Name: Terapia genowa hepatocytów ex vivo za pośrednictwem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj terapię genową hepatocytów ex vivo z wykorzystaniem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń. Ta metoda umożliwia leczenie dziedzicznej tyrozynemii typu 1 oraz innych chorób metabolicznych wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Duane'owi Meixnerowi za doświadczenie w wykonywaniu iniekcji do żyły wrotnej, Steve'owi Krage'owi, Joanne Pederson i Lori Hillin za wsparcie podczas zabiegów chirurgicznych. Praca ta była wspierana przez Fundację Szpitala Dziecięcego w Minnesocie i Medycynę Regeneracyjną w Minnesocie. R.D.H. został sfinansowany przez NIH K01 DK106056 Award oraz Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine Career Development Award.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) przed przeprowadzeniem badań. Opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone na samcach i samicach dużych białych świń hodowlanych (50% Landrace/50% Duże białe tło genetyczne) do 3 miesiąca życia, które są uważane za zdrowe i odpowiednie do operacji. Zwierzęta są trzymane w pomieszczeniach socjalnych, chyba że personel instytucjonalnej opieki weterynaryjnej uzna je za niezgodne. Zwierzęta są karmione odpowiednią dawką karmy dwa razy dziennie i obserwowane pod kątem objawów klinicznych przez personel opiekuńczy co najmniej raz dziennie.
1. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Podawać domięśniowo 5 mg/kg telazolu i 2 mg/kg ksylazyny w celu wywołania sedacji. Buprenorfinę SR należy podawać podskórnie w dawce 0,18 mg/kg mc. w przypadku znieczulenia pooperacyjnego (przewidywana analgezja po tej dawce wyniesie do 72 godzin). Ręcznie sprawdź zwierzę pod kątem odpowiedzi, aby zweryfikować sedację.</li>
	<li>Po podaniu środków uspokajających należy wprowadzić cewnik dożylny do żyły obwodowej w celu uzyskania dostępu farmakologicznego.</li>
	<li>Przed operacją podawać dożylnie 25 mg/kg cefazoliny i domięśniowo 5 mg/kg ceftiofuru.
	<ol>
		<li>Normalną sól fizjologiczną należy podawać dożylnie, aby utrzymać ciśnienie krwi i tętno w normalnych granicach fizjologicznych przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść rurkę ustno-żołądkową, aby odbarczyć żołądek. Wykonaj intubację dotchawiczą za pomocą rurki dotchawiczej o odpowiedniej wielkości, sprawdź prawidłowe umieszczenie, ręcznie uciskając klatkę piersiową w celu wykrycia wydechu, a następnie mechanicznie przewietrz zwierzę 1-3% izofluranem.</li>
	<li>Umieść przewody do elektrokardiogramu (EKG), mankiet do pomiaru ciśnienia krwi, sondę temperatury i pulsoksymetr, aby monitorować i rejestrować parametry życiowe. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, wyszoruj brzuch od klatki piersiowej do miednicy betadyną i sterylnie ułożyć.</li>
	<li>Podczas zabiegu należy przewietrzyć pacjenta za pomocą 1-3% izofluranu, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Kontynuuj monitorowanie parametrów życiowych pod kątem zmian i odpowiednio dostosuj izofluran, aby utrzymać częstość akcji serca na poziomie sprzed nacięcia Jeśli ciśnienie krwi drastycznie spadnie, zmniejsz poziom izofluranu i rozpocznij instytucjonalnie zatwierdzone środki przywracające witalność, takie jak epinefryna podawana dożylnie.
	<ol>
		<li>Rejestruj tętno, częstość oddechów, ciśnienie krwi i temperaturę ciała w rejestrze zabiegu chirurgicznego, aby śledzić i utrzymywać dobrostan zwierząt zgodnie z polityką specyficzną dla instytucji, aby zapewnić zgodność ze standardami dobrostanu dużych zwierząt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Laparoskopowa częściowa hepatektomia
<ol>
	<li>Wykonaj wstępne wejście do portu za pomocą otwartej techniki Hassena, głowowe do pępka. Po uwidocznieniu otrzewnej bezpiecznie wprowadź trokar 12 mm do jamy brzusznej. Przełóż lunetę 5 mm, 30° przez ten port.</li>
	<li>Napełnij jamę brzuszną COod 2 do 15 mmHg. Pod bezpośrednią wizualizacją za pomocą kamery laparoskopowej umieść dwa dodatkowe porty 5 mm triangulujące się na lewym płacie bocznym wątroby. Dokładne rozmieszczenie portów będzie zależało od wielkości i anatomii zwierzęcia.
	<ol>
		<li>W tym momencie umieść laparoskop w jednym z portów 5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj lewy boczny segment wątroby w miejscu głównej szczeliny lewego płata. Szczelina ta oddziela medyczny i lewy boczny segment. Zabezpiecz struktury wrotne wraz z żyłą wątrobową wzdłuż tej szczeliny za pomocą zszywacza chirurgicznego (patrz Tabela materiałów). Przeciąć miąższ przez tę szczelinę, stosując sekwencyjne odpalania ze zszywacza przy użyciu obciążeń naczyniowych o długości 60, 45 lub 30 mm.
	<ol>
		<li>Po zakończeniu resekcji miąższu należy ocenić resztki wątroby, aby zapewnić odpowiednią hemostazę. Kontrolować krwawienie z miąższu za pomocą kauteryzacji lub szwu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać wycinek wątroby za pomocą chwytaków endoskopowych i endoskopowego worka do pobierania tkanek.</li>
	<li>Usuń porty i zamknij nacięcie portu 12 mm w trzech warstwach za pomocą przerywanego szwu w rozmiarze 0 dla powięzi środkowej, szwu biegnącego 2-0 dla głębokiej warstwy skóry właściwej i szewu biegnącego 4-0 dla warstwy podskórnej. Porty 5 mm mogą być zamknięte w jednej warstwie za pomocą 2-0.</li>
	<li>Umieścić sterylny opatrunek na nacięciach (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Gdy komórki będą gotowe w czasie krótszym niż 4 godziny, utrzymuj zwierzęta w znieczuleniu ogólnym po operacji do czasu autotransplantacji.</li>
	<li>Alternatywnie, jeśli manipulacje komórkami wymagają dłuższych okresów (takich jak umożliwienie tworzenia sferoidów hepatocytów lub dłuższych okresów transdukcji/selekcji w oparciu o indywidualne zastosowania tej metody), pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu i powtórz etapy indukcji znieczulenia przed autotransplantacją, gdy komórki są gotowe.</li>
</ol>
3. Izolacja hepatocytów
<ol>
	<li>Podłączyć pompę perystaltyczną z zestawem perfuzyjnym w celu dostarczenia ciepłych roztworów dyspersyjnych (utrzymywanych w łaźni wodnej o temperaturze 43 °C) do cewników, które mają być umieszczone w dużych odsłoniętych naczyniach wątroby, tak aby temperatura roztworu wynosiła 38 °C po wprowadzeniu do tkanki. Wszystkie rurki, sprzęt i roztwory muszą być utrzymywane w sterylności, aby zapewnić, że komórki nadają się do przeszczepu.
	<ol>
		<li>Zalać pompę i rurkę Per II aż do zaworu odcinającego ustawionego tak, aby przełączać się między dostarczaniem Per I i Per II do tkanki. Ustaw kran w pozycji Per I i zalej resztę zestawu przewodów, całkowicie wypełniając wbudowaną pułapkę pęcherzykową, aby zapobiec wprowadzaniu pęcherzyków powietrza do tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj czyste cięcie poprzeczne prostopadłe do krążenia wątrobowego, aby odsłonić przekroje poprzeczne odgałęzień żyły wrotnej i żył wątrobowych do cewnikowania.</li>
	<li>Cewnikować dostępne odsłonięte żyły za pomocą dobrze dopasowanego cewnika, aby uniknąć wycieku perfuzatu. Kanulatuj co najmniej 1 żyłę wrotną i 1 żyłę wątrobową, aby zapewnić odpowiednią perfuzję tkanki.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że cewnik (cewniki) są zalane/wolne od powietrza przed umieszczeniem cewnika w żyle.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utymuluj ciepłym Per I z prędkością 100 ml/min, przesuwając rurkę wylotową od żyły do żyły co 30 sekund do 1 minuty. Przełączaj się przez wszystkie dostępne żyły przez 15–20 minut. Podczas infuzji Per I należy ustawić rurkę ewakuacyjną, aby opróżnić tackę zabiegową do pojemnika na odpady pod próżnią.</li>
	<li>Przełącz się na Per II w dawce 100 ml/min, cyklicznie przechodząc przez żyły jak w przypadku Per I, w sumie przez 30 minut. Podczas Per II należy użyć pompy powrotnej, aby zawrócić Per II z powrotem do zbiornika w celu ponownego podania w celu zaoszczędzenia przygotowania aktywnego enzymu. Ustaw pompę powrotną na wartość mniejszą niż pompa odpływowa (tj. 94 ml/min), uważając, aby nie zawracać nadmiaru powietrza do butelki źródłowej.
	<ol>
		<li>Jeśli torebka wątrobowa pęknie, czas ten można skrócić.</li>
		<li>Jeśli wątroba nie jest w pełni strawiona (nie pozostaje z wgłębieniami przy delikatnym nacisku ogniskowym), można wykonać dodatkowe 5 minut perfuzji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Od czasu do czasu (mniej więcej co 5 minut) dokumentuj temperaturę powierzchni pułapki bąbelkowej i/lub wątroby, aby upewnić się, że hepatocyty nie stygną. Jeśli wątroba jest zimna (<35 °C), zwiększ ciepło łaźni wodnej, aby przywrócić temperaturę wątroby bliższą 38 °C. Wątroba powinna blanszować w miarę postępu perfuzji.</li>
	<li>Wyjąć wątrobę na sterylną płytkę lub szalkę Petriego w celu transportu do okapu do hodowli komórkowych. Przykryj sterylne pole sterylną serwetą, aby zachować integralność podczas przetwarzania hepatocytów.</li>
	<li>Odsłoń część wątroby ze sterylnej serwety i zanurz wątrobę w zimnym pożywce do płukania hepatocytów (HWM). Zarąb działanie kapsuły, przeciągając nożyczki po górze. Zakładając sterylne rękawiczki, delikatnie masuj wątrobę, aby uwolnić hepatocyty do pożywki.</li>
	<li>Przefiltruj HWM zawierające hepatocyty przez sterylną gazę do dużych (~200 ml) butelek wirówek. Przemyć hepatocyty zgodnie z następującą procedurą w trzech egzemplarzach, łącząc osad komórkowy z wielu butelek po pierwszym ponownym zawieszeniu (w stosownych przypadkach):
	<ol>
		<li>Odwirować przy 50 x g, 5 min, 4 °C.</li>
		<li>Odessać i ponownie zawiesić w 150 ml HWM.</li>
		<li>Pozostaw pellet w HWM po 3praniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia, jeśli jest dostępne. Komórki te są teraz gotowe do manipulacji ex vivo, w tym terapii genowej, sortowania komórek lub innej specjalizacji przed autotransplantacją. Końcowa objętość HWM może być dostosowana do określonego stężenia (komórki/ml).</li>
</ol>
4. Transdukcja hepatocytów
<ol>
	<li>Zawiesić hepatocyty w pożywce (zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco [DMEM], 10% płodowa surowica bydlęca [FBS], penicylina-streptomycyna, kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy [HEPES], deksametazon, naskórkowy czynnik wzrostu [EGF] i NTBC) w ilości 1–2 milionów komórek na ml w stożkowej probówce na lodzie.</li>
	<li>Rozmrozić wektor lentiwirusowy w temperaturze pokojowej i dodać do stożkowej rurki na lodzie przy docelowej 20 wielokrotności infekcji (MOI), aby związać komórki. Obracaj komórki w temperaturze 4 °C przy 10 obr./min przez 90 minut, aby związać wektor wirusowy z powierzchnią komórki.</li>
	<li>Przenieś probówki do temperatury 37 °C na 30–40 minut. Odwracaj do mieszania co 5 minut, aby ułatwić wektorowi transdukcję związanych komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 50 x g w temperaturze 4 °C przez 4 minuty. Zawiesić osad komórkowy w soli fizjologicznej o żądanym stężeniu na lodzie. Powtórzyć to płukanie, aby upewnić się, że z preparatu usunięto wszelkie niezwiązane wektory.</li>
	<li>Jeśli to możliwe, umieść na płytce wystarczającą ilość komórek (tj. 500 000 komórek na basenie na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej), aby sprawdzić żywotność, adhezję, wydajność transdukcji itp. 
	UWAGA: Często nie jest możliwa ocena tych parametrów przed autotransplantacją, zwłaszcza w przypadku zabiegów tego samego dnia. Na przykład, procedura opisana w niniejszym dokumencie wykorzystywała nieoznakowane cDNA Fah pod kontrolą promotora alfa-1 antytrypsyny specyficznego dla wątroby, który nie był łatwy do oznaczenia w hepatocytach przed przeszczepem. Jednak te posiane komórki mogą być oznaczane po autotransplantacji jako wskaźnik powodzenia transdukcji (tj. poprzez Western blotting) lub predyktor ogólnego sukcesu procedury.</li>
</ol>
5. Przeszczep hepatocytów
<ol>
	<li>Zidentyfikuj żyłę wrotną za pomocą ultradźwięków za pomocą przetwornika od 2 do 5 MHz. Skieruj igłę o gramaturze 18 G, 5 cali w kierunku głównej żyły wrotnej proksymalnie do jej rozwidlenia.</li>
	<li>Rozpocząć powolną infuzję manualną do 1 x10 9 hepatocytów (około 10 g) za pomocą strzykawki. Monitoruj ciśnienie wrotne podczas przeszczepu za pomocą cewnika infuzyjnego.
	<ol>
		<li>Jeśli ciśnienie wrotne wzrośnie o więcej niż 8 mmHg powyżej wartości wyjściowej, należy wstrzymać infuzję i odczekać, aż ciśnienie powróci do poziomu wyjściowego.</li>
		<li>Jeśli ciśnienie wrotne nie powróci do wartości wyjściowej po przerwaniu infuzji na pięć minut, należy przerwać infuzję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po przeszczepie i usunięciu cewnika należy użyć ultradźwięków, aby ocenić obecność zdarzeń zakrzepowych i przepływu do przodu w żyle wrotnej.</li>
</ol>
6. Rekonwalescencja i utrzymanie pooperacyjne
<ol>
	<li>Przenieś obiekt do odpowiedniego obszaru rekonwalescencji i obserwuj, aż zwierzę będzie w pełni zdolne do chodzenia, monitorując tętno, nasycenie tlenem i temperaturę ciała co 15–30 minut. W razie potrzeby utrzymuj temperaturę ciała za pomocą ciepłych lub okładu ogrzewanego powietrzem.</li>
	<li>Omeprazol należy podawać doustnie w dawce 1 mg/kg mc. dziennie (do końca badania), aby zmniejszyć ryzyko wystąpienia owrzodzenia żołądka, które może wystąpić w przypadku napadów braku apetytu.</li>
	<li>Po operacji zwierzę jest ściśle monitorowane przez personel laboratoryjny i weterynaryjny i zazwyczaj nie wymaga dodatkowych leków przeciwbólowych poza przedoperacyjną dawką buprenorfiny. Jeśli wykwalifikowany personel opieki weterynaryjnej zaobserwuje oznaki niepokoju/bólu (pilnowanie nacięć, brak apetytu, letarg), można podać środki przeciwzapalne (np. karprofen).</li>
</ol>
7. Przepisy
<ol>
	<li>Patrz tabela 1, aby zapoznać się z przepisami stosowanymi w niniejszym protokole.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Hwm</td>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Na I (10x)</td>
			<td>Na II (10x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proszek Williams'-E (g/L)</td>
			<td>Rozdział 10.8</td>
			<td>NaCl (g/L)</td>
			<td>Rozdział 83</td>
			<td>39 Rozdział 39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (g/L)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>KCl (g/L)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (g/L)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>HEPES (g/L)</td>
			<td>24</td>
			<td>240</td> szt.
		</tr>
		<tr>
			<td>Pióro/paciorkowiec (100x, ml/l)</td>
			<td>10</td>
			<td>EGTA (g/L)</td>
			<td>Pytanie 9,5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surowica bydlęca płodu (ml/l)</td>
			<td>100</td> szt.
			<td>N-acetylo-L-cysteina</td>
			<td rowspan="2">8</td>
			<td rowspan="2">8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ph</td>
			<td>7,3</td>
			<td>(N-A-C, g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Nitrogliceryna (ml/l)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>-</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kolagenaza D (mg/ml)</td>
			<td>-</td>
			<td>0,2</td> pkt.
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ph</td>
			<td>7,4</td>
			<td>7,6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przepisy na roztwory stosowane w izolacji hepatocytów z odcinków wątroby.

<ol><li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening%3A+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li>
<li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li>
<li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism%3A+advancing+towards+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43(2017).</li>
<li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism%3A+progress+towards+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Italian+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2(2008).</li>
<li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li>
<li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors%3A+from+virology+to+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li>
<li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+basic+to+translational%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li>
<li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li>
<li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li>
<li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663(2013).</li>
<li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym raporcie opisano metodę autologicznej terapii genowej ex vivo w celu wyleczenia świńskiego modelu HT-1. Polega na częściowej hepatektomii, a następnie izolacji hepatocytów ex vivo i transdukcji izolowanych hepatocytów wirusem lenti przenoszącym transgen korekcyjny. Skorygowane autologiczne hepatocyty są następnie przeszczepiane z powrotem do zwierzęcia z niedoborem FAH przez żyłę wrotną8. Chociaż opisana metoda ma zastosowanie do wszystkich dużych modeli zwierzęcych ...

Wrodzone błędy metabolizmu wątroby to rodzina chorób genetycznych, które łącznie dotykają aż 1 na 800 żywych urodzeń1. Wiele z tych chorób to defekty pojedynczego genu2 i można je funkcjonalnie wyleczyć poprzez wprowadzenie pojedynczej poprawionej kopii dotkniętego genu do wystarczającej liczby hepatocytów3. Rzeczywisty odsetek hepatocytów, które należy skorygować, różni się w zależności od choroby4 i jest w dużej mierze zależny od charakteru kodowanego białka, na przykład wydalanych białek w porównaniu z cytoplazmatycznym. W większości przypadków skuteczność każdego leczenia chorób metabolicznych można łatwo ocenić na podstawie obecności biomarkerów często dostępnych w krążeniu.
HT-1 to wrodzony błąd metabolizmu wątroby, który wynika z defektu hydrolazy fumaryloacetooctanu (FAH)5, ostatni etap enzymatyczny w metabolizmie tyrozyny6. Niedobór FAH prowadzi do gromadzenia się toksycznych metabolitów w wątrobie, które mogą powodować ostrą niewydolność wątroby i śmierć lub w przewlekłej postaci choroby mogą powodować marskość wątroby i raka wątrobowokomórkowego. Choroba jest klinicznie kontrolowana przez podawanie 2-(2-nitro-4-trifluorometylobenzoilo)-1,3-cykloheksanodionu (NTBC), małocząsteczkowego inhibitora enzymu poprzedzającego FAH w metabolizmie tyrozyny. Choroba stanowi idealne środowisko do testowania metod terapii genowej, ponieważ skuteczna korekta nawet niewielkiej liczby hepatocytów ostatecznie doprowadzi do ponownego zasiedlenia całej wątroby skorygowanymi komórkami zarówno w małych, jak i dużych modelach zwierzęcych7,8. Dzieje się tak, ponieważ skorygowane komórki mają znaczną przewagę nad komórkami nieskorygowanymi ze względu na akumulację toksycznych metabolitów w tych ostatnich. Utrata nieskorygowanych hepatocytów pozwala na selektywną ekspansję skorygowanych hepatocytów zgodną ze zdolnościami regeneracyjnymi wątroby. Leczenie można łatwo prześledzić, mierząc spadek poziomu krążącej tyrozyny i sukcynyloacetonu po przeszczepie.
Aby uzasadnić inwazyjny charakter procedury, która obejmuje częściową hepatektomię, celem tego podejścia musi być trwałe wyleczenie. W związku z tym stosuje się wektory lentiwirusowe niekompetentne w zakresie replikacji, ponieważ będą one stabilnie integrować się z genomem hepatocytów9. Zapewnienie dostarczenia skorygowanego genu do wszystkich komórek potomnych, gdy wątroba rośnie i rozszerza się, aby zastąpić szybką utratę nieskorygowanych komórek. Jest to korzystne w porównaniu z wektorami wirusowymi związanymi z adeno (AAV), które istnieją głównie jako episomy, które mogą być przekazane tylko do jednej komórki potomnej podczas mitozy10, tracąc w ten sposób jakikolwiek efekt terapii w ciągu kilku tygodni.
Chociaż rosnąca ilość literatury potwierdza bezpieczeństwo lentiwirusa11, obawy związane z zdarzeniami genotoksycznymi są łagodzone przez ograniczenie transdukcji komórek gospodarza do kontrolowanego środowiska in vitro. Wolny wektor nigdy nie jest wprowadzany ogólnoustrojowo do gospodarza, gdy ta metoda jest wykonywana, co ogranicza ekspozycję na hepatocyty, które zostaną ponownie wprowadzone po autologicznym przeszczepie przez żyłę wrotną.
Ten raport opisuje metodę procedur chirurgicznych i ex vivo stosowanych do izolowania hepatocytów do terapii genowej ex vivo i późniejszego przeszczepu autologicznego12 dla leczenia HT-1 pig8. Cały proces obejmuje 1) częściową hepatektomię, która służy jako źródło hepatocytów i bodziec wzrostu dla wątroby gospodarza, 2) izolację hepatocytów z wyciętej wątroby, a następnie korektę genów ex vivo, i wreszcie 3) ponowne wprowadzenie skorygowanych hepatocytów z powrotem do gospodarza. Opisana metoda ma zastosowanie do wszystkich dużych modeli zwierzęcych z pewnymi modyfikacjami, ale tylko klasa świń z niedoborem FAH<sup="xref">13 będzie miała przewagę w postaci selektywnego środowiska dla skorygowanych hepatocytów.

<table><tbody><tr><td>2-(2-nitro-4-trifluorometylobenzoilo)-1,3-cykloheksanodion (NTBC)</td><td>Yecuris</td><td>20-0027</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Trocar</td><td>Covidien</td><td>B12STS</td><td></td></tr><tr><td>5 mm Trocar</td><td>Covidien</td><td>B5SHF</td><td></td></tr><tr><td>Zszywacz chirurgiczny Endo 60</td><td>Covidien</td><td>EGIA60AMT</td><td></td></tr><tr><td>Endo Zszywacz chirurgiczny 45</td><td>Covidien</td><td>EGIA45AVM</td><td></td></tr><tr><td>Endo Zszywacz chirurgiczny 30</td><td>Covidien</td><td>SIG30AVM</td><td></td></tr><tr><td>Endo Torba na łapanie</td><td>Covidien</td><td>173050G</td><td></td></tr><tr><td>0 PDS</td><td>Ethicon</td><td>Z340H</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J459H</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J426H</td><td></td></tr><tr><td>Dermabond</td><td></td><td>Ethicon DNX12</td><td>Sterylny opatrunek</td></tr><tr><td>Williams'-E Proszek&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>ME16060P1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Długopis/Paciorkowiec&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (g / L)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>S1679-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl (g / L)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (g / L)</td> <td>Oakwood Chemical</td><td>45172</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Oakwood Chemical</td><td>3631</td><td></td></tr> <tr><td>(N-A-C, g / L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O (g / L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D (mg / mL)</td> <td>Crescent Chemical</td><td>17456.2</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Fresenius Kabi</td><td>NDC6337</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Gibco</td><td>PHG0314</td><td></td></tr></tbody></table>

terapia genowa hepatocytów ex vivo za pośrednictwem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Terapia genowa jest idealnym wyborem do leczenia wielu wrodzonych wad metabolizmu wątroby. Wektory lentiwirusowe ex vivo są z powodzeniem stosowane w leczeniu wielu chorób krwiotwórczych u ludzi, ponieważ ich stosowanie zapewnia stabilną ekspresję transgenu dzięki zdolności wektora do integracji z genomem gospodarza. Metoda ta demonstruje zastosowanie terapii genowej ex vivo hepatocytów do dużego modelu zwierzęcego dziedzicznej tyrozynemii typu I. Proces ten składa się z 1) izolacji pierwotnych hepatocytów od autologicznego zwierzęcia dawcy/biorcy, 2) dostarczenia genu ex vivo poprzez transdukcję hepatocytów z wektorem lentiwirusowym oraz 3) autologicznego przeszczepu skorygowanych hepatocytów poprzez wstrzyknięcie żyły wrotnej. Powodzenie tej metody zazwyczaj opiera się na skutecznym i sterylnym usunięciu resekcji wątroby, ostrożnym obchodzeniu się z wyciętą próbką w celu wyizolowania żywotnych hepatocytów wystarczających do ponownego wszczepienia, wysokoprocentowej transdukcji wyizolowanych komórek oraz aseptycznych zabiegach chirurgicznych w celu zapobiegania infekcji. Awaria techniczna na którymkolwiek z tych etapów spowoduje niską wydajność żywotnych transdukowanych hepatocytów do przeszczepu autologicznego lub zakażenia zwierzęcia dawcy/biorcy. Świński model ludzkiej dziedzicznej tyrozynemii typu 1 (HT-1) wybrany do tego podejścia jest wyjątkowo podatny na taką metodę, ponieważ nawet niewielki procent wszczepienia skorygowanych komórek doprowadzi do ponownego zasiedlenia wątroby zdrowymi komórkami w oparciu o potężną selektywną przewagę nad rodzimie chorymi hepatocytami. Chociaż ta selekcja wzrostu nie będzie prawdziwa dla wszystkich wskazań, podejście to stanowi podstawę do rozszerzenia na inne wskazania i pozwala na manipulowanie tym środowiskiem w celu zajęcia się dodatkowymi chorobami, zarówno w wątrobie, jak i poza nią, przy jednoczesnym kontrolowaniu narażenia na wektor wirusowy i możliwości toksyczności i rakotwórczości poza celem.

Resekcja wątroby i przeszczep autologiczny zostały przedstawione schematycznie na Rysunku 1. W reprezentatywnej kohorcie 5 świń, które przeszły resekcję wątroby, u większości uzyskano wydajność &gt;1 x 109 hepatocytów przy żywotności wynoszącej około 80% (Tabela 2), co zapewniło wystarczającą liczbę komórek do dowolnego rodzaju pożądanych manipulacji, w tym terapii genowej. Kolejna hodowla nieprzeszczepionej części przygotowanych h...

Ten protokół ma na celu opisanie izolacji hepatocytów świń i dostarczania genów ex vivo w celu leczenia modeli chorób metabolicznych poprzez autologiczny przeszczep komórek. Chociaż ten konkretny model cieszy się wyjątkowymi zaletami, które sprzyjają skutecznej terapii, aplikacja jest istotną podstawą do zajęcia się dodatkowymi chorobami i wskazaniami.

Terapia genowa hepatocytów ex vivo za pośrednictwem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Terapia genowa ex vivo i autologiczny przeszczep komórek w leczeniu wrodzonych wad metabolizmu w wątrobie jest ważną alternatywą dla terapii tych zaburzeń. I pozwala nam nie tylko leczyć te zaburzenia, ale także określić biomasę niezbędną do osiągnięcia wyniku terapeutycznego. Takie podejście pozwala również uniknąć poważnych konsekwencji immunosupresji i innych konsekwencji związanych z różnymi rodzajami terapii.W obecnym kontekście stosujemy to podejście do leczenia dziedzicznej tyrozynemii typu 1. Chodzi jednak o to, że będzie to podejście platformowe do leczenia wielu różnych chorób wątroby przy minimalnych zmianach. Ważne jest, aby móc zwizualizować tę technikę, ponieważ istnieje pewna zmienność, jeśli chodzi o wizualizację skuteczności perfuzji, co jest niezbędne do uzyskania żywotnych hepatocytów do przeszczepu.Zabieg chirurgiczny wykonany przez Roberta Kaisera i Josepha Lillegarda. Izolacja komórek wykonywana przez Zeji Du, Bruce Amiot. Oczyszczanie komórek UAU i transdukcja ex vivo komórek została wykonana przez Caitlin VanLith.Przygotowaniem zwierząt i przygotowaniem sali operacyjnej zajęły się Kari Allen i Laurie Hillin. Aby dokonać wstępnego wejścia do portu, należy wyk

lentiviral-vector-mediated-gene-therapy-hepatocytes-ex-vivo-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wirusoterapie onkolityczne są w trakcie opracowywania jako nowe terapie w leczeniu raka wątrobowokomórkowego (HCC).  W tym artykule opisano metodę lokoregionalnej terapii HCC poprzez wątrobowe podawanie wirusa onkolitycznego do tętnic.

Przeztętnicze podawanie wirusów onkolitycznych w lokoregionalnej terapii ortotopowego HCC u szczurów

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Hydrodynamiczne wstrzykiwanie wektorów integracji opartych na transpozonach do żyły ogonowej umożliwia stabilną transfekcję mysich hepatocytów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół dla systemów transfekcji, który umożliwia długotrwałą konstytutywną ekspresję pojedynczego transgenu lub połączoną konstytutywną i indukowaną doksycykliną ekspresję transgenu lub miR-shRNA w wątrobie.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Opisujemy protokół przeprowadzania przeszczepu in utero (IUT) poprzez dożylne i dożylne drogi iniekcji w modelu mysim. Protokół ten może być stosowany do wprowadzania komórek, wektorów wirusowych i innych substancji do unikalnego środowiska płodu tolerancyjnego na odporność.

Przeszczepienie dożylne i owodniowe w macicy w modelu mysim

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i transfekcji pierwotnych komórek nabłonka tęczówki i barwnika siatkówki od różnych ssaków (myszy, szczury, króliki, świnie i bydło). Metoda ta idealnie nadaje się do badania podejść do ocznej terapii genowej w różnych konfiguracjach do analiz ex vivo i badań in vivo, które można przenieść na ludzi.

Izolacja, hodowla i inżynieria genetyczna pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego ssaków do niewirusowej terapii genowej

Przedstawiamy protokół wykorzystania normotermicznego systemu perfuzji krwi ex vivo do dostarczania środków terapeutycznych do całego alloprzeszczepu serca w heterotopowym modelu przeszczepu serca u świń.

Protokół heterotopowego przeszczepu serca u świń w celu dostarczenia leków do alloprzeszczepu serca

Używając taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI), wyprodukowaliśmy cząsteczki lentiwirusowe do stabilnej ekspresji shRNA w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych H9 (hESC) i przejściowo transdukowaliśmy neuronalne komórki progenitorowe (NPC) pochodzące z H9 z wysoką wydajnością.

Dostarczanie shRNA za pośrednictwem lentiwirusów do hESC i NPC przy użyciu taniego kationowego polimeru polietyleniminy (PEI)

W tym protokole opisany jest model ortotopowego przeszczepu wątroby u świń po statycznym przechowywaniu narządów dawcy w chłodni przez 20 godzin bez użycia bypassu żylno-żylnego podczas wszczepienia. Podejście to wykorzystuje uproszczoną technikę chirurgiczną z minimalizacją fazy bezwątrobowej oraz zaawansowanym zarządzaniem objętością i wazopresorem.

Przeszczepienie wątroby świni bez bypassu żylno-żylnego jako model dawcy o rozszerzonych kryteriach

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Ten protokół opisuje, w jaki sposób dośledzionowa iniekcja małego RNA spinki do włosów dostarczanego przez AAV8 osiąga taką samą skuteczność knockdownu genu w wątrobie jak iniekcja do żyły wrotnej, co stanowi prostszą procedurę ze znacznie niższą śmiertelnością i powikłaniami okołooperacyjnymi i pooperacyjnymi.

Skuteczny knockdown genu w wątrobie poprzez wstrzyknięcie do śledziony małego RNA dostarczonego przez serotyp 8 (AAV8) wirusa związanego z adenowirusem

Poznaj terapię genową hepatocytów ex vivo z wykorzystaniem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń. Ta metoda umożliwia leczenie dziedzicznej tyrozynemii typu 1 oraz innych chorób metabolicznych wątroby.

Terapia genowa hepatocytów ex vivo za pośrednictwem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń

Przeglądaj więcej filmów