczne na dużych kohortach.

Monitorowanie aktywności elastazy neutrofilowej i katepsyny G w próbkach ludzkiej plwociny

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Przedstawiamy protokół zmodyfikowanej techniki testu immunoenzymatycznego połączonego z enzymem kanapkowym do ilościowego pomiaru dwóch składników pozostałości po pułapkach zewnątrzkomórkowych neutrofili, kompleksów DNA sprzężonego z mieloperoksydazą i sprzężonego DNA elastazy neutrofilowej, pochodzących z aktywowanych neutrofili.

Kwantyfikacja kompleksów mieloperoksydazy-DNA i elastazy neutrofilowej z zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili przy użyciu zmodyfikowanego testu ELISA typu kanapkowego

Ten protokół zawiera zestaw testów funkcjonalnych neutrofili, które mają być używane jako metoda przesiewowa w celu pokrycia funkcji z różnych ścieżek sygnałowych. Protokół zawiera wstępną i prostą ocenę żywotności komórek, czystości, produkcji reaktywnych form tlenu, migracji w czasie rzeczywistym, fagocytozy oraz wstępną sugestię pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.

Zestaw technik przesiewowych do szybkiego przeglądu funkcji neutrofili

Ten protokół opisuje wieloanalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas, który umożliwia diagnostykę raka w miejscu opieki nad pacjentem poprzez analizę ex vivo aktywności proteazy związanej z nowotworem.

Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

Neutrofile o niskiej gęstości (LDN) znacznie wzrastają w kilku chorobach. LDN są zwykle izolowane poprzez sortowanie komórek. Przedstawiamy praktyczną metodę uzyskania czystego i skutecznego LDN. Po wirowaniu krwi obwodowej z gradientem gęstości komórki są inkubowane za pomocą mikrogranulek magnetycznych, a następnie LDN rozdzielane przez kolumny magnetyczne.

Szybka metoda magnetyczno-mikrokulkowa do efektywnego oczyszczania neutrofilów o niskiej gęstości

Poznaj metodę detekcji neutrofili za pomocą peptydu MUB40 wiążącego laktoferynę w ziarnistościach komórkowych. Technika umożliwia specyficzne oznaczanie neutrofili w próbkach żywych i utrwalonych, wspierając badania nad stanami zapalnymi.

Peptyd MUB₄₀ do stosowania w wykrywaniu zdarzeń zapalnych za pośrednictwem neutrofili

Przeglądaj więcej filmów