Name: Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę indukowalnego hamowania białka dominująco-ujemnego w komórkach NIH3T3 przy użyciu wektorów pTet-Splice i pCMV-Tet3G. Technika ta umożliwia odwracalną inaktywację białek przy zachowaniu resztkowej aktywności endogennej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wektor pCS2+CB-Myc6 był prezentem od Marshalla Horwitza (University of Washington, Seattle, WA, USA). Komórki HEI-OC1 zostały dostarczone dzięki uprzejmości Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Wsparcie techniczne zapewniły UNMC Mouse Genome Engineering Core (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) oraz Creighton University Integrated Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Inżynieria genomu myszy UNMC była wspierana przez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDea) od NIH/NIGMS, grant numer P20 GM103471. Zintegrowane Centrum Obrazowania Biomedycznego było wspierane przez Creighton University School of Medicine oraz granty GM103427 i GM110768 z NIH/NIGMS. Obiekt powstał dzięki wsparciu z grantów Narodowego Centrum Zasobów Badawczych (RR016469) oraz NIGMS (GM103427). Linie myszy wygenerowane w tym badaniu były utrzymywane w Creighton University's Animal Resource Facility, którego infrastruktura została ulepszona dzięki grantowi NIH/NCRR G20RR024001. Prace te otrzymały wcześniejsze wsparcie w ramach grantu NIH/NCRR 5P20RR018788-/NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE (dla Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) oraz nowego grantu badawczego z Fundacji Zdrowia Słuchu (dla S. Taranga). Wyłączną odpowiedzialność za treść tych badań ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health.

Generacja transgenicznej myszy CBRb oraz cała opieka nad zwierzętami i eksperymenty związane z badaniem zostały zatwierdzone przez Creighton University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i przeprowadzone zgodnie z ich wytycznymi.
1. Transgeniczny konstrukt CB-Myc 6-RB1
UWAGA: Klonowanie CBRb do wektora pTet_Splice zostało przeprowadzone w wieloetapowym procesie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A i 1B).
<ol>
	<li>Wykonaj pierwszy etap klonowania do wektora pCS2+CB-Myc6.
	<ol>
		<li>Aby utworzyć konstrukt transgenu CBRb, amplifikuj fragment cDNA Rb1 o długości 1583 pz (528 aminokwasów odpowiadających regionowi aminokwasowemu 369-896) białka RB1 przy użyciu następującego zestawu starterów: dla EcoRI+RB 1243F użyj GGGGAATTCATTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, a dla XbaI+EcoRV+RB 2826R użyj CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATTTACTTCC.</li>
		<li>Sklonuj wygenerowany fragment (1546 pz) między miejscami ograniczeń EcoR1 i XbaI wektora pCS2+CB-Myc6 zgodnie z wcześniejszym opisem1,12. 
		UWAGA: Konstrukt CB-Myc6 o długości 1012 pz (337 aminokwasów) połączony z fragmentem Rb1 dał białko składające się z około 865 aminokwasów (około 108 kDa), które jest nieco mniejsze niż endogenne białko RB1 (~ 110 kDa) (<silna klasa = "xfig" >Figura 1A), ze znacznikiem CB-Myc6 na końcu N i Rb1 na końcu C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj drugi etap podklonowania do wektora pTet-Splice.
	<ol>
		<li>Aby wzmocnić fragment fuzji CB-RB-Myc6 i uzyskać promotor Tet, amplifikuj kasetę, składającą się z CB-myc6-Rb1 za pomocą starterów zawierających EcoRV (XbaI+EcoRV+RB 2826R) i miejsca SalI: dla SalI+CBF użyj CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTCC.</li>
		<li>Wygenerowany fragment (2567 pz) należy sklonować do wektora pTet-Splice, między miejscami restrykcyjnymi SalI i EcoRV, w taki sposób, aby cały transgen TetO-DN-CB-myc6-Rb1, w tym intron SV40 i sygnał PolyA, można było wyizolować poprzez pojedyncze trawienie za pomocą NotI (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Fragment NotI został wykorzystany do wygenerowania transgenicznych funderów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Testy in vitro transgenu TetO-DN-CB-myc6-Rb1
<ol>
	<li>Regulacja doks: linia komórkowa NIH3T3 
	nuta: O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie objętości zostały dostosowane do płytki 6-dołkowej.
	<ol>
		<li>Hoduj komórki NIH3T3 zgodnie ze specyfikacjami dostawcy, używając zalecanych pożywek do hodowli komórkowych zawierających 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 °C z 10% CO2 .</li>
		<li>Kotransfekcja komórek za pomocą wektorów pTet-Splice i pCMV-Tet3G (od kroku 1) przez 24 godziny. Postępuj zgodnie z poniższymi krokami w celu kotransfekcji.
		<ol>
			<li>Wymieszać 2-4 μl odczynnika/basenika do transfekcji na bazie lipidów i 1 ml niekompletnego (bez surowicy) zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku płytki 12- lub 24-dołkowej należy użyć odpowiednio 250 lub 500 μl pożywki hodowlanej i odpowiednio dostosować objętość odczynnika do transfekcji.</li>
			<li>Dodać 2–3 μg plazmidowego DNA/basenika do odczynnika do transfekcji-DMEM i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Dodać mieszaninę zawierającą DNA i odczynnik do transfekcji w DMEM do każdego dołka. Po 3–4 godzinach inkubacji dodać 1 ml kompletnej pożywki (tak, aby końcowa objętość wynosiła 2 ml/dołek). Zachować porcje zapasu Dox (1 mg/ml) i dodać 2 μl do każdej z studzienek (+ Dox). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
			nuta: Próbki kontrolne powinny składać się z komórek kotransfekowanych, które nie zostały poddane działaniu Dox (- Dox), jak również komórek NIH3T3 transfekowanych tylko wektorem transaktywatora pCMV-Tet3G i poddanych działaniu Dox przez okres 24 godzin. W przypadku pCMV-Tet3G stężenia 0,1–1 μg/ml Dox powinny być wystarczające do indukcji ekspresji transgenu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetestuj odwracalność konstruktu przy użyciu linii komórkowej HEK293.
	<ol>
		<li>Aby przetestować odwracalność transgenu TetO-DN-CB-myc6-Rb1, należy wyhodować komórki HEK293 w pożywce Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) zgodnie ze specyfikacjami dostawcy i kotransfekować zarówno z wektorami pTet-Splice, jak i pCMV-Tet3G przez 24 godziny, jak opisano powyżej (krok 2.1.2).</li>
		<li>W celu inaktywacji transgenu należy usunąć pożywkę zawierającą Dox po 24 godzinach, przemyć komórki 2x–3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i inkubować je w pożywce wolnej od Dox przez dodatkowe 24 godziny 
		nuta: Po usunięciu Dox, inaktywacja transgenu i regularna ekspresja białka powinny zostać wznowione w ciągu tego 24-godzinnego okresu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ocenić funkcjonalność konstruktu TetO-DN-CB-myc6-Rb1 w promowaniu nieplanowanej proliferacji komórek, należy przeprowadzić analizy funkcjonalne przy użyciu linii komórkowej HEI-OC1, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek HEI-OC1 w 10% DMEM w warunkach dopuszczalnych (33 °C z 10% CO2 ). W przypadku badań proliferacji komórek należy policzyć komórki za pomocą licznika komórek i umieścić 10 000 komórek HEI-OC1 na 96-dołkowej płytce w objętości 200 μl. Inkubuj komórki przez noc.</li>
		<li>Następnego dnia należy przeprowadzić przejściową kotransfekcję wektorów pTet-Splice i pCMV-Tet3G przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (patrz kroki 2.1.2). W oddzielnym dołku przeprowadzić transfekcję pmR-ZsGreen1 przy 2 μg przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (kroki 2.1.2) w celu obliczenia szybkości transfekcji. Użyj komórek nietransfekowanych jako kontroli.</li>
		<li>Wykryć obecność zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym (wzbudzenie = 485 nm, emisja = 530 nm) dla transfekowanych komórek 24 godziny po transfekcji. Zapisać obecność lub brak zielonej fluorescencji i obliczyć szybkość transfekcji jako całkowitą liczbę komórek GFP-dodatnich (komórek transfekowanych) w stosunku do komórek znakowanych DAPI (całkowita liczba komórek). 
		nuta: Oszacowaliśmy, że współczynnik transfekcji wynosi ~70%.</li>
		<li>Aby indukować ekspresję transgenu, dodaj 1 μg/ml Dox do podzbioru transfekowanych komórek, używając drugiego podzbioru jako kontroli (-Dox). Użyj nieleczonych komórek HEI-OC1 jako dodatkowych kontroli.</li>
		<li>Aby ocenić proliferację komórek, użyj zestawu do proliferacji komórek zgodnie z protokołem producenta.
		<ol>
			<li>Krótko mówiąc, 48 godzin po transfekcji usuń pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj 100 μl 1x roztworu wiążącego barwnik do każdej studzienki mikropłytki. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Następnie zmierz intensywność fluorescencji każdej próbki za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych (wzbudzenie = 485 nm, emisja = 530 nm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W celu dalszej oceny proliferacji komórek za pomocą immunocytochemii należy umieścić komórki HEI-OC1 na szkle nakrywkowym na 12-dołkowej płytce i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
		<ol>
			<li>Następnego dnia wykonać kotransfekcję z pTet-Splice i pCMV-Tet3G i wykonać zabieg Dox (+ Dox). Użyj nietransfekowanych komórek jako kontrolnych. Przetwarzaj komórki HEI-OC1 do znakowania Ki-67.</li>
			<li>Utrwal komórki 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS, pH 7,4, przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki 3x lodowatym PBS i inkubuj komórki w 0,25% niejonowym detergencie w PBS przez 10 minut.</li>
			<li>Ponownie umyj komórki, 3x w PBS przez 5 min, a następnie blokuj za pomocą 10% serum w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Inkubować komórki w 500 μl pierwszorzędowego przeciwciała Ki-67 (rozcieńczenie 1:200) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Myj komórki 3x przez 5 min PBS. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
			<li>Usuń roztwór przeciwciał drugorzędowych i przemyj komórki 3x PBS przez 5 minut każda w ciemności.</li>
			<li>W celu znakowania falloidyny inkubuj komórki HEI-OC1 w falloidynie w proporcji 1:200 przez 30 minut. Aby oznaczyć jądra komórek, inkubuj komórki z 5 μg/ml DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. 
			nuta: Upewnij się, że koniugat barwnika falloidyny jest inny niż koniugat przeciwciała drugorzędowego.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generacja transgenicznych myszy CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) i testy in vivo podejścia DN-CBRb
<ol>
	<li>Po potwierdzeniu skutecznej regulacji Dox transgenu TetO-DN-CB-myc6-Rb1, należy oczyścić fragment NotI i wstrzyknąć go do mysich zygot, które są następnie przenoszone do samic pseudociężarnych. 
	nuta: Procedury te zostały przeprowadzone w Centrum Medycznym Uniwersytetu Nebraski (UNMC) Mouse Genome Engineering Core Facility.</li>
	<li>Po dostarczeniu genotypuj młode za pomocą zestawu starterów specyficznego dla regionu fuzji CB-Rb1: dla CBRb F użyj 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAAATTGTGGCTGG 3′, a dla CBRB R użyj 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′. 
	nuta: Wielkość produktu PCR obserwowana na żelu agarozowym wynosi 401 pz (region CB 60 pz + region Rb1 341 pz (tabela 1). Zidentyfikowano dziesięć niezależnych linii założycielskich na podstawie obecności transgenu TetO-DN-CB-myc6-Rb1. W pięciu z tych linii potomstwo odziedziczyło transgen, co potwierdziło transgen w linii zarodkowej. Jedna z linii transgenicznych została ostatecznie wykorzystana do stworzenia i utrzymania linii oraz wygenerowania eksperymentalnych zwierząt TetO-DN-CB-myc6-Rb1 do dalszych badań.</li>
	<li>Wyhoduj dorosłe myszy TetO-DN-CB-myc6-Rb1 do linii induktora tetracykliny ROSA-CAG-rtTA (Stock #006965) (alternatywnie rozmnażaj się do linii induktora tTA) w celu wygenerowania eksperymentalnych myszy DN-CBRb. Genotyp potomstwa z tej krzyżówki przy użyciu następującego zestawu starterów: dla rtTA-WT R, użyj GGAGCGGGAGAAATGGATATG; dla rtTA Mutant R użyj GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; a dla rtTA Common użyj AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Rozmiary produktów PCR to 340 pz (mutant), 340 pz i 650 pz (heterozygota) oraz 650 pz (typ dziki).</li>
	<li>Wygeneruj krzywą dawka-odpowiedź białka RB1 po podaniu działaniu Dox, aby określić czas i czas trwania leczenia Dox niezbędne do wywołania ekspresji transgenu. 
	nuta: W tym eksperymencie zastosowano western blot i qRT-PCR do oceny specyficznej tkankowo aktywacji transgenu i ekspresji RB1.</li>
	<li>Przeprowadzić fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH), aby potwierdzić genomową insercję transgenu. 
	nuta: Przeprowadzono je w Centrum Genomiki Stosowanej Szpitala dla Chorych Dzieci (Toronto, Kanada). ELISA lub western blot (przy użyciu przeciwciała swoistego dla białka) mogą być stosowane do oceny aktywacji transgenu, specyficzności tkankowej i zmian w poziomach endogennego POI. Do konstruktu DN-CB-myc6-Rb1 użyliśmy przeciwciała anty-RB1.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
<li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+retinoblastoma+%28rb%291-inducible+dominant-negative+%28DN%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li>
<li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li>
<li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+ciliogenesis%2C+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122%2FWdr10%2C+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1%2FMbd4%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li>
<li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li>
<li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20813881">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15190215">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+retinoblastoma+1+%28Rb1%29+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+%28Skp2%29+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li>
<li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li>
<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+%28RB%29+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li>
<li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts%3A+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li>
<li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li>
<li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li>
<li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animal+models+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li>
<li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li>
<li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby obejść ograniczenia związane z tradycyjnymi strategiami transgenicznymi, staraliśmy się wygenerować model myszy, w którym endogenny POI może być warunkowo inaktywowany przez nadekspresję jego zmutowanej formy DN w sposób czasoprzestrzenny. W celu zniesienia funkcji endogenicznych punktów POI zaproponowano kilka opcji 15,16,17. Zmodyfikowaliśmy wcześniejszą strategię genetyczną1, łącząc system transkry...

Większość podejść mających na celu ablację genów i białek opiera się na trwałych procesach, które zazwyczaj prowadzą do całkowitej eliminacji lub skrócenia genu, sekwencji RNA lub białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI). Ogólnym celem tej metody jest inżynieria rekombinowanego białka w celu zniesienia funkcji endogennego białka typu dzikiego. Ponownie przyjrzeliśmy się i przebudowaliśmy alternatywną strategię1,2, która pozwala na tymczasową ablację punktu POI poprzez zahamowanie DN. Ta metoda działa zarówno w przypadku peptydów multimerycznych, jak i monomerycznych, ale najlepiej nadaje się do białek, które działają w złożeniu multimerycznym.
Metoda polega na fuzji lizosomalnej proteazy CB z podjednostką multimerycznego POI (kompleksu fuzyjnego CB). Powstały w ten sposób kompleks fuzyjny CB może wchodzić w interakcje z endogennym białkiem i trawić je proteolitycznie lub przekierowywać cały kompleks CB-POI do lizosomu w celu degradacji3. Co więcej, połączenie kompleksu fuzyjnego CB z indukowalnym charakterem systemu aktywacji transkrypcji kontrolowanej przez tetracyklinę (TetO) pozwala na indukowaną i kontrolowaną ekspresję transgenu w sposób odwracalny2. Chociaż jest to przydatne w wielu okolicznościach, całkowita delecja genów lub białek in vivo może skutkować śmiertelnością4,5,6. Podobnie, specyficzna tkankowo, warunkowa delecja niektórych genów lub białek za pomocą systemu Cre/Lox może nie być prosta, ponieważ ostatecznie doprowadzi do trwałej utraty krytycznych elementów genomu7. W związku z tym, w zależności od genu lub POI, żadne z tych podejść nie będzie skuteczne w dostarczaniu użytecznego modelu dla późniejszych badań, w szczególności badań funkcjonalnych genów lub białek u myszy w późnym okresie postnatalnym i dorosłych.
Aby obejść problemy związane z takimi podejściami i dostarczyć dowodu na skuteczność proponowanej metody, zdecydowaliśmy się przetestować przedstawioną tutaj metodę, generując warunkową wersję DN białka Retinoblastoma 1 (RB1). Zaproponowano kilka opcji8,9,10 w celu zniesienia funkcji endogennego RB1; jednak wszystkie z nich napotkały niektóre z tych samych ograniczeń, o których mowa powyżej: trwała delecja linii zarodkowej RB1 jest embrionalnie śmiertelna i, zgodnie z jej rolą supresorową nowotworu, trwała warunkowa delecja RB1 prowadzi do różnych nowotworów11. Nawet jeśli wersja DN RB1 nie wydaje się występować naturalnie, lepsza alternatywa dla obecnie dostępnych strategii powinna pozwolić na czasowo kontrolowaną inaktywację endogennego RB1 i zapewnić alternatywny mechanizm, który ostatecznie przywróci jego funkcję. Podstawa takiego konstruktu została opisana ponad dwie dekady temu1. Jednak ze względu na ograniczenia technologiczne brakowało mechanizmu kontrolującego aktywację, odpowiedź i swoistość tkankową transgenu. Badanie to jest pierwszym, które łączy elegancję systemu transkrypcyjnego zależnego od doksycykliny (Dox) z zmodyfikowanym transgenicznym konstruktem białek CB i Rb1 proteazy lizosomalnej. Powstały w ten sposób mysi model CBRb pozwala na tymczasową regulację RB1 za pośrednictwem Dox2. Zaletą stosowania takiego podejścia opartego na proteomie do badania funkcji genów jest to, że można je zastosować do dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania, przy minimalnej ilości informacji na temat jego aktywności.
Proponowana strategia transgenu DN oferuje wiele zalet w porównaniu z tradycyjnymi podejściami. Po pierwsze, hamowanie białka DN prowadzi tylko do częściowej ablacji aktywności białka, zachowując w ten sposób resztkową ekspresję endogenną. Taki wynik jest wysoce pożądany w sytuacjach, w których całkowita eliminacja aktywności białka prowadzi do śmiertelności embrionalnej, co znacznie ogranicza wszelkie badania mające na celu badanie funkcji genów u żywej myszy. Po drugie, obecność systemu TetO umożliwia aktywację transgenu tylko w obecności antybiotyku, co pozwala na skuteczną i odwracalną kontrolę aktywności transgenu. W ten sposób, poprzez zaprzestanie podawania antybiotyku, układ transgeniczny może zostać dezaktywowany, a normalna ekspresja RB1 zostaje przywrócona. Po trzecie, specyficzność ekspresji transgenu może się różnić w zależności od wybranego promotora. Chociaż wybraliśmy wszechobecny promotor ROSA-CAG jako dowód słuszności zasady, umieszczenie transgenu pod swoistym tkankowo promotorem prawdopodobnie ograniczy niepożądaną ekspresję transgenu i ułatwi badania nad terapeutycznym zastosowaniem tej metodologii transgenu.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Minimum niezbędne podłoże Orzeł, MEME&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina&nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma&nbsp;</td>Zestaw do proliferacji komórek <td>NF S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Retinoblastoma 1</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało c-Myc</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-actin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Phallodin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linia myszy TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) jest dostępna w Jackson Laboratory jako JAX#032011.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (dn)

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN) jest potężną metodą manipulowania funkcją białka i oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi podejściami opartymi na genomie. Na przykład, chociaż strategie celowania w chimerykę i Cre-LoxP są szeroko stosowane, wewnętrzne ograniczenia tych strategii (tj. nieszczelna aktywność promotora, mozaikowa ekspresja Cre itp.) znacznie ograniczyły ich zastosowanie. Co więcej, całkowita delecja wielu endogennych genów jest zarodkowo śmiertelna, co uniemożliwia badanie funkcji genów w życiu postnatalnym. Aby sprostać tym wyzwaniom, dokonaliśmy znaczących zmian we wczesnym protokole inżynierii genetycznej i połączyliśmy krótką (transgeniczną) wersję genu Rb1 z lizosomalną proteazą prokathepsyną B (CB), aby wygenerować mysi model DN Rb1 (CBRb). Ze względu na obecność proteazy lizosomalnej, całe białko fuzyjne CB-RB1 i jego oddziałujący kompleks są kierowane do degradacji za pośrednictwem proteasomu. Co więcej, obecność elementu induktora tetracykliny (rtTA) w konstrukcie transgenicznym umożliwia indukowalną i odwracalną regulację białka RB1. Obecność wszechobecnego promotora ROSA-CAG w mysim modelu CBRb sprawia, że jest to użyteczne narzędzie do przeprowadzania przejściowej i odwracalnej ablacji genu Rb1 oraz zapewnia naukowcom zasoby do zrozumienia jego aktywności w praktycznie każdym typie komórki, w którym dochodzi do ekspresji RB1.

Zazwyczaj projektowanie mutacji DN wymaga znacznej ilości informacji na temat struktury i funkcji badanego białka (POI). W przeciwieństwie do tego, strategia DN przedstawiona w niniejszej pracy jest szczególnie przydatna w sytuacjach, gdy informacje strukturalne i funkcjonalne dotyczące POI są ograniczone. Jeśli POI jest białkiem multimerycznym, fuzja jednej podjednostki z proteazą lizosomalną może dominująco hamować zmontowany multimer, a potencjalnie także inne ligandy, poprzez kombinac...

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju dominująco-ujemnego systemu indukcyjnego, w którym każde białko może być warunkowo dezaktywowane przez odwracalną nadekspresję jego dominująco-ujemnej wersji zmutowanej.

Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w wielu różnych dziedzinach wymagających warunkowej i przejściowej inaktywacji genu będącego przedmiotem zainteresowania poprzez odwracalną nadekspresję jego dominującej negatywnej wersji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona tylko na częściową ablację aktywności białka, zachowując w ten sposób resztkową ekspresję endogenną. Chociaż tutaj opisujemy stan inaktywacji białka RB, które funkcjonuje w złożeniu multimerycznym, metodologia ta może być również zastosowana do białek monomerycznych.Umesh Pyakurel, nasz technik laboratoryjny i współautor manuskryptu, zademonstruje procedury. Na początek hoduj komórki NIH3T3, zgodnie ze specyfikacją dostawcy, w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2, używając zalecanej pożywki do hodowli komórkowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej. Aby kotransfekować komórki za pomocą wektorów pTet-Splice i pCMV-Tet3G, najpierw wymieszaj od dwóch do czterech mikrolitrów odczynnika do transfekcji na bazie lipidów na dołek i jeden mililitr niekompletnego DMEM na studzienkę w 15-mililitrowej probówce i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Dodaj dwa do trzech mikrogramów DNA osocza na studzienkę do mieszanki DMEM tego odczynnika do transfekcji. Mieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Dodać jeden mililitr mieszanki zawierającej DNA i odczynnik do transfekcji w DMEM do każdej studzienki sześciodołkowej płytki z komórkami NIH3T3.Po trzech do czterech godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki. Następnie dodaj 2 mikrolitry bulionu doksycykliny do każdej studzienki i oznacz płytkę jako plus-doksycyklinę. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.Aby ocenić funkcjonalność konstruktu TetO-DN-CB-myc6-Rb1 w promowaniu nieplanowanej proliferacji komórek, należy hodować komórki HEI-OC1 w DMEM zawierającym 10% FBS, w warunkach permisywnych. W przypadku badań proliferacji komórek należy policzyć komórki HEI-OC1 za pomocą licznika komórek. Płytka 10 000 komórek HEI-OC1 na studzienkę na 96-dołkowej płytce o objętości 200 mikrolitrów każda.Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 33 stopni Celsjusza z 5% CO2. Aby indukować ekspresję transgenu, dodaj jeden mikrogram na mililitr doksycykliny do podzbioru transfekowanych komórek HEI-OC1. Użyj drugiego podzbioru oznaczonego jako minus-doksycyklina i nietransfekowanych komórek HEI-OC1 jako kontroli i inkubuj komórki w temperaturze 33 stopni Celsjusza z 10% CO2.Aby ocenić proliferację komórek, 48 godzin po transfekcji usuń pożywkę do hodowli komórkowej i dodaj 100 mikrolitrów 1x roztworu wiążącego barwnik z zestawu do proliferacji komórek do każdej studzienki mikropłytki. Postępuj zgodnie z protokołem producenta i inkubuj przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Użyj czytnika mikropłytek fluorescencyjnych, aby zmierzyć intensywność fluorescencji każdej próbki.Aby dokładniej ocenić proliferację komórek za pomocą immunocytochemii, umieść komórki HEI-OC1 na szkle nakrywkowym umieszczonym w każdym dołku 12-dołkowej płytki w DMEM. Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 33 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy przeprowadzić kotransfekcję do komórek w dwóch dołkach za pomocą wektorów pTet-Splice i pCMV-Tet3G, a następnie przeprowadzić obróbkę doksycykliną na jednym dołku, tak jak to zrobiono z komórkami NIH3T3.Użyj jednego nietransfekowanego dobrze jako kontroli. Aby przetworzyć komórki do znakowania Ki-67, utrwal je 4% paraformaldehydem w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj je trzy razy lodowatym PBS przez pięć minut każdy.Dodaj 0,25% niejonowego detergentu do PBS i inkubuj przez 10 minut. Powtórz pranie trzy razy w PBS przez pięć minut każde. Użyj 10% serum, aby zablokować komórki.W wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Dodaj 500 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała Ki-67 i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie umyj komórki trzy razy w PBS przez pięć minut każda.Dodaj jeden mililitr przeciwciała wtórnego i inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po usunięciu roztworu przeciwciał drugorzędowych ponownie umyj komórki trzy razy przez pięć minut w PBS w ciemności. Aby oznaczyć komórki HEI-OC1 falloidyną, inkubuj je w falloidynie w proporcji 1:200 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Aby oznaczyć jądra komórkowe, inkubuj komórki z pięcioma mikrogramami na mililitr DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po dostarczeniu myszy transgenicznych, genotypuj młode za pomocą zestawu starterów specyficznego dla regionu fuzji CBRb1, jak opisano w manuskrypcie. Wyhoduj dorosłe myszy TetO-DN-CB-myc6-Rb1 do linii induktora ROSA-CAG-rtTA i tetrestyny w celu wygenerowania eksperymentalnych myszy DN-CBRb i genotypowania ich potomstwa zgodnie z opisem w manuskrypcie.NIH3T3 nie ulega ekspresji endogennego białka RB1, więc silna ekspresja RB1 obserwowana tutaj jest spowodowana indukcją transgenu w obecności Dox, ale nie w jego braku, co potwierdza efektywną aktywację konstruktu RB1 mieszanki TetO-DN-CB-myc6-Rb1. Natomiast komórki HEK293 mają endogenną ekspresję RB1. Dodanie doksycykliny doprowadziło do aktywacji TetO-DN-CB-myc6-Rb1 i regulacji w dół RB1.Ekspresja RB1 została wznowiona 21 godzin po usunięciu doksycykliny z pożywki. Komórki HEI-OC1 kotransfekowane tymi samymi wektorami wykazywały niewielki, ale znaczący wzrost liczby komórek po leczeniu doksycykliną w porównaniu z komórkami transfekowanymi nieleczonymi doksycykliną i komórkami nietransfekowanymi. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ potwierdziła genomową insercję transgenu TetO-DN-CB-myc6-RB1 u myszy.Nastąpił początkowy wzrost całkowitej ekspresji białka RB1 w ślimaku myszy transgenicznych leczonych doksycykliną przez trzy dni w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak w grupach leczonych doksocykliną przez siedem i 10 dni zaobserwowano znaczne zmniejszenie ekspresji RB1. Niezależnie od analizowanej tkanki, u myszy transgenicznych leczonych doksocykliną zaobserwowano istotne zmniejszenie białka RB1, ale nie w grupie kontrolnej, co potwierdza skuteczność konstruktu TetO-DN-CB-myc6-RB1.Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby sprawdzić, czy każdy z elementów kodujących transgenu jest ze sobą w ramce. Gdyby regiony kodujące katepsynę B i siatkówczaka opisane w tym raporcie zostały przypadkowo połączone poza ramą, nie dałoby to zamierzonego białka fuzyjnego. W związku z tym weryfikacja sekwencji DNA musi zostać przeprowadzona przed wstrzyknięciem transgenu do jednokomórkowych zarodków myszy.Po tej procedurze wszechobecny promotor CAG może zostać zastąpiony specyficznymi promotorami w celu zbadania funkcji genu w specyficzny sposób komórki.

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Szybki i prosty sposób na wygenerowanie ludzkich linii komórkowych z indukowalną i odwracalną nadekspresją cDNA lub nokautem za pośrednictwem shRNA interesującego genu. Metoda ta umożliwia naukowcom wiarygodne i wysoce powtarzalne manipulowanie liniami komórkowymi, które są trudne do zmiany za pomocą przejściowych metod transfekcji lub konwencjonalnych strategii knockdown/knockout.

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Opisujemy tutaj system wykorzystujący specyficzny dla miejsca, odwracalny blok białkowy in vivo do zatrzymywania i zwijania widełek replikacyjnych u Escherichia coli. Ustanowienie bloku replikacji ocenia się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, a do wizualizacji produktów pośrednich replikacji stosuje się neutralno-neutralną 2-wymiarową elektroforezę w żelu agarozowym.

Indukowanie specyficznej dla miejsca blokady replikacji u E. coli przy użyciu systemu operatora represora fluorescencyjnego

Ten protokół służy jako schemat do tworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON w liniach komórek nowotworowych i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania roli białek pochodzących z komórek nowotworowych w rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza.

Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Interakcja zależnego od ATP czynnika remodelującego chromatynę z ligandem DNA jest opisana za pomocą spektroskopii CD. Indukowane zmiany konformacyjne na promotorze genu analizowane przez wygenerowane piki można wykorzystać do zrozumienia mechanizmu regulacji transkrypcji.

Spektroskopia CD do badania interakcji DNA-białko

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Poznaj metodę indukowalnego hamowania białka dominująco-ujemnego w komórkach NIH3T3 przy użyciu wektorów pTet-Splice i pCMV-Tet3G. Technika ta umożliwia odwracalną inaktywację białek przy zachowaniu resztkowej aktywności endogennej.

Indukowalne i odwracalne hamowanie białka dominująco-ujemnego (DN)

Przeglądaj więcej filmów