Name: Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę mikrodializy in vivo z zapisami EEG u swobodnie poruszających się szczurów, służącą analizie uwalniania glutaminianu i asparaginianu w hipokampie. Technika ta pozwala badać zmiany neurochemiczne związane z rozwojem epilepsji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Annie Binaschi, Paolo Ronconowi i Eleonorze Palmie za ich wkład w powstanie manuskryptów opublikowanych w pierwszej kolejności.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tej pracy pokazujemy, w jaki sposób można przeprowadzić ciągły zapis wideo-EEG w połączeniu z mikrodializą w eksperymentalnym modelu TLE. Techniki zapisu wideo-EEG są wykorzystywane do prawidłowego diagnozowania różnych faz progresji choroby u zwierząt, a technika mikrodializy służy do opisania zmian w uwalnianiu glutaminianu, które zachodzą w czasie (nie stwierdzono żadnych zmian dla asparaginianu we wcześniej opublikowanym badaniu2). Zdecydowanie zalecamy użycie jednego urządzenia/implantu do ...

Aby zapewnić wgląd w funkcjonalne upośledzenie pobudzającego za pośrednictwem glutaminianu i hamującego GABA-ergicznego neurotransmisji skutkującego spontanicznymi napadami padaczkowego w padaczce skroniowej (TLE), systematycznie monitorowaliśmy zewnątrzkomórkowe stężenia GABA1 i później poziomy glutaminianu i asparaginianu2 poprzez mikrodializę w brzusznym hipokampie szczurów w różnych punktach czasowych naturalnego przebiegu choroby, tj. w okresie rozwoju i progresji padaczki. Wykorzystaliśmy model pilokarpiny TLE u szczurów, który bardzo dokładnie naśladuje chorobę pod względem zmian behawioralnych, elektrofizjologicznych i histopatologicznych3,4 i skorelowaliśmy stężenie aminokwasów w dializacie z jego różnymi fazami: fazą ostrą po zniewadze padaczkowej, fazą utajenia, czasem pierwszego napadu spontanicznego i przewlekłym phass5,6,7. Określenie faz choroby było możliwe dzięki długotrwałemu monitorowaniu wideo-EEG oraz precyzyjnemu EEG i charakterystyce klinicznej napadów samoistnych. Zastosowanie techniki mikrodializy w połączeniu z długotrwałym monitorowaniem wideo-EEG pozwoliło na zaproponowanie mechanistycznych hipotez dotyczących neuropatologii TLE. Podsumowując, technika opisana w tym manuskrypcie pozwala na powiązanie zmian neurochemicznych w określonym obszarze mózgu z rozwojem i progresją padaczki w modelu zwierzęcym.
Sparowane urządzenia, składające się z elektrody głębokościowej zestawionej z kaniulą do mikrodializy, są często wykorzystywane w badaniach nad padaczką, gdzie zmiany w neuroprzekaźnikach, ich metabolitach lub substratach energetycznych powinny być skorelowane z aktywnością neuronalną. W zdecydowanej większości przypadków stosuje się ją u swobodnie zachowujących się zwierząt, ale może być również przeprowadzana w podobny sposób u ludzi, np. u pacjentów z padaczką oporną na farmako, poddawanych badaniu elektrody głębinowej przed operacją8. Zarówno zapis EEG, jak i pobranie dializatu mogą być wykonywane oddzielnie (np. wszczepienie elektrody w jednej półkuli i sondy do mikrodializy w drugiej półkuli lub nawet wykonanie mikrodializy w jednej grupie zwierząt podczas wykonywania samego EEG w innej grupie zwierząt). Jednak sprzężenie elektrod z sondami może mieć wiele zalet: upraszcza chirurgię stereotaktyczną, ogranicza uszkodzenia tkanek tylko do jednej półkuli (pozostawiając drugą, nienaruszoną, jako kontrolę dla badań histologicznych) i homogenizuje wyniki, ponieważ są one uzyskiwane z tego samego obszaru mózgu i tego samego zwierzęcia.
Z drugiej strony, przygotowanie sprzężonego urządzenia do mikrodializy z elektrodą wymaga umiejętności i czasu, jeśli jest ono domowej roboty. Można było wydać stosunkowo wysokie sumy pieniędzy, jeśli zostało się zakupionym na rynku. Co więcej, gdy sondy do mikrodializy (końcówki sond mają zwykle średnicę 200-400 μm i długość 7-12 mm)9 i elektrody EEG (końcówki elektrod mają zwykle średnicę 300-500 μm i są wystarczająco długie, aby dotrzeć do interesującej nas struktury mózgu10), zamontowane urządzenie reprezentuje nieporęczny i stosunkowo ciężki przedmiot po jednej stronie głowy, co jest kłopotliwe dla zwierząt i podatne na zgubienie, zwłaszcza gdy jest podłączone do pompy dializacyjnej i przewodowego systemu rejestracji EEG. Ten aspekt jest bardziej istotny u zwierząt z padaczką, które są trudne w obsłudze i mniej przystosowują się do sesji mikrodializy. Właściwe techniki chirurgiczne i odpowiednia opieka pooperacyjna mogą skutkować długotrwałymi implantami, które powodują minimalny dyskomfort u zwierząt i powinny być stosowane w skojarzonych eksperymentach mikrodializy-EEG10,11,12.
Zalety i ograniczenia techniki mikrodializy zostały szczegółowo omówione przez wielu neurobiologów. Jej główną przewagą nad innymi technikami perfuzji in vivo (np. szybkim przepływem push-pull lub perfuzją kubka korowego) jest mała średnica sondy, która pokrywa stosunkowo precyzyjny obszar zainteresowania13,14,15. Po drugie, błona mikrodializacyjna tworzy fizyczną barierę między tkanką a perfugatem; W związku z tym substancje o dużej masie cząsteczkowej nie krzyżują się i nie zakłócają analizy<klasa SUP="xref">16,<klasa SUP="XREF">17. Ponadto tkanka jest chroniona przed turbulentnym przepływem perfuzatu18. Kolejną ważną zaletą jest możliwość modyfikacji przepływu perfuzatu w celu maksymalizacji stężenia analitu w perfuzacie (tj. proces mikrodializy może być dobrze zdefiniowany matematycznie i może być modyfikowany w celu uzyskania wysokich stężeń analitu w próbce)19. Wreszcie, technika ta może być wykorzystana do wprowadzenia leków lub substancji farmakologicznie czynnych do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania i do określenia ich działania w miejscu interwencji20. Z drugiej strony, mikrodializa ma ograniczony czas rozwiązywania (zwykle więcej niż 1 minutę ze względu na czas potrzebny na pobranie próbek) w porównaniu z czujnikami elektrochemicznymi lub biologicznymi; Jest to technika inwazyjna, która powoduje uszkodzenie tkanek; Narusza równowagę neurochemiczną w przestrzeni wokół błony ze względu na ciągły gradient stężeń wszystkich rozpuszczalnych substancji, które dostają się do perfuzatu wraz z interesującym analitem. Wreszcie, na technikę mikrodializy duży wpływ mają ograniczenia technik analitycznych stosowanych do ilościowego oznaczania substancji w klasie perfuzatów<sup="xref">9,<klasa sup="xref">21,22,23. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) po derywatyzacji dialdehydem ortoftalowym do analizy glutaminianu i asparaginianu w próbkach biologicznych została dobrze zweryfikowana24,25,26,27 i jej obszerne omówienie wykracza poza zakres tego manuskryptu, ale dane uzyskane przy użyciu tej metody zostaną szczegółowo opisane.
Jeśli mikrodializa jest wykonywana prawidłowo i bez modyfikacji składu perfuzatu, może dostarczyć wiarygodnych informacji o podstawowych poziomach uwalniania neuroprzekaźników. Największa część poziomów podstawowych jest prawdopodobnie wynikiem rozlania się nadajnika z synaps9. Ponieważ w wielu przypadkach proste próbkowanie neuroprzekaźnika w dodatkowej przestrzeni synaptycznej nie jest wystarczające do osiągnięcia celów badania, technika mikrodializy może być również stosowana do stymulacji neuronów lub pozbawienia ich ważnych jonów fizjologicznych, takich jak K+ lub Ca2+, w celu wywołania lub zapobieżenia uwalnianiu neuroprzekaźnika.
Stymulacja o wysokim K+ jest często używana w neurobiologii do stymulowania aktywności neuronalnej nie tylko u obudzonych zwierząt, ale także w kulturach pierwotnych i organotypowych. Narażenie zdrowego ośrodkowego układu nerwowego na roztwory o wysokich stężeniach K+ (40-100 mM) wywołuje wypływ neuroprzekaźników28. Ta zdolność neuronów do zapewnienia dodatkowego uwalniania w odpowiedzi na wysoki poziom K+ może być zagrożona u zwierząt z padaczką1 i w innych chorobach neurodegeneracyjnych29,30. Podobnie, deprywacja Ca2 + (uzyskana przez perfuzję roztworów wolnych od Ca2 +) jest wykorzystywana do ustalenia zależnego od wapnia uwalniania większości neuroprzekaźników mierzonego za pomocą mikrodializy. Powszechnie uważa się, że uwalnianie zależne od Ca2+ jest pochodzenia neuronalnego, podczas gdy uwalnianie niezależne od Ca2+ pochodzi z gleju, ale wiele badań wzbudziło kontrowersje co do znaczenia wrażliwych na Ca2+ pomiarów np. glutaminianu lub GABA9: dlatego, jeśli to możliwe, wskazane jest wspieranie badań mikrodializ badaniami mikrosensorowymi, ponieważ te ostatnie mają wyższą rozdzielczość przestrzenną, a elektrody pozwalają zbliżyć się do synaps31.
Jeśli chodzi o badania mikrodializy u zwierząt z padaczką, ważne jest, aby podkreślić, że dane uzyskane od większości z nich opierają się na monitorowaniu wideo lub wideo-EEG napadów, tj. przejściowego występowania oznak i/lub objawów z powodu nieprawidłowej nadmiernej lub synchronicznej aktywności neuronalnej w mózgu32. Istnieją pewne cechy charakterystyczne napadów elektrograficznych u zwierząt leczonych pilokarpiną, które należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania doświadczenia. Po spontanicznych napadach następuje depresyjna aktywność z częstymi skokami międzynapadowymi EEG3 i występują w klastrach33,34. Zwierzęta nieepileptyczne operowane pozorami mogą wykazywać aktywność podobną do napadów padaczkowych35 i dlatego parametry oceny zapisów EEG powinny być ustandaryzowane36 i, jeśli to możliwe, czas sesji mikrodializy powinien być dobrze zdefiniowany. Na koniec zdecydowanie zalecamy przestrzeganie zasad i standardów metodologicznych monitorowania wideo-EEG u dorosłych gryzoni z grupy kontrolnej, przedstawionych przez ekspertów z Międzynarodowej Ligi Przeciwko Padaczce i Amerykańskiego Towarzystwa Epilepsji w ich najnowszych raportach37,38.
Tutaj opisujemy mikrodializę glutaminianu i asparaginianu równolegle z długoterminowymi zapisami wideo EEG u zwierząt z padaczką i ich analizą w dializacie za pomocą HPLC. Położymy nacisk na krytyczne kroki protokołu, o które należy zadbać, aby uzyskać najlepszy wynik.

<table><tbody><tr><td>3-kanałowa dwuskrętna elektroda</td><td>Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA</td><td>MS333/3-B/SPC</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula prowadząca</td> po materiałach <td>Agn Tho's, Lindig&ouml;, Szwecja</td><td>MAB 4.15.IC</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>Żywica KK2 Plastik</td><td>Elettra Sport, Lecco, Włochy</td><td>Materiał KK2</td><td></td></tr><tr><td>Żel Super Attack Loctite</td><td>Henkel Italia Srl, Mediolan, Włochy</td><td>2047420_71941</td><td>materiał</td></tr><tr><td>Imalgene-Ketamine</td><td>Merial, Tuluza, Francja</td><td>221300288 (AIC)</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma, Milano, Italy</td><td>X1251</td><td>Material</td></tr><tr><td>Isoflurane-Vet</td><td>Merial, Tuluza, Francja</td><td>103120022 (AIC)</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Altadol 50 mg / ml - tramadol</td><td>Formevet, Milano, Włochy</td><td>103703017 (AIC)</td><td>Solution</td></tr><tr><td>Gentalyn 0,1% crm - gentamycyna</td><td>MSD Italia, Roma, Włochy</td><td>20891077 (AIC)</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>simplex szybki cement dentystyczny</td><td>Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Wielka Brytania</td><td>ACR811</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>GlasIonomer CX-Plus Cement</td><td>Shofu, Kioto, Japonia</td><td>PN1167</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt klipsa do sondy</td> materiału <td>Agn Tho's, Lindig&ouml;, Szwecja</td><td>p/n 100 5001</td><td>Wyposażenie</td></tr><tr><td>Histoacryl&reg; Niebieski miejscowy klej do skóry</td><td>TissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USA</td><td>TS1050044FP</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>Valium 10 mg/2 ml - diazepam</td><td>Roche, Monza, Włochy</td><td>019995063 (AIC)</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka z igłą 25G</td><td>Vetrotecnica, Padwa, Włochy</td><td>11.3500.05</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>elastyczna igła do karmienia szczura 17G</td><td>Agn Tho's, Lindig&ouml; Szwecja</td><td>7206</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>Aparatura do technologii trawy</td><td>Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Kalifornia, USA</td><td>M665G08</td><td>Sprzęt (wzmacniacz AS40, skrzynka główna, połączeniowe, telefaktor model RPSA S40)</td></tr> <tr><td>modułowa akwizycja danych i&nbsp; system analityczny MP150</td><td>Biopac, Goleta, Kalifornia, USA</td><td>MP150WSW</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>cyfrowy system nadzoru wizyjnego</td><td>AverMedia Technologies, Fremont, Kalifornia, USA</td><td>V4.7.0041FD</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>do mikrodializy</td><td>Agn Tho's, Lindig&ouml; Szwecja</td><td>MAB 4.15.1.Cu</td><td>Materiałowa</td></tr><tr><td>sonda do mikrodializy</td><td>Synaptech, Colorado Springs, Kolorado, USA</td><td>S-8010</td><td>Materiałowy</td></tr><tr><td>grzejnik</td><td>blokowy Grant Instruments, Cambridge, Anglia</td><td>QBD2</td><td>Mieszadło sprzętowe</td></tr><tr><td></td><td>Cecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Włochy</td><td>711</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>pompy infuzyjnej</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>864</td><td>sprzęt</td></tr><tr>rurki <td>polietylenowe o drobnym otworze</td><td>Smiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA</td><td>800/100/100/100</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>niebieskie adaptery rurowe</td><td>Agn Tho's, Lindig&ouml; Szwecja</td><td>1002</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>czerwone adaptery rur</td><td>Agn Tho's, Lindig&ouml; Szwecja</td><td>1003</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>2,5 ml strzykawka z igłą 22G</td><td>Chemil, Padwa, Włochy</td><td>S02G22</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>nasadka na fiolkę</td><td>Cronus, Labicom, Ołomuniec, Czechy</td><td>VCA-1004TB-100</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>przegrody</td><td>Thermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USA</td><td>National C4013-60 Przegroda 8 mm TEF/SIL Materiał</td><td></td></tr><tr><td>szklany wkład z dolną sprężyną</td><td>Supelco, Sigma, Mediolan, Włochy</td><td>27400-U</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka z autosamplerem</td> materiału <td>National Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, Włochy</td><td>C4013-2</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>Sterownik systemu i jednostka odgazowująca Smartline manager 5000</td><td>Knauer, Berlin, Niemcy</td><td>Wyposażenie V7602</td><td>Pompa</td></tr><tr><td>o nachyleniu czwartorzędowym Smartline 1000</td><td>Knauer, Berlin, Niemcy</td><td>Wyposażenie</td><td></td></tr> <tr><td>V7603detektor spektrofluorometryczny</td><td>Shimadzu, Kioto, Japonia</td><td>RF-551</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna</td><td>Knauer, Berlin, Niemcy</td><td>25EK181EBJ</td><td>Materiał</td></tr><tr><td>chromatogrficzna kolumna wstępna</td><td>Knauer, Berlin, Niemcy</td><td>P5DK181EBJ</td><td>Materiał:</td></tr><tr><td>roztwór fazy ruchomej A</td><td>0,1 M bufor fosforanu sodu, pH 6,0</td><td></td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>fazy ruchomej, roztwór B</td><td>40% 0,1 M bufor fosforanu sodu, 30% metanol, 30% acetonitryl, pH 6,5</td><td></td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>Skład roztworu Ringera</td><td>w mM: MgCl2 0,85, KCl 2,7, NaCl 148, CaCl2 1,2, 0,3% BSA</td><td>Zmodyfikowany roztwór</td>Skład roztworu <td></td></tr><tr><td>Ringera</td><td>w mM: MgCl2 0,85, KCl 100, NaCl 50,7, CaCl2 1,2, 0,3% BSA</td><td>Roztwór</td>soli fizjologicznej <td></td></tr><tr><td></td><td>0,9% NaCl, ph dostosowane do 7,0</td><td></td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>sacharozy</td><td>10% sacharozy w wodzie</td><td></td> destylowanej <td>Roztwór</td></tr></tbody></table>

mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów eeg u swobodnie poruszających się szczurów

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Mikrodializa jest dobrze znaną techniką neurobiologiczną, która koreluje zmiany neurologicznie aktywnych substancji dyfundujących do przestrzeni śródmiąższowej mózgu z zachowaniem i/lub konkretnym wynikiem patologii (np. napady padaczkowe). Podczas badania padaczki technika mikrodializy jest często łączona z krótkotrwałym lub nawet długoterminowym monitorowaniem wideoelektroencefalografii (EEG) w celu oceny częstości napadów spontanicznych, ich nasilenia, progresji i grupowania. Kombinowana mikrodializa-EEG opiera się na zastosowaniu kilku metod i instrumentów. Tutaj przeprowadziliśmy mikrodializę in vivo i ciągły zapis wideo EEG w celu monitorowania odpływu glutaminianu i asparaginianu w czasie, w różnych fazach naturalnej historii padaczki w modelu szczurzym. To połączone podejście pozwala na powiązanie zmian w uwalnianiu neuroprzekaźników z określonymi etapami rozwoju i progresji choroby. Stężenie aminokwasów w dializacie oznaczono metodą chromatografii cieczowej. W tym miejscu opisano metody i nakreślono główne środki ostrożności, które należy podjąć podczas mikrodializy in vivo-EEG, ze szczególnym uwzględnieniem chirurgii stereotaktycznej, stymulacji bazowej i wysokiej zawartości potasu podczas mikrodializy, zapisu EEG na elektrodzie głębokości oraz analizy asparaginianu i glutaminianu w dializacie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Podejście to można dostosować do testowania różnych zmian fizjologicznych stężeń asparaginianu i glutaminianu w mózgu, wywołanych lekami lub chorobami. W zależności od dostępności odpowiedniego testu analitycznego, może on być dalej wykorzystywany do badania różnych rozpuszczalnych cząsteczek przy jednoczesnym zastosowaniu zapisu EEG.

Odzyskiwanie sondy
Średnia wydajność odzysku (tj. średnia zawartość aminokwasów w perfuzacie wyrażona jako procent zawartości w równym objętości roztworze z fiolki) wynosiła 15,49 ± 0,42% przy szybkości przepływu 2 μL/min oraz 6,32 ± 0,64 przy 3 μL/min dla glutaminianu oraz 14,89 ± 0,36% przy szybkości przepływu 2 μL/min i 10,13 ± 0,51 przy 3 μL/min dla asparaginianu przy zastosowaniu sondy z membraną z kuprofanu. W przypa...

Tutaj opisujemy metodę mikrodializy in vivo do analizy uwalniania asparaginianu i glutaminianu w brzusznym hipokampie u szczurów z padaczką i bez padaczki, w połączeniu z zapisami EEG. Zewnątrzkomórkowe stężenia asparaginianu i glutaminianu mogą być skorelowane z różnymi fazami choroby.

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neuronaukach, takie jak zmiany w neurochemii podczas naturalnej historii chorób neurologicznych. Główną zaletą proponowanej techniki mikrodializy EEG jest to, że takie łączone podejście pozwala na parowanie zmian w uwalnianiu neuroprzekaźników w określonych etapach rozwoju i progresji choroby. Zacznij od włączenia amplifier umieszczony na zewnątrz klatki Faradaya.Otwórz oprogramowanie EEG i rozpocznij akwizycję EEG i obserwuj sygnał EEG wytwarzany przez niepodłączone. Następnie podłącz zwierzę do systemu rejestracji EEG na uwięzi, trzymając głowę zwierzęcia między dwoma rozciągniętymi palcami jednej ręki i przykręcając łączniki do cokołu elektrody drugą wolną ręką. Ustaw współczynnik wzmocnienia na każdym kanale wzmacniacza zgodnie z sygnałem elektrody pojedynczego zwierzęcia, aby sygnał EEG był w skali.Następnie pozwól zwierzęciu eksplorować nową klatkę przez co najmniej godzinę pod bezpośrednią obserwacją badacza. Dostosuj do towaru zwierzęcia i upewnij się, że nie przeszkadzają w ruchach zwierzęcia i pozycji leżącej. Na koniec sprawdź, czy kadrowanie obrazu na kamerach wideo jest prawidłowe, a następnie rozpocznij zapis wideo EEG.Zacznij od przygotowania sond do mikrodializy do pierwszego użycia zgodnie z instrukcją obsługi producenta i napełnij je roztworem Ringera. Następnie wytnij 10-centymetrowe kawałki rurki FEP i podłącz je do kaniul wlotowych i wylotowych sondy za pomocą adapterów rurek w różnych kolorach. Upewnij się, że rurki stykają się z adapterami bez martwych przestrzeni we wszystkich połączeniach.Wyjmij atrapę kaniuli z prowadnicy za pomocą pęsety, mocno trzymając głowę zwierzęcia. Włóż sondę do mikrodializy do kaniuli prowadzącej i użyj plasteliny, aby jeszcze bardziej ujędrnić kaniulę. Następnie podłącz zwierzę do systemu rejestracji EEG na uwięzi.Następnie włóż zwierzę do cylindra z pleksi i pozwól mu eksplorować nowe środowisko. Śledź obudzone i swobodnie poruszające się ruchy szczurów. Następnie podłącz wlot sondy do strzykawki o pojemności 2,5 mililitra za pomocą igły o rozmiarze 22 zawierającej roztwór Ringera za pomocą adapterów rurek.Wepchnij jeden mililitr roztworu Ringera do sondy w ciągu 10 sekund, ciągle popychając tłok strzykawki o pojemności 2,5 mililitra. Sprawdź, czy na wylocie nie pojawiła się kropla płynu, aby oznaczyć, kiedy sonda jest gotowa do użycia. Na koniec napełnij 2,5-mililitrowe strzykawki podłączone do rurki FEP za pomocą adapterów rurek z roztworem Ringera i zamontuj je na pompie infuzyjnej.Uruchom pompę z prędkością dwóch mikrolitrów na minutę i pozwól jej pracować przez noc. Po zweryfikowaniu za pomocą zapisów wideo EEG braku napadów w ciągu trzech godzin poprzedzających pobranie próbki, należy zatrzymać pompę przenoszącą kaniulowane strzykawki z rurką FEP wypełnione roztworem Ringera. Zamontuj kolejny zestaw strzykawek o pojemności 2,5 mililitra połączonych z rurką FEP za pomocą adapterów rurek wypełnionych zmodyfikowanym roztworem Ringera zawierającym 100-milimolowy roztwór potasu.Uruchom pompę z prędkością dwóch mikrolitrów na minutę i pozwól jej pracować. Sprawdź, czy w systemie nie ma pęcherzyków powietrza i upewnij się, że przewód styka się z adapterami bez martwych przestrzeni we wszystkich połączeniach. Następnie sprawdź, czy na wylocie nie pojawiła się kropla płynu, aby oznaczyć, kiedy sonda jest gotowa do użycia.Następnie podłącz rurkę FEP strzykawek wypełnionych roztworem Ringera do kaniuli wlotowej sondy w każdym zwierzęciu i poczekaj na pojawienie się kropli cieczy na końcówce wylotu. Podłącz wylot sondy do rurki FEP, która prowadzi do zbierania w probówce. Włóż rurkę FEP do zamkniętej probówki o pojemności 0,2 mililitra z perforowaną nasadką i upewnij się, że rurka pozostaje na swoim miejscu, mocując ją kawałkiem plasteliny.Po uruchomieniu pompy z prędkością dwóch mikrolitrów na minutę przez 60 minut bez pobierania próbek w celu zrównoważenia systemu, należy pobrać pięć kolejnych 30-minutowych próbek dializatu w warunkach wyjściowych i przechowywać próbki na lodzie. Po 10 minutach przełączyć rurkę ze strzykawek zawierających 100-milimolowy roztwór potasu Ringera na normalny roztwór Ringera i pozwolić pompie pracować. Po pobraniu piątego dializatu po równowadze należy zbierać 20 mikrolitrowych frakcji dialiatu co 10 minut przez jedną godzinę.Następnie pobrać trzy dodatkowe 30-minutowe próbki dializatu i zatrzymać pompę. Na koniec należy przechowywać próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza po doświadczeniu do czasu analizy HPLC. Po zakończeniu eksperymentu przepłucz zużyte sondy do mikrodializy wodą destylowaną i przechowuj je w fiolce wypełnionej czystą wodą destylowaną do następnego użycia.Na koniec przepłucz cały zestaw do mikrodializy wodą destylowaną, a następnie 70% etanolem. Zastąp etanol powietrzem i przechowuj zestaw w sterylnym środowisku. Są to reprezentatywne ślady EEG zarejestrowane w hipokampie szczurów kontrolnych i padaczkowych w przewlekłej fazie choroby.Nie zaobserwowano żadnych zmian w EEG u szczurów kontrolnych, podczas gdy zsynchronizowaną napadową aktywność padaczkową obserwowano około 500 milisekund przed i podczas napadów behawioralnych u szczurów padaczkowych. Podstawowe stężenie glutaminianu stwierdzone u szczurów z przewlekłą padaczką było znacznie wyższe niż u zwierząt kontrolnych. Wysoki poziom potasu powodował dodatkowe uwalnianie glutaminianu przez około 30 minut u szczurów kontrolnych i przez około 60 minut u szczurów przewlekle chorych na padaczkę.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że zwierzęta, którym wszczepiono urządzenie, mają skłonność do utraty go w trakcie długotrwałego eksperymentu, dlatego należy użyć lekkiego zestawu głowic i wystarczająco długich, aby uniknąć zakłócania mobilności zwierząt. W zależności od dostępności odpowiedniego eseju analitycznego, metoda może być dalej stosowana do badania różnych rozpuszczalnych cząsteczek w mózgu przy jednoczesnym zastosowaniu zapisu EEG. Po opracowaniu technika ta pozwoliła naukowcom zajmującym się epileptologią na uzyskanie wglądu w zmiany w neuroprzekaźnictwie pobudzającym w przypadku padaczki skroniowej.Ufamy, że po obejrzeniu tego filmu lepiej zrozumiesz, jak wykonywać mikrodializy in vivo wraz z zapisem EEG na elektrodzie głębinowej u swobodnie poruszającego się szczura z padaczką.

microdialysis-excitatory-amino-acids-during-eeg-recordings-freely

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje test oparty na matrycy mikroelektrod do badania aktywności sieci neuronalnej w odcinkach rdzenia kręgowego myszy. Najpierw rejestruje się aktywność elektrofizjologiczną z powierzchownego rogu grzbietowego (SDH) warstwy. Następnie wprowadza się inhibitor kanału potasowego w celu przedłużenia depolaryzacji, co skutkuje synchroniczną aktywnością rytmiczną w całej sieci neuronalnej.

Oparta na mikroelektrodach ocena sieci neuronalnych w wycinkach rdzenia kręgowego myszy

Ten film pokazuje elektroencefalograficzny (EEG) zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką. Szczur z elektrodami wszczepionymi w brzuszny hipokamp podłącza się do systemu rejestracji EEG i umieszcza w komorze z pleksi. Szczur może się swobodnie poruszać, podczas gdy aktywność mózgu jest rejestrowana w celu monitorowania występowania napadów.

Elektroencefalograficzny zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką

Źródło: Soukupová, M., et al. Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia ocenę poziomu zewnątrzkomórkowego neuroprzekaźnika pobudzającego u szczurów z przewlekłą indukcją padaczki. Po wszczepieniu sondy do mikrodializy do mózgu i potwierdzeniu braku napadów za pomocą elektroencefalografii (EEG), pobiera się płyn zewnątrzkomórkowy w celu oceny podwyższonego poziomu neuroprzekaźników u szczurów z...

Ocena poziomu neuroprzekaźników pobudzających u szczurów z przewlekłą padaczką

Źródło: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restricted Rats. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje metodę zestawiania nagrań komórkowych i barwienia u skrępowanego, przytomnego szczura. Zabieg polega na rejestrowaniu sygnałów z neuronów i wstrzykiwaniu barwnika w celu precyzyjnej lokalizacji miejsca zapisu. Technika ta pozwala na dokładne odwzorowanie aktywności neuronalnej na anatomiczną strukturę...

Zapis i barwienie Juxtacellular w celu precyzyjnego mapowania aktywności neuronalnej u obudzonego szczura 

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

To badanie bada nowatorskie zastosowanie technologii matryc mikroelektrod opartych na enzymach (MEA) do monitorowania in vivo aktywności neuroprzekaźników  u prosiąt.Postawiono hipotezę, że rozregulowanie glutaminianu przyczynia się do mechanizmu neurotoksyczności znieczulającej. W tym miejscu przedstawiamy protokół adaptacji technologii MEA do badania mechanizmu neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem.

Adaptacja technologii matryc mikroelektrod do badania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem w nienaruszonym mózgu prosiąt

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Przedstawiono połączone użycie technologii matryc mikroelektrod i stymulacji chemicznej indukowanej 4-aminopirydyną do badania aktywności nocyceptywnej na poziomie sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego.

Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

Protokół opisuje metodologię zewnątrzkomórkowego zapisu w korze ruchowej (MC) w celu ujawnienia zewnątrzkomórkowych właściwości elektrofizjologicznych u swobodnie poruszających się świadomych myszy, a także analizę danych lokalnych potencjałów pola (LFP) i skoków, co jest przydatne do oceny aktywności neuronalnej sieci leżącej u podstaw interesujących zachowań.

Wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy w swobodnie poruszających się myszach

Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.

Opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłej wielomiejscowej elektroencefalografii u swobodnie poruszających się myszy

Poznaj metodę mikrodializy in vivo z zapisami EEG u swobodnie poruszających się szczurów, służącą analizie uwalniania glutaminianu i asparaginianu w hipokampie. Technika ta pozwala badać zmiany neurochemiczne związane z rozwojem epilepsji.

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

Przeglądaj więcej filmów