Indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy

Różnicowanie komórek progenitorowych serca lub CPC po amplifikacji wymaga przełączenia fazy z etapu proliferacji do etapu zaangażowanego, a protokół ten wykorzystuje wydajną linię śródbłonka w CPC. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do CPC wyizolowanych na podstawie kilku technik i pochodzących od różnych gatunków. Protokół ten może być stosowany w celu zwiększenia potencjału terapeutycznego CPC w terapii komórkowej.

Może być również wykorzystany do badania potencjałów i mechanizmów różnicowania oraz tego, jak wpływają na nie choroby serca. CPC to niejednorodna populacja komórek, które mogą różnić się kształtem, wielkością i siłą działania. W związku z tym protokół musi zostać dostosowany do konkretnej subpopulacji stosowanych CPC.

Po znieczuleniu myszy przetrzyj jej klatkę piersiową 70% etanolem. Za pomocą nożyczek przetnij skórę i ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić klatkę piersiową. Użyj kleszczy, aby podnieść serce, a następnie użyj nożyczek, aby przeciąć je u podstawy.

Przenieś serce do naczynia hodowlanego P60 zawierającego pięć mililitrów zimnego PBS, a następnie użyj kleszczy, aby napompować serce i wyrzucić krew z jam. Umieść serce w naczyniu P60 zawierającym pięć mililitrów zimnego PBS i umyj je. Użyj małych nożyczek, aby usunąć przedsionki, pokrój serce na dwie podłużne części i umyj je w pięciu mililitrach lodowatego PBS.

Za pomocą małych nożyczek pokrój kawałki serca na mniejsze części. Dodaj kroplę zbilansowanego roztworu soli Hank's zawierającego kolagenazę B w stężeniu jednego miligrama na mililitr i użyj sterylnej żyletki, aby dokładnie zmielić małe kawałki serca. Następnie dodaj do naczynia 2,5 mililitra roztworu kolagenazy B.

Umieść naczynie pod kątem 30 stopni w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pozostawić zmielone kawałki serca do inkubacji przez maksymalnie 30 minut, wielokrotnie przepuszczając je przez pipetę Pasteura co 10 minut podczas inkubacji. Najpierw dodaj pięć mililitrów zimnego HBSS uzupełnionego 2% FBS do zmielonych i homogenizowanych kawałków serca.

Używając filtra o średnicy 100 mikrometrów, przefiltruj kawałki serca, aby usunąć niestrawioną tkankę. Wirować w temperaturze 470 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek.

Inkubować na lodzie przez pięć minut, od czasu do czasu wstrząsając. Następnie dodaj 10 mililitrów PBS i przefiltruj próbkę przez filtr 40 mikrometrów, aby wykluczyć większe komórki, w tym resztkowe kardiomiocyty. Wirować w temperaturze 470 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut bez przerwy.

Następnie ponownie zawieś komórki w DMEM uzupełnionym 10% FBS, dążąc do końcowego stężenia komórek na poziomie miliona komórek na mililitr. Rozprowadź komórki w dwóch probówkach do barwienia i sortowania, dodając 1,5 mililitra roztworu komórkowego do jednej probówki i 3,5 mililitra do drugiej probówki. Dodaj roztwór Hoechsta i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, od czasu do czasu odwracając, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie barwnika i zapobiec krzepnięciu komórek.

Populacja boczna pojawia się w lewym dolnym rogu Hoechst, obok głównej populacji. Na wykresie FACS można go zidentyfikować na podstawie kontroli negatywnej, w której werapamil powoduje zanik populacji bocznej. Rozgrzej podłoże o jeden do 37 stopni Celsjusza i ostudź wirówkę do czterech stopni Celsjusza.

Odwirować probówki sortujące w temperaturze 470 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez sześć minut. Następnie ponownie zawieś komórki w podłożu. Przenieś komórki do przepuszczalnego dla gazu naczynia P60 zawierającego cztery mililitry pożywki.

Zmieniaj pożywkę co trzy dni, aż komórki osiągną zbieg między 70 a 80% SP-CPC hodowli przez dwa do trzech dni w kolbach T75, używając ośmiu mililitrów pożywki, po jednym w każdej kolbie. Następnie ostrożnie odessać pożywkę i delikatnie przepłukać kolbę pięcioma mililitrami ciepłego HBSS. Potraktuj komórki pięcioma mililitrami trypsyny EDTA przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki, aby zatrzymać aktywność trypsyny i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Wirować w temperaturze 470 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś komórki na podłożu pierwszym lub drugim.

Umieść komórki na szalkach P60, posiewając 250 000 SP-CPC na szalkę trzema mililitrami pożywki zawierającej różne stężenia surowicy. Po dwóch dniach hodowli zbierz pożywkę z każdej potrawy do 15-mililitrowej probówki, aby zebrać martwe komórki. Trypsynizuj przylegające komórki, jak opisano wcześniej, i zbierz zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej zebrane podłoże.

Wirować w temperaturze 840 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, następnie odessać supernatant i dodać jeden mililitr pożywki jeden lub pożywki drugiej do liczenia komórek. Wybarwić SP-CPC błękitem trypanowym i policzyć komórki żywotne i martwe. Najpierw odessać pożywkę z przygotowanych komórek i delikatnie spłukać je pięcioma mililitrami ciepłego HBSS.

Traktuj komórki pięcioma mililitrami trypsyny EDTA przez pięć minut w inkubatorze komórkowym. Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki, aby zatrzymać aktywność trypsyny. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 470 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Odessać supernatant i dodać pożywkę numer dwa do zliczania komórek. Następnie wysiewaj 80 000 komórek do każdej studzienki wstępnie pokrytej sześciodołkowej płytki hodowlanej trzema mililitrami pożywki dwa. Utrzymuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 24 godzin, a następnie zmień pożywkę w każdym dołku na trzy mililitry pożywki trzy.

Hoduj płytkę przez 21 dni, zmieniając podłoże co trzy dni. Następnie wybarwić komórki markerem śródbłonka i wykonać mikroskopię fluorescencyjną, aby zweryfikować śródbłonkowy charakter zróżnicowanych komórek. Najpierw odessać pożywkę z przygotowanych komórek i delikatnie spłukać je pięcioma mililitrami ciepłego HBSS.

Potraktuj komórki dwoma mililitrami trypsyny EDTA przez pięć minut w inkubatorze komórek, a następnie dodaj trzy mililitry pożywki trzy, aby zatrzymać aktywność trypsyny. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 470 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i dodać jeden mililitr pożywki trzech, delikatnie pipetując do wymieszania.

Policz komórki i nasiona od 2 000 do 4 000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki po trzy do każdej studzienki pokrytej matrycą na 96-dołkowej płytce. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnie użyj mikroskopu jasnego pola o dwukrotnym powiększeniu, aby zrobić zdjęcie komórek.

W tym badaniu badane są odpowiednie warunki ułatwiające zaangażowanie komórek progenitorowych serca w linię śródbłonka. Gdy konfluencja komórek wynosi 60% lub mniej, nie obserwuje się znaczącej różnicy w próbkach traktowanych 3,5% FBS. Gdy komórki w tym zbiegu są traktowane 0,1% FBS, wykazują zmniejszenie proliferacji komórek na lamininie w porównaniu z fibronektyną, ale nie wykazują wzrostu śmierci komórki.

W przeciwieństwie do tego, komórki o wysokim zbiegu nie wykazują znaczącej różnicy ani w proliferacji komórek, ani w śmierci komórki między tymi dwoma stanami. Zmiany w kształcie komórek wydają się być wskaźnikiem odpowiednich warunków hodowli, w których różnicowanie śródbłonka będzie skuteczne. W ciągu siedmiu do 14 dni w pożywce różnicującej śródbłonek obserwuje się, że udane hodowle zawierają większe komórki o różnej morfologii.

Co ciekawe, komórki te zniknęły pod koniec fazy różnicowania i miały tendencję do pojawiania się w mniejszej liczbie i w późniejszych punktach czasowych w kulturach o dużej gęstości. Tworzenie probówek jest konsekwentnie skuteczne w komórkach posianych o niskiej gęstości i zróżnicowanych na lamininie, podczas gdy obserwuje się, że w większości przypadków zawodzi w komórkach posianych o dużej gęstości. Podczas gdy tworzenie rurki jest w większości nieskuteczne w komórkach hodowanych na fibronektynie niezależnie od gęstości komórek, te zróżnicowane o niskiej gęstości czasami tworzą szczątkowe rurki.

Stężenie w surowicy i gęstość komórek w celu indukowania linii śródbłonka mają kluczowe znaczenie i muszą być dostosowane, aby zagwarantować spowolnienie proliferacji przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności. Po indukcji linii, CPC od ludzi lub przedkliniczne modele choroby mogą być wykorzystane do badań transplantacji komórek w celu oceny ich potencjału różnicowania in vivo. Protokół ten może pomóc w badaniu lub ustanowieniu nowych narzędzi regeneracji serca, a wcześniej był używany do badania molekularnego mechanizmu zaangażowania we wczesnej linii.