Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów i energetyki transportu białek przez błony chloroplastowe, a także lokalizacji białek w plastydach. Główną zaletą tej techniki celowania w białka tylakoidowe jest to, że pozwala ona na pełną kontrolę środowiska tylakoidu podczas transportu, w tym temperatury, pH, warunków jonowych i stężeń prekursorów. Zacznij od namoczenia około 55 gramów groszku w 400 mililitrach wody destylowanej przez trzy godziny.

Zasiej namoczony groszek na plastikowej tacy w glebie, pokrytej cienką warstwą wermikulitu i rosnąć przez dziewięć do 15 dni, jak opisano w protokole tekstowym. W dniu izolacji chloroplastów należy przygotować ciągły gradient gęstości, odwirowując mieszaninę 15 mililitrów Percollu i 15 mililitrów buforu 2xGB w 15-mililitrowej probówce wirówkowej z poliwęglanu o dużej prędkości przy 30, 900 gs w wirniku o stałym kącie przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza przy wyłączonym hamulcu. Następnie zbierz około 25 gramów od dziewięciu do 15 dni pędów grochu.

Dodaj je do 95 mililitrów zimnego buforu 1xGB w schłodzonym blenderze, z zaostrzonymi ostrzami. I homogenizować. Przefiltrować tę mieszaninę przez co najmniej dwie warstwy gazy serowej, umieszczonej w lejku nad schłodzoną zlewką.

Odwirować filtrat za pomocą 15-mililitrowej probówki wirówkowej z poliwęglanu w wahadłowym wirniku kubełkowym o masie 3 000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzuć supernatant i za pomocą pędzla delikatnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 1 x GB. Następnie użyj szklanej pipety do ustawiania ciała, aby ostrożnie nałożyć zawieszenie sita na gradient Percoll.

Odwiruj go w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 8 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy wyłączonym hamulcu. Ponownie za pomocą pipety do pomiaru postawy ostrożnie przenieś dolny zielony pasek zawierający nienaruszone chloroplasty do świeżej 50-mililitrowej probówki z poliwęglanu i dodaj 30 mililitrów buforu 1xIB. Odwirować probówkę w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 1 800 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po wyrzuceniu supernatantu delikatnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze 1xIB za pomocą pędzla. Przemyć 30 mililitrów 1xIB i ponownie odwirować w tych samych warunkach. Zawiesić osad po końcowym odwirowaniu w jednym mililitrze 1xIB.

Aby określić stężenie chlorofilu, wymieszaj 10 mikrolitrów całkowicie zawieszonych chloroplastów z pięcioma mililitrami 80% acetonu. Przefiltrować przez bibułę filtracyjną o grubości 180 mikrometrów z porami o wielkości 11 mikrometrów, a następnie określić stężenie chlorofilu za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć mieszaninę chloroplastów do jednego miligrama na mililitr za pomocą zimnego 1xIB.

Aby rozpocząć izolację tylakoidów, gdy ekstrakt zrębu nie jest konieczny, taki jak transport cpTat, odwiruj nienaruszone chloroplasty w 1,5-mililitrowych probówkach w wahadłowym wirniku kubełkowym przy 1,000 g w czterech stopniach Celsjusza przez sześć minut. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w hipotonicznym buforze do lizy, aby uzyskać jeden miligram na mililitr za pomocą mikropipety. Inkubować na lodzie w ciemności z okazjonalnym mieszaniem przez 10 minut.

Aby odzyskać tylokoidy, odwiruj w wahadłowym wirniku kubełkowym o temperaturze 3 200 g w czterech stopniach Celsjusza przez osiem minut. Umyj tylokoidy dwukrotnie, ponownie zawieszając osad jednym do dwóch mililitrów buforu do lizy, a następnie odwirowując w tych samych warunkach. Po końcowym odwirowaniu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu 1xIB i oznaczyć stężenie chlorofilu w izolowanych tylokoidach za pomocą spektrofotometru, jak wykazano wcześniej.

W przypadku ścieżek, które wymagają odzyskiwania ekstraktu zrębu, takich jak CPSec1 i CPSRP, należy skroplić 600 mikrolitrów wyizolowanych chloroplastów w wahadłowym wirniku kubełkowym i odwirować w temperaturze 1 000 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W celu lizy chloroplastów zawieszamy osad z 600 mikrolitrami hipotonicznego buforu do lizy. Inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut, od czasu do czasu mieszając.

Następnie odwirować probówki w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 3,200 g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby uratować zrąb, przenieś jasnozielony do żółtego supernatant do nowej probówki mikrowirówki i dodaj równą objętość 2x surowego buforu zrębu. Aby umyć tylokoidy, dodać dwie objętości buforu do lizy i odwirować w stężeniu 3 200 g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zawiesić osad w 1xIB, aby osiągnąć stężenie chlorofilu wynoszące jeden miligram na mililitr i odłożyć na lód do późniejszego wykorzystania w testach transportowych. Usunąć resztki błon z zrębu surowego przez odwirowanie rozcieńczonego zrębu surowego w wirniku o stałym kącie nachylenia pod kątem 42 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zbierz 95% objętości z każdej tuby, uważając, aby nie naruszyć małego żółto-zielonego granulki, jednocześnie zwracając uwagę na objętość pobraną z każdej tuby.

Aby przygotować skoncentrowany ekstrakt zrębu, należy połączyć zebrane supernatanty. Następnie użyj czteromililitrowego koncentratora o masie cząsteczkowej 30 kilodaltonów, aby pięciokrotnie zagęścić ekstrakt. Aby oznaczyć transport cpTat w 1,5-mililitrowej probówce na lodzie, wymieszaj izolowane tylokoidy do końcowego stężenia chlorofilu 0,33 miligrama na mililitr, pięć milimolowych ATP przygotowanych w 1xIB i osiem milimolowych DTT przygotowanych w 1xIB.

Aby zainicjować transport, należy wprowadzić białko substratowe do mieszanki transportowej. Reakcję należy przeprowadzić, oświetlając zawiesinę promieniowaniem fotosyntetycznie aktywnym w temperaturze od 80 do 100 mikroeinsteinów na metr kwadratowy na sekundę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać reakcję transportu, należy rozcieńczyć zawiesinę ośmiokrotnie lodowatym roztworem 1xIB.

Wirować w temperaturze 3 200 g w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby odzyskać tylokoidy. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 120 mikrolitrach lodowatego zimnego 1xIB. Aby oznaczyć ścieżki CPSec1 lub PSRP, wymieszaj następujące elementy w 1,5-mililitrowej probówce na lodzie.

Tylakoidy do końcowego stężenia chlorofilu 0,33 miligrama na mililitr, 0,83 miligrama na mililitr ekwiwalentu chlorofilu ekstraktu zrębu i pięciu milimolowych ATP przygotowanych w 1xIB. Doprowadź reakcję do pożądanej objętości za pomocą lodowatego lodu 1xIB i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Aby zainicjować transport, należy wprowadzić 10% objętości białka substratowego do tej mieszanki transportowej.

Oświetlać promieniowaniem fotosyntetycznym aktywnym z prędkością od 80 do 100 mikroeinsteinów na metr kwadratowy na sekundę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać reakcję, rozcieńczyć zawiesinę ośmiokrotnie lodowatym 1xIB. Wirować przy 3 200 g w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 120 mikrolitrach lodowatego zimnego 1xIB. Aby usunąć resztki substratu, który nie został przetransportowany, trawić białko zewnętrzne, dodając sześć mikrolitrów po dwa miligramy na mililitr termolizyny i 10 milimolowy chlorek wapnia w 1xIB. Inkubuj tę reakcję proteazy na lodzie przez 40 minut.

Ugasić proteazę, podwajając objętość za pomocą 25-milimolowego EDTA w 1xIB. Wirować w temperaturze 3 200 g w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby odzyskać tylokoidy. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś odzyskane tylokoidy w 120 mikrolitrach pięciu milimolowych EDTA w 1xIB i przenieś do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Po ponownym odwirowaniu w temperaturze 3,200 g w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu do próbek laemmli, uzupełnionego 10-milimolowym EDTA. Umieścić próbki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Przejdź do analizy próbek według strony SDS.

Transport białka iOE17 przez szlak cpTat spowodował przesunięcie wielkości o dwa do trzech kilodaltonów między wprowadzonym substratem a dojrzałą przetworzoną formą. Wynika to z rozszczepienia peptydu sygnałowego końca n, co wskazuje na udany transport cpTat. Zabieg termolizyny pozostawia tylko pomyślnie przetransportowane, a tym samym odporne na proteus dojrzałe pasmo.

Transport prekursora OE33 przez szlak CPSec1 spowodował zmianę wielkości dojrzałego substratu i ochronę proteuszową transportowanego substratu. Wprowadzenie prekursora LHCP do błony tylokoidalnej za pośrednictwem szlaku cpSRP, ocenianego za pomocą trawienia termolizyną, doprowadziło do zmiany wielkości o 1,5 do dwóch kilodaltonów. Wskazywało to na udane wprowadzenie błony, ponieważ błona chroni nierozszczepiony dojrzały produkt degradacji LHCP przed całkowitą proteolizą.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować tylokoidy i oznaczać przemieszczenie za pomocą zależnych od energii szlaków cpTat, cpSec 1 i cpSRP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Chociaż nie zostało to zilustrowane w tym filmie, zazwyczaj wyłączamy górne światła w laboratorium podczas izolowania i pracy z fotosyntetycznie aktywnymi chloroplastami i tylakoidami.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać izolowane chloroplasty i tylakoidy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pamiętaj, aby na początku delikatnie zawiesić chloroplasty. Unikaj zakłócania gradientu Procoll po pierwszym etapie wirowania.

Dodatkowo, procentowa próbka wejściowa może być przygotowana równolegle z reakcjami transportu i przebiegać na tym samym żelu w celu oszacowania transportu substratu. Nie zapominaj, że praca z podłożami radioaktywnymi wymaga sumiennego obchodzenia się z nimi i stosowania odpowiednich środków ochrony osobistej. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się celowaniem w białka do zbadania energetyki, kinetyki i unikalnych mechanizmów rządzących transportem białek przez błony tylakoidów.