Name: Produkcja powlekanego nafionem, zredukowanego tlenku grafenu/polianiliny czujnika chemiorezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji mikrobiologicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Poznaj produkcję powlekanego nafionem czujnika chemirezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji Lactococcus lactis. Ta metoda oferuje kompaktową alternatywę dla konwencjonalnych elektrod pH.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Uniwersytetowi w Groningen za wsparcie finansowe.

1. Przygotowanie tlenku grafitu
UWAGA: Tlenek grafitu jest przygotowywany zgodnie z metodą Hummersa10,11.
<ol>
	<li>Dodać 3 g grafitu do 69 ml stężonegoH2SO4 i mieszać roztwór, aż grafit całkowicie się rozproszy. Dodać 1,5 g azotynu sodu i odstawić na 1 godzinę, mieszając. Następnie umieść pojemnik w łaźni lodowej.</li>
	<li>Dodać 9 g nadmanganianu potasu do dyspersji i wyjąć pojemnik z łaźni lodowej. Pozwól, aby roztwór rozgrzał się do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Najpierw dodaj kroplami 138 ml wody destylowanej. Następnie kontynuuj dodawanie 420 ml wody destylowanej. Utrzymuj temperaturę 90 °C przez 15 minut za pomocą płyty grzejnej. Dodaj 7,5 ml 30% nadtlenku wodoru do dyspersji.</li>
	<li>Zebrać produkt przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 20 minut i wyrzucić roztwór sklarowanego osadu. Umyj granulat 4x ciepłą wodą podwójnie destylowaną i 2x 10% roztworem HCl (v/v). Na koniec umyj go 2x etanolem i wysusz w temperaturze 50 °C w piekarniku.</li>
</ol>
2. Przygotowanie elektrody zdeponowanej GO
<ol>
	<li>Rozpuścić 10 mg tlenku grafitu w 10 ml wody, a następnie poddać go sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 6 godzin.</li>
	<li>Usunąć niezłuszczone płatki tlenku grafitu przez odwirowywanie przez 30 minut przy 2 700 x g. Po odwirowaniu wyrzucić cząstki stałe i użyć supernatantu do dalszych doświadczeń. 
	UWAGA: Użyliśmy tej złuszczonej dyspersji płatków GO jako roztworu podstawowego.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy GO dwukrotnie. Zawsze należy przygotowywać świeży roztwór roboczy GO z roztworu podstawowego.</li>
	<li>Dodać 2 μl roztworu roboczego GO na odsłoniętą międzypalcową złotą elektrodę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A i <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Po odlaniu kroplowym suszyć elektrodę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Jest to elektroda osadzona metodą GO.</li>
</ol>
3. Redukcja GO do elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu
<ol>
	<li>Włóż elektrodę do uchwytu elektrody z polidimetylosiloksanu (PDMS) (dolna część). Umieść drugą część uchwytu elektrody, która służy jako zbiornik roztworu, na górze elektrody, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A - 1C. Zmontuj uchwyty, spinając ze sobą dwie części za pomocą dwóch spinaczy do papieru. Upewnij się, że uchwyt PDMS nie zakrywa części elektrody zdeponowanej przez GO.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 300 μl 0,2 M buforu fosforanowego (pH 7) do zbiornika. Następnie umieść elektrodę odniesienia i przeciwelektrodę w roztworze w taki sposób, aby elektrody były umieszczone blisko powierzchni folii GO, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C. Układ ten służy jako ogniwo elektrochemiczne do przeprowadzania elektrochemicznej redukcji GO i osadzania polianiliny.</li>
	<li>Połącz elektrody z potencjostatem podłączonym do komputera w celu akwizycji danych. Do redukcji elektrochemicznej należy użyć woltamperometrii cyklicznej: wybierz od 0 do -1,2 V jako zakres potencjału i 50 mV/s jako szybkość skanowania. Przełączaj napięcie na elektrodzie w zakresie od 0 do -1,2 V 10x (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Po eksperymencie wyjmij elektrodę z uchwytu i kilkakrotnie umyj ją wodą podwójnie destylowaną. Następnie suszyć elektrodę w piecu w temperaturze 101 °C przez 12 godzin.</li>
	<li>Gdy elektroda wyschnie, wyjmij ją z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie zmierz przewodność elektrody za pomocą multimetru. Elektroda jest obecnie określana jako elektrochemicznie zredukowana elektroda tlenku grafenu (ERGO).</li>
</ol>
4. Funkcjonalizacja polianiliny elektrody ERGO
<ol>
	<li>Przygotować 10 mM monomeru aniliny do funkcjonalizacji polianiliny. Rozpuścić 5 μl 10 mM aniliny w 5 ml 1 M H2SO4.</li>
	<li>W celu funkcjonalizacji polianiliny dodać 300 μl monomeru aniliny do zbiornika roztworu. Umieść elektrodę osadzoną ERGO w uchwycie elektrody zgodnie z opisem w procedurze redukcji GO.</li>
	<li>Użyj woltamperometrii cyklicznej do elektropolimeryzacji aniliny w celu funkcjonalizacji ERGO w polianilinę ERGA (ERGO-PA): wybierz od 0 do 0,9 V jako zakres potencjału i 50 mV/s jako szybkość skanowania. Przełączaj napięcie na elektrodzie w zakresie od 0 do 0,9 V przez 50x (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Po osadzeniu polianiliny wyjmij elektrodę i kilkakrotnie przemyj ją wodą podwójnie destylowaną. Następnie wysuszyć elektrodę w temperaturze 80 °C w piekarniku przez 12 godzin.</li>
	<li>Wyjmij elektrodę z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej przed pomiarem przewodności elektrody za pomocą multimetru.</li>
	<li>Przygotować roztwór buforowy o pH 5, dodając 0,2 M NaOH do roztworu buforowego Brittona-Robinsona do uzyskania pH 5 (patrz krok 5.1). Trzymaj elektrodę w buforze o pH 5 przez 24 godziny.
	<ol>
		<li>Aby przygotować uniwersalny roztwór buforowy Brittona-Robinsona, wymieszaj 0,04 mola kwasu fosforowego, 0,04 mola kwasu octowego i 0,04 mola kwasu borowego w 0,8 l ultraczystej wody. Dodawać kroplami 0,2 M wodorotlenku sodu do roztworu buforowego, aż do osiągnięcia pożądanego pH4. Dodaj ultraczystą wodę, aż ostateczna objętość wyniesie 1 l.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Testowanie elektrod ERGO-PA przy różnych pH (wstępna kalibracja przed nałożeniem powłoki Nafion)
<ol>
	<li>Po kondycjonowaniu elektrody w roztworze buforowym o pH 5, zmierz rezystancję elektrody w roztworach o innym pH (od pH 4 do pH 9; patrz Rysunek 5).
	<ol>
		<li>W celu wykonania tego pomiaru zanurz elektrodę bezpośrednio w roztworze buforowym i podłącz drugą część elektrody do sterowanego komputerowo potencjostatu w celu uzyskania danych. Zmienić pH, miareczkując 0,2 M NaOH.</li>
		<li>Z listy technik należy wybrać chronopotencjometrię lub amperometrię i zastosować do elektrody różnicę potencjałów 100 mV. 
		UWAGA: Potencjostat mierzy prąd w funkcji czasu. Oprogramowanie sterujące potencjostatem zapewnia graficzne odwzorowanie prądu w funkcji czasu.</li>
		<li>Użyj prawa Ohma (rezystancja równa się napięciu podzielonemu przez prąd), aby obliczyć wartość rezystancji na podstawie zmierzonego prądu i przyłożonego napięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pomiarach suszyć elektrodę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.</li>
</ol>
6. Przygotowanie elektrody ERGO-PA pokrytej nafionem
<ol>
	<li>Dodać 5 μl 5% wag. Nafionu na elektrodę ERGO-PA i suszyć elektrodę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.</li>
	<li>Po nałożeniu powłoki Nafion należy trzymać elektrodę w roztworze buforowym o pH 5 przez 24 godziny przed pomiarem pH.</li>
	<li>Po kondycjonowaniu w pH 5 wyjmij elektrodę ERGO-PA pokrytą nafionem (ERGO-PA-NA) i zmierz rezystancję elektrody od pH 4 do pH 9, jak wspomniano w sekcji 5.1 (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 6).</li>
</ol>
7. Przygotowanie pożywki hodowlanej L. lactis
<ol>
	<li>Dodaj 9,3 g proszku M17 do 250 ml ultraczystej wody. Powoli mieszać roztwór, aż proszek całkowicie się rozpuści. Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Wziąć wysterylizowaną kolbę o pojemności 250 ml z mieszadłem magnetycznym i dodać 50 ml wysterylizowanej pożywki M17 do kolby. Następnie dodać 8 ml autoklawizowanego 1 M roztworu glukozy. Zaszczepić roztwór 10 μl kultury L. lactis, uprzednio wyhodowanej w tej samej pożywce hodowlanej. 
	UWAGA: Szczep bakteryjny został uzyskany od Jana Koka, genetyki molekularnej, Uniwersytetu w Groningen.</li>
	<li>Umieścić kolbę z zaszczepioną pożywką hodowlaną na 18 godzin na mieszadle magnetycznym w piecu inkubacyjnym w temperaturze 30 °C, mieszając i monitorując pH.</li>
</ol>
8. Testowanie reakcji pH ERGO-PA-NA w eksperymencie fermentacji L. lactis
<ol>
	<li>Umieść elektrodę ERGO-PA-NA w kulturze L. lactis i zamknij ją bawełnianym zatyczką. Następnie umieść zestaw w termostacie w temperaturze 30 °C, aby wyhodować L. lactis.</li>
	<li>Przyłóż 100 mV do elektrody i zmierz prąd w funkcji czasu.</li>
	<li>Pobrać próbki o pojemności 0,5 ml w różnych punktach czasowych (patrz na przykład <silna klasa="xfig">Rysunek 7), aby zmierzyć off-line gęstość optyczną przy 600 nm i pH za pomocą konwencjonalnej elektrody szklanej. Kontynuuj pomiary, aż gęstość optyczna kultury stanie się stała, co wskaże, że bakterie już się nie rozwijają.</li>
</ol>

<ol><li>Gou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+Nanotube+Chemiresistor+for+Wireless+pH+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Carbon Nanotube Chemiresistor for Wireless pH Sensing.</a> Scientific Reports. 4, 4468(2014).</li>
<li>Hols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Lactococcus+lactis+from+homolactic+to+homoalanine+fermentation+through+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of Lactococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering.</a> Nature Biotechnology. 17, 588-592 (1999).</li>
<li>Luedeking, R., Piret, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+lactic+acid+fermentation.+Batch+process+at+controlled+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Microbiological+Technology+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the lactic acid fermentation. Batch process at controlled pH.</a> Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering. 1, 393-412 (1959).</li>
<li>Britton, H. T. S., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/1931/jr/jr9310001456">Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal.</a> Journal of the Chemical Society. 0, 1456-1462 (1931).</li>
<li>Ambrosi, A., Chua, C. K., Bonanni, A., Pumera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemistry+of+Graphene+and+Related+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Electrochemistry of Graphene and Related Materials.</a> Chemical Reviews. 114, 7150-7188 (2014).</li>
<li>Xie, F., Cao, X., Qu, F., Asiri, A. M., Sun, X. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S092540051731523X">Cobalt nitride nanowire array as an efficient electrochemical sensor.</a> Sensors and Actuators B. 255, 1254-1261 (2018).</li>
<li>Xie, F., Liu, T., Xie, L., Sun, X., Luo, Y. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517317616">Metallic nickel nitride nanosheet: An efficient catalyst electrode for sensitive and selective non-enzymatic glucose sensing.</a> Sensors and Actuators B. 255, 2794-2799 (2018).</li>
<li>Xie, L., Asiri, A. M., Sun, X. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400516320640">Monolithically integrated copper phosphide nanowire: An efficient electrocatalyst for sensitive and selective nonenzymatic glucose detection.</a> Sensors and Actuators B. 244, 11-16 (2017).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+NiCoP+nanosheet+array+on+a+Ti+mesh%3A+A+high-performance+electrochemical+sensor+for+glucose+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Ternary NiCoP nanosheet array on a Ti mesh: A high-performance electrochemical sensor for glucose detection.</a> Chemical Communications. 52, 14438-14441 (2016).</li>
<li>Hummers, W. S. Jr, Offeman, R. E. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja01539a017">Preparation of Graphitic oxide.</a> Journal of the American Chemical Society. 80, 1339(1958).</li>
<li>Kumar, S., Chinnathambi, S., Munichandraiah, N., Scanlon, L. G. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2013/ra/c3ra42617c">Gold nanoparticles anchored reduced graphene oxide as catalyst for oxygen electrode of rechargeable Li-O2 cells.</a> RSC Advances. 3, 21706-21714 (2013).</li>
<li>Guo, H. L., Wang, X. F., Qian, Q. Y., Wang, F. B., Xia, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+green+approach+to+the+synthesis+of+graphene+nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A green approach to the synthesis of graphene nanosheets.</a> ACS Nano. 3, 2653-2659 (2009).</li>
<li>Ramesha, G. K., Sampath, S. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp811377n">Electrochemical Reduction of Oriented Graphene Oxide Films: An in Situ Raman Spectroelectrochemical Study.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 113, 7985-7989 (2009).</li>
<li>Amal Raj, A., Abraham John, S. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jp400066z">Fabrication of Electrochemically Reduced Graphene Oxide Films on Glassy Carbon Electrode by Self-Assembly Method and Their Electrocatalytic Application.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 177, 4326-4335 (2013).</li>
<li>Bhadani, S. N., Gupta, M. K., Sen Gupta, S. K. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/app.1993.070490304">Cyclic voltammetry and conductivity investigations of polyaniline.</a> Journal of Applied Polymer Science. 49, 397-403 (1993).</li>
<li>Genies, E. M., Tsintavis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+mechanism+and+electrochemical+behaviour+or+polyaniline+deposits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electroanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Redox mechanism and electrochemical behaviour or polyaniline deposits.</a> Journal of Electroanalytical Chemistry. 195, 109-128 (1985).</li>
<li>Jannakoudakis, P. D., Pagalos, N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0379677994901422">Electrochemical characteristics of anodically prepared conducting polyaniline films on carbon fibre supports.</a> Synthetic Metals. 68, 17-31 (1994).</li>
<li>Deshmukh, M. A., Celiesiute, R., Ramanaviciene, A., Shirsat, M. D., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468617322533">EDTA_PANI/SWCNTs Nanocomposite Modified Electrode for Electrochemical Determination of Copper (II), Lead (II) and Mercury (II) Ions.</a> Electrochimica Acta. 259, 930-938 (2018).</li>
<li>Deshmukh, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517324930">EDTA-Modified PANI/SWNTs Nanocomposite for Differential Pulse Voltammetry Based Determination of Cu(II) Ions.</a> Sensors and Actuators B Chemical. 260, 331-338 (2018).</li>
<li>Deshmukh, M. A., Shirsat, M. D., Ramanaviciene, A., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composites+Based+on+Conducting+Polymers+and+Carbon+Nanomaterials+for+Heavy+Metal+Ion+Sensing+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Composites Based on Conducting Polymers and Carbon Nanomaterials for Heavy Metal Ion Sensing (Review).</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 48, 293-304 (2018).</li>
<li>Deshmukh, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517305932">A Hybrid Electrochemical/Electrochromic Cu(II) Ion Sensor Prototype Based on PANI/ITO-Electrode.</a> Sensors and Actuators B Chemical. 248, 527-535 (2017).</li>
<li>Chinnathambi, S., Euverink, G. J. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400518303654">Polyaniline functionalized electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive sensor to monitor the pH in real time during microbial fermentations.</a> Sensors and Actuators B Chemical. 264, 38-44 (2018).</li>
<li>Sha, R., Komori, K., Badhulika, S. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/7959556/">Amperometric pH Sensor Based on Graphene-Polyaniline Composite.</a> IEEE Sensors Journal. 17 (16), 5038-5043 (2017).</li>
<li>Huai-Ping, C., Xiao-Chen, R., Ping, W., Shu-Hong, Y. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/ee/c2ee24203f">Flexible graphene-polyaniline composite paper for high-performance supercapacitor.</a> Energy & Environmental Science. 6, 1185-1191 (2013).</li>
<li>Xiang, J., Drzal, L. T. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386112006106">Templated growth of polyaniline on exfoliated graphene nanoplatelets (GNP) and its thermoelectric properties.</a> Polymer. 53, 4202-4210 (2012).</li>
<li>Xiangnan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+synthesis+of+graphene%2Fpolyaniline+hybrids+by+in+situ+intercalation+polymerization+and+their+electromagnetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">One-step synthesis of graphene/polyaniline hybrids by in situ intercalation polymerization and their electromagnetic properties.</a> Nanoscale. 6, 8140-8148 (2014).</li>
<li>Azzarelli, J. M., Mirica, K. A., Ravnsbæk, J. B., Swager, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+gas+detection+with+a+smartphone+via+rf+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wireless gas detection with a smartphone via rf communication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18162-18166 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istotne jest, aby warstwy GO całkowicie zakrywały złote druty elektrody po osadzeniu GO. Jeśli złote elektrody nie są pokryte GO, polianilina będzie osadzać się nie tylko na ERGO, ale także bezpośrednio na widocznych drutach złotych elektrod. Osadzanie się polianiliny na drutach elektrody złotej może mieć wpływ na działanie elektrody. Po redukcji GO do ERGO, elektroda jest suszona w temperaturze 100 °C w celu wzmocnienia wiązania między warstwą ERGO a drutami elektrody złotej. Rezystancja każdej elektrody różni się w zal...

pH odgrywa istotną rolę w wielu procesach chemicznych i biologicznych. Nawet niewielkie zmiany wartości pH zmieniają proces i niekorzystnie wpływają na jego wynik. W związku z tym konieczne jest monitorowanie i kontrolowanie wartości pH na każdym etapie eksperymentów. Elektroda pH na bazie szkła jest z powodzeniem stosowana do monitorowania pH w wielu procesach chemicznych i biologicznych, chociaż zastosowanie elektrody szklanej stwarza kilka ograniczeń w pomiarze pH. Elektroda pH na bazie szkła jest stosunkowo duża, delikatna i możliwe są niewielkie wycieki elektrolitu do próbki. Co więcej, elektroda i elektronika są stosunkowo drogie w zastosowaniach w 96-dołkowych systemach fermentacji przesiewowej. Co więcej, czujniki elektrochemiczne są inwazyjne i zużywają próbkę. W związku z tym korzystniejsze jest stosowanie nieinwazyjnych, bezreferencyjnych czujników.
Obecnie zminiaturyzowane systemy reakcji są preferowane w wielu zastosowaniach inżynierii chemicznej i biotechnologii, ponieważ te mikrosystemy zapewniają lepszą kontrolę procesu, a także wiele innych zalet w porównaniu z ich analogami makrosystemów. Monitorowanie i kontrolowanie parametrów w zminiaturyzowanym systemie jest trudnym zadaniem, ponieważ rozmiary czujnika do pomiaru, na przykład pH iO2, również muszą zostać zminimalizowane. Skuteczna produkcja mikroreaktorów dla systemów biologicznych wymaga różnego rodzaju narzędzi analitycznych do monitorowania procesów. W związku z tym rozwój inteligentnych mikroczujników odgrywa znaczącą rolę w przeprowadzaniu procesów biologicznych w mikroreaktorach.
Ostatnio podjęto kilka prób opracowania inteligentnych czujników pH wykorzystujących chemiooporne materiały pomiarowe, takie jak nanorurki węglowe i polimery przewodzące1. Te czujniki chemiorezystancyjne nie wymagają elektrody referencyjnej i można je łatwo zintegrować z obwodami elektronicznymi. Skuteczne czujniki chemiorezystancyjne umożliwiają produkcję inteligentnych czujników, które są ekonomiczne i łatwe w produkcji, wymagają niewielkiej objętości do testowania i są nieinwazyjne.
Tutaj przedstawiamy metodę opracowania elektrody z funkcjonalizowanego polianiliną, elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu. Elektroda chemiorezystancyjna działa jako czujnik pH podczas fermentacji L. laktis. L. lactis jest bakterią wytwarzającą kwas mlekowy, stosowaną w procesach fermentacji żywności i konserwacji żywności. Podczas fermentacji produkcja kwasu mlekowego obniża pH, a bakteria przestaje rosnąć przy niskim pH2,3,4.
Medium fermentacyjne to złożone środowisko chemiczne, które zawiera peptydy, sole i cząsteczki redoks, które mają tendencję do zakłócania powierzchni czujnika5,6,7,8,9. Badanie to pokazuje, że czujnik pH oparty na materiale chemiorezystancyjnym z odpowiednią warstwą ochronną powierzchni może być używany do pomiaru pH w tego rodzaju złożonych pożywkach fermentacyjnych. W tym badaniu z powodzeniem wykorzystujemy Nafion jako warstwę ochronną dla powlekanego polianiliną, elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu do pomiaru pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji L. laktis.

<table><tbody><tr><td>Płatki grafitowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (H2SO4)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azotyn sodu (NaNO2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadmanganian potasu (KMnO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 % H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5wt % Nafion</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M17 w proszku</td><td>BD Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas fosforowy (H3PO4)</td><td>Kwas borowy Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(HBO3)</td><td>Kwas octowy Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dipostassium wodorofosforan</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Au Elektrody międzypalcowe</td><td>Technologia BVT - CC1 W1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potencjostat</td><td>CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja powlekanego nafionem, zredukowanego tlenku grafenu/polianiliny czujnika chemiorezystancyjnego do monitorowania ph w czasie rzeczywistym podczas fermentacji mikrobiologicznej

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Tutaj przedstawiamy inżynierię półprzewodnikowego mikroczujnika pH opartego na funkcjonalizowanym polianiliną, elektrochemicznie zredukowanym tlenku grafenu (ERGO-PA). Elektrochemicznie zredukowany tlenek grafenu działa jako warstwa przewodząca, a polianilina działa jako warstwa wrażliwa na pH. Przewodność polianiliny zależna od pH występuje w wyniku domieszkowania podczas protonowania i dozieszywania podczas deprotonacji. Stwierdziliśmy, że elektroda półprzewodnikowa ERGO-PA nie działała jako taka w procesach fermentacji. Elektrochemicznie aktywne gatunki, które bakterie wytwarzają podczas procesu fermentacji, zakłócają odpowiedź elektrody. Z powodzeniem zastosowaliśmy Nafion jako warstwę przewodzącą protony zamiast ERGO-PA. Elektrody z powłoką nafionową (ERGO-PA-NA) wykazują dobrą czułość 1,71 Ω/pH (pH 4 - 9) do pomiarów za pomocą czujników chemiorezystancyjnych. Przetestowaliśmy elektrodę ERGO-PA-NA w czasie rzeczywistym w fermentacji Lactococcus lactis. Podczas wzrostu L. lactis pH pożywki zmieniło się z pH 7,2 na pH 4,8, a rezystancja elektrody półprzewodnikowej ERGO-PA-NA zmieniła się z 294,5 Ω do 288,6 Ω (5,9 Ω na 2,4 jednostki pH). Odpowiedź pH elektrody ERGO-PA-NA w porównaniu z reakcją konwencjonalnej elektrody pH na bazie szkła pokazuje, że bezreferencyjne układy mikroczujników półprzewodnikowych działają z powodzeniem w fermentacji mikrobiologicznej.

Pojawienie się silnego piku redukcji w okolicach -1,0 V (Rycina 3) ilustrowało redukcję GO do ERGO12,13,14,22. Intensywność piku zależy od liczby warstw GO na elektrodzie. Gruba czarna warstwa całkowicie pokryła złote druty na elektrodzie. W tym momencie dwie izolowane elektrody złote stały się przewodzące, ponieważ GO połączyło oba...

Tutaj przedstawiamy protokół produkcji chemicznie zredukowanego mikroczujnika pH z powłoką Nafion, funkcjonalizowanego polianiliną, elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu. Ten półprzewodnikowy czujnik pH oparty na chemiorezystorze może wykrywać zmiany pH w czasie rzeczywistym podczas procesu fermentacji Lactococcus lactis.

Produkcja powlekanego nafionem, zredukowanego tlenku grafenu/polianiliny czujnika chemiorezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji mikrobiologicznej

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Technologia ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu technologii bioprocesowej, takie jak konwersja biomasek, czy produkcja biogazu z odpadów organicznych. Główną zaletą tego chemiorezystancyjnego czujnika pH jest to, że elektrody są małe, czy rurka replikuje się w dużej liczbie i działa bez elektrody referencyjnej. Implikacje tej techniki rozciągają się na wiele mikroreaktorów, ponieważ pH jest ważnym parametrem.Konwencjonalne elektrody pH są zbyt drogie lub zbyt duże, aby można je było stosować w platformie przesiewowej mikroreaktorów. Ta metoda może zapewnić wgląd w wiele przebiegów permutacji na małą skalę. Może być również stosowany w innych przejściach chemicznych lub biologicznych, w których ważne są pomiary pH.Najpierw dodaj trzy gramy grafitu do 69 mililitrów stężonego kwasu siarkowego i mieszaj roztwór, aż grafit całkowicie się rozproszy. Dodaj 1,5 grama azotynu sodu. Po godzinie mieszania umieść pojemnik w łaźni lodowej.Dodać dziewięć gramów nadmanganianu potasu do dyspersji i wyjąć pojemnik z łaźni lodowej. Po pozostawieniu roztworu do ogrzania do temperatury pokojowej, dodaj kroplami 138 mililitrów wody Milli-Q. Następnie dodaj 420 mililitrów wody Milli-Q i utrzymuj temperaturę 90 stopni Celsjusza przez 15 minut za pomocą gorącej płyty.Dodaj 7,5 mililitra 30% nadtlenku wodoru do gorącej dyspersji. Po przeniesieniu dyspersji do probówki wirówkowej, zebrać produkt przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez 20 minut. Po odrzuceniu supernatantu przemyć osad czterokrotnie ciepłą wodą podwójnie destylowaną i dwa razy 10% kwasem solnym.Na koniec umyj pellet dwa razy etanolem i wysusz go w piekarniku w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Rozproszyć 10 miligramów tlenku grafitu w 10 mililitrach wody Milli-Q, a następnie sonikować dyspersję w kąpieli ultradźwiękowej przez sześć godzin. Po ultradźwiękach usunąć niezłuszczone płatki tlenku grafitu przez odwirowanie przez 30 minut w temperaturze 2700 razy G. Po odwirowaniu wyrzuć cząstki stałe i użyj supernatantu do dalszych eksperymentów.Aby przygotować roztwór roboczy, należy dwukrotnie rozcieńczyć roztwór podstawowy tlenku grafenu wodą Milli-Q. Teraz dodaj dwa mikrolitry roztworu roboczego tlenku grafenu na odsłoniętą złotą elektrodę międzypalcową. Po odlaniu kroplowym wysuszyć elektrodę tlenku grafenu w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.Włóż elektrodę do uchwytu elektrody PDMS. Umieść drugą część uchwytu elektrody, która służy jako zbiornik roztworu, na górze elektrody. Zmontuj uchwyty, spinając ze sobą dwie części za pomocą dwóch spinaczy do papieru.Następnie odpipetować 300 mikrolitrów 2-molowego buforu fosforanowego w zbiorniku. Następnie umieść elektrodę odniesienia i przeciwelektrody w roztworze w taki sposób, aby były umieszczone blisko powierzchni warstwy tlenku grafenu. Połącz elektrody z potencjostatem, podłączonym do komputera w celu akwizycji danych.Użyj woltamperometrii cyklicznej do redukcji elektrochemicznej i wybierz odpowiedni zakres potencjału i szybkość skanowania. Przełącz napięcie na elektrodzie 10 razy w zakresie od zera do minus 1.2 wolta. Po eksperymencie wyjmij elektrodę z uchwytu i kilkakrotnie umyj ją wodą Milli-Q.Następnie wysuszyć elektrodę w piekarniku w temperaturze 101 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Gdy elektroda wyschnie, wyjmij ją z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Następnie zmierz przewodność elektrody ErGO za pomocą multimetru.Przygotować 10-milimolowy roztwór monomeru aniliny do funkcjonalizacji polianiliny, rozpuszczając pięć mikrolitrów 10-milimolowej aniliny w pięciu mililitrach jednego molowego kwasu siarkowego. Dodaj 300 mikrolitrów monomeru aniliny do zbiornika roztworu. Następnie umieść elektrodę osadzoną ErGO w uchwycie elektrody, jak opisano wcześniej.Użyj woltamperometrii cyklicznej do elektropolimeryzacji aniliny, aby sfunkcjonalizować ErGO w ErGO-PA i wybierz odpowiedni zakres potencjału i szybkość skanowania. Przełącz napięcie na elektrodzie 50 razy, od zera do 9 woltów. Po osadzeniu polianiliny wyjmij elektrodę i kilkakrotnie przemyj ją wodą Milli-Q.Następnie suszyć elektrodę w temperaturze 80 stopni Celsjusza w piekarniku przez 12 godzin. Gdy elektroda wyschnie, wyjmij ją z piekarnika i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej przed pomiarem przewodności elektrody za pomocą multimetru. Następnie dodaj 2 molowe wodorotlenki sodu do roztworu buforowego Brittona-Robinsona, aż pH wyniesie pięć.Aby przygotować uniwersalny roztwór buforowy Britton-Robinson, wymieszaj 04 mole kwasu fosforowego, 04 mole kwasu octowego i 04 mole kwasu borowego w 8 litrach wody Milli-Q. Następnie dodaj wodę Milli-Q, aż ostateczna objętość wyniesie jeden litr. Po kondycjonowaniu elektrody w roztworze buforowym o pH pięć należy zmierzyć jej rezystancję w roztworach o różnym pH, zanurzając ją najpierw bezpośrednio w roztworze buforowym.Następnie podłącz drugą część elektrody do potencjostatu sterowanego komputerowo w celu uzyskania danych. Wybierz krzywą prądu amperometrycznego w funkcji czasu z listy technik i zastosuj różnicę potencjałów 100 miliwoltów do elektrody. Po pomiarach suszyć elektrodę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin.Dodaj pięć mikrolitrów nafionu o pięciu procentach wagowych na elektrodę ErGO-PA i susz elektrodę w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Po pokryciu nafionem podgrzej elektrodę w roztworze buforowym o pH pięć przez 24 godziny przed pomiarem pH. Po kondycjonowaniu w roztworze buforowym o pH pięć należy wyjąć elektrodę ErGO-PA pokrytą nafionem i zmierzyć rezystancję elektrody od pH od czwartego do dziewiątego, jak opisano wcześniej.Dodaj 9,3 grama proszku M17 do 250 mililitrów wody demineralizowanej. Powoli mieszać roztwór, aż proszek całkowicie się rozpuści. Następnie roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut.Następnie dodaj 50 mililitrów wysterylizowanej pożywki M17 do 250-mililitrowej wysterylizowanej kolby z mieszadłem magnetycznym. Dodać 8 mililitrów autoklawizowanego 1 molowego roztworu glukozy do pożywki. Następnie zaszczepić roztwór 10 mikrolitrami kultury L.lactis, wcześniej wyhodowanej w tej samej pożywce hodowlanej.Umieścić kolbę z zaszczepioną pożywką hodowlaną na magnetycznej płytce mieszającej w piecu inkubacyjnym w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 18 godzin, mieszając. Monitoruj pH podczas inkubacji. Umieścić elektrodę ErGO-PA-NA w kulturze L.lactis i zamknąć ją bawełnianym zatyczką.Następnie umieść zestaw w termostacie o temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby wyhodować L.lactis. Następnie przyłóż 100 miliwoltów do elektrody i zmierz prąd w funkcji czasu. Weź 5 mililitrów próbek w różnych punktach czasowych, aby zmierzyć offline gęstość optyczną przy 600 nanometrach i pH za pomocą konwencjonalnej elektrody szklanej.Kontynuuj pomiary, aż gęstość optyczna kultury stanie się stała, co wskaże, że bakterie już się nie rozwijają. Pojawienie się silnego piku redukcji około minus 1,0 V ilustruje redukcję tlenku grafenu do ErGO. Intensywność piku zależy od liczby warstw tlenku grafenu na elektrodzie.Gdy elektrodę ErGO-PA umieszczono w roztworach buforowych o pH od czterech do dziewięciu, prąd wzrastał wraz ze wzrostem pH z powodu domieszkowania i dedomieszkowania podczas procesu deprotonacji protonacji. Odpowiedź elektrody była natychmiast stabilna, gdy dodawanie wodorotlenku sodu ustało przy określonym pH. Na przewodność elektrody powłoka nafionowa nie miała większego wpływu.Wystąpiło jednak kilka omów różnicy w wartości rezystancji, które zmieniły wartość prądu bazowego elektrody ErGO-PA. Podobnie jak w przypadku elektrody ErGO-PA, rezystancja elektrody ErGO-PA-NA zmieniała się, gdy pH roztworu buforowego zmieniało się z czterech na dziewięć. Gdy wzrost L.lactis się rozpoczął, prąd elektrody ErGO-PA-NA stopniowo zmniejszał się, a następnie przyspieszał w fazie wzrostu wykładniczego, osiągając stabilną wartość pod koniec wzrostu.Końcowa wartość prądu jest porównywalna z wartością prądu elektrody ErGO-PA-NA badanej w roztworze buforowym. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o całkowitym pokryciu złotych elektrod tlenkiem grafenu. Technologia ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się sterowaniem procesami w zakresie produkcji i stosowania małych elektrod pH w systemach biologicznych i chemicznych.Nie zapominaj, że praca ze stężonym kwasem siarkowym, nadmanganianem potasu i nadtlenkiem wodoru może być bardzo niebezpieczna. Ta procedura musi być wykonywana w dygestorium.

manufacturing-nafion-coated-reduced-graphene-oxidepolyaniline

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie opisujemy technologię biodetekcji z efektem polowym (FEB) do wykrywania i ilościowego określania interakcji białko-białko. Białka docelowe unieruchomione na biosensorze grafenu oddziałują z białkami analitu w roztworze, powodując zmiany prądu elektrycznego w systemie FEB. Ta zmiana w odpowiedzi elektrycznej wskazuje na powinowactwo wiązania między białkami.

Biodetekcja polowa oparta na biosensorach grafenowych do wykrywania interakcji białko-białko

Opisujemy protokół produkcji i pomiaru urządzeń dla biosensorów wysokiej częstotliwości opartych na nanorurkach węglowych. Technika wykrywania wysokiej częstotliwości łagodzi podstawowy efekt ekranowania jonowego (Debye) i umożliwia pracę biosensora z nanorurkami w roztworach o wysokiej sile jonowej, w których zawodzą konwencjonalne bioczujniki elektroniczne. Nasza technologia stanowi unikalną platformę dla elektronicznych bioczujników przyłóżkowych (POC) działających w warunkach fizjologicznie...

Wytwarzanie nanoelektronicznego biosensora wysokiej częstotliwości z nanorurek węglowych do wykrywania w roztworach o wysokiej sile jonowej

Badanie pokazuje wzrost cienkich warstw nanohybrydowych cienkich warstw z tlenku grafenu o obniżonej zawartości tlenku irydu (IrO 2-RGO) na nieregularnym i szorstkim podłożu węglowym drukowanym sitodrukiem poprzez zieloną syntezę elektrochemiczną oraz ich implementację jako czujnika pH z wzorzystą platformą papierowo-fluidyczną.

Tlenek grafenu o obniżonej zawartości tlenku irydu Nanohybrydowe cienkowarstwowe modyfikowane elektrody z sitodrukiem jako jednorazowe elektrochemiczne papierowe mikroprzepływowe czujniki pH

Opisujemy kluczowe etapy biodetekcji za pomocą tranzystorów polowych z polikrzemu nanoprzewodowego, w tym przygotowanie urządzenia oraz immobilizację i potwierdzenie sondy molekularnej DNA na powierzchni nanodrutu, a także warunki do wykrywania DNA.

Przygotowanie tranzystora polowego z nanodrutu krzemowego do zastosowań chemicznych i biosensorycznych

Kwasy nukleinowe są powszechnymi analitami do oceny systemów biologicznych; jednak stronniczość wynikająca z manipulacji enzymatycznych może budzić niepokój. W tym miejscu opisano metodę bezznacznikowego wykrywania kwasów nukleinowych za pomocą polianiliny. Ta czuła, ekonomiczna technologia czujników może rozróżniać różnice między pojedynczymi nukleotydami między cząsteczkami.

Czujnik kwasów nukleinowych na bazie polianiliny

W tej pracy opisujemy nową metodę badania interakcji białko-białko za pomocą konduktometrycznego biosensora opartego na technologii hybrydowej β-laktamazy. Metoda ta polega na uwalnianiu protonów w wyniku hydrolizy β-laktamów.

Zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania urządzenia opartego na tranzystorze polowym z modulacją ładunku organicznego (OCMFET) do łączenia komórkowego in vitro. Urządzenie, zwane macierzą micro OCMFET, jest elastycznym, tanim i niereferencyjnym urządzeniem, które umożliwi monitorowanie aktywności elektrycznej i metabolicznej elektroaktywnych kultur komórkowych.

In vitro Wieloparametryczna analiza komórkowa za pomocą mikroorganicznych matryc tranzystorów polowych z modulacją ładunku

Obecny protokół demonstruje rozwój biosensora grafenowego tranzystora polowego (EGGFET) bramkowanego elektrolitem i jego zastosowanie w wykrywaniu biomarkerów immunoglobuliny G (IgG).

Opracowanie i funkcjonalizacja grafenowego tranzystora polowego bramkowanego elektrolitem do detekcji biomarkerów

Biosensing (FEB) to bezznacznikowa technika wykrywania interakcji biomolekularnych. Mierzy prąd elektryczny przepływający przez bioczujnik grafenowy, do którego unieruchomione są cele wiążące. Do oceny interakcji biomolekularnych między Hsp90 i Cdc37 wykorzystano technologię FEB i wykryto silną interakcję między tymi dwoma białkami.

Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

Poznaj produkcję powlekanego nafionem czujnika chemirezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji Lactococcus lactis. Ta metoda oferuje kompaktową alternatywę dla konwencjonalnych elektrod pH.

Produkcja powlekanego nafionem, zredukowanego tlenku grafenu/polianiliny czujnika chemiorezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji mikrobiologicznej (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja powlekanego nafionem, zredukowanego tlenku grafenu/polianiliny czujnika chemiorezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji mikrobiologicznej

Przeglądaj więcej filmów