Name: Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metodę izolacji limfocytów T CD4+ i analizę podzbiorów komórek T-pęcherzykowych obojętnych z krwi obwodowej przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybką ocenę biomarkerów postępu choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta grantem z Leukaemia UK dla ETB i MJA.

Próbki krwi pobrano od osób zdrowych (NS) (n = 12), jak również od pacjentów z chłoniakiem strefy brzeżnej (MZL) (n = 7) i innymi typami chłoniaka nieziarniczego z komórek B (BNHL) (6 pacjentów z FL, 2 pacjentów z chłoniakiem limfoplazmatycznym i 1 pacjent z chłoniakiem nieziarniczym z komórek B o niskim stopniu złośliwości). Pacjenci zostali zrekrutowani z klinik hematologicznych w Leicester Royal Infirmary po wyrażeniu świadomej, pisemnej zgody na wszystkie badania, z obowiązującą etyczną zgodą. Aprobata etyczna została uzyskana przez Komitet Etyki Badań Naukowych Leicestershire, Northamptonshire i Rutland 1, numer referencyjny 06/Q2501/122 dla próbek od pacjentów oraz Komitet ds. Badań nad Zdrowiem (HRA) NRES East Midlands-Derby, numer referencyjny 14/EM/1176 dla osób zdrowych.
1. Izolacja limfocytów T CD4+ z całej krwi obwodowej
<ol>
	<li>Pobrać świeżą krew obwodową (od 2 do 15 ml) do probówek K2EDTA za pomocą standardowego nakłucia dożylnego i przetwarzać tak szybko, jak to możliwe, aby utrzymać maksymalną żywotność. 
	nuta: Stosować standardowe laboratoryjne środki ochrony osobistej (fartuch, rękawice, okulary) i wykonywać prace w Komorze Bezpieczeństwa Biologicznego II klasy.</li>
	<li>Przynieś krew i wszystkie niezbędne odczynniki (koktajl wzbogacający CD4 +, 2% płodowa surowica bydlęca/sól fizjologiczna buforowana fosforanem (FBS / PBS), pożywka o gradiencie gęstości i pożywka do zamrażania w przypadku kriokonserwacji komórek) do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Wymieszaj krew z dostępnym na rynku koktajlem przeciwciał w celu wzbogacenia ludzkich limfocytów T CD4 +. Użyj 50 μl odczynnika na każdy 1 ml krwi. Użyj stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml na 5 do 15 ml krwi. 
	nuta: Jeśli używasz od 2 do 4 ml krwi, wykonaj ten krok w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć mieszaninę równą objętością 2% FBS/PBS</li>
	<li>Tę rozcieńczoną mieszaninę należy powoli nakładać na podłoże o gradiencie gęstości, aby uniknąć zakłócenia granicy faz i natychmiast przystąpić do wirowania, aby uniknąć dyfuzji krwi do pożywki o gradiencie gęstości.
	<ol>
		<li>W przypadku 2 do 3 ml krwi należy użyć 3 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml, ale w przypadku 4 ml krwi należy użyć 4 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml, a w przypadku 5 do 15 ml krwi należy użyć 15 ml pożywki o gradiencie gęstości w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować warstwową mieszaninę przez 20 minut przy 1 200 x g z wyłączonym hamulcem w temperaturze 20 °C. 
	nuta: Temperatura poniżej otoczenia może spowodować zanieczyszczenie czerwonymi krwinkami i granulocytami. Niższa prędkość spowoduje, że proces izolacji CD4+ zakończy się niepowodzeniem. Pozostawienie włączonej przerwy zmniejszy wydajność komórek. Użyj wirówki stołowej z wirnikami, które można zamknąć, aby uniknąć aerozoli.</li>
	<li>Usuń wzbogaconą warstwę komórek CD4+ z interfejsu za pomocą pipety Pasteura. 
	nuta: Wzbogacona warstwa komórkowa będzie przypominać standardową "kożuchową powłokę" białych, mętnych komórek, ale ponieważ obecne są tylko komórki CD4 +, będzie ona naturalnie mniejsza i trudniejsza do zobaczenia.</li>
	<li>Dodaj 2% FBS/PBS do komórek CD4+ do całkowitej objętości 10 ml, a następnie przemyj dwukrotnie 2% FBS/PBS, wirując przez 10 minut przy 400 x g podczas każdego prania.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2% FBS/PBS i policzyć komórki zabarwione życiodajnym barwnikiem (błękitem trypanowym) w celu określenia liczby komórek i żywotności.</li>
	<li>Opcjonalny krok: ponowne zawieszenie 5 x 105 do 1 x 106 komórek w pożywce zamrażającej (10% dimetylosulfotlenku w FBS) w 1 ml podwielokrotności. 
	nuta: Poziomy niektórych markerów powierzchniowych mogą ulec zmianie w wyniku kriokonserwacji i rozmrażania. Dlatego bardzo ważne jest, aby wszystkie próbki były przetwarzane w sposób konsekwentny. W celu zminimalizowania różnic w zmiennych analitycznych, próbki zostały zakonserwowane kriogenicznie i zgrupowane do analizy w tym badaniu.</li>
</ol>
2. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Kriokonserwowane komórki CD4+ szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i raz umyć w podgrzanym podłożu (RPMI 1640 + L-glutamina uzupełniona 10% FBS i 1x penicylina-streptomycyna).</li>
	<li>Dodać komórki do 9 ml pożywki, odwirować przez 5 minut przy 400 x g i usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS (50 μl), tak aby każdy badany stan wykorzystywał od 5 x 105 do 1 x 106 komórek.</li>
	<li>Wymieszaj komórki z buforem barwiącym (50 μl). 
	UWAGA: Brilliant Stain Buffer zapobiega różnym artefaktom barwienia, które mogą zakłócać analizę danych, gdy dwie lub więcej plam BV lub BUV jest używanych jednocześnie ze względu na nieodłączne właściwości chemiczne tych barwników. W warunkach jednobarwnych lub niebarwionych 50 μl brylantowego buforu do barwienia można zastąpić 50 μl 1% BSA/PBS.</li>
	<li>Dodać przeciwciała do komórek (zgodnie z kolumną "wykorzystana objętość" w tabeli 1) i inkubować na lodzie w ciemności przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie w 1% BSA/PBS, odwirowując przez 3 minuty przy 600 x g podczas każdego mycia.</li>
	<li>Zawiesić w 1% BSA/PBS (400 μl) i przenieść do probówki do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Delikatnie zwiruj komórki przed uzyskaniem danych na cytometrze przepływowym:</li>
</ol>
3. Kontrola i konfiguracja cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Używając niebarwionej próbki, ustaw napięcia fotodiody tak, aby limfocyty mogły zostać oddzielone od oczywistych szczątków i martwych komórek (zdarzenia z obszarem wysokiego rozproszenia bocznego (SSC) i obszarem niskiego rozproszenia przodu (FSC))16. Używając pojedynczych barwionych próbek, ustaw napięcia fotopowielacza (PMT) tak, aby można było odróżnić fluorescencję dodatnią od fluorescencji tła, upewniając się, że wszystkie zdarzenia mieszczą się w wykrywalnej skali. 
	nuta: Ulepszeniem byłoby wykreślenie CV w stosunku do napięcia PMT dla każdego PMT za pomocą słabo fluorescencyjnych koralików w celu znalezienia minimalnego napięcia dla optymalnej rozdzielczości (metoda "Peak 2"19).</li>
	<li>Uwzględnij nakładanie się widma, generując matrycę kompensacyjną przy użyciu pojedynczych barwień z kulkami wychwytującymi. Dodaj dostępne w handlu kulki kompensacyjne (60 μL) i kulki kontroli ujemnej (60 μL) do 1% BSA/PBS (100 μL) i vortex. 
	nuta: Użyte kulki wychwytujące muszą być zgodne z gatunkiem gospodarza i izotypem IgG stosowanego przeciwciała. Macierz kompensacji powinna zostać ponownie obliczona, jeżeli zmieni się numer partii jakichkolwiek barwników tandemowych, ponieważ mogą one wykazywać znaczną zmienność widm emisji między partiami.</li>
	<li>Dodać pojedyncze przeciwciało (20 μl) i wirować.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 1% BSA/PBS (500 μL) i wirować.</li>
	<li>Pobrać próbkę za pomocą cytometru przepływowego za pomocą wyznaczonego generatora matrycy kompensacyjnej w oprogramowaniu do akwizycji zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Użyj kontrolek FMO, aby pokierować rozmieszczeniem bramek dla fluorescencji markera dodatniego, aby uwzględnić rozlanie barwnika, który jest głównym źródłem fluorescencji tła w eksperymentach z użyciem ≥4 kolorów16. Postępuj zgodnie z ogólnym protokołem barwienia powierzchni komórki, jak opisano w kroku 3, ale dla każdego warunku pomiń jeden z fluoroforów z etapu barwienia (gdzie CD45RA jest pominięty, pomiń również żywą/martwą plamę). Zdobądź 100 000 limfocytów dla każdego schorzenia.</li>
	<li>Ustaw dodatnią bramkę na ≤0,5% komórek. Zobacz Rysunek 2 ilustruje przykład kontrolek FMO.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Skorzystaj z oprogramowania do akwizycji cytometru przepływowego, aby ustawić próg 5,000 jednostek na parametrze FSC, aby wykluczyć bardzo małe zanieczyszczenia.</li>
	<li>Użyj bramki zatrzymującej, aby uzyskać 10 000 komórek cTfh (CD4+, CD45RA- CXCR5+). 
	nuta: Indywidualny użytkownik może zebrać ponad 10 000 komórek. Liczba ta stanowiła kompromis między zebraniem wystarczającej liczby komórek, aby zapewnić miarodajne wyniki, a czasem potrzebnym na pobranie.</li>
	<li>Korzystając z wykresu punktowego obszaru FSC / obszaru SSC, narysuj elipsę lub bramkę wielokątną, aby wybrać populację limfocytów, wykluczając szczątki i jawnie martwe komórki (zdarzenia o wysokim obszarze SSC i niskim obszarze FSC).</li>
	<li>Korzystając z wykresu punktowego FSC-Area / FSC-Width, narysuj bramkę wielokątną, aby zaznaczyć pojedyncze komórki, wykluczając dublety (dublety mają zwiększony obszar, ale podobną szerokość jak pojedyncze komórki).</li>
	<li>Korzystając z obszaru FSC / CD45RA i wykresu punktowego znacznika żywotności, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać żywe komórki CD45RA- (komórki o niskiej fluorescencji dla tego markera).</li>
	<li>Korzystając z wykresu punktowego FSC-Area / CD4, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać komórki CD4+ (komórki o wysokiej fluorescencji dla tego markera).</li>
	<li>Korzystając z wykresu punktowego CD4 / CXCR5, narysuj prostokątną bramkę, aby wybrać komórki CXCR5+ (tj. cTfh) (komórki o wysokiej fluorescencji dla tego markera).</li>
	<li>Korzystając z wykresu punktowego CXCR3 / CCR6, umieść poczwórną bramkę, aby podzielić komórki cTfh na komórki cTfh1,2 i 17 (komórki, które są wysokie i niskie dla każdego markera). 
	nuta: Komórki o fenotypie CD4+, CXCR5+, CXCR3+, CCR6+, są słabo scharakteryzowane. Odnosimy się do tych komórek jako cTfh1/1718, ponieważ konwencjonalne limfocyty T pomocnicze (CD4 + CXCR5-), które przechodzą między Th17 i Th1, wykazują ekspresję CXCR3 i CCR6 i zostały opisane jako cTfh1/1719.</li>
	<li>Korzystając z histogramu PD-1, użyj narzędzia zakresu, aby podzielić komórki cTfh (lub, jeśli wolisz, poszczególne podzbiory cTfh1,2,17 lub 1/17) na populacje PD-1-/+ lub hi. 
	nuta: Rozróżnienie między PD-1+ a PD-1hi nie jest dobrze zdefiniowane w literaturze. Próg ustalono jako taką samą intensywność PD-1 wymaganą do wykrycia Tfh w dobrej wierze w zawiesinach limfocytów migdałków ludzkich przy użyciu cytometrii przepływowej z tym samym panelem przeciwciał. Alternatywnie do panelu przeciwciał można dodać marker ICOS, ponieważ tylko komórkihi PD1 są ICOS+.</li>
</ol>

<ol><li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular Helper T Cells.</a> Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+Mediates+the+Development+of+T+Follicular+Helper+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells.</a> Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+Helper+T+Cells+Express+Cxc+Chemokine+Receptor+5%2C+Localize+to+B+Cell+Follicles%2C+and+Support+Immunoglobulin+Production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Linterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+T+cells+are+required+for+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).</li>
<li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Dynamics+of+Intratumoral+Immune+Cells+Reveal+the+Immune+Landscape+in+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li>
<li>Amé-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intratumoral+follicular+helper+T+cells+in+follicular+lymphoma%3A+role+in+the+survival+of+malignant+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells.</a> Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).</li>
<li>Bossaller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+Deficiency+Is+Associated+with+a+Severe+Reduction+of+CXCR5%2BCD4+Germinal+Center+Th+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells.</a> The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).</li>
<li>Morita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Blood+CXCR5%2BCD4%2B+T+Cells+Are+Counterparts+of+T+Follicular+Cells+and+Contain+Specific+Subsets+that+Differentially+Support+Antibody+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion.</a> Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).</li>
<li>Locci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+circulating+PD-1%2BCXCR3-CXCR5%2B+memory+Tfh+cells+are+highly+functional+and+correlate+with+broadly+neutralizing+HIV+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses.</a> Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24138884">Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure.</a> Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).</li>
<li>Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+functions+of+memory+Tfh+cells+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood.</a> Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).</li>
<li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+circulating+T+cells+resembling+follicular+helper+T+cells+is+a+fixed+phenotype+that+identifies+a+subset+of+severe+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+activated+B+cells+and+T+follicular+helper+cells+are+correlated+with+disease+activity+in+patients+with+new-onset+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).</li>
<li>Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Circulating+T+Follicular+Helper+Cell+Subsets+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease.</a> Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).</li>
<li>Maecker Holden, T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Function+of+CD4%2B+T+Follicular+Helper+%28Tfh%29+Cells+Associated+with+Hepatocellular+Carcinoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression.</a> PLOS ONE. 10 (2), 0117458(2015).</li>
<li>Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tfh1+%28cTfh1%29+cell+numbers+and+PD1+expression+are+elevated+in+low-grade+B-cell+non-Hodgkin%27s+lymphoma+and+cTfh+gene+expression+is+perturbed+in+marginal+zone+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma.</a> PLOS ONE. 13 (1), 0190468(2018).</li>
<li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Duan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+CXCR5%2BCD45RA-CD4%2B+T+cells+were+altered+in+HBV-related+hepatocellular+carcinoma+and+elevated+serum+CXCL13+predicted+better+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis.</a> Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+CXCR5%2BCD4%2Bhelper+T+cells+in+systemic+lupus+erythematosus+patients+share+phenotypic+properties+with+germinal+center+follicular+helper+T+cells+and+promote+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production.</a> Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).</li>
<li>Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+PD-1+controls+follicular+regulatory+T+cells+in+the+lymph+nodes+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood.</a> Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).</li>
<li>Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+T+follicular+regulatory+and+helper+cells+have+memory-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).</li>
<li>Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TFH+Cell+Function+and+Increased+TFR+Cells+Contribute+to+Defective+Antibody+Production+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging.</a> Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22752562">CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten stanowi prosty i skuteczny sposób analizy komórek cTfh krwi obwodowej, umożliwiając wykrycie wszystkich istotnych podzbiorów zidentyfikowanych do tej pory w literaturze. Próbki krwi można łatwo i sprawnie pozyskiwać w ramach standardowych przychodni, a próbki seryjne mogą być pobierane równolegle z danymi klinicznymi. To z kolei umożliwia badania prospektywne oceniające podzbiory cTfh jako biomarkery progresji choroby lub odpowiedzi na leczenie. Badania te byłyby szczególnie uzasadnione w chorobach, w któryc...

T-pęcherzykowe komórki pomocnicze (Tfh) to podzbiór limfocytów T CD4+, który początkowo został scharakteryzowany w tkankach limfatycznych1. Komórki te wyrażają receptory powierzchniowe PD-1 i CXCR5, wydzielają IL-21 i IL-4 oraz wykazują ekspresję jądrową czynnika transkrypcyjnego, BCL-62,3. Jak sama nazwa wskazuje, znajdują się one w centrach rozrodczych i są niezbędne do produkcji przeciwciał o wysokim powinowactwie1.
Dysregulowane odpowiedzi Tfh są związane z patogenezą chorób, zwłaszcza z chorobami autoimmunologicznymi, gdzie sprzyjają ekspansji autoreaktywnych komórek B4. Odgrywają również rolę w mikrośrodowisku guza zarówno solid5,6, jak i nowotworów limfoidalnych7. I odwrotnie, defekty genetyczne białek powierzchniowych niezbędnych do funkcjonowania Tfh, takich jak indukowalny kostymulator limfocytów T (ICOS), powodują ludzkie zespoły niedoboru odporności8. Komórki CD4 + CXCR5 + w ludzkiej krwi obwodowej są określane jako krążące komórki pomocnicze T-pęcherzyków (cTfh) i uważa się, że są przedziałem pamięci komórek Tfh w tkankach9. Celem opisanej tutaj metody jest analiza podzbiorów cTfh po izolacji komórek CD4 + z próbek krwi obwodowej.
Zdefiniowano kilka podzbiorów cTfh, a efektywność, z jaką zapewniają one pomoc komórkom B, różni się w zależności od podzbioru9,10,11,12. Względne proporcje tych podzbiorów są zmienione w wielu chorobach, z których najbardziej widoczna jest choroba autoimmunologiczna, w której prawie zawsze występuje względny wzrost bardziej funkcjonalnych podzbiorów PD-1+/hi i/lub cTfh2 lub cTfh17 w porównaniu z mniej funkcjonalnymi podzbiorami PD-1 i/lub cTfh112. Zakres tych zmian często wiąże się z parametrami klinicznymi, w tym aktywnością choroby i mianami autoprzeciwciał, co wskazuje na potencjalną rolę dystrybucji podzbioru cTfh jako biomarkera prognostycznego w chorobie, który może odzwierciedlać aktywność Tfh w tkankach limfatycznych9,12,13,14. Ponadto pobieranie próbek krwi od uczestników jest szybkie, bezpieczne i akceptowalne, a więc umożliwia seryjne monitorowanie w celu analizy postępu choroby lub odpowiedzi na terapię.
Użycie izolowanych limfocytów T CD4+ zamiast tradycyjnych zawiesin komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) umożliwia eksperymenty z cytometrią przepływową o wyższej przepustowości, skracając czas potrzebny do pozyskania znacznej liczby komórek cTfh do analizy. Jest to szczególnie przydatne podczas sortowania komórek z rzadkich podzbiorów cTfh przy użyciu sortowania komórek aktywowanych przepływem (FACS). Aby zwiększyć wydajność, zawiesiny te mogą być kriokonserwowane, aby umożliwić "grupowanie" próbek do wykorzystania w eksperymencie cytometrii przepływowej. Podczas testów czystość CD4+ nie została zmniejszona przez krioprezerwację.
Podczas gdy różne laboratoria używały różnych markerów do kategoryzacji komórek cTfh we wczesnych stadiach ich odkrycia, metoda przedstawiona tutaj wykorzystuje ujednolicony schemat dwóch grup markerów powierzchni komórek, jak zaproponowali Schmidt et al.12,15, aby umożliwić jednoczesną identyfikację cTfh i ich dziewięciu rozpoznanych podzbiorów w jednym eksperymencie cytometrii przepływowej.
Ponieważ używane są tylko markery powierzchni komórek, komórki nie wymagają utrwalenia ani przepuszczalności, a zatem mogą pozostać żywe do dalszych badań funkcjonalnych. Można to ułatwić poprzez sortowanie komórek za pomocą FACS z tym samym panelem przeciwciał. Panel ten można rozszerzyć o inne markery, co pozwala na ograniczenie stosowania cytometru przepływowego.
Analiza eksperymentów z wielokolorową cytometrią przepływową może być trudna ze względu na z natury subiektywną naturę bramkowania na dwuwymiarowych wykresach punktowych, zwłaszcza gdy populacje komórek nie mają wyraźnego rozkładu dwumodalnego we fluorescencji markerów, jak to ma miejsce w przypadku komórek cTfh i ich podzbiorów. Z tego powodu konieczne jest ustanowienie skutecznych kontroli w celu zmniejszenia liczby artefaktów, aby umożliwić lepszą rozdzielczość populacji i pewne ustalanie strategii bramkowania. W związku z tym projekt panelu przeciwciał i konfiguracja podstawowych kontroli dla eksperymentu cytometrii przepływowej, tj. przy użyciu kompensacji i kontroli FMO, są przedstawione odpowiednio w kroku 3.4.2 i 3.4.3.
Wszystkie komórki cTfh są zdefiniowane jako CD4+ CXCR5+ CD45RA-. Następnie można określić poziom ekspresji charakterystycznego markera aktywacji Tfh PD-1 w celu identyfikacji podzbiorów komórek PD-1-, PD-1+ lub PD-1hi cTfh. Następnie, wykorzystując kombinację receptorów chemokiny CXCR3 i CCR6, które są różnie wyrażane przez tradycyjne komórki Th1,2 lub 17, cTfh można scharakteryzować jako cTfh1,2 lub 17-podobne przez profil CXCR3 + CCR6-, CXCR3- CCR6- i CXCR3- CCR6+, odpowiednio.
Panel przeciwciał używany przez nasze laboratorium jest wyświetlany w Tabeli 1. Użytkownik może być zmuszony do dostosowania wyboru fluoroforu, aby uwzględnić konfigurację lasera i filtra światła dostępną w lokalnym cytometrze przepływowym.
Następujące względy wpływają na wybór fluoroforów. Tam, gdzie to możliwe, używaj jasnych fluoroforów. W szczególności używaj najjaśniejszych dostępnych fluoroforów na najciemniejszych (mniej wyrazistych) markerach. Markery ściemniacza obejmują PD-1, CXCR3 i CCR6 oraz, w mniejszym stopniu, CXCR5. W szczególności wykorzystaliśmy nowsze fluorofory BB, BV i BUV, które zapewniają doskonałą jasność, a tym samym umożliwiają łatwiejszą rozdzielczość różnych populacji komórek.
Rozłóż wybór fluoroforów na widmach emisyjnych tak bardzo, jak to możliwe, aby zminimalizować nakładanie się widm, a tym samym wymagany poziom kompensacji. Bezpłatne narzędzie online, które można wykorzystać do pomocy w projektowaniu panelu cytometrii przepływowej, można znaleźć tutaj: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Aby zaoszczędzić miejsce w widmie emisyjnym, zastosowaliśmy "kanał zrzutu" poprzez użycie barwnika żywotności o długości fali emisyjnej, która pokrywa się z długością fali APC-H7 (sprzężonej z CD45RA), aby umożliwić wykrycie (i wykluczenie) zarówno martwego, jak i / lub CD45RA+ za pomocą jednego detektora.
Tutaj przedstawiono protokół izolacji limfocytów T CD4+ krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji różnych i ostatnio opisanych krążących podzbiorów.

<table><tbody><tr><td>RosetteSep Ludzki koktajl wzbogacający limfocyty T CD4+</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 Mysz anty-ludzka CD183&nbsp; Klon 1C6/CXCR3</td><td>BD Horizon</td><td>565223</td><td></td></tr><tr><td>BV711 Mysz anty-ludzka CD196 (CCR6)&nbsp; Klon 11A9</td><td>BD Horizon</td><td>563923</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Szczur anty-ludzki CXCR5 (CD185)&nbsp; Klonowanie&nbsp; RF8B2</td><td>BD Horizon</td><td>562747</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Mysz anty-ludzka CD4&nbsp; Klon &nbsp; RPA-T4</td><td>BD Horizon</td><td>564419</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz anty-ludzka CD279&nbsp; Klon MIH4</td><td>BD Pharmingen</td><td>557946</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 Mysz anty-ludzka CD45RA Klon&nbsp; HI100</td><td>BD Pharmingen</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do nawożenia Far Red Dead Cell Stain Kit, do wzbudzenia 633 lub 635 nm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34973</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ig, &kappa;/Zestaw cząstek kompensujących kontrolę negatywną</td><td>BD CompBead</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACS Aria II</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 6.1.3</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td>Oprogramowanie do akwizycji cytometru przepływowego</td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>Treestar Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty-CXCR3</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>565223</tr><tr><td>Przeciwciało anty-CCR6</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>563923</tr><tr><td>Przeciwciało anty-CXCR5</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>562747</tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD4</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>564419</tr><tr><td>Przeciwciało anty-PD-1</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>557946</tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD45RA</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>560674 Marker żywotności</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>L34973</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja limfocytów t cd4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek t-pęcherzyków obojętnych (ctfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aktywność nieprawidłowych komórek T-pęcherzykowych (Tfh) jest wykrywalna w chorobach autoimmunologicznych, a ich obecność jest związana z wynikami klinicznymi, gdy analizowane jest mikrośrodowisko węzłów chłonnych w chłoniaku nieziarniczym komórek B. Podzbiory krążących komórek pomocniczych pęcherzyków T (cTfh), krążącego przedziału pamięci komórek Tfh we krwi, są również zaburzone w chorobie i dlatego stanowią potencjalne nowe biomarkery predykcyjne. Badania krwi obwodowej są korzystne, ponieważ są stosunkowo nieinwazyjne i umożliwiają proste monitorowanie seryjne. W artykule opisano metodę izolacji limfocytów T CD4+ z krwi ludzkiej oraz dalszą analizę za pomocą cytometrii przepływowej w celu zliczenia komórek cTfh i proporcji ich różnych podzbiorów (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 i cTfh1/17). Poziom tych podgrup porównano następnie między osobami zdrowymi a pacjentami z chłoniakiem. Okazało się, że metoda była wystarczająco solidna, aby uzyskać wiarygodne wyniki z rutynowo pobieranego materiału pacjenta. Opisaną przez nas technikę analizy można łatwo dostosować do sortowania komórek i dalszych zastosowań, takich jak RT-PCR.

Wysoką czystość CD4+ osiągnięto stosując protokół izolacji CD4+, który okazał się niezawodny dla wszystkich przebadanych przez nas próbek krwi (średnia: 96,6%, SD: 2,38, n=31) (Rycina 3).
Przedstawiono identyfikację komórek cTfh (CD4+ CXCR5+) u reprezentatywnej zdrowej osoby (Rysunek 4A). Odsetek całkowitych k...

Tutaj opisany jest protokół izolacji i charakterystyki podzbiorów limfocytów T CD4+ z ludzkiej krwi obwodowej. Oczyszczone limfocyty T CD4 + są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia proporcji podzbiorów komórek pomocniczych mieszków T.

Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Metoda ta może pomóc w wykazaniu różnic między krążącymi podzbiorami komórek pomocniczych mieszków T w stanach zdrowych i chorych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest szybka, że próbki mogą być przetwarzane wsadowo, a komórki pozostają żywe do dalszej analizy funkcjonalnej. Technika ta ułatwia ocenę krążących podzbiorów pomocniczych pęcherzyków T-pęcherzykowych jako biomarkerów postępu choroby, ponieważ korelują one z markerami ciężkości klinicznej. W demonstracji tej procedury pomoże dr Lucia Pi

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje protokół izolacji opartej na znakowaniu magnetycznym populacji limfocytów T CD4+Vδ1+γδ o niskim stężeniu z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Wykorzystując kombinację przeciwciał anty-Vδ1 sprzężonych z FITC, magnetycznych mikrokulek anty-FITC i superparamagnetycznych kulek pokrytych przeciwciałem anty-CD4, limfocyty T CD4 + Vδ1 + można z powodzeniem oczyścić z populacji PBMC.

Selektywna izolacja limfocytów T CD4 + Vδ1 + γδ z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Ten protokół opisuje czuły, komórkowy test cytotoksyczności. Wyliczając spadek częstości żywych docelowych limfocytów T CD4 + w obecności rosnącej liczby efektorowych limfocytów T CD8 +, test ten pozwala na bezpośrednią ocenę aktywności cytolitycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu.

Test cytometrii przepływowej opartej na komórkach do pomiaru aktywności cytotoksycznej

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy protokół cytometrii przepływowej do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkiej krwi obwodowej przy użyciu tylko dwóch fluorochromów zamiast siedmiu. Dzięki takiemu podejściu na większości cytometrów przepływowych można zarejestrować pięć dodatkowych markerów.

Dyskryminacja siedmiu podzbiorów komórek odpornościowych za pomocą dwufluorochromowej cytometrii przepływowej

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Obecny protokół opisuje eksperymentalny przebieg pracy, który pozwala na analizę ex vivo stymulacji ludzkich limfocytów T w allogenicznym systemie kohodowli z wcześniej leczonymi komórkami nowotworowymi.

Analiza aktywności ludzkich limfocytów T w allogenicznej kokulturze wstępnie leczonych komórek nowotworowych

Izolacja limfocytów przy użyciu zestawu Miltenyi MACs jest niezawodną metodą oczyszczania komórek z homogenatów całych tkanek limfatycznych. Komórki oczyszczone za pomocą systemu Miltenyi charakteryzują się zazwyczaj czystością ≥ 96%. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki niezbędne do izolacji komórek T CD4+, wykorzystując jeden z wielu zestawów oferowanych przez firmę Miltenyi.

Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem oczyszczania metodą Miltenyi MACS

Poznaj metodę izolacji limfocytów T CD4+ i analizę podzbiorów komórek T-pęcherzykowych obojętnych z krwi obwodowej przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika umożliwia szybką ocenę biomarkerów postępu choroby.

Izolacja limfocytów T CD4 + i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja limfocytów T CD4 ⁺ i analiza podzbiorów komórek krążących komórek T-pęcherzyków obojętnych (cTfh) z krwi obwodowej przy użyciu 6-kolorowej cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów