Name: Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów z chloroplastów grochu oraz testy transportu białek zależne od energii. Protokół umożliwia kontrolę warunków eksperymentalnych w badaniach biologii roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt został przygotowany dzięki finansowaniu przez Wydział Nauk Chemicznych, Nauk o Ziemi i Nauk Biologicznych, 408 Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych Departamentu Energii USA poprzez Grant DE-SC0017035

1. Materiały początkowe
<ol>
	<li>Namocz około 55 g grochu przez 3 godziny w 400 ml wody destylowanej, a następnie wysiej na plastikowej tacy (35 cm x 20 cm x 6 cm) w glebie pokrytej cienką warstwą wermikulitu.</li>
	<li>Hodować tacę z groszkiem w temperaturze 20 °C w cyklu 12/12 godzin światła/ciemności (50 μE/m2s) przez 9 do 15 dni.</li>
	<li>Przygotować substrat białkowy zgodnie z preferowaną metodą. 
	Uwaga: Przygotowaliśmy substraty białkowe przy użyciu różnych metod, w tym 1) transkrypcji in vitro z oczyszczonych plazmidów, a następnie translacji przy użyciu ekstraktów z kiełków pszenicy lub lizatów retikulocytów królika w obecności [3H]-leucyny lub [35S]-metioniny, 2) translacji in vitro przy użyciu sprzężonego zestawu do transkrypcji/translacji, takiego jak zestawy TnT firmy Promega, z radioznakowaniem jak powyżej, oraz 3) oczyszczanie z nadekspresji białka w E. coli. Radioaktywne produkty translacji in vitro są zazwyczaj schładzane zimnym aminokwasem o stężeniu 50 mM przed użyciem w reakcjach transportowych. Każda z tych metod zazwyczaj wymaga pewnej optymalizacji dla każdego nowego substratu białkowego. Przykład sprzężonego systemu in vitro można znaleźć w Ling and Jarvis (2016)9.</li>
</ol>
2. Izolacja i kwantyfikacja chloroplastów
Uwaga: Pierwszym krokiem w przygotowaniu tylakoidów jest izolacja nienaruszonych chloroplastów10. Podczas przygotowania wszystkie materiały powinny być przechowywane w chłodzie. Z ponownym wywieszeniem chloroplastów należy obchodzić się delikatnie, ponieważ pęknięcie na tym etapie może poważnie ograniczyć późniejszą wydajność tylakoidów.
<ol>
	<li>Wcześniej przygotuj następujące rozwiązania.
	<ol>
		<li>2x Bufor mielący (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7,3, 660 mM sorbitol, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2% BSA.</li>
		<li>2x bufor importowy (2xIB): 100 mM K-Tricine lub K-HEPES pH 8,0, 660 mM sorbitol, 8 mM MgCl2, 
		Uwaga: Stężenia MgCl2 w zakresie od 3 mM do 10 mM zostały użyte bez zauważalnych różnic.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować ciągły gradient gęstości przez odwirowanie mieszaniny 15 ml Percollu i 15 ml 2 x GB przy 30 900 g w wirniku o stałym kącie przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy wyłączonym hamulcu.</li>
	<li>Zbierz około 25 g 9-15-dniowego groszku i homogenizuj w 95 ml 1xGB. Z powodzeniem użyto blendera z zaostrzonymi ostrzami lub Polytrona. Przefiltruj tę mieszaninę przez co najmniej 2 warstwy Miracloth w lejku. 
	Uwaga: Ograniczenie ilości tkanki macierzystej nie jest konieczne, ale może ułatwić proces homogenizacji, zmniejszając w ten sposób pękanie chloroplastów, które może wystąpić przy długotrwałym mieszaniu.</li>
	<li>Granulat o masie 3 000 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 5 minut w temperaturze 4 °C i delikatnie ponownie zawiesić w 1 ml 1 x GB. Pędzel może być najdelikatniejszą techniką ponownego zawieszenia.</li>
	<li>Ostrożnie ułóż zieloną zawiesinę na wierzchu gradientu Percoll i odwiruj przy 8 000 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy wyłączonym hamulcu.</li>
	<li>Ostrożnie zbierz dolny zielony pasek zawierający nienaruszone chloroplasty do świeżej probówki. Odzyskane nienaruszone chloroplasty należy odwirować w temperaturze 1 800 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 5 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad w 1xIB. Powtórzyć ten etap płukania jeszcze raz, ponownie zawieszając za każdym razem w 30 ml 1xIB, z końcowym ponownym zawieszeniem w 1 ml 1xIB.</li>
	<li>Aby określić ilościowo zawartość chlorofilu (Chl), należy zmieszać 10 μl całkowicie zawieszonych chloroplastów z 5 ml 80% acetonu i przefiltrować przez bibułę filtracyjną Whatman 1 (grubość nominalna 180 μm). Zapisać absorbancję przy 720 nm, 663 nm i 645 nm w spektrofotometrze i obliczyć stężenie Chl za pomocą następującego wzoru11: 
	[Chl] mg/ml = [40,2*(A663 – A720) + 101,4*(A645 – A720)]*0,1</li>
	<li>Dostosuj chloroplasty do 1 mg/ml ekwiwalentu Chl za pomocą 1xIB.</li>
</ol>
3. Izolacja tylakoidów
Uwaga: Tylakoidy są przygotowywane przez hipotoniczną lizę nienaruszonych chloroplastów. Osiąga się to poprzez wystawienie chloroplastów na działanie hipotonicznego buforu pozbawionego sorbitolu. Wyizolowane tylakoidy mogą być używane do oznaczania dowolnego szlaku translokacji, ale ekstrakt zrębu (SE) musi być również wyizolowany podczas tego przygotowania, jeśli mają być badane szlaki cpSec1 lub cpSRP.
<ol>
	<li>Przygotuj z wyprzedzeniem następujące rozwiązania.
	<ol>
		<li>Hipotoniczny bufor do lizy: 50 mM K-tricine lub K-HEPES pH 8,0, 8 mM MgCl2.</li>
		<li>2x Surowy bufor zrębu (do stężenia SE): 100 mM K-HEPES pH 8,0, 660 mM sorbitolu, 8 mM MgCl2.</li>
		<li>Bufor do próbek Laemmli (dla SDS-PAGE, uzupełniony o EDTA): 125 mM Tris pH 6,8, 10% SDS, 20% glicerol, 0,05 mg/ml błękitu bromofenolowego, 10% β-merkaptoetanol, 10 mM EDTA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeżeli odzysk SE nie jest konieczny, należy odwirować nienaruszone chloroplasty o masie 1 000 g w obrotowym wirniku kubełkowym przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić do 1 mg/ml w hipotonicznym buforze do lizy. Inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut, od czasu do czasu mieszając.</li>
		<li>Tylakoidy należy odzyskać przez odwirowanie z stężeniem 3 200 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Tylakoidy należy przemyć dwukrotnie, za każdym razem ponownie dodając 1 do 2 ml buforu do lizy. Zawiesić ponownie za pomocą 1 ml 1xIB i ponownie określić ilościowo Chl jak powyżej w protokole izolacji chloroplastów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie i koncentracja ekstraktu zrębu
<ol>
	<li>Jeśli konieczne jest odzysk SE, podzielić nienaruszone chloroplasty na 600 μl podwielokrotności w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i odwirować każdą probówkę przy 1 000 g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 6 minut w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Ta objętość jest wygodna w przypadku korzystania z probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, co pomaga zapobiec zakłóceniu ewentualnego osadu w przypadku resztek membran.
	<ol>
		<li>Zawiesić do 1 mg/ml Chl w hipotonicznym buforze do lizy i inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut, jak w kroku 3.2.1.</li>
		<li>Odwirować każdą probówkę o masie 3 200 x g w obracającym się wirniku kubełkowym przez 8 minut w temperaturze 4 °C i przenieść jasnozielony lub żółty supernatant po lizie chloroplastów do nowej probówki mikrowirówkowej o równej objętości 2x surowego buforu zrębu.</li>
		<li>Przemyć tylakoidy 2 objętościami buforu do lizy (w przybliżeniu 0,5 mg/ml) i zebrać przez odwirowanie w stężeniu 3 200 g w obrotowym wirniku kubełkowym przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić do 1 mg/ml Chl w 1xIB na lodzie.</li>
		<li>Wirować zrąb surowy o masie 42 000 g w wirniku o stałym kącie przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek membran. Immunoblotting dla białek otoczki zewnętrznej i wewnętrznej może być stosowany do weryfikacji czystości supernatantu.</li>
		<li>Zbierz 95% objętości z każdej tuby, nie naruszając małego żółto-zielonego granulatu. Zwróć uwagę na objętość pobraną z każdej probówki.</li>
		<li>Aby przygotować skoncentrowany ekstrakt zrębu (SE), zebrać zebrane supernatanty i zagęścić pięciokrotnie za pomocą koncentratora MWCO o pojemności 4 ml 30 kDa. 
		Uwaga: SE przygotowany w ten sposób jest równoważny zrębowi pochodzącemu z chloroplastów w stężeniu 2,5 mg/ml Chl. W razie potrzeby SE można zagęścić dziesięciokrotnie do 5 mg/ml ekwiwalentu Chl. SE będzie miał złoty kolor i lepkość. W laboratoryjnej wirówce Legend RT z wahliwym wirnikiem kubełkowym wymaga to około 10 minut na ml koncentratu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Transport przez ścieżkę cpTat
Uwaga: W przeciwieństwie do cpSec1 lub cpSRP, ścieżka cpTat nie wymaga rozpuszczalnych składników ani egzogenicznie dodanych źródeł energii; potrzebna jest tylko siła napędowa protonów napędzana światłem3. Dlatego do testu wymagane są tylko wyizolowane tylakoidy i białko substratowe. Typowymi substratami są pośrednie formy podjednostek 17 kDa (jak pokazano na rysunku 1) i 23 kDa kompleksu wydzielającego tlen, odpowiednio iOE17 i iOE23, ale formy prekursorowe, prOE17 i prOE23, mogą być również z powodzeniem transportowane. Formy prekursorowe mają całą dwudzielną N-końcową sekwencję celowania, podczas gdy formy pośrednie mają tylko sekwencję celującą w tylakoidy.
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę transportową cpTat z 0,33 mg/ml tylakoidów Chl, 5 mM ATP z bulionu przygotowanego w 1xIB i 8 mM ditiotreitolu (DTT) z podkładu przygotowanego w 1xIB, na lodzie. ATP nie jest ściśle wymagane do tej reakcji, jeśli jest prowadzona w oświetleniu.</li>
	<li>Rozpocznij transport, wprowadzając białko substratowe w proporcji 1:30 objętościowo do mieszanki transportowej. Jeżeli białko substratowe nie jest przygotowane w 1xIB, należy przygotować rozcieńczenie 1:1 z 2xIB, a następnie użyć 1:30 objętościowo rozcieńczonego substratu w mieszance transportowej. 
	Uwaga: Stężenia podłoża będą się różnić w zależności od metody przygotowania. Zazwyczaj preparaty in vitro pozwolą na ilości nanomolowe do mikromolowych, podczas gdy nadekspresja pozwoli na ilości mikromolowe do milimolowych. Należy również wziąć pod uwagę metody wykrywania, ponieważ autoradiografia i fluorografia są bardziej czułe niż immunoblotting.</li>
	<li>Oświetlać zawiesinę w 80 - 100 μE/m2s promieniowania fotosyntetycznie aktywnego (PAR) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli wymagana jest kinetyka transportu, należy wstępnie zrównoważyć zarówno tylakoidy, jak i mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej i oświetlać przez maksymalnie 30 minut.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję transportu za pomocą 8-krotnego rozcieńczenia lodowatego 1xIB i odzyskać tylakoidy przez odwirowanie w stężeniu 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć resztki substratu, który nie został przetransportowany, ponownie zawiesić osad tylakoidu w 120 μl 1xIB i strawić białko zewnętrzne przez dodanie 6 μl 2 mg/ml termolizyny i 10 mM CaCl2 w 1xIB.</li>
	<li>Inkubować reakcję proteazy na lodzie przez 40 minut, a następnie wygasić proteazę, podwajając objętość za pomocą 25 mM EDTA przygotowanego w 1xIB.</li>
	<li>Odzyskać tylakoidy przez odwirowanie z stężeniem 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskane tylakoidy przemyć w 120 μl 5 mM EDTA w 1xIB i przenieść do nowej probówki.</li>
	<li>Odwirować przy 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w odpowiedniej objętości bufor próbki Laemmli uzupełniony 10 mM EDTA. Objętość 40 μl jest zwykle wystarczająca do wykrycia podłoża na żelu SDS-PAGE i w razie potrzeby zachowuje próbkę do powtórzenia żelu.</li>
	<li>Umieścić próbki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut i przeanalizować za pomocą SDS-PAGE. Autoradiografia, fluorografia lub Western blot białek nienatywnych lub znakowanych epitopami są z powodzeniem stosowane do wykrywania transportowanych białek.</li>
</ol>
6. Transport przez ścieżkę cpSec1
Uwaga: Transport przez translokon cpSec1 wymaga białka zrębu cpSecA112,13, które można uzyskać poprzez nadekspresję w E. coli14,15 lub odzyskane przez zagęszczenie zrębu podczas izolacji tylakoidu. Typowym substratem jest podjednostka 33 kDa kompleksu wydzielającego tlen (prOE33), jak pokazano na rysunku 2.
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę transportową cpSec1 z 0,33 mg/ml tylakoidów Chl, 0,83 mg/ml ekwiwalentu Chl SE lub 1,5 μg rekombinowanego cpSecA1 i 5 mM ATP na lodzie i inkubować przez 10 minut. Typowa mieszanina reakcyjna transportu wynosi tutaj 72 μl, w porównaniu z 60 μl ze względu na dodatek SE.
	<ol>
		<li>Jeśli zamiast SE zostanie użyty rekombinowany cpSecA1, należy dostosować oczyszczony cpSecA1 o równej objętości 2xIB, a następnie rozcieńczyć do dogodnego stężenia, aby dodać do reakcji transportu (np. 0,75 μg/μL). 
		Uwaga: W przypadku długotrwałego przechowywania, cpSecA1 jest przechowywany na lodzie w kontrolowanym, chłodzonym pomieszczeniu po oczyszczeniu, ponieważ zamrażanie znosi aktywność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij transport, wprowadzając do mieszanki transportowej białko substratowe w stosunku 1:10 objętościowo. Jeżeli białko substratowe nie jest przygotowane w 1xIB, należy przygotować rozcieńczenie 1:1 z 2xIB i dodać 1:10 objętościowo rozcieńczonego białka do mieszaniny transportowej.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 80 – 100 μE/m2s PAR. Ponownie, dłuższe czasy mogą być konieczne dla kinetyki lub niektórych substratów.</li>
	<li>Po lekkiej obróbce rozcieńczyć 8-krotnie lodowatym 1xIB i odwirować reakcje przy 3200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Leczyć termolizyną i gasić EDTA, jak powyżej w krokach od 5.5 do 5.7.</li>
	<li>Odwirować przy 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu do próbek Laemmli uzupełnionego 10 mM EDTA. Umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut przed załadowaniem żelu SDS-PAGE.</li>
</ol>
7. Wprowadzanie przez ścieżkę cpSRP
Uwaga: Integracja białek kompleksu zbierającego światło (LHCP) za pośrednictwem cpSRP widoczna na rysunku 3 wymaga cpSRP54, cpSRP43 i cpFtsY16. Składniki te są dostarczane do reakcji transportu poprzez skoncentrowany ekstrakt zrębu, zgodnie z opisem w protokole transportowym cpSec1.
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę transportową cpSRP z 0,33 mg/ml tylakoidów Chl, 0,83 mg/ml ekwiwalentu Chl SE i 5 mM ATP na lodzie i inkubować przez 10 minut.</li>
	<li>Rozpocznij transport, wprowadzając do mieszanki transportowej białko substratowe w stosunku 1:10 objętościowo. Jeżeli białko substratowe nie jest przygotowane w 1xIB, należy przygotować rozcieńczenie 1:1 z 2xIB i dodać 1:10 objętościowo rozcieńczonego białka do mieszaniny transportowej.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 10 minut w 80 – 100 μE/m2s PAR.</li>
	<li>Po lekkiej obróbce rozcieńczyć 8-krotnie lodowatym 1xIB i odwirować reakcje przy 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 120 μl 1xIB.</li>
	<li>Leczyć termolizyną, jak powyżej w sekcjach od 5.5 do 5.7. Trawienie termolizyną jest tutaj konieczne, aby ocenić pomyślną integrację błony. Odzyskane tylakoidy przemyć w 120 μl 5 mM EDTA w 1xIB i przenieść do nowej probówki.</li>
	<li>Odwirować przy 3 200 g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości 2x bufor Laemmli uzupełniony 10 mM EDTA. Umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut przed analizą za pomocą SDS-PAGE. 
	Uwaga: Integracja dojrzałego LHCP (mLHCP) ocenia się na podstawie pojawienia się produktu degradacji chronionego przed proteazą (mLHCP-D) o około 1,5-2 kDa mniejszego niż nienaruszony mLHCP17.</li>
</ol>

<ol><li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+protein+synthesis%3A+principles+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237(1983).</li>
<li>Li, H. -m, Chiu, C. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transport+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li>
<li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li>
<li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li>
<li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDabney-Smith%2C+C+%22Plastid+Biology%22">Plastid Biology</a>. , Springer. 271-289 (2014).</li>
<li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+%26%2334%3Bassisted%26%2334%3B+and+%26%2334%3Bspontaneous%26%2334%3B+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct &#34;assisted&#34; and &#34;spontaneous&#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li>
<li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. hloroP. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChloroP%2C+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li>
<li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP%2C+SignalP+and+related+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953(2007).</li>
<li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717(2016).</li>
<li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLo%2C+SM+%22Photosynthesis+Research+Protocols%22">Photosynthesis Research Protocols</a>. , Springer. 139-157 (2011).</li>
<li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li>
<li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secA+inhibitor%2C+azide%2C+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li>
<li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts%3A+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li>
<li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li>
<li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li>
<li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRP-mediated+protein+targeting%3A+structure+and+function+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Hsp70.+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li>
<li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li>
<li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+%28Tat%29+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li>
<li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li>
<li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li>
<li>Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+FtsY%2C+chloroplast+signal+recognition+particle%2C+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Izolacja chloroplastów i tylakoidów
Nadmierne pękanie może skutkować słabą izolacją chloroplastów, a tym samym słabą wydajnością tylakoidów po oddzieleniu w gradiencie. Najlepiej jest delikatnie homogenizować pobraną tkankę, upewniając się, że cały materiał jest zanurzony przed zmieszaniem i pulsowaniem w cyklach 15 sekund, aż do pełnej homogenizacji. Jeśli to konieczne, użyj wielu krótszych rund mieszania z mniejszą ilością tkanki w każdej rundzie.
Chłodzenie wszystki...

Prawie cała białkowa maszyneria odpowiedzialna za prawidłowe funkcjonowanie chloroplastów musi zostać przeniesiona z cytozolu1. W otoczkach chloroplastowych substraty białkowe są importowane przez translokon błony zewnętrznej (TOC) i translokon błony wewnętrznej (TIC)2. Dalsze ukierunkowanie na błonę tylakoidową i światło odbywa się poprzez bliźniaczą translokację argininy (cpTat)3, wydzielniczą (cpSec1)4, cząstkę rozpoznającą sygnał (cpSRP)5, oraz spontaniczne ścieżki insercji6. Metoda wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych chloroplastów i błon tylakoidów jest niezbędna do pomiaru energii i kinetyki zdarzenia translokacji, zrozumienia różnorodnych mechanizmów transportu w każdym szlaku oraz zlokalizowania określonego substratu białkowego interesującego w dowolnym z sześciu odrębnych przedziałów chloroplastu.
Izolacja membran od chloroplastu zapewnia lepszą eksperymentalną kontrolę nad czynnikami środowiskowymi (takimi jak stężenie soli i substratu, obecność ATP/GTP i warunki pH), które wpływają na pomiar energetyki transportu i kinetyki. To środowisko in vitro nadaje się do badania mechanistycznych szczegółów translokacji z tych samych powodów. Ponadto, podczas gdy oprogramowanie predykcyjne do lokalizacji białek chloroplastowych uległo poprawie7,8, testy transportu in vitro zapewniają szybszą metodę potwierdzenia w porównaniu z testami fluorescencyjnymi opartymi na mikroskopii, które wymagają genetycznie kodowanego znacznika fluorescencyjnego, transformacji rośliny i/lub specyficznych przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy protokoły izolacji chloroplastów i tylakoidów z grochu (Pisum sativum), a także testów transportu zoptymalizowanych dla każdego ze szlaków translokacji tylakoidów zależnych od energii.

<table><tbody><tr><td>Pisum sativum</td><td>nasiona Seedway LLC, Hall, NY</td><td>8686 - Little Marvel</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td><td>475855-1</td><td></td></tr><tr><td>80% Aceton</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Blender z zaostrzonymi ostrzami</td><td>Waring Commercial</td><td>BB155S</td><td></td></tr><tr><td>Polytron 10-35</td><td>Fischer Sci</td><td>13-874-617</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Beckman J2-MC z wirnikiem JA 20</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8043-30-1180</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B z wirnikiem HB-4</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1016</td><td></td></tr><tr><td>100 mM ditiotreitol (DTT) w 1xIB</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>12/3/83</td><td>Może być zamrożony w podwielokrotnościach do wykorzystania w przyszłości</td></tr><tr><td>200 mM MgATP w 1xIB</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>74804-12-9</td><td>Może być zamrożony w podwielokrotnościach do wykorzystania w przyszłości</td></tr><tr><td>Termolizyna w 1xIB (2mg/mL)</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>9073-78-3</td><td>Można zamrozić w podwielokrotnościach do wykorzystania w przyszłości</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K-Tricine</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek manganu</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>13446-34-9</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>B-merkaptoetanol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasty to organelle w roślinach zielonych, odpowiedzialne za przeprowadzanie wielu ważnych szlaków metabolicznych, w szczególności fotosyntezy. W obrębie chloroplastów system błon tylakoidowych zawiera wszystkie pigmenty fotosyntetyczne, kompleksy centrum reakcji i większość nośników elektronów i jest odpowiedzialny za zależną od światła syntezę ATP. Ponad 90% białek chloroplastowych jest kodowanych w jądrze, ulegających translacji w cytozolu, a następnie importowanych do chloroplastu. Dalszy transport białek do błony tylakoidów lub przez nią wykorzystuje jeden z czterech szlaków translokacji. W tym miejscu opisujemy wysokowydajną metodę izolacji tylakoidów kompetentnych do transportu z grochu (Pisum sativum), wraz z testami transportu przez trzy zależne od energii szlaki, w których pośredniczy cpTat, cpSec1 i cpSRP. Metody te umożliwiają prowadzenie eksperymentów związanych z lokalizacją białek tylakoidów, energetyką transportu oraz mechanizmami translokacji białek przez błony biologiczne.

Aby ocenić ilość skutecznie przetransportowanego substratu, warto uwzględnić jedną lub więcej ścieżek „procentu wejściowego” (% input). W przypadku danych przedstawionych poniżej zastosowano 10% końcowej reakcji transportu bez tylakoidów. Ten „procent wejściowy” pomaga również zwizualizować rozmiar substratu prekursorowego. Procent ten reprezentuje znaną, określoną ilość substratu, z którą można porównać substrat przetransportowany; można go zwiększać lub zmniejszać w razie potrzeby, wyko...

Prezentujemy tutaj protokoły do wysokowydajnej izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów i testów transportu białek dla szlaków translokacji bliźniaczej argininy chloroplastów (cpTat), wydzielniczej (cpSec1) i rozpoznawania sygnałów cząstek (cpSRP).

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mechanizmów i energetyki transportu białek przez błony chloroplastowe, a także lokalizacji białek w plastydach. Główną zaletą tej techniki celowania w białka tylakoidowe jest to, że pozwala ona na pełną kontrolę środowiska tylakoidu podczas transportu, w tym temperatury, pH, warunków jonowych i stężeń prekursorów. Zacznij od namoczenia około 55 gramów groszku w 400 mililitrach wody destylowanej przez trzy godziny.Zasiej namoczony groszek na plastikowej tacy w glebie, pokrytej cienką warstwą wermikulitu i rosnąć przez dziewięć do 15 dni, jak opisano w protokole tekstowym. W dniu izolacji chloroplastów należy przygotować ciągły gradient gęstości, odwirowując mieszaninę 15 mililitrów Percollu i 15 mililitrów buforu 2xGB w 15-mililitrowej probówce wirówkowej z poliwęglanu o dużej prędkości przy 30, 900 gs w wirniku o stałym kącie przez 30 minut w czterech stopniach Celsjusza przy wyłączonym hamulcu. Następnie zbierz około 25 gramów od dziewięciu do 15 dni pędów grochu.Dodaj je do 95 mililitrów zimnego buforu 1xGB w schłodzonym blenderze, z zaostrzonymi ostrzami. I homogenizować. Przefiltrować tę mieszaninę przez co najmniej dwie warstwy gazy serowej, umieszczonej w lejku nad schłodzoną zlewką.Odwirować filtrat za pomocą 15-mililitrowej probówki wirówkowej z poliwęglanu w wahadłowym wirniku kubełkowym o masie 3 000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzuć supernatant i za pomocą pędzla delikatnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 1 x GB. Następnie użyj szklanej pipety do ustawiania ciała, aby ostrożnie nałożyć zawieszenie sita na gradient Percoll.Odwiruj go w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 8 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy wyłączonym hamulcu. Ponownie za pomocą pipety do pomiaru postawy ostrożnie przenieś dolny zielony pasek zawierający nienaruszone chloroplasty do świeżej 50-mililitrowej probówki z poliwęglanu i dodaj 30 mililitrów buforu 1xIB. Odwirować probówkę w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 1 800 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po wyrzuceniu supernatantu delikatnie ponownie zawiesić granulat w jednym mililitrze 1xIB za pomocą pędzla. Przemyć 30 mililitrów 1xIB i ponownie odwirować w tych samych warunkach. Zawiesić osad po końcowym odwirowaniu w jednym mililitrze 1xIB.Aby określić stężenie chlorofilu, wymieszaj 10 mikrolitrów całkowicie zawieszonych chloroplastów z pięcioma mililitrami 80% acetonu. Przefiltrować przez bibułę filtracyjną o grubości 180 mikrometrów z porami o wielkości 11 mikrometrów, a następnie określić stężenie chlorofilu za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć mieszaninę chloroplastów do jednego miligrama na mililitr za pomocą zimnego 1xIB.Aby rozpocząć izolację tylakoidów, gdy ekstrakt zrębu nie jest konieczny, taki jak transport cpTat, odwiruj nienaruszone chloroplasty w 1,5-mililitrowych probówkach w wahadłowym wirniku kubełkowym przy 1,000 g w czterech stopniach Celsjusza przez sześć minut. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w hipotonicznym buforze do lizy, aby uzyskać jeden miligram na mililitr za pomocą mikropipety. Inkubować na lodzie w ciemności z okazjonalnym mieszaniem przez 10 minut.Aby odzyskać tylokoidy, odwiruj w wahadłowym wirniku kubełkowym o temperaturze 3 200 g w czterech stopniach Celsjusza przez osiem minut. Umyj tylokoidy dwukrotnie, ponownie zawieszając osad jednym do dwóch mililitrów buforu do lizy, a następnie odwirowując w tych samych warunkach. Po końcowym odwirowaniu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu 1xIB i oznaczyć stężenie chlorofilu w izolowanych tylokoidach za pomocą spektrofotometru, jak wykazano wcześniej.W przypadku ścieżek, które wymagają odzyskiwania ekstraktu zrębu, takich jak CPSec1 i CPSRP, należy skroplić 600 mikrolitrów wyizolowanych chloroplastów w wahadłowym wirniku kubełkowym i odwirować w temperaturze 1 000 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W celu lizy chloroplastów zawieszamy osad z 600 mikrolitrami hipotonicznego buforu do lizy. Inkubować na lodzie w ciemności przez 10 minut, od czasu do czasu mieszając.Następnie odwirować probówki w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 3,200 g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby uratować zrąb, przenieś jasnozielony do żółtego supernatant do nowej probówki mikrowirówki i dodaj równą objętość 2x surowego buforu zrębu. Aby umyć tylokoidy, dodać dwie objętości buforu do lizy i odwirować w stężeniu 3 200 g przez osiem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zawiesić osad w 1xIB, aby osiągnąć stężenie chlorofilu wynoszące jeden miligram na mililitr i odłożyć na lód do późniejszego wykorzystania w testach transportowych. Usunąć resztki błon z zrębu surowego przez odwirowanie rozcieńczonego zrębu surowego w wirniku o stałym kącie nachylenia pod kątem 42 000 g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zbierz 95% objętości z każdej tuby, uważając, aby nie naruszyć małego żółto-zielonego granulki, jednocześnie zwracając uwagę na objętość pobraną z każdej tuby.Aby przygotować skoncentrowany ekstrakt zrębu, należy połączyć zebrane supernatanty. Następnie użyj czteromililitrowego koncentratora o masie cząsteczkowej 30 kilodaltonów, aby pięciokrotnie zagęścić ekstrakt. Aby oznaczyć transport cpTat w 1,5-mililitrowej probówce na lodzie, wymieszaj izolowane tylokoidy do końcowego stężenia chlorofilu 0,33 miligrama na mililitr, pięć milimolowych ATP przygotowanych w 1xIB i osiem milimolowych DTT przygotowanych w 1xIB.Aby zainicjować transport, należy wprowadzić białko substratowe do mieszanki transportowej. Reakcję należy przeprowadzić, oświetlając zawiesinę promieniowaniem fotosyntetycznie aktywnym w temperaturze od 80 do 100 mikroeinsteinów na metr kwadratowy na sekundę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać reakcję transportu, należy rozcieńczyć zawiesinę ośmiokrotnie lodowatym roztworem 1xIB.Wirować w temperaturze 3 200 g w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby odzyskać tylokoidy. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 120 mikrolitrach lodowatego zimnego 1xIB. Aby oznaczyć ścieżki CPSec1 lub PSRP, wymieszaj następujące elementy w 1,5-mililitrowej probówce na lodzie.Tylakoidy do końcowego stężenia chlorofilu 0,33 miligrama na mililitr, 0,83 miligrama na mililitr ekwiwalentu chlorofilu ekstraktu zrębu i pięciu milimolowych ATP przygotowanych w 1xIB. Doprowadź reakcję do pożądanej objętości za pomocą lodowatego lodu 1xIB i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Aby zainicjować transport, należy wprowadzić 10% objętości białka substratowego do tej mieszanki transportowej.Oświetlać promieniowaniem fotosyntetycznym aktywnym z prędkością od 80 do 100 mikroeinsteinów na metr kwadratowy na sekundę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać reakcję, rozcieńczyć zawiesinę ośmiokrotnie lodowatym 1xIB. Wirować przy 3 200 g w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 120 mikrolitrach lodowatego zimnego 1xIB. Aby usunąć resztki substratu, który nie został przetransportowany, trawić białko zewnętrzne, dodając sześć mikrolitrów po dwa miligramy na mililitr termolizyny i 10 milimolowy chlorek wapnia w 1xIB. Inkubuj tę reakcję proteazy na lodzie przez 40 minut.Ugasić proteazę, podwajając objętość za pomocą 25-milimolowego EDTA w 1xIB. Wirować w temperaturze 3 200 g w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby odzyskać tylokoidy. Po usunięciu supernatantu ponownie zawieś odzyskane tylokoidy w 120 mikrolitrach pięciu milimolowych EDTA w 1xIB i przenieś do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Po ponownym odwirowaniu w temperaturze 3,200 g w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu do próbek laemmli, uzupełnionego 10-milimolowym EDTA. Umieścić próbki we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Przejdź do analizy próbek według strony SDS.Transport białka iOE17 przez szlak cpTat spowodował przesunięcie wielkości o dwa do trzech kilodaltonów między wprowadzonym substratem a dojrzałą przetworzoną formą. Wynika to z rozszczepienia peptydu sygnałowego końca n, co wskazuje na udany transport cpTat. Zabieg termolizyny pozostawia tylko pomyślnie przetransportowane, a tym samym odporne na proteus dojrzałe pasmo.Transport prekursora OE33 przez szlak CPSec1 spowodował zmianę wielkości dojrzałego substratu i ochronę proteuszową transportowanego substratu. Wprowadzenie prekursora LHCP do błony tylokoidalnej za pośrednictwem szlaku cpSRP, ocenianego za pomocą trawienia termolizyną, doprowadziło do zmiany wielkości o 1,5 do dwóch kilodaltonów. Wskazywało to na udane wprowadzenie błony, ponieważ błona chroni nierozszczepiony dojrzały produkt degradacji LHCP przed całkowitą proteolizą.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować tylokoidy i oznaczać przemieszczenie za pomocą zależnych od energii szlaków cpTat, cpSec 1 i cpSRP. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Chociaż nie zostało to zilustrowane w tym filmie, zazwyczaj wyłączamy górne światła w laboratorium podczas izolowania i pracy z fotosyntetycznie aktywnymi chloroplastami i tylakoidami.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać izolowane chloroplasty i tylakoidy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pamiętaj, aby na początku delikatnie zawiesić chloroplasty. Unikaj zakłócania gradientu Procoll po pierwszym etapie wirowania.Dodatkowo, procentowa próbka wejściowa może być przygotowana równolegle z reakcjami transportu i przebiegać na tym samym żelu w celu oszacowania transportu substratu. Nie zapominaj, że praca z podłożami radioaktywnymi wymaga sumiennego obchodzenia się z nimi i stosowania odpowiednich środków ochrony osobistej. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się celowaniem w białka do zbadania energetyki, kinetyki i unikalnych mechanizmów rządzących transportem białek przez błony tylakoidów.

isolation-physiologically-active-thylakoids-their-use-energy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Ponieważ mitochondria stanowią tylko niewielki procent komórki roślinnej, muszą zostać oczyszczone do szeregu badań. Mitochondria można wyizolować z różnych organów roślinnych poprzez homogenizację, a następnie wirowanie w gradiacji różnicowej i gęstości w celu uzyskania wysoce oczyszczonej frakcji mitochondrialnej.

Izolacja i pomiary oddechowe mitochondriów Arabidopsis thaliana

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

Opisano protokół wyjaśniający organizację i skład kompleksu białek tylakoidowych roślin za pomocą elektroforezy w naturalnym żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE) i 2D-SDS-PAGE. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem Arabidopsis thaliana, ale może być stosowany do innych gatunków roślin z niewielkimi modyfikacjami.

Analiza kompleksów białkowych błony tylakoidowej za pomocą elektroforezy w niebieskim natywnym żelu

Tutaj prezentujemy protokół rozdzielania rozpuszczonych kompleksów tylakoidów za pomocą natywnej elektroforezy Zielonego Żelu. Zielone pasma żelowe są następnie charakteryzowane za pomocą skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC) i dostarczane są podstawowe kroki do analizy danych.

Separacja kompleksów białek tylakoidów szpinaku za pomocą natywnej elektroforezy zielonego żelu i charakterystyki pasma przy użyciu skorelowanego w czasie zliczania pojedynczych fotonów

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania nienaruszonych chloroplastów z liści Arabidopsis i ich trzech głównych podkomór (otoczka, zrąb i tylakoidy), używając kombinacji wirowania różnicowego, ciągłych gradientów Percoll i nieciągłych gradientów sacharozy. Metoda ta jest cenna dla subplastydialnej i subkomórkowej lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu i proteomiki.

Przygotowanie podkompartmentów chloroplastowych z Arabidopsis do analizy lokalizacji białek za pomocą immunoblottingu lub proteomiki

Prezentujemy dwuetapowy protokół wysokiej jakości izolacji mitochondriów, który jest zgodny z odkrywaniem białek i kwantyfikacją w skali proteomu. Nasz protokół nie wymaga inżynierii genetycznej, a zatem nadaje się do badania mitochondriów z dowolnych pierwotnych komórek i tkanek.

Dwuetapowa izolacja mitochondriów bez znaczników w celu lepszego odkrywania białek i kwantyfikacji

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę izolacji fizjologicznie aktywnych tylakoidów z chloroplastów grochu oraz testy transportu białek zależne od energii. Protokół umożliwia kontrolę warunków eksperymentalnych w badaniach biologii roślin.

Izolacja fizjologicznie aktywnych tylakoidów i ich zastosowanie w testach transportu białek zależnych od energii

Przeglądaj więcej filmów