Name: Genetyczna inkorporacja biosyntetyzowanej L-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) i jej zastosowanie do koniugacji białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę genetycznej inkorporacji L-Dihydroksyfenyloalaniny (L-DOPA) do białek w celu ich modyfikacji i koniugacji. Technika wykorzystuje biosyntetyczny system w komórkach E. coli DH10 beta, zapewniając wysoką specyficzność i wydajność modyfikacji białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Te badania były wspierane przez Global Frontier Research Program (NRF-2015M3A6A8065833), oraz Basic Science Research Program (2018R1A6A1A03024940) przez National Research Foundation of Korea (NRF) finansowane przez rząd Korei.

1. Budowa plazmidu
<ol>
	<li>Skonstruuj plazmid ekspresyjny (pBAD-dual-TPL-GFP-WT), który wyraża gen TPL z Citrobacter freundii pod kontrolą konstytutywnego promotora i genu białka zielonej fluorescencji (GFP) ze znacznikiem His6 pod kontrolą promotora araBAD. W przypadku pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG zastąp kodon dla miejsca (E90) DOPA kodonem bursztynowym (TAG), stosując protokół mutagenezy skierowanej do miejsca. Szczegóły dotyczące budowy tego plazmidu zostały opisane w naszym poprzednim raporcie18.</li>
	<li>Skonstruuj plazmid eksprymujący tRNA/aaRS (pEVOL-DHPRS2)18,19 w celu genetycznej inkorporacji DOPA. pEVOL to specjalny wektor plazmidowy wykazujący ekspresję dwóch kopii genów aaRS z niezależnymi promotorami, a szczegółowe informacje o plazmidzie opisano w poprzednim raporcie19.</li>
	<li>Użyj dostępnych na rynku zestawów do przygotowania plazmidów, aby uzyskać plazmidowe DNA o wysokiej czystości. Sprawdź czystość przygotowanych DNA, używając elektroforezy w żelu agarozowym, jeśli to konieczne.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury
<ol>
	<li>Elektroporacja
	<ol>
		<li>Do tego eksperymentu użyj elektrokompetentnego szczepu E. coli DH10β. Dodać 1 μl każdego plazmidowego DNA (pEVOL-DHPRS2 i pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) do 20 μl kompetentnych komórek. Wymieszaj je delikatnie, aby uzyskać jednorodną mieszaninę, za pomocą pipety.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę do kuwet do elektroporacji. Umieść kuwetę w komorze elektroporacji. Wepchnij kuwetę do komory, aby mocno zetknąć się z komorą kuwety.</li>
		<li>Wstrząsnij kuwetą, używając 25 μF i 2.5 kV dla kuwet 0.1 cm.</li>
		<li>Dodaj 1 ml podgrzanego super optymalnego bulionu (SOC), zawierającego 2% (w/v) tryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 i 20 mM glukozy do kuwety i przenieś komórki do probówki hodowlanej. Uratować komórki, inkubując je przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.</li>
		<li>Rozprowadź 10 - 100 μl uratowanych komórek na płytce agarowej z bulionu lizogennego (LB) zawierającej 35 μg/ml chloramfenikolu i 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kultury starterowej
	<ol>
		<li>Zaszczepić pojedynczą przekształconą kolonię w 5 ml pożywki LB zawierającej antybiotyki. Inkubować rodzinę przez 12 godzin w temperaturze 37 °C, wytrząsając.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ekspresja i oczyszczanie GFP-E90DOPA przez system biosyntezy
<ol>
	<li>Ekspresja GFP-E90DOPA przez system biosyntezy
	<ol>
		<li>Przenieść kulturę starterową (2 ml) do 100 ml PA-5052 pożywka20 (50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM [NH4]2SO4, 2 mMMgSO4, 0,1% [w/v] metali śladowych, 0,5% [w/v] glicerolu, 0,05% [w/v] glukozy i 5% [w/v] aminokwasów [pH 7,25]) zawierających 35 μg/ml chloramfenikolu, 100 μg/ml ampicyliny, 100 mM pirogronianu, 10 mM katecholu, 25 mM amoniaku i 300 μM ditiotreitolu (DTT), a następnie inkubacja w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.</li>
		<li>Dodać 2 ml 0,2% (w/v) L-arabinozy, gdy gęstość optyczna (OD) przy 550 nm osiągnie 0,8. Inkubować próbkę przez 12 godzin w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 11 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza komórek
	<ol>
		<li>Rozmrozić osad komórkowy na lodzie i ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu do lizy zawierającego 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 10 mM imidazolu i 300 mM NaCl.</li>
		<li>Sonikować zawieszone komórki na lodzie przez 10 minut. Użyj 80% amplitudy sonikacji z impulsem 25 s włączonym i 35 s wyłączonym.</li>
		<li>Odwirowywać lizat komórkowy w temperaturze 18 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki w celu oczyszczenia i wyrzucić osad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia powinowactwa Ni-NTA
	<ol>
		<li>Dodać żywicę Ni-NTA (kwas nitrylotroctowy) (300 μl zawiesiny żywicy na 100 ml hodowli) do supernatantu i związać białka z żywicą Ni-NTA w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając zawiesiną przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę do kolumny polipropylenowej i przemyć żywicę 3x 5 ml buforu płuczącego zawierającego 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 20 mM imidazolu i 300 mM NaCl.</li>
		<li>Eluować białka 3x za pomocą 300 μl buforu elucyjnego zawierającego 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0), 250 mM imidazolu i 300 mM NaCl.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie białka, mierząc absorbancję przy 280 nm. Współczynnik ekstynkcji (24 630 M-1 cm-1) dla GFP-E90DOPA przy 280 nm obliczono za pomocą kalkulatora współczynnika ekstynkcji białka (np. https://web.expasy.org/protparam/), a niezależnie zmierzony współczynnik ekstynkcji (2630 M-1 cm-1) dla DOPA. Jako alternatywną metodę należy użyć testu białkowego Bradforda21 w celu określenia stężenia białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oligomeryzacja oczyszczonego GFP-E90DOPA
<ol>
	<li>Dodać 1 μl periodianu sodu wH2O(6 mM) (1,0 ekwiwalent GFP-E90DOPA) do roztworu 20 μl GFP-E90DOPA (300 μM) w buforze fosforanowym zawierającym 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) i 300 mM NaCl.</li>
	<li>Pozostawić reakcję oligomeryzacji do przebiegu w temperaturze 25 °C przez 48 godzin.</li>
	<li>Analizować mieszaninę reakcyjną za pomocą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu) (SDS-PAGE) zgodnie z opisem w kroku 6.</li>
</ol>
5. Koniugacja GFP-E90DOPA z sondą alkinową przez SPOCQ
<ol>
	<li>Dodać 1 μl azadibenzocykloktyny (Cy5.5-ADIBO) połączonej z Cy5.5 <klasa sup = "xref">22 w H2O (4,0 mM) (10 odpowiednik GFP-E90DOPA) do roztworu 20 μl GFP-E90DOPA (20 μM) w buforze fosforanowym zawierającym 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) i 300 mM NaCl.</li>
	<li>Dodać 1 μl periodianu sodu wH2O(400 μM) (1,0 odpowiednik GFP-E90DOPA) do mieszaniny reakcyjnej.</li>
	<li>Pozostawić reakcję SPOCQ w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Jeśli używana jest sonda światłoczuła, przykryj naczynie reakcyjne folią aluminiową.</li>
</ol>
6. Oczyszczanie oznakowanego GFP
<ol>
	<li>Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną SPOCQ przez dodanie buforu fosforanowego, zawierającego 50 mM Na2HPO4 (pH 8,0) i 300 mM NaCl, do 500 μL.</li>
	<li>Przenieść rozcieńczony roztwór do odśrodkowej kolumny wirowej z filtrem. Odwirować kolumnę wirową o sile 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut i odrzucić przepływ. Powtórz ten krok 3 razy, aby usunąć nadmiar Cy5.5-ADIBO.</li>
	<li>Przenieść oczyszczoną próbkę z kolumny wirowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Alternatywnie, należy przeprowadzić oczyszczanie przez dializę w stosunku do tego samego buforu.</li>
	<li>Oczyszczoną GFP należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Analiza SDS-PAGE i skanowanie żelem fluorescencyjnym
<ol>
	<li>Przygotować próbki białek do analizy SDS-PAGE, dodając 5 μl buforu próbki białka (patrz tabela materiałów) i 2 μl DTT (1,00 M) do 13 μl oczyszczonego lub surowego, znakowanego GFP (13,6 μM lub 0,38 mg/ml). Do analizy oligomerycznej GFP należy użyć wyższego stężenia GFP (67,8 μM lub 1,9 mg/ml). Denaturacja białek poprzez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Umieść kasetę z żelem 4% - 12% Bis-Tris SDS-PAGE (zakupione, gotowe kasety żelowe) do ogniwa elektroforezy i dodaj bufor do pracy (patrz Tabela materiałów). Załadować próbki białek i marker masy cząsteczkowej. Uruchomić elektroforezę na 35 - 40 minut przy napięciu 200 V. 
	UWAGA: Unikaj wystawiania próbek białek na działanie światła, przeprowadzając wszystkie procesy w ciemności, aby zminimalizować fotowybielanie sondy fluorescencyjnej.</li>
	<li>Do obrazowania fluorescencyjnego należy używać skanera fluorescencyjnego. Owiń żel białkowy z elektroforezy i umieść go na skanerze fluorescencyjnym. Zeskanuj żel, używając odpowiedniego ustawienia długości fali. W przypadku Cy5.5 wybierz tryb Cy5 dostępny w oprogramowaniu skanera.</li>
	<li>Zabarwić żel dostępnym w handlu odczynnikiem do barwienia białek.</li>
</ol>
8. Analiza MS MALDI-TOF metodą trawienia trypsyny
<ol>
	<li>Inkubować 100 μl oczyszczonego GFP-E90DOPA (2,2 mg/ml lub 80 μM) w buforze zawierającym 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1% (w/v) SDS i 25 mM DTT w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodać 1 μl jodoacetamidu wH2O(IAA, 4,0 M) (500 ekwiwalent GFP-E90DOPA) do oczyszczonego roztworu GFP-E90DOPA (80 μM) w tym samym buforze. Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 °C przez 30 minut, chroniąc ją przed światłem.</li>
	<li>Trawić próbkę GFP-E90DOPA przez dodanie trypsyny (stosunek proteazy do białka substratu 1:100 [w/w]) i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Oczyścić przetrawioną próbkę peptydu przy użyciu standardowej metody odsalania za pomocą kolumn wirowych C18.</li>
	<li>Analizuj strawione peptydy za pomocą zgłoszonego protokołu spektrometrii mas czasu przelotu desorpcji/jonizacji laserowej wspomaganej matrycą (MALDI-TOF MS) przy użyciu kwasu alfa-cyjano-4-hydroksycynamonowego (CHCA) jako matrycy<klasa sup="xref">23.</li>
</ol>

<ol><li>Nagatsu, T., Levitt, M., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+hydroxylase%3A+The+initial+step+in+norepinephrine+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine hydroxylase: The initial step in norepinephrine biosynthesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 2910-2917 (1964).</li>
<li>Pinder, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+dopamine+derivatives+capable+of+crossing+the+blood-brain+barrier+in+relation+to+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Possible dopamine derivatives capable of crossing the blood-brain barrier in relation to parkinsonism.</a> Nature. 228 (5269), 358(1970).</li>
<li>Waite, J. H., Tanzer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenolic+substance+of+mytilus+edulis%3A+novel+adhesive+containing+L-DOPA+and+hydroxyproline%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polyphenolic substance of mytilus edulis: novel adhesive containing L-DOPA and hydroxyproline.</a> Science. 212 (4498), 1038-1040 (1981).</li>
<li>Lee, H., Scherer, N. F., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanics+of+mussel+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanics of mussel adhesion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 12999-13003 (2006).</li>
<li>Papov, V. V., Diamond, T. V., Biemann, K., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyarginine-containing+polyphenolic+proteins+in+the+adhesive+plaques+of+the+marine+mussel+Mytilus+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydroxyarginine-containing polyphenolic proteins in the adhesive plaques of the marine mussel Mytilus edulis.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (34), 20183-20192 (1995).</li>
<li>Waite, J. H., Qin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphoprotein+from+the+adhesive+pads+of+Mytilus+edulis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polyphosphoprotein from the adhesive pads of Mytilus edulis.</a> Biochemistry. 40 (9), 2887-2893 (2001).</li>
<li>Nicklisch, S. C., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+The+role+of+redox+in+DOPA-mediated+marine+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: The role of redox in DOPA-mediated marine adhesion.</a> Biofouling. 28 (8), 865-877 (2012).</li>
<li>Silverman, H. G., Roberto, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2100433/">Understanding marine mussel adhesion.</a> Marine Biotechnology. 9 (6), 661-681 (2007).</li>
<li>Lee, B. P., Messersmith, P. B., Israelachvili, J. N., Waite, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+adhesives+and+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired adhesives and coatings.</a> Annual Review of Materials Research. 41, 99-132 (2011).</li>
<li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Zhu, J., Lee, Y., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+protein+cross-linking+with+genetically+incorporated+3%2C4-dihydroxy-L-phenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Site-specific protein cross-linking with genetically incorporated 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine.</a> ChemBioChem. 10 (8), 1302-1304 (2009).</li>
<li>Umeda, A., Thibodeux, G. N., Moncivais, K., Jiang, F., Zhang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+approach+to+transform+low-affinity+peptides+into+protein+probes+with+cotranslationally+expressed+chemical+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A versatile approach to transform low-affinity peptides into protein probes with cotranslationally expressed chemical cross-linker.</a> Analytical Biochemistry. 405 (1), 82-88 (2010).</li>
<li>Xu, J., Tack, D., Hughes, R. A., Ellington, A. D., Gray, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+non-canonical+amino+acid+design+to+covalently+crosslink+an+antibody-antigen+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure-based non-canonical amino acid design to covalently crosslink an antibody-antigen complex.</a> Journal of Structural Biology. 185 (2), 215-222 (2014).</li>
<li>Burdine, L., Gillette, T. G., Lin, H. J., Kodadek, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15366882">Periodate-triggered cross-linking of DOPA-containing peptide-protein complexes.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (37), 11442-11443 (2004).</li>
<li>Borrmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+oxidation-controlled+cyclooctyne-1%2C2-quinone+cycloaddition+%28SPOCQ%29+for+fast+and+activatable+protein+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted oxidation-controlled cyclooctyne-1,2-quinone cycloaddition (SPOCQ) for fast and activatable protein conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 257-261 (2015).</li>
<li>Ayyadurai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+selective%2C+sensitive%2C+and+reversible+biosensor+by+the+genetic+incorporation+of+a+metal-binding+site+into+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Development of a selective, sensitive, and reversible biosensor by the genetic incorporation of a metal-binding site into green fluorescent protein.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (29), 6534-6537 (2011).</li>
<li>Kim, B. J., Cheong, H., Hwang, B. H., Cha, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+protein+nanoparticles+containing+iron%28III%29-DOPA+complexes+for+pH-responsive+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired protein nanoparticles containing iron(III)-DOPA complexes for pH-responsive drug delivery.</a> Angewandte Chemie International Edition. 54 (25), 7318-7322 (2015).</li>
<li>Alfonta, L., Zhang, Z., Uryu, S., Loo, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+incorporation+of+a+redox-active+amino+acid+into+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific incorporation of a redox-active amino acid into proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14662-14663 (2003).</li>
<li>Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+L-dihydroxyphenylalanine+%28DOPA%29+biosynthesized+by+a+tyrosine+phenol-lyase%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase.</a> Chemical Communications. 54 (24), 3002-3005 (2018).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, H. J., Kim, D. W., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Gobom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+affinity+sample+preparation.+A+protocol+for+MALDI-MS+peptide+analysis+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid affinity sample preparation. A protocol for MALDI-MS peptide analysis in proteomics.</a> Analytical Chemistry. 73 (3), 434-438 (2001).</li>
<li>Mukai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reproductive+Escherichia+coli+cells+with+no+specific+assignment+to+the+UAG+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon.</a> Scientific Reports. 5, 9699(2015).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomically+recoded+organisms+expand+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genomically recoded organisms expand biological functions.</a> Science. 342 (6156), 357-360 (2013).</li>
<li>Bryson, D. I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29035361">Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases.</a> Nature Chemical Biology. 13 (12), 1253-1260 (2017).</li>
<li>Guo, J., Melancon, C. E., Lee, H. S., Groff, D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+amber+suppressor+tRNAs+for+efficient+bacterial+production+of+proteins+containing+nonnatural+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Evolution of amber suppressor tRNAs for efficient bacterial production of proteins containing nonnatural amino acids.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (48), 9148-9151 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+strategy+for+selective+phosphoserine+incorporation+in+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A facile strategy for selective phosphoserine incorporation in histones.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (22), 5771-5775 (2013).</li>
<li>Neumann, H., Wang, K., Davis, L., Garcia-Alai, M., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+multiple+unnatural+amino+acids+via+evolution+of+a+quadruplet-decoding+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome.</a> Nature. 464 (7287), 441-444 (2010).</li>
<li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+reactions+for+labeling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal reactions for labeling proteins.</a> ACS Chemical Biology. 9 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular Incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opisano biosyntezę i bezpośrednią inkorporację DOPA. Komórka bakteryjna wykorzystana w tej metodzie może zsyntetyzować dodatkowy aminokwas i wykorzystać go jako nienaturalny budulec do syntezy białek. Genetyczna inkorporacja nienaturalnych aminokwasów była kluczową technologią dla rozwoju nienaturalnego organizmu z rozszerzonym kodem genetycznym. Jednak metoda ta jest technicznie niekompletna i jest modyfikowana w celu poprawy wydajności inkorporacji i zminimalizowania zakłóceń w endogennych systemach tra...

DOPA to aminokwas biorący udział w biosyntezie katecholamin u zwierząt i roślin. Aminokwas ten jest syntetyzowany z Tyr przez hydroksylazę tyrozynową i tlen cząsteczkowy (O2)1. Ponieważ DOPA jest prekursorem dopaminy i może przenikać przez barierę krew-mózg, jest stosowany w leczeniu choroby Parkinsona2. DOPA znajduje się również w białkach adhezyjnych małży (MAP), które są odpowiedzialne za właściwości adhezyjne małży w wilgotnych warunkach3,4,5,6,7. Tyr jest początkowo kodowany w miejscach, w których DOPA znajduje się w MAP, a następnie jest przekształcany w DOPA przez tyrozynazy8,9. Ze względu na swoje interesujące właściwości biochemiczne, DOPA jest wykorzystywany w różnych zastosowaniach. Grupa dihydroksylowa DOPA jest chemicznie podatna na utlenianie, a aminokwas łatwo przekształca się w L-dopachinon, prekursor melaniny. Ze względu na wysoką elektrofilowość, L-dopachinon i jego pochodne są używane do sieciowania i koniugacji z tiolami i aminami10,11,12,13. 1,2-chinony mogą również funkcjonować jako den w reakcjach cykloaddycji i były używane do biokoniugacji przez promowaną przez szczep cykloaddycję-1,2-chinonu kontrolowanego utlenianiem (SPOCQ) cykloaddycję14. Ponadto grupa dihydroksylowa może chelatować jony metali, takie jak Fe3+ i Cu2+, a białka zawierające DOPA zostały wykorzystane do dostarczania leków i wykrywania jonów metali15,16.
DOPA została genetycznie włączona do białek za pomocą ortogonalnej pary syntetazy aminoacylo-tRNA (aa-tRNA) i aminoacylo-tRNA (aaRS) class<="xref">17 i używana do koniugacji białek i sieciowania10,11,12,13. W niniejszym raporcie opisano wyniki eksperymentalne i protokoły genetycznej inkorporacji biosyntetyzowanej DOPA z tanich materiałów wyjściowych oraz jej zastosowania do biokoniugacji. DOPA jest biosyntetyzowany przy użyciu TPL, zaczynając od katecholu, pirogronianu i amoniaku w Escherichia coli. Biosyntetyzowany DOPA jest bezpośrednio włączony do białek poprzez ekspresję wyewoluowanej pary aa-tRNA i aaRS dla DOPA. Ponadto biosyntetyzowane białko zawierające DOPA jest swoiście sprzężone z sondą fluorescencyjną i usieciowane w celu wytworzenia oligomerów białkowych. Protokół ten będzie przydatny dla naukowców zajmujących się białkami, do biosyntezy zmutowanych białek zawierających DOPA i koniugacji białek z sondami biochemicznymi lub lekami do zastosowań przemysłowych i farmaceutycznych.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Konstrukcja plazmidu</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plazmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG</td><td></td><td></td><td>opcjonalnie zawiera bursztynowy kodon stop (TAG) w żądanej pozycji. Ko, W. i wsp. Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez promowaną szczepem cykloaddycję azydowo-alkinową. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>Plazmid pEvol-DHPRS2</td><td></td><td></td><td>1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. i Schultz, P. G. Ulepszony system do nienaturalnej mutagenezy aminokwasów w E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, SC, Lee, HS Genetyczne włączenie l-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) biosyntetyzowanej przez liazę fenolową tyrozyny. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).</td></tr><tr><td>DH10 i wersja beta;</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression Host</td></tr><tr><td>Plasmid Mini-zestaw przygotowawczy</td><td>Nukleogen</td><td>5112</td><td>200 / opakowanie</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Rosół</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500 g</td></tr><tr><td>2. Przygotowanie hodowli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1) Elektroporacja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro pulser&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta mikropulsacyjna</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0,1 cm odstęp między elektrodami, opakowanie 50</td></tr><tr><td>sztuk Ampicylina Sód</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC podłoże</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 ml</td></tr><tr><td><silny>3. Ekspresja i oczyszczanie GFP-E90DOPA przez system biosyntetyczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.1 Ekspresja GFP-E90DOPA przez system biosyntetyczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L(+)-arabinoza, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Pyrocatechol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1387</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Siarczan amonu, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0943</td><td>500 gramów</td></tr><tr><td>kwas pirogronowy, 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13875</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy, bezwodny, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0891</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fosforan potasu, jednozasadowy, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1127</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu, bezwodny, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>M0146</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>D(+)-Glukoza, bezwodna, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>D0092</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Glicerol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0269</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Mieszanka metali śladowych a5 z co</td><td>Sigma</td><td>92949</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>L-prolina, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1257</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-fenyloalanina, 98,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1982</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-tryptofan</td><td>JUNSEI</td><td>49550-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-arginina, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1149</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-glutamina, 98%</td><td>JUNSEI</td><td>27340-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Asparagina jednowodna, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1198</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>JUNSEI</td><td>73190-0410</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Chlorowodorek L-histydyny jednowodny, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0604</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-treonina, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T2938</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Glicyna, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0286</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>G0233</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-alanina, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1543</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-izoleucyna, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I1049</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-walina, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>V0088</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-seryna</td><td>SAMCHUN</td><td>S2447</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>SAMCHUN</td><td>A1205</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Monochlorowodorek L-lizyny, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>L0592</td><td>25 g</td></tr><tr><td>3.2 Liza komórek</silna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Chlorek sodu, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Procesor ultradźwiękowy - 150 mikrolitrów do 150 mililitrów</td><td>SONIC & MATERIAŁY</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>3.3 Chromatografia powinowactwa Ni-NTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>Kolumna polipropylenowa</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50 / opakowanie, pojemność 1</td></tr> <tr><td>mL <mocny>4. Oligomeryzacja oczyszczonego GFP-E90DOPA&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Periodynian sodu, 99,8&</td><td>Acros</td><td>419610050</td><td>5 g</td></tr><tr><td><mocny>5. Sprzężenie GFP-E90DOPA z sondą alkinową za pomocą cyklooktyny kontrolowanej utlenianiem promowanej szczepem&ndash; Cykloaddycja 1,2-chinonu (SPOCQ)&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1mg</td></tr><tr><td><silny>6. Oczyszczanie znakowanych filtrów odśrodkowych GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 ml</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96 / opakowanie, pojemność 500ul</td></tr> <tr><td><mocny>7. SDS-PAGE Analiza i skanowanie żelem fluorescencyjnym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-treitol, DTT, 99,5 %</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor do próbek, 4X</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>bufor do biegania MES</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% żele SDS PAGE</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12 well</td></tr><tr><td>Coomassie Błękit brylantowy R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>G:BOX Chemi Fluorescent & System obrazowania chemiluminescencyjnego</td><td>Syngene</td><td></td><td>G BOX Chemi XT4</td></tr><tr><td>8. Analiza MALDI-Tof MS metodą trawienia trypsyny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8.1 Przygotowanie strawionej próbki peptydu przez trawienie trypsyną</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kwas solny, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu dodecylu, 85%</td><td>SAMCHUN</td><td>D1070</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Proteaza trypsynowa, MS Grade</td><td>Thermofisher</td><td>90057</td><td>5 x 20 &mikro; g / pakiet</td></tr><tr><td>Kolumny wirujące C-18</td><td>Thermofisher</td><td>89870</td><td>25 / opakowanie, 200 i mikro; L pojemność</td></tr><tr><td><silny>8,2 Analiza strawionego peptydu za pomocą MALDI-TOF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitirile, 99,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0125</td><td>500 ml</td></tr> <tr><td>i kwas alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy</td><td>Sigma</td><td>C2020</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1666</td><td>100 g</td></tr><tr><td>MTP 384 tarcza celownicza szlifowane stalowe tarcze BC</td><td>Spektrometr masowy Bruker</td><td>8280784</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genetyczna inkorporacja biosyntetyzowanej l-dihydroksyfenyloalaniny (dopa) i jej zastosowanie do koniugacji białek

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

L-dihydroksyfenyloalanina (DOPA) to aminokwas występujący w biosyntezie katecholamin u zwierząt i roślin. Ze względu na swoje szczególne właściwości biochemiczne aminokwas ten ma wiele zastosowań w zastosowaniach biochemicznych. Niniejszy raport opisuje protokół genetycznej inkorporacji biosyntetyzowanego DOPA i jego zastosowania do koniugacji białek. DOPA jest biosyntetyzowany przez liazę fenolową tyrozynową (TPL) z katecholu, pirogronianu i amoniaku, a aminokwas jest bezpośrednio wprowadzany do białek metodą inkorporacji genetycznej przy użyciu wyewoluowanej pary syntetazy aminoacylo-tRNA i aminoacylo-tRNA. Ten system bezpośredniej inkorporacji skutecznie integruje DOPA z niewielką inkorporacją innych naturalnych aminokwasów i z lepszą wydajnością białka niż poprzedni system inkorporacji genetycznej dla DOPA. Koniugacja białek z białkami zawierającymi DOPA jest wydajna i specyficzna dla danego miejsca oraz wykazuje swoją przydatność w różnych zastosowaniach. Protokół ten zapewnia naukowcom zajmującym się białkami szczegółowe procedury wydajnej biosyntezy zmutowanych białek zawierających DOPA w pożądanych miejscach i ich koniugacji do zastosowań przemysłowych i farmaceutycznych.

System ekspresyjny do bezpośredniej inkorporacji DOPA biosyntetyzowanej z TPL przedstawiono na Rysunku 1. Geny dla ewoluowanej pary aa-tRNA i aaRS umieszczono w plazmidzie, a gen GFP (GFP-E90TAG) zawierający kodon bursztynowy w pozycji 90 znajduje się w innym plazmidzie, aby ocenić inkorporację DOPA za pomocą fluorescencji GFP. Gen TPL umieszczono w tym samym plazmidzie ekspresyjnym co gen GFP i jest on wyrażany konstytutywnie, aby zmaksymalizować wydajność b...

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej inkorporacji L-dihydroksyfenyloalaniny zsyntetyzowanej z prostych materiałów wyjściowych i jej zastosowania do koniugacji białek.

Genetyczna inkorporacja biosyntetyzowanej L-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) i jej zastosowanie do koniugacji białek

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii chemicznej, takie jak modyfikacja białek, koniugacja i system biosyntezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że L-DOPA może być cytowana konkretnie i skutecznie wprowadzając białka Tyr za pomocą systemu biosyntezy. Po skonstruowaniu plazmidu ekspresyjnego należy umieścić elektrokompetentne komórki szczepu beta E.coli DH10 do tej procedury.Dodaj jeden mikrolitr każdego plazmidowego DNA do 20 mikrolitrów kompetentnych komórek. Użyj pipety, aby delikatnie wymieszać. Przenieś tę mieszaninę do kuwet do elektroporacji o średnicy 0,1 centymetra.Umieść napełnioną kuwetę w komorze elektroporacji, upewniając się, że komora kuwety mocno się styka. Wstrząs w kuwecie przy 25 mikrofaradach i 2.4 kilowoltach. Następnie dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej pożywki SOC.Przenieś komórki do probówki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z potrząsaniem, aby uratować komórki. Rozprowadź od 10 do 100 mikrolitrów uratowanych komórek na płytce agarowej z bulionu lizogenicznego, która zawiera 35 mikrogramów na mililitr chloramfenikolu i 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.Inkubować w tempera

genetic-incorporation-biosynthesized-l-dihydroxyphenylalanine-dopa

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj przedstawiono procedurę selektywnej aktywacji białka neuronalnego za pomocą krótkiego impulsu światła poprzez genetyczne kodowanie fotoreaktywnego nienaturalnego aminokwasu do docelowego białka neuronalnego wyrażanego w neuronach w hodowli lub in vivo.

Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Rozszerzenie kodu genetycznego służy jako potężne narzędzie do badania szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym acetylacji białek. Tutaj demonstrujemy prosty protokół wykorzystania tej techniki do generowania jednorodnie acetylowanych białek w określonych miejscach w komórkach Escherichia coli.

Łatwy protokół do generowania specyficznie specyficznych dla miejsca acetylowanych białek w Escherichia coli

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Włączenie pochodnej cyklopropenu lizyny do przeciwciał pozwala na specyficzne dla miejsca, szybkie i efektywne połączenie cząsteczek zawierających tetrazynę w celu wytworzenia koniugatów przeciwciało-lek.

Kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej

Przedstawiono prosty protokół funkcjonalizacji powierzchni nanodiamentów za pomocą polidopaminy.

Inspirowana biologicznie polidopaminowa modyfikacja powierzchni nanodiamentów i redukcja nanocząstek srebra

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Rozszerzenie kodu genetycznego jest stosowane do wprowadzenia nienaturalnego aminokwasu posiadającego biorthogonalną grupę funkcyjną na białku nośnikowym w określonym miejscu. Funkcja biortogalna jest dalej wykorzystywana do selektywnego sprzęgania antygenu węglowodanowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem.

Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych

Aby przezwyciężyć ograniczenia klasycznej mutagenezy ukierunkowanej, analogi proliny ze specyficznymi modyfikacjami zostały włączone do kilku białek fluorescencyjnych. Pokazujemy, jak zastąpienie wodoru przez fluor lub pojedynczego przez wiązania podwójne w resztach proliny ("chirurgia molekularna") wpływa na podstawowe właściwości białek, w tym ich fałdowanie i interakcję ze światłem.

Specyficzna dla reszty wymiana proliny przez analogi proliny w białkach fluorescencyjnych: jak "chirurgia molekularna" kręgosłupa wpływa na fałdowanie i stabilność

Poznaj metodę genetycznej inkorporacji L-Dihydroksyfenyloalaniny (L-DOPA) do białek w celu ich modyfikacji i koniugacji. Technika wykorzystuje biosyntetyczny system w komórkach E. coli DH10 beta, zapewniając wysoką specyficzność i wydajność modyfikacji białkowych.

Genetyczna inkorporacja biosyntetyzowanej L-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) i jej zastosowanie do koniugacji białek

Przeglądaj więcej filmów