Name: Indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Poznaj protokół różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca przy niskiej gęstości i stężeniu surowicy. Metoda wspiera badania regeneracji serca oraz terapię komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Verze Lorenz za jej pomocne wsparcie podczas eksperymentów oraz personelowi z Zakładu Cytometrii Przepływowej z Wydziału Biomedycyny (DBM), Uniwersytetu i Szpitala Uniwersyteckiego w Bazylei. Prace te były wspierane przez program Stay-on track Uniwersytetu w Bazylei (dla Michiki Mochizuki). Gabriela M. Kuster jest wspierana przez grant Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (numer grantu 310030_156953).

Użycie myszy do izolacji komórek było zgodne z Przewodnikiem do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz ze szwajcarskim prawem ochrony zwierząt i zostało zatwierdzone przez szwajcarskie władze kantonalne.
UWAGA: Izolacja Sca-1+/CD31- SP-CPC od serca myszy została zasadniczo przeprowadzona tak, jak wcześniej opisano34 z pewnymi modyfikacjami. Aby zapoznać się z użytymi materiałami i odczynnikami, patrz Tabela materiałów. We wszystkich eksperymentach sercowe SP-CPC wyizolowane od myszy amplifikowano, pasażowano i stosowano w sposób podobny do linii komórkowej. W tym badaniu wykorzystano fragmenty 7 - 20.
1. Przygotowanie tkanek
UWAGA: Wszystkie eksperymenty na myszach muszą być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i przepisami. Ten protokół wykorzystuje cztery myszy. Płytki hodowlane o średnicy 100 mm są opisane jako P100, a płytki hodowlane o średnicy 60 mm są opisane jako P60 w poniższych częściach protokołu.
<ol>
	<li>Wstrzyknąć każdej myszy 200 mg/kg pentobarbitalu dootrzewnowo (i.p.) i poczekać, aż zostanie w pełni znieczulona, sprawdzając jej reakcję na szczypanie palca.</li>
	<li>Przetrzyj klatkę piersiową 70% etanolem. Przetnij skórę i ścianę klatki piersiowej nożyczkami, aby odsłonić klatkę piersiową.</li>
	<li>Podnieś serce kleszczami i przetnij je u podstawy za pomocą nożyczek. Umieść serce w P100 z 25 ml (5 ml dla P60) zimnego soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (trzy do pięciu serc na P100 lub od jednego do dwóch serc na P60).</li>
	<li>Pompuj serce kleszczami, aby wyrzucić krew z jam (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść serce w P100 z 25 ml (5 ml dla P60) zimnego PBS do mycia. Usuń przedsionki za pomocą małych nożyczek. Pokrój serce na dwie podłużne części i umyj je ponownie w lodowatym PBS (25 ml/P100, 5 mL/P60).</li>
	<li>Przenieś kawałki do nowego P100 z 25 ml (5 ml dla P60) zimnego PBS. Pokrój kawałki na mniejsze kawałki za pomocą małych nożyczek (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Dodaj kroplę 1 mg/ml kolagenazy B rozcieńczonej w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) i dokładnie zmiel małe kawałki sterylną żyletką (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
</ol>
2. Trawienie
<ol>
	<li>Dodaj 10 ml (2,5 ml dla P60) 1 mg/ml roztworu kolagenazy B do naczynia z kroku 1.6.</li>
	<li>Umieść roztwór kolagenazy B zawierający zmielone kawałki serca w nachylonym (około 30°) P100 (lub P60) inkubatorze o temperaturze 37 °C (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Inkubować zmielone kawałki serca przez maksymalnie 30 minut; homogenizować poprzez wielokrotne przepuszczanie ich przez pipetę Pasteura co 10 minut podczas inkubacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: Ważne jest, aby nie przekraczać łącznie 30 minut inkubacji dla kroku 1.3.</li>
</ol>
3. Filtracja
<ol>
	<li>Do zmielonych i homogenizowanych kawałków serca dodać 10 ml (5 ml dla P60) zimnego HBSS uzupełnionego 2% FBS. 
	UWAGA: HBSS uzupełniony o 2% FBS wygasza aktywność kolagenazy B.</li>
	<li>Przefiltruj kawałki serca przez filtr 100 μm, aby usunąć niestrawioną tkankę i odwiruj przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F, żółte filtry).</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml (3 ml dla P60) buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować osad przez 5 minut, od czasu do czasu wstrząsając na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 10 ml (5 ml dla P60) PBS (aby zatrzymać reakcję lizy) i przefiltruj próbkę przez filtr 40 μm, aby wykluczyć większe komórki, w tym resztkowe kardiomiocyty (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F, niebieskie filtry).</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 470 x g przez 5 minut przy temperaturze pokojowej (bez hamulca). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml DMEM, w tym 10% FBS.</li>
	<li>Policz komórki w podwielokrotności za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić komórki za pomocą DMEM, w tym 10% FBS, dążąc do końcowego stężenia komórek 1 x 106 komórek/mL. 
	UWAGA: Na mysz można oszacować około 5 x 106 komórek zubożonych w kardiomiocyty i erytrocyty.</li>
	<li>Rozmieść komórki do dwóch probówek (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2): w probówce A dodaj 1,5 ml do barwienia Hoechst 33342 werapamilem; do probówki B dodaj 18,5 ml do barwienia Hoechst 33342 i przystąp do barwienia i sortowania (kroki 4.1 i 4.2) komórek SP serca za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Sortowanie komórek SP serca za pomocą cytometrii przepływowej
UWAGA: Werapamil hamuje wypływ Hoechst poprzez blokowanie aktywności transportera ABC oporności wielolekowej (MDR). Hoechst 33342 to barwnik wiążący DNA, który może być stosowany w żywych komórkach do wykrywania cyklu komórkowego, ponieważ koreluje on z zawartością DNA. Komórki wytłaczające Hoechst-33342 pojawiają się w dolnej części obu kanałów emisyjnych Hoechst (450 nm, niebieski Hoechst; 650 nm, czerwony Hoechst), czyli poza "główną populacją" zachowującą Hoechst, nadając im nazwę "populacja boczna". Komórki SP są wzbogacone w komórki o właściwościach progenitorowych i wykazują wysoką ekspresję wielolekoopornych transporterów ABC (takich jak MDR1 i ABCG2). Hoechst 33342 jest zapisywany jako Hoechst dla następujących części protokołu. Ważne jest, aby chronić materiały wrażliwe na światło, aby uzyskać idealne rezultaty.
<ol>
	<li>Barwienie preparatem Hoechst w obecności i bez werapamilu
	<ol>
		<li>Dodać werapamil (o końcowym stężeniu 83,3 μM) i Hoechst (o końcowym stężeniu 5 μg/106 komórek) do roztworu komórkowego. W przypadku rurki A należy użyć Verapamil i Hoechst; w przypadku rurki B należy używać tylko Hoechst. Inkubować w łaźni wodnej (w temperaturze 37 °C) przez 90 minut i odwracać probówki co 20 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
		<li>Odwirować probówki o stężeniu 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w HBSS (1 x 106 komórek/ml).</li>
		<li>Weź 1,5 ml podwielokrotności do pojedynczych barwień i kontroli ujemnej z probówki B (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2): (i) anty-Sca-1 sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC); (ii) anty-CD31 sprzężoną z allofikocyjaniną (APC); (iii) komórki niebarwione (kontrola ujemna). 
		UWAGA: Kontrolki Isotype są tutaj używane do ustawiania protokołu izolacji.</li>
		<li>Probówki wirówkowe A i B oraz podwielokrotności do pojedynczego barwienia i kontroli ujemnej w dawce 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu wypłukania Hoechsta i werapamilu.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki probówki A oraz (iii) kontrolę ujemną w 250 μl HBSS i przechowywać je na lodzie w ciemności do czasu sortowania.</li>
		<li>Zawiesić osad z probówki B w 200 μl HBSS, a osad z (i, ii) podwielokrotności jednobarwnych w 100 μl HBSS. Dodaj anty-Sca-1 sprzężony z FITC (0,6 μg / 107 komórek) i anty-CD31 sprzężony z APC (0,25 μg / 107 komórek). Inkubuj granulki przez 30 minut na lodzie i potrząsaj nimi od czasu do czasu w ciemności.</li>
		<li>Dodaj 2 ml HBSS do probówek. Odwirować probówki o sile 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić wszystkie granulki za pomocą 1 ml HBSS i odwirować jak powyżej. Odrzucić supernatanty. Zawiesić osad podwielokrotności barwienia pojedynczego w 200 μl HBSS. Zawiesić osad probówki B w HBSS (20 x 106 komórek/ml).</li>
		<li>Próbki należy przechowywać na lodzie i chronić przed światłem do czasu sortowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Przygotuj sterylne probówki do sortowania o pojemności 1,5 ml z 500 μl HBSS, w tym 2% FBS.</li>
		<li>Wybarwić komórki 7-aminoaktynomycyną D (7-AAD) (0,15 μg/106 komórek) na lodzie przez 10 minut, aby wykluczyć martwe komórki.</li>
		<li>Posortuj SP serca przy użyciu następujących ustawień: wzbudzić Hoechsta za pomocą wzbudzenia 350 nm (UV), zebrać emisję fluorescencji za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 450/50 nm (Hoechst Blue) i filtra pasmowo-przepustowego 670/30 nm (czerwony Hoechst) i użyć dyszy o rozmiarze 100 μm i ciśnieniu 15 psi.</li>
		<li>Do analizy należy zarejestrować zdarzenia 5 x 105 dla próbek sortujących i 1 x 105 zdarzeń dla kontroli ujemnej, kontroli werapamilu i próbek jednobarwnych. 
		UWAGA: SP serca wynosi około 0,5% - 2% (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1H), ale może się różnić w zależności od laboratorium i izolatu. Frakcja Sca-1+/CD31- wynosi około 1% - 11% całkowitego SP serca (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1I), ale może się różnić w zależności od laboratorium i izolatu. Sca-1+/CD31- SP-CPC są zapisywane jako SP-CPC dla następujących części protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pierwotna kultura izolowanych SP-CPC
UWAGA: W tym protokole użyto trzech różnych typów mediów. Są one określane jako Medium 1 (według Noseda i wsp.)8, Medium 2 i Medium 3 i są opisane w Tabeli Materiałów dotyczące ich składu.
<ol>
	<li>Przed użyciem rozgrzać pożywkę w temperaturze od 1 do 37 °C i schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Odwirować probówki sortujące w temperaturze 4 °C i 470 x g przez 6 minut i ponownie zawiesić komórki w pożywce 1.</li>
	<li>Umieść komórki na przepuszczalnym dla gazu naczyniu P60 z 4 ml pożywki 1. Zmieniaj podłoże co 3 dni, aż komórki osiągną 70% - 80% konfluencji. 
	UWAGA: Krok 5.2 może zająć około 2-3 tygodni.</li>
</ol>
6. Ekspansja i zróżnicowanie SP-CPC
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Hodowla 3 x 105 SP-CPC w 8 ml pożywki 1 w kolbie T75.</li>
		<li>Inkubować SP-CPC w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do konfluencji 70% - 80%, zmieniając pożywkę co 2 - 3 d. 
		UWAGA: Numer komórki należy zmodyfikować w zależności od typu użytych CPC, czasu podwojenia i rozmiaru komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzrost i żywotność SP-CPC przy różnych stężeniach w surowicy
	<ol>
		<li>Hodowla SP-CPC przez 2 - 3 dni w kolbach T75 z 8 ml pożywki 1. Ostrożnie zassać pożywkę i delikatnie spłukać 5 ml ciepłego (37 °C) HBSS.</li>
		<li>Potraktuj komórki 5 ml trypsyny-EDTA przez 5 minut w inkubatorze komórkowym, dodaj 5 ml pożywki 1, aby zatrzymać aktywność trypsyny i przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce 1 lub pożywce 2 (pożywka indukcyjna linii) i poszczepić 2,5 x 105 SP-CPC na szalkach P60 z 3 ml pożywki zawierającej różne stężenia w surowicy.</li>
		<li>Pobrać pożywkę z naczynia opisanego w kroku 6.2.4 w celu zebrania martwych komórek do probówki o pojemności 15 ml po 2 dniach hodowli w pożywce 1 lub pożywce 2.</li>
		<li>Trypsynizować przylegające komórki, jak w kroku 6.2.2, i zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml z kroku 6.2.5. Odwirować komórki przy 840 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i dodać 1 ml pożywki 1 lub pożywki 2 w celu zliczenia komórek. Zabarwić SP-CPC błękitem trypanowym (0,4%) i policzyć komórki trypanowo-niebiesko-dodatnie (martwe) i trypanowo-ujemne (żywotne). 
		UWAGA: Żywotność komórek (krok 6.2.7) jest podawana jako ujemna liczba komórek trypanowo-niebieskich w stosunku do całkowitej liczby komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indukcja różnicowania śródbłonka 
	<ol>
		<li>Wstępnie pokryj (6-dołkową) płytkę hodowlaną 10 μg/ml lamininy (LN) lub fibronektyny (FN).
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór substratu zawierający 10 μg/ml LN lub FN z pożywką F12 (lub PBS). Dodaj 2 ml roztworu substratu do każdej studzienki. Utrzymywać płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Odessać roztwór z płytki i dodać 2 ml PBS do każdej studzienki, aż do jej użycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odessać pożywkę z komórek z kroku 6.1.2, delikatnie przepłukać je 5 ml ciepłego (37 °C) HBSS, potraktować je 5 ml trypsyny-EDTA przez 5 minut w inkubatorze komórkowym, dodać 5 ml pożywki 1 w celu zatrzymania aktywności trypsyny i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i dodać pożywkę 2 do liczenia komórek.</li>
		<li>Wysiewaj 8 x 104 komórek na basenik na powlekanej płytce z 3 ml pożywki 2 i utrzymuj ją w temperaturze 37 °C przez 20 - 24 godziny. Zmień pożywkę na 3 ml pożywki 3, 
		UWAGA: Zalecamy stosowanie pożywki o niskim stężeniu w surowicy - i bez suplementów - przez pierwsze 20 - 24 godziny. Zalecamy stosowanie <60% konfluencji komórek (tj. liczba komórek w kroku 6.3.4 musi być dostosowana w zależności od wielkości komórki i szybkości wzrostu).</li>
		<li>Hodować komórki przez 21 dni i zmieniać pożywkę co 3 dni.</li>
		<li>Sprawdź śródbłonkową naturę zróżnicowanych komórek, barwiąc je markerem śródbłonka, takim jak czynnik von Willebranda (vWF) i wykonując mikroskopię fluorescencyjną.
		<ol>
			<li>Umyj komórki 1 ml PBS i utrwal komórki w 3,7% formaldehydzie przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% Triton X w ddH2O (lub PBS) przez 30 minut i zablokowanie go 10% kozimi surowicą przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Inkubować komórki z przeciwciałem przeciwko czynnikowi von Willebranda (1:100) przez 48 godzin w temperaturze 4 °C</li>
			<li>Umyj komórki 3x 1 ml PBS, za każdym razem przez 10 minut. Inkubuj je z kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko królikowi Alexa Fluor 546 (1:500) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
			<li>Umyj ponownie 3x, po 10 minut, 1 ml PBS. Wybarwić jądra komórkowe dichlorowodorkiem 4'6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI; 1:500) przez 5 minut w temperaturze RT w ciemności.</li>
			<li>Umyj komórki 3x, po 5 minut każda, 1 ml PBS. Zamontuj ogniwa i przechowuj je w temperaturze 4 °C 
			UWAGA: Warunki hodowli (substrat, pożywka, odczynniki uzupełniające i stężenie FBS) w krokach 6.1 i 6.3 są opisane w <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test tworzenia probówek
	<ol>
		<li>Przygotować płytkę z matrycą błony podstawnej (np. Matrigel, zwaną dalej matrycą).
		<ol>
			<li>Rozmrozić matrycę w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
			<li>Pokryj 96-dołkową płytkę 100 μl matrycy na lodzie. 
			UWAGA: Ważne jest, aby unikać pęcherzyków w matrycy. Płytki muszą być pokryte lodem, aby uniknąć galaretki matrycy.</li>
			<li>Utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odessać pożywkę z komórek (po zakończeniu kroku 6.3.5), delikatnie przepłukać komórki 5 ml ciepłego (37 °C) HBSS i traktować je trypsyną-EDTA przez 5 minut w inkubatorze komórkowym. Dodaj pożywkę 3, aby zatrzymać aktywność trypsyny i przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, dodać 1 ml pożywki 3 i delikatnie pipetować.</li>
		<li>Przefiltrować komórki za pomocą sitka o wielkości 35 μm, jeśli komórki są zagregowane.</li>
		<li>Policz komórki i zasiew 2 x 103 do 4 x 103 komórek w 100 μl pożywki 3 w każdym basenie pokrytym matrycą. Przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym przez 16 godzin.</li>
		<li>Zrób zdjęcie mikroskopem w jasnym polu przy 2-krotnym powiększeniu. 
		UWAGA: W przypadku niepełnej trypsynizacji należy wydłużyć czas ekspozycji na Trypsin-EDTA maksymalnie do 7 - 8 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li>
<li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).</li>
<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li>
<li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes%3A+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li>
<li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1%2B+stem%2Fprogenitor+cell+in+adult+murine+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930(2015).</li>
<li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing%2C+clonogenic%2C+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium%2C+improving+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Acadademy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li>
<li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li>
<li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+c-kit%28pos%29+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li>
<li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium%3A+homing%2C+differentiation%2C+and+fusion+after+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Acadademy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li>
<li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter%2C+Abcg2%2C+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31-+but+Not+CD31%2B+cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+isl1%2B+cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit%2B+cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li>
<li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li>
<li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+migration+of+Sca1%2B%2FCD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li>
<li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic%3A+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+c-kit+receptor%2C+stem+cell+factor%2C+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li>
<li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li>
<li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li>
<li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195(2009).</li>
<li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669(2011).</li>
<li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).</li>
<li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li>
<li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li>
<li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors%2C+matrices%2C+and+forces+combine+and+control+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zalety tego Protokołu:
Protokół ten zapewnia technikę różnicowania śródbłonka CPC. Stwierdziliśmy, że niskie stężenie w surowicy i niska gęstość komórek mogą poprawić efektywność różnicowania śródbłonka, przy czym LN okazał się bardziej odpowiednim substratem niż FN w tych warunkach. Użyliśmy dwóch różnych typów CPC: CPC szczurów, które były używane w sposób podobny do linii komórkowej, oraz mysich SP-CPC, które zostały wyizolowane i namandowane. Warto zauważyć, że protokół miał zastosowanie do o...

Ostatnie badania potwierdzają istnienie rezydentnych komórek progenitorowych serca (CPC) u serca dorosłego ssaka1,2,3, a CPC mogą być użytecznym źródłem do terapii komórkowej po urazie serca4,5. Ponadto, rozszerzone CPC mogą stanowić owocny model do badań przesiewowych leków i badania mechanizmów chorobowych po odizolowaniu od pacjentów z rzadkimi kardiomiopatiami lub od odpowiednich modeli choroby6,7.
CPC wyizolowane z dorosłego serca posiadają cechy komórek macierzystych/progenitorowych1,2,3,8 ponieważ są multipotencjalne, klonogeniczne i mają zdolność do samoodnawiania. Istnieje jednak wiele różnych (sub)populacji CPC wykazujących różne profile markerów powierzchniowych, w tym na przykład c-kit, Sca-1 i inne, lub pozyskiwanych za pomocą różnych technik izolacji (tabela 1). Ustanowiono kilka protokołów kulturowych i różnicujących1,2,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Protokoły te różnią się głównie w odniesieniu do czynnika wzrostu i zawartości surowicy, które są dostosowywane w zależności od celu hodowli i co może prowadzić do różnic w wynikach i wynikach, w tym skuteczności różnicowania.
Techniki izolacji oparte na markerach:
CPC mogą być izolowane na podstawie określonego wyrażenia znacznika powierzchni1,2,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17,18. Wcześniejsze badania sugerują, że c-kit i Sca-1 mogą być najlepszymi markerami do izolowania rezydentnych CPCs1,11,14,19,20. Ponieważ żaden z tych markerów nie jest tak naprawdę specyficzny dla CPC, zwykle stosuje się kombinacje różnych markerów. Na przykład, podczas gdy CPC wyrażają niskie poziomy c-kit21, c-kit jest również wyrażany przez inne typy komórek, w tym mastucyjne komórki22, komórki śródbłonka23 i hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe24. Dodatkowym problemem jest fakt, że nie wszystkie markery ulegają ekspresji u wszystkich gatunków. Tak jest w przypadku Sca-1, który wyraża się w myszy, ale nie w human25. W związku z tym stosowanie protokołów, które są niezależne od markerów izolacji, może być korzystne ze względu na badania kliniczne i badania z wykorzystaniem próbek ludzkich.
Techniki izolacji niezależne od markerów:
Istnieje kilka głównych technik izolacji CPC, które są przede wszystkim niezależne od ekspresji znaczników powierzchniowych, ale które mogą być udoskonalone przez sekwencyjny wybór określonych podfrakcji marker-dodatnich w zależności od potrzeb (zobacz również Tabelę 1). (1) Technika populacji bocznej (SP) została pierwotnie scharakteryzowana w prymitywnej populacji hematopoetycznych komórek macierzystych w oparciu o zdolność do wypływu barwnika DNA Hoechst 3334226 przez transportery kasety wiążącej ATP (ABC)27. Komórki SP serca zostały wyizolowane przez różne grupy i stwierdzono, że wyrażają różne markery z niewielkimi różnicami między raportami2,8,13,14. (2) Komórki fibroblastów tworzących kolonie (CFU-F) zostały pierwotnie zdefiniowane na podstawie fenotypu podobnego do mezenchymalnych komórek zrębu (MSC). Wyizolowane MSCs są hodowane na szalkach w celu wywołania tworzenia kolonii. Takie tworzące kolonie podobne do MSC CFU-F mogą być izolowane z dorosłego serca i są zdolne do różnicowania się w linie sercowe15. (3) Komórki pochodzące z kardiosfery (CDC) to pojedyncze komórki pochodzące z klastrów komórek wyhodowanych z biopsji tkanek lub eksplantatów28,29,30,31. Niedawno wykazano, że głównie frakcja komórek CD105+/CD90-/c-kit- wykazuje potencjał kardiomiogenny i regeneracyjny32.
Tutaj, korzystając z SP-CPC wyizolowanych od myszy, dostarczamy protokół do efektywnej indukcji linii śródbłonka oparty na poprzednim badaniu na szczurzych CPC i mysich SP-CPCs33. Protokół zawiera specyficzne adaptacje do techniki hodowli i ekspandacji w odniesieniu do gęstości komórek, zawartości surowicy w pożywce i substratu. Może być stosowany nie tylko do mysich SP-CPC, ale do różnych typów CPC w celu wywołania zmiany losu z CPC wzmacniającego na CPC zaangażowanego śródbłonka, czy to w celu przeszczepienia tych komórek, czy ich wykorzystania do mechanistycznych badań in vitro.

<table><tbody><tr><td>Culture Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Mieszanka składników odżywczych F12 Szynka</td><td>Merck</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Bydło płodowe Surowica (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>#SH30071</td><td>3,5% (0,1% do indukcji linii)</td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td>Stężenie końcowe 2 mM</td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Merck</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>Kardiotrofin 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, Szwajcaria</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14170</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsyna-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25300</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolba</td><td>Sarstedt</td><td>#83.3911</td><td></td></tr><tr><td>Różnicowanie śródbłonka&nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12K (Kaighn's) Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>#21127</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#F4759</td><td>Rozcieńczyć w ddH2O</td></tr><tr><td>6 dołków</td><td>Falcon</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Merck</td><td>#F1635</td><td>Diluite 1:10 w PBS (stężenie końcowe 3,7%)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>#93420</td><td>0,1% w ddH2O</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (10%)</td><td>ThermoFisher</td><td>#50062Z</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-von Willebranda Factor</td><td>Abcam</td><td>#ab6994</td><td>1:100 w 10% koziej surowicy</td></tr><tr><td>anty-króliczej IgG, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher</td><td>#A11010</td><td>1:500 w 10% koziej surowicy</td></tr><tr><td>4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>#62247</td><td>1:500 w ddH2O&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw przeciwblakowy SlowFade</td><td>Mikroskop</td><td></td> szerokokątny ThermoFisher#S2828 <td></td></tr><tr><td>BX63</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube formation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Falcon</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Probówka z okrągłym dnem i nasadką sitka</td><td>Falcon</td><td>#352235</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Zmniejszony</td> <td>współczynnik wzrostuMikroskop</td> szerokokątny Corning<td>#354230</td><td></td></tr><tr><td>IX50</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sca-1+/CD31- izolacja populacji po stronie serca34&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.</td><td>w aptece szpitalnej</td><td>#9077862</td><td>Roztwór roboczy: 200 mg/kg</td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanami (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#20012</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), czerwień fenolowa (-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14175</td><td>Przygotuj HBSS 500 ml + 2% FBS&nbsp; do gaszenia Aktywność kolagenazy B&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L D-glukozy, L-glutaminy, pirogronianu</td><td>ThermoFisher</td><td>#331885</td><td>Przygotuj DMEM + 10% FBS&nbsp; + 25 mM HEPES+ P/S dla Hoechst Stanining</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp; (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ThermoFisher</td><td>#15630080</td><td>Stężenie końcowe 25 mM</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>RBC LysisBuffer (10X)</td><td>BioLegend</td><td>#420301/100mL</td><td>Rozcieńczyć do 1X w ddH2O i przefiltrować przez 0,2 &mikro; m filtr</td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Merck</td><td>#11088807001</td><td>Końcowe stężenie 1 mg/ml w HBSS, przefiltrowane przez 0,2 &mikro; m filter</td></tr><tr><td>bisBenzimide H33342 Trichlorowodorek (Hoechst)</td><td>Merck</td><td>#B2261</td><td>Przygotować 1 mg/ml w ddH2O</td></tr><tr><td>Chlorowodorek werapamilu&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#V4629</td><td>Stężenie końcowe 83,3 &mikro; M&nbsp;</td></tr><tr><td>APC Szczurzy anty-mysz CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>#551262</td><td>0,25 i mikro; g/107komórki</td></tr><tr><td>FITC Szczur Anty-Mysz Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>#557405</td><td>0,6 &mikro; g/107komórki</td></tr><tr><td>7-aminoaktynomycyna D (7-ADD)</td><td>ThermoFisher</td><td>#A1310</td><td>0,15 &mikro; g/106komórki</td></tr><tr><td>APC szczur IgG2a k Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>#553932</td><td>0,25 i mikro; g/107komórki</td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a k Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>#554688</td><td>0,6 i mikro; g/107cells</td></tr><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needles 27G</td><td>Terumo</td><td>#NN-2719R</td><td></td></tr><tr><td>Igły 18G</td><td>Terumo</td><td>#NN-1838S</td> Strzykawki jednorazowe <td></td></tr><tr><td>1 mL sterylne</td><td>CODAN</td><td>#62.1640</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa 3,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>#86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>Komórka Sitko 40 i mikro; m niebieski</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 100 &mikro; m żółty</td><td>BD Biosciences</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>Lumox Dish 50</td><td>Sarstedt</td><td>#94.6077.305</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish P100</td><td>Corning</td><td>#353003</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dishes P60</td><td>Corning</td><td>#353004</td><td></td></tr><tr><td>Mouse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Line</td><td>Wiek</td><td>Hodowla</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NRj / samiec</td><td>12 tygodni</td><td>w domu</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa produktu</td><td>Firma</strong</td><td>>Nr katalogowy</td><td></td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco (DMEM)/mieszanka składników odżywczych F12 Szynka</td><td>Merck</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp; (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td></td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Merck</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Kardiotrofina 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, Szwajcaria&nbsp;</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Przegląd kompozycji pożywki. Niektóre z tych informacji są identyczne z tymi podanymi powyżej, ale posortowane według składu Mediów 1-3. </silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa produktu</silny></td><td><silny>Średni 18</mocny></td><td><silny>Średni 2</silny></td><td><silny>Średni 3</silny></td></tr><tr><td><silny>Odczynniki</silny></td><td><silny>Kultura</silny></td><td><silny>Indukcja linii</silny></td><td><silny>Śródbłonek diff.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>35%</td><td>35%</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Mieszanka składników odżywczych F12 Szynka 65</td><td>%</td><td>65%</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp; (P/S)</td><td>1%</td><td>1%</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>3.5%</td><td>&le; 0,1%</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>2 mM</td><td>2 mM</td><td></td></tr><tr><td>Glutation</td><td>0,2 nM</td><td>0,2 nM</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>1,3%</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>6,5 ng / ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (FGF)</td><td>13 ng / ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kardiotrofina 1&nbsp;</td><td>0,65 ng/ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>0,0005 U/ml</td><td></td><td>Wszystkie niezbędne elementy zawarte w zestawie</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka (EGM)-2 BulletKit</td><td></td><td></td><td>Wszystkie niezbędne elementy zawarte w zestawie</td></tr></tbody></table>

indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Komórki progenitorowe serca (CPC) mogą mieć potencjał terapeutyczny do regeneracji serca po urazie. W sercu dorosłych ssaków wewnętrzne CPC są niezwykle rzadkie, ale rozszerzone CPC mogą być przydatne w terapii komórkowej. Warunkiem wstępnym ich stosowania jest ich zdolność do różnicowania się w kontrolowany sposób w różne linie serca przy użyciu zdefiniowanych i skutecznych protokołów. Ponadto, po ekspansji in vitro, CPC wyizolowane od pacjentów lub przedkliniczne modele choroby mogą stanowić owocne narzędzia badawcze do badania mechanizmów chorobowych.
Obecne badania używają różnych markerów do identyfikacji CPC. Jednak nie wszystkie z nich ulegają ekspresji u ludzi, co ogranicza wpływ translacyjny niektórych badań przedklinicznych. Protokoły różnicowania, które mają zastosowanie niezależnie od techniki izolacji i ekspresji markerów, pozwolą na standaryzowaną ekspansję i torowanie CPC do celów terapii komórkowej. Tutaj opisujemy, że pobudzanie CPC w warunkach niskiego stężenia płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i niskiej gęstości komórek ułatwia różnicowanie śródbłonka CPC. Korzystając z dwóch różnych subpopulacji CPC myszy i szczurów, pokazujemy, że laminina jest bardziej odpowiednim substratem niż fibronektyna do tego celu zgodnie z następującym protokołem: po hodowli przez 2 - 3 dni w pożywce, w tym w suplementach utrzymujących multipotencję i z 3,5% FBS, CPC wysiewa się na lamininie w <60% zbiegu i hoduje w pożywce bez suplementów o niskim stężeniu FBS (0,1%) przez 20 - 24 godziny przed różnicowaniem w pożywce różnicującej śródbłonek. Ponieważ CPC są populacją niejednorodną, może być konieczne dostosowanie stężeń w surowicy i czasu inkubacji w zależności od właściwości odpowiedniej subpopulacji CPC. Biorąc to pod uwagę, technika ta może być stosowana również do innych typów CPC i stanowi użyteczną metodę badania potencjału i mechanizmów różnicowania oraz tego, jak choroba wpływa na nie przy użyciu CPC wyizolowanych z odpowiednich modeli choroby.

Izolacja komórek SP-CPC myszy:
W niniejszym badaniu wykorzystano CPC myszy izolowane zgodnie z fenotypem SP, natomiast wyniki dla CPC szczura zostały zmodyfikowane i dodane z poprzedniego raportu za zgodą autorów (Rysunek 8)33.
Proliferacja komórek przy wysokiej i niskiej gęstości komórek oraz przy różnych stężeniach suro...

Ten protokół opisuje technikę różnicowania śródbłonka dla komórek progenitorowych serca. W szczególności koncentruje się na tym, jak stężenie surowicy i gęstość wysiewu komórek wpływają na potencjał różnicowania śródbłonka.

Indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Różnicowanie komórek progenitorowych serca lub CPC po amplifikacji wymaga przełączenia fazy z etapu proliferacji do etapu zaangażowanego, a protokół ten wykorzystuje wydajną linię śródbłonka w CPC. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do CPC wyizolowanych na podstawie kilku technik i pochodzących od różnych gatunków. Protokół ten może być stosowany w celu zwiększenia potencjału terapeutycznego CPC w terapii komórkowej.Może być również wykorzystany do badania potencjałów i mechanizmów różnicowania oraz tego, jak wpływają na nie choroby serca. CPC to niejednorodna populacja komórek, które mogą różnić się kształtem, wielkością i siłą działania. W związku z tym protokół musi zostać dostosowany do konkretnej subpopulacji stosowanych CPC.Po znieczuleniu myszy przetrzyj jej klatkę piersiową 70% etanolem. Za pomocą nożyczek przetnij skórę i ścianę klatki piersiowej, aby odsłonić klatkę piersiową. Użyj kleszczy, aby podnieść serce, a następnie użyj nożyczek, aby przeciąć je u podstawy.Przenieś serce do naczynia hodowlanego P60 zawierającego pięć mililitrów zimnego PBS, a następnie użyj kleszczy, aby napompować serce i wyrzucić krew z jam. Umieść serce w naczyniu P60 zawierającym pięć mililitrów zimnego PBS i umyj je. Użyj małych nożyczek, aby usunąć przedsionki, pokrój serce na dwie podłużne części i umyj je w pięciu mililitrach lodowatego PBS.Za pomocą małych nożyczek pokrój kawałki serca na mniejsze części. Dodaj kroplę zbilansowanego roztworu soli Hank's zawierającego kolagenazę B w stężeniu jednego miligrama na mililitr i użyj sterylnej żyletki, aby dokładnie zmielić małe kawałki serca. Następnie dodaj do naczynia 2,5 mililitra roztworu kolagenazy B.Umieść naczynie pod kątem 30 stopni w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pozostawić zmielone kawałki serca do inkubacji przez maksymalnie 30 minut, wielokrotnie przepuszczając je przez pipetę Pasteura co 10 minut podczas inkubacji. Najpierw dodaj pięć mililitrów zimnego HBSS uzupełnionego 2% FBS do zmielonych i homogenizowanych kawałków serca.Używając filtra o średnicy 100 mikrometrów, przefiltruj kawałki serca, aby usunąć niestrawioną tkankę. Wirować w temperaturze 470 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek.Inkubować na lodzie przez pięć minut, od czasu do czasu wstrząsając. Następnie dodaj 10 mililitrów PBS i przefiltruj próbkę przez filtr 40 mikrometrów, aby wykluczyć większe komórki, w tym resztkowe kardiomiocyty. Wirować w temperaturze 470 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut bez przerwy.Następnie ponownie zawieś komórki w DMEM uzupełnionym 10% FBS, dążąc do końcowego stężenia komórek na poziomie miliona komórek na mililitr. Rozprowadź komórki w dwóch probówkach do barwienia i sortowania, dodając 1,5 mililitra roztworu komórkowego do jednej probówki i 3,5 mililitra do drugiej probówki. Dodaj roztwór Hoechsta i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut, od czasu do czasu odwracając, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie barwnika i zapobiec krzepnięciu komórek.Populacja boczna pojawia się w lewym dolnym rogu Hoechst, obok głównej populacji. Na wykresie FACS można go zidentyfikować na podstawie kontroli negatywnej, w której werapamil powoduje zanik populacji bocznej. Rozgrzej podłoże o jeden do 37 stopni Celsjusza i ostudź wirówkę do czterech stopni Celsjusza.Odwirować probówki sortujące w temperaturze 470 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez sześć minut. Następnie ponownie zawieś komórki w podłożu. Przenieś komórki do przepuszczalnego dla gazu naczynia P60 zawierającego cztery mililitry pożywki.Zmieniaj pożywkę co trzy dni, aż komórki osiągną zbieg między 70 a 80% SP-CPC hodowli przez dwa do trzech dni w kolbach T75, używając ośmiu mililitrów pożywki, po jednym w każdej kolbie. Następnie ostrożnie odessać pożywkę i delikatnie przepłukać kolbę pięcioma mililitrami ciepłego HBSS. Potraktuj komórki pięcioma mililitrami trypsyny EDTA przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki, aby zatrzymać aktywność trypsyny i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki. Wirować w temperaturze 470 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś komórki na podłożu pierwszym lub drugim.Umieść komórki na szalkach P60, posiewając 250 000 SP-CPC na szalkę trzema mililitrami pożywki zawierającej różne stężenia surowicy. Po dwóch dniach hodowli zbierz pożywkę z każdej potrawy do 15-mililitrowej probówki, aby zebrać martwe komórki. Trypsynizuj przylegające komórki, jak opisano wcześniej, i zbierz zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej zebrane podłoże.Wirować w temperaturze 840 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, następnie odessać supernatant i dodać jeden mililitr pożywki jeden lub pożywki drugiej do liczenia komórek. Wybarwić SP-CPC błękitem trypanowym i policzyć komórki żywotne i martwe. Najpierw odessać pożywkę z przygotowanych komórek i delikatnie spłukać je pięcioma mililitrami ciepłego HBSS.Traktuj komórki pięcioma mililitrami trypsyny EDTA przez pięć minut w inkubatorze komórkowym. Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki, aby zatrzymać aktywność trypsyny. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 470 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Odessać supernatant i dodać pożywkę numer dwa do zliczania komórek. Następnie wysiewaj 80 000 komórek do każdej studzienki wstępnie pokrytej sześciodołkowej płytki hodowlanej trzema mililitrami pożywki dwa. Utrzymuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 24 godzin, a następnie zmień pożywkę w każdym dołku na trzy mililitry pożywki trzy.Hoduj płytkę przez 21 dni, zmieniając podłoże co trzy dni. Następnie wybarwić komórki markerem śródbłonka i wykonać mikroskopię fluorescencyjną, aby zweryfikować śródbłonkowy charakter zróżnicowanych komórek. Najpierw odessać pożywkę z przygotowanych komórek i delikatnie spłukać je pięcioma mililitrami ciepłego HBSS.Potraktuj komórki dwoma mililitrami trypsyny EDTA przez pięć minut w inkubatorze komórek, a następnie dodaj trzy mililitry pożywki trzy, aby zatrzymać aktywność trypsyny. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 470 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i dodać jeden mililitr pożywki trzech, delikatnie pipetując do wymieszania.Policz komórki i nasiona od 2 000 do 4 000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki po trzy do każdej studzienki pokrytej matrycą na 96-dołkowej płytce. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnie użyj mikroskopu jasnego pola o dwukrotnym powiększeniu, aby zrobić zdjęcie komórek.W tym badaniu badane są odpowiednie warunki ułatwiające zaangażowanie komórek progenitorowych serca w linię śródbłonka. Gdy konfluencja komórek wynosi 60% lub mniej, nie obserwuje się znaczącej różnicy w próbkach traktowanych 3,5% FBS. Gdy komórki w tym zbiegu są traktowane 0,1% FBS, wykazują zmniejszenie proliferacji komórek na lamininie w porównaniu z fibronektyną, ale nie wykazują wzrostu śmierci komórki.W przeciwieństwie do tego, komórki o wysokim zbiegu nie wykazują znaczącej różnicy ani w proliferacji komórek, ani w śmierci komórki między tymi dwoma stanami. Zmiany w kształcie komórek wydają się być wskaźnikiem odpowiednich warunków hodowli, w których różnicowanie śródbłonka będzie skuteczne. W ciągu siedmiu do 14 dni w pożywce różnicującej śródbłonek obserwuje się, że udane hodowle zawierają większe komórki o różnej morfologii.Co ciekawe, komórki te zniknęły pod koniec fazy różnicowania i miały tendencję do pojawiania się w mniejszej liczbie i w późniejszych punktach czasowych w kulturach o dużej gęstości. Tworzenie probówek jest konsekwentnie skuteczne w komórkach posianych o niskiej gęstości i zróżnicowanych na lamininie, podczas gdy obserwuje się, że w większości przypadków zawodzi w komórkach posianych o dużej gęstości. Podczas gdy tworzenie rurki jest w większości nieskuteczne w komórkach hodowanych na fibronektynie niezależnie od gęstości komórek, te zróżnicowane o niskiej gęstości czasami tworzą szczątkowe rurki.Stężenie w surowicy i gęstość komórek w celu indukowania linii śródbłonka mają kluczowe znaczenie i muszą być dostosowane, aby zagwarantować spowolnienie proliferacji przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności. Po indukcji linii, CPC od ludzi lub przedkliniczne modele choroby mogą być wykorzystane do badań transplantacji komórek w celu oceny ich potencjału różnicowania in vivo. Protokół ten może pomóc w badaniu lub ustanowieniu nowych narzędzi regeneracji serca, a wcześniej był używany do badania molekularnego mechanizmu zaangażowania we wczesnej linii.

induction-endothelial-differentiation-cardiac-progenitor-cells-under

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Śródbłonkowe komórki progenitorowe (EPC) są kluczowe w neowaskularyzacji niedokrwionych tkanek. Metoda ta opisuje izolację ludzkich EPC z krwi obwodowej, a także identyfikację ich potencjału migracyjnego w próbkach surowicy pacjentów kardiochirurgicznych.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych od zdrowych ochotników i ich potencjał migracyjny pod wpływem próbek surowicy po operacji kardiochirurgicznej

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Celem tej metody jest generowanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca w celu zbadania specyfikacji komórek progenitorowych i właściwości funkcjonalnych, a także generowanie komórek serca specyficznych dla komory do modelowania chorób serca.

Wytwarzanie in vitro komórek progenitorowych serca specyficznych dla pola serca

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj protokół różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca przy niskiej gęstości i stężeniu surowicy. Metoda wspiera badania regeneracji serca oraz terapię komórkową.

Indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy

Przeglądaj więcej filmów