Name: Katalityczne oczyszczanie roślinnych reaktywnych form tlenu in vivo za pomocą anionowych nanocząstek tlenku ceru (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Poznaj metodę syntezy nanocząstek tlenku ceru do katalitycznego usuwania reaktywnych form tlenu in vivo u roślin Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów sygnalizacji i tolerancji na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Kalifornijski, Riverside i USDA National Institute of Food and Agriculture, projekt Hatch 1009710 J.P.G. Materiał ten oparty jest na pracach wspieranych przez National Science Foundation w ramach grantu nr 1817363 dla J.P.G.

1. Uprawa roślin A. thaliana
<ol>
	<li>Wysiewaj nasiona A. thaliana w jednorazowych doniczkach o wymiarach 5 cm x 5 cm wypełnionych standardową mieszanką gleby. Umieść 32 takie doniczki w plastikowej tacy wypełnionej wodą (głębokość ~ 0,5 cm) i przenieś plastikową tacę z roślinami do komory wzrostu roślin.
	<ol>
		<li>Ustaw ustawienia komory wzrostowej w następujący sposób: odpowiednio aktywne promieniowanie fotosyntetyczne (PAR) 200 μmol/ms, 24 ± 1 °C w dzień i 21 ± 1 °C w nocy, wilgotność 60% i 14/10 h światła dziennego/nocnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć każdą doniczkę, aby po tygodniu kiełkowania pozostała tylko jedna roślina. Zwróć uwagę, aby w każdej doniczce trzymać sadzonki o podobnej wielkości.</li>
	<li>Podlewaj garnki, wylewając wodę z kranu bezpośrednio na plastikową tackę raz na dwa dni. Uprawiaj rośliny przez cztery tygodnie. Rośliny A. thaliana są gotowe do dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Synteza i charakterystyka PNC
<ol>
	<li>Odważyć 1,08 g azotanu ceru (III) i rozpuścić go w 2,5 ml wody klasy biologii molekularnej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odważyć 4,5 g kwasu poli(akrylowego) i rozpuścić go w 5 ml wody klasy biologii molekularnej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj te dwa roztwory przy 2,000 obr./min przez 15 minut za pomocą cyfrowego miksera wirowego.</li>
	<li>Przenieść 15 ml roztworu wodorotlenku amonu (7,2 M) do szklanej zlewki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Mieszając z prędkością 500 obr./min, dodawać kroplami mieszaninę z kroku 2.3 do roztworu wodorotlenku amonu i mieszać z prędkością 500 obr./min w temperaturze pokojowej przez 24 godziny w dygestorium.</li>
	<li>Przykryj zlewkę kawałkiem papieru, aby uniknąć znacznej utraty roztworu podczas reakcji przez noc.</li>
	<li>Po 24 godzinach przenieść otrzymany roztwór do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować go przy 3 900 x g przez 1 godzinę w celu usunięcia wszelkich ewentualnych zanieczyszczeń i dużych aglomeratów.</li>
	<li>Przenieść te 22,5 ml roztworu supernatantu do trzech filtrów 15 ml 10 kDa i napełnić pozostałą część filtra wodą molekularną, aby uzyskać całkowite rozcieńczenie 45 ml.</li>
	<li>Oczyścić roztwór sklarowanego osadu z wolnych polimerów i innych odczynników za pomocą wirówki stołowej, dodając supernatant do filtra o pojemności 15 ml i 10 kDa i odwirować przy 3 900 x g przez 15 minut. Powtórzyć ten krok co najmniej sześć razy.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję eluentu w każdym cyklu za pomocą spektrofotometru UV-VIS o długości fali od 220 do 700 nm, aby upewnić się, że w końcowym roztworze PNC nie ma wolnych polimerów i innych odczynników.</li>
	<li>Pobrany roztwór PNC należy pobrać do strzykawki o pojemności 5 ml i przefiltrować go do filtra strzykawkowego o porach 20 nm. Zebrać przefiltrowany roztwór PNC w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Pobrać rozcieńczony końcowy roztwór PNC do plastikowej kuwety i zmierzyć jego absorbancję za pomocą spektrofotometru UV-VIS od 220-700 nm. Szczyt absorbancji PNC wynosi 271 nm.</li>
	<li>Oblicz jego stężenie, korzystając z prawa Beera-Lamberta: A = εCL. A to absorbancja wartości piku dla danej próbki, ɛ to molowy współczynnik absorpcji PNC (cm-1 M-1), L to długość drogi optycznej (szerokość kuwety, 1 cm w tej metodzie), a C to stężenie molowe mierzonych nanocząstek.</li>
	<li>Zmierz średnicę hydrodynamiczną i potencjał zeta zsyntetyzowanego PNC za pomocą analizatora wielkości cząstek i potencjału zeta (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Końcowy roztwór PNC należy przechowywać w lodówce (4 °C) do czasu dalszego użycia. 
	UWAGA: Proszę zapoznać się z Wu i wsp. 8, aby uzyskać więcej informacji na temat charakterystyki PNC.</li>
</ol>
3. Etykietowanie PNC barwnikiem fluorescencyjnym DiI
<ol>
	<li>Wymieszaj 0,4 ml 5 mM (58 mg/L) PNC z 3,6 ml wody klasy biologii molekularnej w szklanej fiolce o pojemności 20 ml i mieszaj z prędkością 500 obr./min.</li>
	<li>Dodać 24 μl roztworu barwnika nadchloranu 1,1'-dioktadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI, 2,5 mg/ml; rozcieńczyć w DMSO) do 176 μl DMSO (dimetylosulfotlenku) w celu uzyskania roztworu barwnika DiI.</li>
	<li>Dodaj barwnik DiI kroplami do roztworu PNC, mieszając z prędkością 1,000 obr./min przez 1 minutę w temperaturze otoczenia.</li>
	<li>Przenieś tę otrzymaną mieszaninę do filtra o pojemności 15 ml i 10 kDa i napełnij probówkę do góry wodą klasy biologii molekularnej, aby uzyskać całkowite rozcieńczenie 15 ml.</li>
	<li>Roztwór PNC (DiI-PNC) znakowany DiI należy oczyścić z DMSO i wszelkich możliwych wolnych barwników DiI przez wirowanie na stole z filtrem 15 ml 10 kDa przy 3,900 x g przez 5 minut.
	<ol>
		<li>Powtórz krok 3.5 co najmniej pięć razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltruj końcowe roztwory DiI-PNC przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 20 nm.</li>
	<li>Zmierz absorbancję końcowego DiI-PNC za pomocą spektrofotometrii UV-VIS i oblicz jego stężenie zgodnie z prawem Beera-Lamberta (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Zobacz krok 2.13, aby uzyskać więcej informacji.</li>
	<li>Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
4. Infiltracja liści roślin za pomocą PNC
<ol>
	<li>Dodać 0,1 ml buforu infiltracyjnego (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7,5, dostosowane HCl) do 0,9 ml 0,5 mM roztworu PNC lub DiI-PNC i przemieszać go wirowo. Jako kontrolę ujemną należy użyć roztworu 10 mM buforu infiltracyjnego TES.</li>
	<li>Przenieść 0,2 ml roztworu infiltracyjnego PNC lub DiI-PNC do sterylnej strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml. Stuknij, aby usunąć wszelkie możliwe pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Wyjmij roślinę z komory wzrostowej tuż przed infiltracją nanocząsteczkami, aby uniknąć możliwego zamknięcia aparatów szparkowych w warunkach oświetlenia pomieszczenia.</li>
	<li>Przed infiltracją zmierz zawartość chlorofilu z liści A. thaliana o podobnej wielkości za pomocą miernika chlorofilu. Zmierz każdy liść za pomocą trzech powtórzeń (każda replika składa się z co najmniej trzech pomiarów)14. Wybierz liście A. thaliana o podobnej zawartości chlorofilu do eksperymentu infiltracji.</li>
	<li>Powoli naciekać liście niedawno przygotowanym roztworem PNC lub DiI-PNC, delikatnie dociskając końcówkę strzykawki bezigłowej do dna blaszki liściowej (strona abaksjalna) i wciskając tłok (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Delikatnie zetrzyj nadmiar roztworu, który pozostaje na powierzchni blaszki liściowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B) za pomocą delikatnej wycieraczki roboczej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C) i oznacz roślinę. Używaj nowych delikatnych chusteczek do zadań dla każdej grupy liści.</li>
	<li>Utrzymuj naciekane rośliny A. thaliana na ławce w celu adaptacji liści i inkubacji z PNC lub DiI-PNC przez 3 godziny 
	UWAGA: Infiltrowane rośliny A. thaliana są wtedy gotowe do dalszego użycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D).</li>
</ol>
5. Przygotowanie próbek liści do mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Rozwałkuj ilość żelu obserwacyjnego wielkości ziarnka grochu na promień około 1 cm (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A), a następnie rozprowadź go na szklanym szkiełku do grubości 1 mm (<silna klasa = "xfig"> Rysunek 4B).</li>
	<li>Użyj świdra korkowego (średnica 0,3 cm), aby wyciąć okrągły przekrój w środku żelu obserwacyjnego na szkiełku podstawowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Dobrze wypełnij nacięcie całkowicie perfluorodekaliną (PFD), aby uzyskać głębszą i lepszą rozdzielczość obrazowania konfokalnego w tkankach liści.</li>
	<li>Użyj świdra korkowego (średnica 0,2 cm), aby zebrać krążki liściowe z zaadaptowanych roślin A. thaliana infiltrowanych przez DiI-PNC (<silna klasa="xfig">Rysunek 4D).</li>
	<li>Zamontuj krążek liściowy w dobrze wypełnionej PFD; skieruj stronę naciekającą (abaksyjną) liścia do góry.</li>
	<li>Umieść kwadratowe szkiełko nakrywkowe na dysku liściowym i delikatnie równomiernie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby uszczelnić je żelem obserwacyjnym i upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie pozostały uwięzione (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4E).</li>
</ol>
6. Obrazowanie DiI-PNC w tkankach liści za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Użyj soczewki obiektywowej 40X w odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym.</li>
	<li>Upuść dwie do trzech kropli ddH2O na wierzch soczewki obiektywu 40X.</li>
	<li>Umieść przygotowane szkiełko z próbką liści naciekanych DiI-PNC na odwróconej soczewce obiektywu 40X.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że strona szkiełka nakrywkowego, ale nie szkiełko szkiełkowe, styka się bezpośrednio z ddH2O na soczewce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdź obszar zainteresowania w próbce pod mikroskopem za pomocą światła laserowego lub jasnego pola.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie mikroskopu i włącz laser argonowy (ustawiony na 20%).</li>
	<li>Ustaw otwór w taki sposób, aby zebrał wycinek optyczny mniejszy niż 2 μm i średnią liniową 4.</li>
	<li>Zobrazuj próbkę za pomocą mikroskopu konfokalnego Ustawienia: wzbudzenie laserowe 514 nm (30 %); Grubość przekroju Z-Stack: 2 μm; PMT1: 550-615 nm (dla obrazowania DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (do obrazowania chloroplastów).</li>
	<li>Wykonaj reprezentatywne obrazy konfokalne próbek liści od różnych osobników, co najmniej trzech powtórzeń biologicznych.</li>
</ol>
7. Obrazowanie PNC in vivo ROS Oczyszczanie za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Przygotować oddzielnie 25 μM dioctan 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (H2DCFDA, barwnik do oznaczania ogólnego ROS) i 10 μM barwników dihydroetydydy (DHE, barwnik do oznaczania anionu ponadtlenkowego) w buforze infiltracyjnym TES (pH 7,5) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Użyj omacnicy korkowej (średnica 0,2 cm), aby zebrać krążki liściowe z zaadaptowanych roślin A. thaliana infiltrowanych przez PNC.
	<ol>
		<li>Użyj ostrej końcówki kleszczy, aby zrobić trzy do czterech otworów w krążkach liści, aby przyspieszyć proces ładowania barwnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść krążki liściowe oddzielnie do probówek mikrowirówkowych zH2, DCFDA i DHE i inkubować przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Po inkubacji przepłukać krążki liściowe trzykrotnymddH2O i umieścić je w szkiełku podstawowym z żelem obserwacyjnym (patrz punkt 5 protokołu).</li>
	<li>Umieść szkiełko w mikroskopie konfokalnym i ręcznie ustaw ostrość na obszarze komórek mezofilu liści. Szczegółowe informacje znajdują się w sekcji 6 Protokołu.</li>
	<li>Wystaw dyski liściowe na działanie lasera UV-A (405 nm) przez 3 minuty, aby wygenerować ROS i zarejestrować zmianę intensywności sygnału ROS w szeregach czasowych ("xyt") na dysk liścia.</li>
	<li>Obraz dysku liścia za pomocą ustawień mikroskopu konfokalnego: obiektyw wodny 40x; wzbudzenie laserowe 496 nm; PMT1: 500-600 nm (do wykrywania barwników DHE i DCFDA); PMT2: 700-800 nm (do wykrywania chloroplastów). Jako kontrolę ujemną należy użyć rośliny infiltrowanej tylko roztworem buforowym do infiltracji.</li>
</ol>
8. PNC Oczyszczanie H2O2 in vitro
<ol>
	<li>Przeprowadź aktywność mimetyczną CAT (katalazy) zsyntetyzowanego PNC in vitro, postępując zgodnie z metodami opisanymi w poprzednich publikacjach3,8,15</li>
	<li>Dodaj 45,4 μl 1x buforu infiltracyjnego TES (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7,5, dostosowane HCl), PNC (60 nM, 3 μL) i H2O2 (2 μM, 1 μL) do dołka (biała płytka 96 dołków z okrągłym dnem) i delikatnie wymieszaj pipetując.</li>
	<li>Dodać 10-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazynę (stężenie robocze 100 μM, 0,5 μL) i peroksydazę chrzanową (HRP; stężenie robocze 0,2 U/ml, 0,1 μL) do studzienki, delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 30 minut. 10-acetylo-3,7-dihydroksyfenoksazyna reaguje zH2O2i jest przekształcana w rezorufinę w obecności HRP.
	<ol>
		<li>Owiń płytkę folią aluminiową, aby uniknąć światła podczas inkubacji.</li>
		<li>Przygotować kontrolę ujemną, używając buforu reakcyjnego lub wody w celu zastąpieniaH2O2.</li>
		<li>Z wyjątkiem roztworu podstawowego, wszystkie inne roztwory należy przygotować w temperaturze otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji, za pomocą czytnika płytek, monitorować absorbancję przy 560 nm, aby użyć rezorufiny do wskazania poziomuH2O2. Ustaw reżim czasu na 0, 2, 5, 10, 20 i 30 min.</li>
</ol>

<ol><li>Xu, C., Qu, X. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/am201388">Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications.</a> NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).</li>
<li>Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+cerium+oxide+nanoparticles+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine.</a> Antioxidants. 5 (2), 15(2016).</li>
<li>Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/tb/c6tb00396f#!divAbstract">Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).</li>
<li>Walkey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+and+biomedical+applications+of+cerium+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles.</a> Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).</li>
<li>Pulido-Reyes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+the+biological+effects+of+cerium+oxide+nanoparticles%3A+the+role+of+surface+valence+states%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states.</a> Scientific reports. 5, 15613(2015).</li>
<li>Dutta, P., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm061580n">Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles.</a> Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).</li>
<li>Boghossian, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/259679554_Application_of_Nanoparticle_Antioxidants_to_Enable_Hyperstable_Chloroplasts_for_Solar_Energy_Harvesting">Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting.</a> Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).</li>
<li>Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anionic+cerium+oxide+nanoparticles+protect+plant+photosynthesis+from+abiotic+stress+by+scavenging+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species.</a> ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).</li>
<li>Giraldo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+nanobionics+approach+to+augment+photosynthesis+and+biochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing.</a> Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).</li>
<li>Demidchik, V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847214001750">Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology.</a> Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).</li>
<li>Rico, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerium+oxide+nanoparticles+impact+yield+and+modify+nutritional+parameters+in+wheat+%28Triticum+aestivum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).</li>
<li>Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cerium+oxide+nanoparticles+on+the+salt+stress+responses+of+Brassica+napus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L.</a> Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).</li>
<li>Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactive+oxygen+species+scavenging+by+overproduction+of+superoxide+dismutase+and+catalase+delays+postharvest+physiological+deterioration+of+cassava+storage+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots.</a> Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+and+validating+a+high-throughput+assay+for+salinity+tissue+tolerance+in+wheat+and+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley.</a> Planta. , (2015).</li>
<li>Pirmohamed, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoceria+exhibit+redox+state-dependent+catalase+mimetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications%22%5BJournal%5D)">Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity.</a> Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).</li>
<li>Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-charge-dependent+cell+localization+and+cytotoxicity+of+cerium+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles.</a> ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).</li>
<li>Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standoff+optical+glucose+sensing+in+photosynthetic+organisms+by+a+quantum+dot+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).</li>
<li>Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2018/en/c8en00323h#!divAbstract">Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention.</a> Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).</li>
<li>Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairment+as+an+early+event+in+the+process+of+apoptosis+induced+by+glutathione+depletion+in+neuronal+cells%3A+Relevance+to+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+the+product+of+hydroethidine+and+intracellular+superoxide+by+HPLC+and+limitations+of+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).</li>
<li>Sun, C., Li, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/ee/c2ee22310d#!divAbstract">Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications.</a> Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475(2012).</li>
<li>Hirano, M., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2000/jm/a907510k/unauth#!divAbstract">Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth.</a> Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).</li>
<li>Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-specific+overexpression+of+antioxidant+genes+in+Arabidopsis+enhances+oxidative+stress+tolerance+during+germination+and+early+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth.</a> Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).</li>
<li>Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+delivery+of+nanoparticles+into+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).</li>
<li>Fukushima, K., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaxial-abaxial+polarity%3A+The+developmental+basis+of+leaf+shape+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity.</a> Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Monda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+stomatal+conductance+by+a+spontaneous+Arabidopsis+tetraploid%2C+Me-o%2C+results+from+increased+stomatal+size+and+greater+stomatal+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture.</a> Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).</li>
<li>Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-mediated+abiotic+stress-induced+programmed+cell+death+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).</li>
<li>Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthesis+under+drought+and+salt+stress%3A+regulation+mechanisms+from+whole+plant+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell.</a> Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opisujemy syntezę PNC, charakterystykę, znakowanie barwnikiem fluorescencyjnym i obrazowanie konfokalne nanocząstek w komórkach mezofilu roślinnego, aby wykazać ich aktywność wymiatania ROS in vivo . PNC są syntetyzowane z mieszaniny azotanu ceru i roztworu PAA w wodorotlenku amonu. PNC charakteryzują się spektrofotomerią absorpcyjną i stężeniem wyznaczanym za pomocą prawa Beera-Lambertsa. Pomiary potencjału Zeta potwierdziły ujemnie naładowaną powierzchnię PNC w celu zwiększenia dostarczania do ...

Nanocząstki tlenku ceru (nanoceria) są szeroko stosowane w organizmach żywych, od badań podstawowych po bioinżynierię, ze względu na ich wyraźną zdolność do oczyszczania katalitycznych reaktywnych form tlenu (ROS)1,2,3. Nanoceria mają zdolności wymiatania ROS ze względu na dużą liczbę powierzchniowych wakatów tlenu, które zmieniają się między dwoma stopniami utlenienia (Ce3+ i Ce4+) 4,5,6. Zwisające wiązania Ce3+ skutecznie oczyszczają ROS, podczas gdy szczepy sieciowe w nanoskali promują regenerację tych miejsc defektów poprzez reakcje cykliczne redoks7. Nanoceria są również ostatnio wykorzystywane do badania i inżynierii funkcji roślin8,9. Rośliny znajdujące się w stresie abiotycznym doświadczają akumulacji ROS, powodując oksydacyjne uszkodzenia lipidów, białek i DNA10. U roślin A. thaliana katalityczne wymiatanie ROS in vivo przez nanocerię prowadzi do poprawy fotosyntezy roślin w warunkach wysokiego światła, ciepła i stresów chłodzących8. Stosowanie nanocerii do gleby zwiększa również biomasę pędów i plon ziarna pszenicy (Triticum aestivum)11; Rośliny rzepaku (Brassica napus) traktowane nanocerią mają wyższą biomasę roślinną w warunkach stresu solnego12.
Nanoceria oferuje bioinżynierom i biologom roślin narzędzie oparte na nanotechnologii, które pozwala zrozumieć reakcje na stres abiotyczny i zwiększyć tolerancję roślin na stres abiotyczny. Zdolności nanocerii do wymiatania ROS in vivo są niezależne od gatunków roślin, a łatwe dostarczanie do tkanek roślinnych może potencjalnie umożliwić szerokie zastosowanie poza organizmami modelowymi. W przeciwieństwie do innych metod opartych na genetyce, nanoceria nie wymaga generowania linii roślinnych z nadekspresją enzymów przeciwutleniających w celu uzyskania wyższej zdolności wymiatania ROS13. Infiltracja nanocerii przez blaszki liściowe do roślin jest praktycznym podejściem do badań laboratoryjnych.
Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie 1) syntezy i charakterystyki ujemnie naładowanych nanocerii kwasu poli(akrylowego) (PNC), 2) dostarczania i śledzenia PNC w komórkach liści, oraz 3) monitorowania oczyszczania ROS z wykorzystaniem PNC in vivo. W tym protokole syntetyzowane są ujemnie naładowane nanoceria kwasu poli(akrylowego) (PNC), które charakteryzują się widmem absorpcyjnym, średnicą hydrodynamiczną i potencjałem zeta. Opisujemy prostą metodę infiltracji blaszki liściowej w celu dostarczenia PNC do tkanek liści roślin. Do obrazowania in vivo rozmieszczenia nanocząstek w komórkach mezofilu użyto barwnika fluorescencyjnego (DiI) do znakowania PNC (DiI-PNC) i obserwacji nanocząstek za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Na koniec wyjaśniamy, jak monitorować wymiatanie in vivo PNC ROS za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>Sześciowodny azotan ceru (III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238538-100G</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy biologii molekularnej, Corning</td><td>VWR</td><td>45001-044&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml</td><td>VWR</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Poly (kwas akrylowy) 1,800 Mw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy mikser wirowy Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Akcesorium do cyfrowego miksera wirowego Fisherbrand, wkładka ustalająca</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-391</td><td></td></tr><tr><td>Akcesoria do cyfrowego miksera wirowego Fisherbrand: Zestaw wkładek piankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-395</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05002-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki PYREX Griffin, z podziałką, Corning</td><td>VWR</td><td>13912-149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic</td><td>IKA</td><td>3810001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Eppendorf 5424</td><td>VWR</td><td>80094-126</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15</td> Wirówka stołowa <td>Millipore-Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30 Seria</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06314</td><td></td></tr><tr><td>UV-2600 Sptecrofotometr</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2600 120V</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA68091102</td><td></td></tr><tr><td>BD Jednorazowe strzykawki z końcówkami Luer-Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano S</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zen 1600</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-tetrametyloindokarbocyjaniny nadchloran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42364-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sultlenek dimetylu, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Sunshine Mix #1 LC1</td><td>Green Island Distributors, Inc</td><td>5212601.CFL080P</td><td></td></tr><tr><td>Adaptis 1000</td><td>Conviron</td><td>A1000</td><td></td></tr><tr><td>TES, >99% (miareczkowanie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Całkowicie plastikowa strzykawka Air-Tite Norm-Ject</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki</td><td>do zadań Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Carolina Observation Gel</td><td>Carolina</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Corning, matowe z jednej strony, z jednego końca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Świdr korkowy Zestawy z uchwytami</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50166A</td><td></td></tr><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9900-25G</td><td></td></tr><tr><td>Okulary Micro Cover Glasses, Kwadratowe, Nr 1</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorofluorescin dioctan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek premium Fisherbrand: 1,5 ml</td><td>Kuwety Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Uvette</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z605050-80EA</td><td></td></tr><tr><td>Miernik chlorofilu&nbsp;</td><td>Konica Minolta</td><td>-502</td><td></td></tr></tbody></table>

katalityczne oczyszczanie roślinnych reaktywnych form tlenu in vivo za pomocą anionowych nanocząstek tlenku ceru

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Akumulacja reaktywnych form tlenu (ROS) jest cechą charakterystyczną abiotycznej reakcji roślin na stres. ROS odgrywają podwójną rolę w roślinach, działając jako cząsteczki sygnałowe na niskich poziomach i uszkadzając cząsteczki na wysokich poziomach. Akumulacja ROS w zestresowanych roślinach może uszkadzać metabolity, enzymy, lipidy i DNA, powodując zmniejszenie wzrostu i plonów roślin. Zdolność nanocząstek tlenku ceru (nanocerii) do katalitycznego wymiatania ROS in vivo stanowi unikalne narzędzie do zrozumienia i bioinżynierii tolerancji roślin na stres abiotyczny. W tym miejscu przedstawiamy protokół syntezy i charakterystyki nanocerii pokrytej kwasem poli(akrylowym) (PNC), łączenia nanocząstek z roślinami poprzez infiltrację blaszki liściowej oraz monitorowania ich dystrybucji i wymiatania ROS in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej. Obecne narzędzia molekularne do manipulowania akumulacją ROS w roślinach są ograniczone do gatunków modelowych i wymagają pracochłonnych metod transformacji. Ten protokół wymiatania ROS in vivo może być potencjalnie stosowany do roślin typu dzikiego o szerokich liściach i strukturze liści, takich jak Arabidopsis thaliana.

Synteza i charakterystyka PNC. 
PNC zostały zsyntetyzowane, oczyszczone i scharakteryzowane zgodnie z metodą opisaną w sekcji 2 protokołu. Na Ryc. 1A przedstawiono barwę roztworów azotanu ceru, PAA, mieszaniny azotanu ceru i PAA oraz PNC. Po syntezie PNC zaobserwowano zmianę barwy z białej na jasnożółtą. Po oczyszczeniu za pomocą filtra 10 kDa, PNC scharakteryzowano przy użyciu spektrofotometru UV...

Tutaj prezentujemy protokół syntezy i charakterystyki nanocząstek tlenku ceru (nanocerii) do oczyszczania ROS (reaktywnych form tlenu) in vivo, obrazowania nanocerii w tkankach roślinnych za pomocą mikroskopii konfokalnej oraz monitorowania in vivo nanocerii ROS za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Katalityczne oczyszczanie roślinnych reaktywnych form tlenu in vivo za pomocą anionowych nanocząstek tlenku ceru

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Zdolność nanocząstek tlenku ceru do katalitycznego wychwytywania reaktywnych form tlenu in vivo stanowi unikalne narzędzie do zrozumienia i inżynierii mechanizmów sygnalizacji roślinnej i tolerancji na stres. Reaktywne formy tlenu odgrywają kluczową rolę w roślinach, działając jako cząsteczki sygnałowe na niskich poziomach i uszkadzając cząsteczki na wysokich poziomach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zastosowania jej do różnych gatunków roślin dziko rosnących o szerokich liściach i strukturze liści, takich jak Arabidopsis thaliana.Po wyhodowaniu roślin Arabidopsis thaliana odważ 1,08 grama azotanu ceru i rozpuść go w 2,5 mililitra wody biologicznej w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Odważ 4,5 grama polikwasu i rozpuść go w pięciu mililitrach wody biologicznej w innej 50-mililitrowej stożkowej probówce. Połącz te dwa roztwory, a następnie użyj cyfrowego miksera wirowego, aby dokładnie je wymieszać z prędkością 2 000 obr./min przez 15 minut.W dygestorii przenieś 15 mililitrów 7,2-molowego roztworu wodorotlenku amonu do 50-mililitrowej szklanej zlewki. Rozpocznij mieszanie przy 500 obr./min i w temperaturze pokojowej. Dodaj kroplami mieszaninę azotanu ceru i polikwasów.Przykryj zlewkę kawałkiem papieru, aby zapobiec znacznej utracie roztworu, i pozostaw do mieszania przez 24 godziny. Następnie przenieś powstały roztwór do 50-mililitrowej stożkowej rurki. Wirować przy 3 900 gach przez jedną godzinę, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub duże aglomeraty.Następnie przenieś supernatant do trzech 50-mililitrowych filtrów 10-kilodaltonowych. Napełnij pozostałą część każdego filtra wodą molekularną, co daje całkowite rozcieńczenie 45 mililitrów. Wirować przy 3 900 razy g przez 15 minut.Powtórz ten proces co najmniej sześć razy. Za pomocą spektrofotometru UV-vis zmierzyć absorbancję każdego eluentu od 220 nanometrów do 700 nanometrów, aby upewnić się, że w końcowym roztworze PNC nie ma wolnych polimerów ani innych odczynników. Użyj pięciomililitrowej strzykawki, aby pobrać zebrany roztwór PNC.Następnie przefiltruj roztwór do 20-nanometrowego filtra strzykawkowego o porach i zbierz przefiltrowany roztwór do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Przenieś rozcieńczony końcowy roztwór PNC do plastikowej kuwety i zmierz jego absorbancję od 220 nanometrów do 700 nanometrów. Za pomocą miary cząstek zmierz średnicę hydrodynamiczną zsyntetyzowanego PNC, a następnie przechowuj końcowy roztwór PNC w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.Po oznaczeniu PNC barwnikiem fluorescencyjnym DiI, przenieść 0,9 mililitra roztworu zawierającego 0,5 milimola roztworu PNC lub roztworu DiI-PNC do probówki. Dodaj 0,1 mililitra buforu infiltracyjnego i wymieszaj przez wirowanie. Przygotować 10-milimolowy bufor infiltracyjny TES jako kontrolę ujemną.Następnie przenieś 0,2 mililitra mieszaniny próbki i buforu do sterylnej strzykawki bezigłowej o pojemności jednego mililitra. Stuknij, aby usunąć wszelkie możliwe pęcherzyki powietrza. Tuż przed infiltracją wyjmij roślinę z komory wzrostowej.Za pomocą miernika chlorofilu zmierz zawartość chlorofilu w liściach A.thaliana. Zmierz każdy liść za pomocą trzech powtórzeń, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wybierz liście o podobnej zawartości chlorofilu.Delikatnie docisnąć końcówkę strzykawki bezigłowej do dna blaszki liściowej i wcisnąć tłok, aby wniknąć w liście. Za pomocą delikatnej wycieraczki delikatnie zetrzyj nadmiar roztworu, który pozostał na powierzchni blaszki liściowej, a następnie oznacz roślinę. Trzymaj infiltrowane rośliny na ławce do inkubacji przez trzy godziny.Najpierw umieść ilość żelu obserwacyjnego wielkości ziarnka grochu na szkiełku podstawowym, rozwałkuj żel i rozprowadź go, aż osiągnie około dwóch centymetrów średnicy i jeden milimetr grubości. Za pomocą świdra korkowego o średnicy 0,3 centymetra wytnij okrągły odcinek na środku żelu, aby stworzyć studnię. Całkowicie napełnij studzienkę PFD, co zapewni głębszą i lepszą rozdzielczość obrazowania konfokalnego.Następnie użyj omacnicy korkowej o średnicy 0,2 centymetra, aby zebrać krążki liściowe z wcześniej zinfiltrowanych roślin A.thaliana. Zamontuj każdy dysk liściowy w studzience wypełnionej PFD stroną infiltracyjną skierowaną do góry. Następnie umieść kwadratową szkiełko nakrywkowe na dysku liściowym.Delikatnie i równomiernie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby uszczelnić studzienką żelu obserwacyjnego i upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie pozostały uwięzione. Na początek przygotuj 25 mikromoli barwnika H2DCFDA i 10 mikromoli barwnika DHE w buforze infiltracyjnym TES w oddzielnych 1,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek. Za pomocą omacnicy korkowej o średnicy 0,2 centymetra zbierz krążki liściowe z przystosowanych roślin A.thaliana infiltrowanych przez PNC.Użyj ostrej końcówki kleszczy, aby zrobić trzy do czterech otworów na każdym krążku liścia, aby przyspieszyć proces ładowania barwnika. Następnie załaduj równą ilość krążków liściowych do każdej tubki z barwnikiem. Wysiaduj w ciemności przez 30 minut.Następnie trzykrotnie spłucz krążki liści podwójnie destylowaną wodą. Użyj żelu obserwacyjnego, aby zamontować każde skrzydło na szklanym szkiełku, jak opisano wcześniej. Załaduj szkiełko do mikroskopu konfokalnego i ręcznie ustaw ostrość na obszarze komórek mezofilu liści, jak opisano w protokole tekstowym, a następnie wystaw krążki liści na działanie lasera UVA o długości 405 nanometrów przez trzy minuty, aby wygenerować ROS.Rejestruj zmianę intensywności sygnału ROS w szeregach czasowych na dysk liścia. Zobrazuj dysk liścia za pomocą obiektywu wodnego 40X i ustawień mikroskopu konfokalnego pokazanych tutaj. Jako kontrolę ujemną należy użyć rośliny infiltrowanej tylko roztworem buforowym do infiltracji.Po oczyszczeniu zsyntetyzowany PNC jest charakteryzowany za pomocą spektrofotometru UV-vis i obserwuje się, że szczyt absorbancji wynosi 271 nanometrów. Proces oczyszczania potwierdza się poprzez pomiar końcowego eluentu. Próbki PNC są następnie znakowane fluorescencyjnym barwnikiem DiI w celu określenia rozkładu nanocząstek in vivo.Obserwuje się trzy piki dla PNC znakowanego DiI, podczas gdy pomiar końcowego eluentu potwierdza, że nieprzereagowane substancje chemiczne są wypłukiwane podczas oczyszczania. Rozmieszczenie DiI-PNC w komórkach mezofilu liści określa się za pomocą obrazowania konfokalnego. Podczas gdy w próbkach kontrolnych nie wykrywa się sygnałów barwnika DiI, obserwuje się, że DiI-PNC jest kolokalizowany z chloroplastami w infiltrowanych liściach.Wymiatanie ROS in vivo możliwe przez PNC jest monitorowane w dysku liściowym poprzez pomiar zmian intensywności fluorescencji w barwnikach DHE i DCF. Po trzech minutach stresu UV liście naciekane przez PNC wykazują znacznie mniejszą intensywność dla obu rodzajów barwnika w porównaniu z kontrolą buforową bez nanocząstek. Test aktywności mimetycznej CAT ujawnia spadek poziomu rezorufiny w mieszaninie zawierającej PNC.Poziom ten wskazuje na poziom nadtlenku wodoru, który w związku z tym również spada i potwierdza aktywność mimetyczną CAT zsyntetyzowanego PNC. Ten protokół syntezy nanocerii jest prostą, krokową procedurą, która generuje nanocząstki tlenku ceru o kontrolowanym rozmiarze, ładunku i zdolnościach wymiatania ROS. Metody modyfikacji genetycznej roślin do manipulacji ROS in vivo są obecnie ograniczone do gatunków modelowych roślin.W przeciwieństwie do tego, wymiatanie ROS nanoceria może być stosowane do różnych gatunków roślin dzikich zarówno w laboratorium, jak i w terenie.

catalytic-scavenging-plant-reactive-oxygen-species-vivo-anionic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Spektroskopię elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) zastosowano do wykrywania tlenku azotu z bydlęcych komórek śródbłonka aorty oraz anionorodnika ponadtlenkowego z ludzkich neutrofili, wykorzystując odpowiednio ditiokarbaminian żelaza (II)-N-metylu-D-glukaminy, Fe(MGD)2, oraz 5,5-dimetylo-1-pyrolino-N-tlenek, DMPO.

Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Spektroskopia ESR z pułapkowaniem spinowym została wykorzystana do zbadania wpływu roślinnych przeciwutleniaczy, takich jak likopen, pyknogenol i ekstrakt z pestek winogron, na neutralizację wolnych rodników w fazie gazowej w dymie papierosowym.

Protokół wykrywania i neutralizacji wolnych rodników w fazie gazowej w głównym nurcie dymu papierosowego

Produkcja wody odpływowej (PBW) została potraktowana nanocząstkami tlenku miedzi (CuO-NPs) i oceniono toksyczność komórkową w hodowanych komórkach ludzkich. Celem tego protokołu było zintegrowanie rodzimej próbki środowiskowej z formatem hodowli komórkowej oceniającym zmiany toksyczności spowodowane traktowaniem CuO-NP.

Usuwanie pierwiastków śladowych przez nanocząstki tlenku miedzi z wody upustowej z odzysku uranu in situ i jej wpływ na żywotność komórek

Przedstawiono protokół fotochemicznego wzrostu oksydacyjnego małych krystalicznych nanocząstek tlenku irydu na powierzchni CdSe@CdS zasianych nanocząstek pręcików.

Fotochemiczny wzrost oksydacyjny nanocząstek tlenku irydu na CdSe@CdS nanoprętach

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

Protokatechuatowa 3,4-dioksygenaza (PCD) może enzymatycznie usuwać wolny dwuatomowy tlen z układu wodnego za pomocą swojego substratu kwasu protokatechowego (PCA). Protokół ten opisuje ekspresję, oczyszczanie i analizę aktywności tego enzymu pochłaniającego tlen.

Ekspresja i oczyszczanie 3,4-dioksygenazy protokatechuatu 3,4-dioksygenazy bez nukleaz

Opracowano nowe metody syntezy heterocykli zawierających azot, wykorzystujące cerkosporynę jako fotokatalizator bez użycia metalu.

Fotokatalizowane cerkosporyną [4+1]- i [4+2]-anulacje azoalkenów w łagodnych warunkach

Tutaj opisujemy metodę wykrywania w czasie rzeczywistym produkcji apoplastycznych reaktywnych form tlenu (ROS) w tkankach ryżu w odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez patogen wywołany wzorcem molekularnym. Ta metoda jest prosta, ustandaryzowana i generuje wysoce powtarzalne wyniki w kontrolowanych warunkach.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym produkcji reaktywnych form tlenu w odpowiedzi immunologicznej ryżu za pomocą testu chemiluminescencyjnego

Ten protokół opisuje nowatorską metodę ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu dihydroetydydy (DHE) jako sondy barwnika fluorescencyjnego przy użyciu wysokoprzepustowego podejścia przesiewowego. W protokole opisano metody oceny ilościowej wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) w trzech różnych liniach komórkowych raka wątrobowokomórkowego.

Wysokoprzepustowa ocena przesiewowa wytwarzania reaktywnych form tlenu (ROS) przy użyciu barwnika fluorescencyjnego Dihydroethidium (DHE)

Poznaj metodę syntezy nanocząstek tlenku ceru do katalitycznego usuwania reaktywnych form tlenu in vivo u roślin Arabidopsis thaliana. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów sygnalizacji i tolerancji na stres.

Katalityczne oczyszczanie roślinnych reaktywnych form tlenu in vivo za pomocą anionowych nanocząstek tlenku ceru

Przeglądaj więcej filmów