Name: Metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Poznaj metodę in vivo do oceny przepuszczalności bariery jelitowo-krwionośnej u szczurów z wykorzystaniem pobierania krwi z żyły wrotnej. Technika ta pozwala również mierzyć klirens wątrobowy metabolitów bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca jest wspierana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Rzeczypospolitej Polskiej, Diamentowy grant nr: DI2017 009247.

Doświadczenia przeprowadzono na samcach szczurów Wistar Kyoto zgodnie z Dyrektywą 2010/63 UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych; projekt został zatwierdzony przez I Lokalną Komisję Bioetyczną w Warszawie.
1. Wprowadzenie kaniuli do podawania doodżelniczego
UWAGA: W niniejszym protokole proponujemy podanie markeru do jelita grubego za pomocą cewnika. Metodę tę można zmodyfikować, stosując podanie doustne lub zgłębnik w różnych odcinkach przewodu pokarmowego, np. w żołądku lub dwunastnicy. Należy pamiętać o użyciu jednorazowej odzieży chirurgicznej, w tym fartucha chirurgicznego, czepka i rękawiczek, oraz o przestrzeganiu zasad bezpieczeństwa dotyczących ostrych narzędzi używanych podczas operacji (igieł itp.) w krokach 1-6.
<ol>
	<li>Zastosować post u zwierząt przez noc przed zabiegiem. Wszystkie procedury należy przeprowadzić w znieczuleniu ogólnym, t. j. uzyskaną poprzez wstrzyknięcie uretanu w dawce 1,5 g/kg mc d.o. Prawidłowe znieczulenie należy ocenić na podstawie braku odruchów powiekowych i rogówkowych oraz metodą ucisku palców i ogona.</li>
	<li>Użyj pediatrycznego cewnika Foleya (10F lub 8F) jako cewnika okrężniczego. Zaznacz cewnik, aby wskazać część, która zostanie wprowadzona do okrężnicy (około 8 cm).</li>
	<li>Przed wprowadzeniem cewnika do jelita grubego należy sprawdzić obszar odbytu oraz zawartość kałową w odbytnicy. W przypadku obecności kałowca należy opróżnić odbytnicę poprzez masaż tego obszaru.</li>
	<li>Nałóż środek smarny (np. (gliceryny lub wazeliny) wzdłuż cewnika. Nawilżyć odbyt i jego okolice środkiem smarującym.</li>
	<li>Wprowadź cewnik z prowadnicą przybliżeniu 8 cm przez zewnętrzny zwieracz odbytu. Wykonuj powolne ruchy przód-tył oraz okrężne. 
	UWAGA: Podczas wprowadzania cewnika należy stale kontrolować jego położenie poprzez palpację brzucha.</li>
</ol>
2. Cewnikowanie żyły głównej dolnej
<ol>
	<li>Ogolić futro w pachwinie. Odkaź skórę naprzemiennie alkoholem i jodkiem powidonu 3 razy, a następnie przykryć obszar pachwiny sterylnymi chustami chirurgicznymi.</li>
	<li>Zlokalizować tętno na tętnicy udowej i naciąć skórę wzdłużnie na długości około 2,0 cm w miejscu, w którym tętno jest wyczuwalne.</li>
	<li>Rozdzielić powięź i mięśnie, aby uwidocznić pęczek naczyniowo-nerwowy.</li>
	<li>Wypreparować żyłę udową z pęczka naczyniowo-nerwowego: najpierw nerwy, następnie tętnicę udową, a na końcu żyłę. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas preparowania pęczka naczyniowo-nerwowego, ponieważ niewielkie odgałęzienia żyły udowej mogą zostać łatwo uszkodzone, co spowoduje krwawienie.</li>
	<li>Nałożyć dwie podwiązki na żyłę udową. Nie zawiązywać jeszcze węzłów. Złapać końce podwiązki proksymalnej za pomocą uchwytu do igieł.</li>
	<li>Ostrożnie pociągnąć końce podwiązki uchwytem do góry, aby zamknąć proksymalną część żyły. Odczekać, aż żyła wypełni się krwią, i zawiązać węzeł dystalny.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek mikrosurgicalnych wykonać małe nacięcie (ok. 1 mm) na żyle pomiędzy węzłem a podwiązką proksymalną. Wprowadzić cewnik za pomocą pęsety lub igły z zakrzywionym końcem. 
	UWAGA: Nakłuć żyłę i wykorzystać zgięty czubek igły jako prowadnicę dla cewnika. Poluzować podwiązkę proksymalną podczas wprowadzania cewnika. Wprowadzić cewnik na głębokość 6-7,0 cm.</li>
	<li>Zabezpieczyć cewnik w żyle udowej za pomocą dwóch pojedynczych węzłów chirurgicznych. Zawiązać również podwiązkę proksymalną.</li>
	<li>Sprawdzić drożność cewnika, próbując pobrać krew za pomocą strzykawki. Przepłukać cewnik 0,3 mL soli fizjologicznej z heparyną (10 units/mL).</li>
	<li>Zamknąć ranę chirurgiczną za pomocą dwóch warstw pojedynczych szwów.</li>
</ol>
3. Cewnikowanie żyły wrotnej
<img alt="Schemat techniki szycia; oznaczone pozycje igły, nici i węzła w celu szkolenia chirurgicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58456/58456fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Kaniula portalna. Kaniula wrotna składa się z igły o średnicy zewnętrznej (OD) 0,9 mm i długości około 25,0 mm [A], elastycznego cewnika poliuretanowego o średnicy zewnętrznej (OD) 0,025" i długości około 10,0 mm [B], elastycznego końcówki cewnika z polietylenu o średnicy zewnętrznej (OD) 0,040" i długości około 15,0 mm [C], korka [D] oraz ligatury 3/0 o długości 10,0 mm [E]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58456/58456fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<ol>
	<li>Przygotuj cewnik wrotny zgodnie z Rysunkiem 1.
	<ol>
		<li>Wprowadź odcięty koniec igły (OD: 9 mm) do poliuretanowego cewnika o średnicy zewnętrznej OD: 0.025".</li>
		<li>Zwiąż ligature 3/0 w miejscu połączenia igły z cewnikiem. 
		UWAGA: Upewnij się, że dłuższa część ligature ma co najmniej 6 cm długości.</li>
		<li>Wprowadź koniec cewnika OD: 0.025" do cewnika polietylenowego o średnicy zewnętrznej OD: 0.040".</li>
		<li>Zamknij cewnik metalowym lub plastikowym korkiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Laparotomia pośrodkowa
	<ol>
		<li>Wygoła sierść w obrębie brzucha, zdezynfekuj skórę naprzemiennie alkoholem i povidone iodine 3 razy, a następnie zabezpiecz obszar chustami chirurgicznymi.</li>
		<li>Wykonaj podłużne cięcie skóry od wyrostka mieczowatego mostka do pępka.</li>
		<li>Przetnij mięśnie ściany brzucha wzdłuż białej linii.</li>
		<li>Rozszerz cięcie w kierunku rostralnym w kształcie litery Y, tak aby chrząstka mieczowata znajdowała się pomiędzy dwoma cięciami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Disekcja żyły wrotnej
	<ol>
		<li>Zwilż tampony chirurgiczne solą fizjologiczną.</li>
		<li>Wyprowadź na zewnątrz kątnicę, okrężnicę wstępującą i poprzeczną oraz pętle jelita cienkiego. Przesuń jelita na lewą stronę, aby odsłonić korzeń krezki. 
		UWAGA: Przykryj jelita gazą zwilżoną solą fizjologiczną, aby zapobiec ich wysychaniu.</li>
		<li>Aby odsłonić żyłę wrotną, ostrożnie odsuń zwilżonymi tamponami płaty wątroby na boki lub w górę w stronę przepony.</li>
		<li>Zlokalizuj odcinek żyły wrotnej nieprzykryty krezką (w wnęce wątroby, o długości około 5 mm) i przeprowadź ligature 3/0 (o długości 15 cm) pod żyłą wrotną. 
		UWAGA: Aby chronić tkanki przed uszkodzeniem podczas zakładania ligature, zwilż ją roztworem soli fizjologicznej.</li>
		<li>Zaciśnij końce ligature kleszczykami i delikatnie ją napnij, aby ustabilizować naczynie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzenie i stabilizacja cewnika
	<ol>
		<li>Przeprowadź dłuższą część ligature cewnika wrotnego pod wolnym odcinkiem żyły wrotnej i pociągnij ją tak, aby cewnik znajdował się bezpośrednio przy żyle wrotnej.</li>
		<li>Wprowadź igłę do żyły krezkowej górnej 3 mm poniżej miejsca połączenia żyły krezkowej górnej z żyłą wrotną. Trzymaj igłę pod kątem 30° i po wprowadzeniu do żyły zmniejsz kąt i przesuwaj igłę niemal poziomo, równolegle do żyły wrotnej. 
		UWAGA: Wprowadź igłę na długość około 6-7 mm. Stabilizująca ligature powinna delikatnie uciskać żyłę wrotną podczas wprowadzania cewnika.</li>
		<li>Nanieś 1-2 krople kleju tkankowego w miejscu wprowadzenia igły. Usuń tampony zakrywające wątrobę.</li>
		<li>Wprowadź jelita z powrotem do jamy brzusznej.</li>
		<li>Zwilż jelita ogrzanym roztworem soli fizjologicznej i przykryj je zwilżoną sterylną gazą.</li>
		<li>Sprawdź drożność cewnika i przemyj go 0,3 mL soli fizjologicznej z heparyną (10 units/mL). 
		UWAGA: Krew żylna samoistnie cofie się do cewnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakończenie operacji
	<ol>
		<li>Po 5 minutach sprawdź kolor jelit oraz ruchy perystaltyczne; upewnij się, że utrzymany jest prawidłowy przepływ krwi w krezce.</li>
		<li>Zamknij jamę brzuszną za pomocą 3 szwów: otrzewnę z wewnętrzną warstwą mięśni ściany brzucha — szew ciągły, wchłanialny; pozostałe mięśnie ściany brzucha — szew ciągły, wchłanialny; skórę i tkankę podskórną — szwy pojedyncze, niewchłanialne. 
		UWAGA: Wyprowadź dystalną część cewnika w okolicy pępka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pobieranie krwi z żyły wrotnej
<ol>
	<li>Pobierać próbki krwi z żyły wrotnej w czasie określonym w konkretnym protokole badawczym; patrz Tabela 1.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Krótki protokół</td>
			<td >Długi protokół</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >t0 – poziom podstawowy (przed podaniem do jelita grubego)</td>
			<td >t0 – poziom podstawowy (przed podaniem do jelita grubego)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >t1 – 5 min po podaniu do jelita grubego</td>
			<td >t1 – 30 min po podaniu do jelita grubego</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >t2 – 30 min po podaniu do jelita grubego</td>
			<td >t2 – 60 min po podaniu do jelita grubego</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Protokoły pobierania krwi z żyły wrotnej w celu oceny przepuszczalności jelit.
UWAGA: Odstęp czasu między kolejnymi pobraniami krwi zależy głównie od biodostępności testowanych substancji oraz miejsca podania (jelito grube, żołądek itp.).
<ol start="2">
	<li>Otwórz korek cewnika portalnego i pozwól krwi swobodnie wypływać.</li>
	<li>Używając strzykawki (obj. 2 mL) i tępej igły o średnicy zewnętrznej 0,9 mm, pobierz nie więcej niż 0,7 mL krwi.</li>
	<li>Przepłucz cewnik 0,3 mL soli fizjologicznej z heparyną (10 jednostek/mL) i zamknij korek cewnika.</li>
</ol>
5. Pobieranie krwi z żyły głównej dolnej
<ol>
	<li>Pobieraj próbki krwi z żyły głównej dolnej w czasie określonym zgodnie ze stosowanym protokołem testowym; patrz Tabela 2.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Żyła wrotna</td>
			<td>Żyła główna dolna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>t0 – poziom wyjściowy (przed podaniem do jelita grubego)</td>
			<td>t0 – poziom wyjściowy (przed podaniem do jelita grubego)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.1 – 30 min po podaniu dopojętniczym</td>
			<td>t1 – 30 min po podaniu do jelita grubego</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Protokół pobierania krwi do pomiaru klirensu wątrobowego i śledzenia ścieżki krew jelitowa-wrotna-wątroba-krew systemiczna.
<ol start="2">
	<li>Otwórz korek cewnika żyły głównej dolnej i pozwól krwi swobodnie przepływać.</li>
	<li>Pobierz nie więcej niż 0.7 mL krwi za pomocą strzykawki (vol. 2 mL) i igły o średnicy zewnętrznej (OD): 0.9mm.</li>
	<li>Przepłucz cewnik 0.2-0.3 mL soli fizjologicznej z heparyną (10 units/mL) i zamknij korek cewnika.</li>
</ol>
6. Podawanie markera przepuszczalności jelitowej
<ol>
	<li>Usuń drut prowadzący i napompuj balon cewnika jelita grubego, używając odpowiedniej objętości sterylnej wody (zazwyczaj 1 mL, ale należy sprawdzić rzeczywisty rozmiar balonu przed wprowadzeniem). 
	UWAGA: Średnica balonu nie powinna przekraczać 1 cm.</li>
	<li>Ustaw szczura głową w dół (nachylenie około 15%), aby zminimalizować ryzyko wypływu podanego roztworu z jelita grubego.</li>
	<li>Powoli podaj badaną substancję (np. trimetyloaminę, 10 mg/kg mc) za pomocą portu odpływowego w cewniku jelita grubego. 
	UWAGA: Nie należy przekraczać objętości 0,75 mL podanego roztworu oraz prędkości podawania 0,5 mL/min, aby zapobiec wypływowi podanego roztworu przez odbyt.</li>
	<li>Po 10 min spuść powietrze z balonu cewnika.</li>
	<li>Pobierz krew z żyły głównej dolnej oraz żyły wrotnej zgodnie ze stosowanym protokołem badawczym; patrz Tabela 1 i Tabela 2.</li>
	<li>Uśmierć zwierzę zatwierdzoną metodą.</li>
</ol>
7. Obliczanie klirensu wątrobowego
<ol>
	<li>Wyrazić klirens wątrobowy, rozumiany jako ekstrakcja wątrobowa, poprzez różnicę między stężeniem we krwi w żyłach wrotnych a stężeniem we krwi w dolnej żyle głównej lub poprzez stosunek stężenia w dolnej żyle głównej do stężenia w krwi w żyłach wrotnych, (1 - (stężenie w dolnej żyle głównej/stężenie w żyłach wrotnych)).</li>
</ol>
8. Ocena stężenia substancji badawczej w próbkach krwi
<ol>
	<li>W zależności od substancji i metodologii testowej, poddać próbkę odpowiednim procedurom laboratoryjnym (wirowaniu itp.). W proponowanych protokołach oceniamy stężenie TMA/TMAO oraz SCFA przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z potrójną spektrometrią mas quadrupole. Szczegółowy opis metody znajduje się w Materiałach Suplementarnych.</li>
</ol>

<ol><li>Camilleri, M., Madsen, K., Spiller, R., Greenwood-Van Meerveld, B., Verne, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+function+in+health+and+gastrointestinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+and+Motility%3A+The+Official+Journal+of+the+European+Gastrointestinal+Motility+Society%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier function in health and gastrointestinal disease.</a> Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 24 (6), 503-512 (2012).</li>
<li>Keita, A. V., Soderholm, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier+and+its+regulation+by+neuroimmune+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+and+Motility%3A+The+Official+Journal+of+the+European+Gastrointestinal+Motility+Society%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier and its regulation by neuroimmune factors.</a> Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society. 22 (7), 718-733 (2010).</li>
<li>Farhadi, A., Banan, A., Fields, J., Keshavarzian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier%3A+an+interface+between+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier: an interface between health and disease.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (5), 479-497 (2003).</li>
<li>Jaworska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertension+in+rats+is+associated+with+an+increased+permeability+of+the+colon+to+TMA%2C+a+gut+bacteria+metabolite%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Hypertension in rats is associated with an increased permeability of the colon to TMA, a gut bacteria metabolite.</a> PloS one. 12 (12), e0189310(2017).</li>
<li>Fujii, H., Nakai, K., Fukagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+oxidative+stress+and+indoxyl+sulfate+in+progression+of+cardiovascular+disease+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Apheresis+and+Dialysis%3A+Official+Peer-Reviewed+Journal+of+the+International+Society+for+Apheresis%2C+the+Japanese+Society+for+Apheresis%2C+the+Japanese+Society+for+Dialysis+Therapy%22%5BJournal%5D)">Role of oxidative stress and indoxyl sulfate in progression of cardiovascular disease in chronic kidney disease.</a> Therapeutic Apheresis and Dialysis: Official Peer-Reviewed Journal of the International Society for Apheresis, the Japanese Society for Apheresis, the Japanese Society for Dialysis Therapy. 15 (2), 125-128 (2011).</li>
<li>Tomasova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracolonic+hydrogen+sulfide+lowers+blood+pressure+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%3A+Biology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intracolonic hydrogen sulfide lowers blood pressure in rats.</a> Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 60, 50-58 (2016).</li>
<li>Brahe, L. K., Astrup, A., Larsen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+butyrate+the+link+between+diet%2C+intestinal+microbiota+and+obesity-related+metabolic+diseases%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%3A+An+Official+Journal+of+the+International+Association+for+the+Study+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Is butyrate the link between diet, intestinal microbiota and obesity-related metabolic diseases?</a> Obesity Reviews: An Official Journal of the International Association for the Study of Obesity. 14 (12), 950-959 (2013).</li>
<li>Ufnal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethylamine-N-oxide%3A+a+carnitine-derived+metabolite+that+prolongs+the+hypertensive+effect+of+angiotensin+II+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Trimethylamine-N-oxide: a carnitine-derived metabolite that prolongs the hypertensive effect of angiotensin II in rats.</a> The Canadian Journal of Cardiology. 30 (12), 1700-1705 (2014).</li>
<li>Huc, T., Nowinski, A., Drapala, A., Konopelski, P., Ufnal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole+and+indoxyl+sulfate%2C+gut+bacteria+metabolites+of+tryptophan%2C+change+arterial+blood+pressure+via+peripheral+and+central+mechanisms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Indole and indoxyl sulfate, gut bacteria metabolites of tryptophan, change arterial blood pressure via peripheral and central mechanisms in rats.</a> Pharmacological Research. 130, 172-179 (2018).</li>
<li>Ufnal, M., Pham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-blood+barrier+permeability+-+A+new+marker+in+cardiovascular+and+metabolic+diseases%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">The gut-blood barrier permeability - A new marker in cardiovascular and metabolic diseases?</a> Medical Hypotheses. 98, 35-37 (2017).</li>
<li>Le Ferrec, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+intestinal+barrier.+The+report+and+recommendations+of+ECVAM+Workshop+46.+European+Centre+for+the+Validation+of+Alternative+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%3A+ATLA%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the intestinal barrier. The report and recommendations of ECVAM Workshop 46. European Centre for the Validation of Alternative methods.</a> Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 29 (6), 649-668 (2001).</li>
<li>Bohets, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+absorption+screening+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for absorption screening in drug discovery and development.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 1 (5), 367-383 (2001).</li>
<li>Grootjans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+assessment+of+barrier+integrity+and+function+of+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastrointestinal+Surgery%22%5BJournal%5D)">Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut.</a> World Journal of Gastrointestinal Surgery. 2 (3), 61-69 (2010).</li>
<li>Bielinska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+salt+intake+increases+plasma+trimethylamine+N-oxide+%28TMAO%29+concentration+and+produces+gut+dysbiosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition%22%5BJournal%5D)">High salt intake increases plasma trimethylamine N-oxide (TMAO) concentration and produces gut dysbiosis in rats.</a> Nutrition. 54, 33-39 (2018).</li>
<li>Clarke, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+Ussing+chamber+studies+of+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 296 (6), G1151-G1166 (2009).</li>
<li>Denno, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+lactulose+to+mannitol+ratio+to+evaluate+childhood+environmental+enteric+dysfunction%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the lactulose to mannitol ratio to evaluate childhood environmental enteric dysfunction: a systematic review.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 Suppl 4, S213-S219 (2014).</li>
<li>Lugea, A., Salas, A., Casalot, J., Guarner, F., Malagelada, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hydrophobicity+of+the+rat+colonic+mucosa+is+a+defensive+barrier+against+macromolecules+and+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Surface hydrophobicity of the rat colonic mucosa is a defensive barrier against macromolecules and toxins.</a> Gut. 46 (4), 515-521 (2000).</li>
<li>Bloemen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+chain+fatty+acids+exchange+across+the+gut+and+liver+in+humans+measured+at+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery.</a> Clinical Nutrition. 28 (6), 657-661 (2009).</li>
<li>Huc, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+hydrogen+sulfide+produces+portal+hypertension+and+systemic+hypotension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Colonic hydrogen sulfide produces portal hypertension and systemic hypotension in rats.</a> Experimental Biology and Medicine. 243 (1), 96-106 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana bezpośrednia, in vivo, metoda pomiaru przepuszczalności GBB utrzymuje warunki zbliżone do fizjologicznych w układzie pokarmowym (zachowuje przepływ krwi w jelitach) i praktycznie nie ma na nią wpływu czynność wątroby i nerek.
Krytycznym etapem tej techniki jest wprowadzenie cewnika wrotnego. Należy to zrobić delikatnie i jednocześnie zdecydowanie. Łagodne, krótkie krwawienie może wystąpić w wyniku prawidłowo wykonanego nakłucia żyły wrotnej; jednak zatrzymuje się po włożeniu i...

Bariera jelitowo-krwienna (GBB), znana również jako bariera jelitowa, to złożony wielowarstwowy system, który oddziela światło jelita od krwiobiegu, aby ograniczyć przepływ szkodliwych związków, jednocześnie umożliwiając wchłanianie składników odżywczych1. Składa się z trzech głównych warstw: warstwy śluzu, nabłonka i blaszki właściwej.
Liczne czynniki mogą wpływać na integralność i funkcję GBB2. Wykazano, że GBB jest zaburzony zarówno w chorobach przewodu pokarmowego, jak i pozajelitowych, w tym w chorobach układu krążenia i metabolicznych3, co może prowadzić do zwiększonego przepływu metabolitów bakteryjnych do krwioobiegu4. Zwiększona penetracja metabolitów bakteryjnych jelit może mieć wpływ na funkcjonowanie całego organizmu. Na przykład ostatnie badania wykazują znaczący wpływ metabolitów bakteryjnych, takich jak indole, H2S, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) i N-tlenek trimetyloaminy, na funkcje układu krążenia5,6,7,8,9. Wreszcie, zaproponowano, że zwiększona przepuszczalność GBB może służyć jako marker chorób sercowo-naczyniowych i metabolicznych, które są związane ze zmianami morfologicznymi i funkcjonalnymi w jelitach10. Dlatego śledzenie szlaku metabolitów bakteryjnych między jelitem a wrotną krwią - wątrobą - układem krwi może być interesujące zarówno dla nauk podstawowych, jak i klinicznych.
Powszechnie stosowane metody eksperymentalne do oceny przepuszczalności GBB są wykonywane in vitro przy użyciu wyciętych odcinków jelita, fragmentów błony śluzowej lub sztucznych błon11,12. Dokładność tych metod jest zagrożona przez fakt, że prawidłowe funkcjonowanie GBB wymaga stałego przepływu krwi w jelitach. Z drugiej strony, dostępne metody in vivo opierają się na ocenie stężeń markerów egzogennych w moczu lub krwi obwodowej 13. Jednak na stężenie związków egzogennych we krwi obwodowej i moczu ma wpływ czynność nerek, tj. szybkość filtracji kłębuszkowej i wydalanie kanalikowe, a także metabolizm wątroby, czyli metabolizm pierwszego przejścia. Oba parametry mogą się istotnie różnić między badanymi niezależnie od funkcji GBB.
Ten artykuł opisuje bezpośredni pomiar przepuszczalności GBB u szczurów za pomocą pobierania próbek krwi z portalu. Ta metoda in vivo zachowuje przepływ krwi w jelitach i praktycznie nie ma na nią wpływu czynność wątroby i nerek. Opisywane podejście nie jest powszechnie stosowane, być może ze względu na pewne trudności metodologiczne. Szczegółowo opisujemy cewnikowanie żyły wrotnej i żyły głównej dolnej tuż nad zbiegiem żyły wątrobowej. Pobieranie próbek krwi z żyły wrotnej i żyły głównej dolnej umożliwia ocenę przepuszczalności GBB i klirensu wątrobowego, a także śledzenie szlaku krew-wątroba-układ pokarmowy jelitowo-wrotny krwi-krwiobiegowy cząsteczek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak metabolity bakterii jelitowych lub leki. Prezentujemy również kilka zastosowań metody, które zostały przetestowane w naszym laboratorium. Obejmują one ocenę przepuszczalności jelita grubego dla TMA, metabolitu bakterii jelitowych, ocenę klirensu TMA z wątroby oraz ocenę szlaku jelitowo-wrotnego krew-wątroba-układ krwionośny SCFA.
Aby ocenić przepuszczalność bariery krew-jelito, należy postępować zgodnie z następującymi krokami protokołu, w kolejności: 1 (wprowadzenie linii do podawania jelita wkrętnego), 3 (cewnikowanie żyły wrotnej), 4 (pobieranie próbek krwi z żyły wrotnej), 6 (podanie markera przepuszczalności jelita), 4.
Aby ocenić klirens wątroby i szlak krew-wątroba-układ pokarmowy, należy postępować zgodnie z następującymi krokami protokołu, w kolejności: 1 (założenie linii do podawania jelitowego), 2 (cewnikowanie żyły głównej dolnej), 3 (cewnikowanie żyły wrotnej), 4 (pobieranie krwi z żyły wrotnej), 5 (pobieranie krwi z żyły głównej dolnej), 6 (podanie markera przepuszczalności jelita), 4, 5, 7 (obliczanie klirensu wątrobowego).

<table><tbody><tr><td>Średnica zewnętrzna igły: 9 mm</td><td>Becton Dickinson&nbsp; S.A.</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik polietylenowy ID: 0,025", OD: 0,040"&nbsp;</td><td>Towary naukowe, Inc.</td><td>#BB520-40</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik polietylenowy ID: 0,012", OD: 0,025"&nbsp;</td><td>Towary naukowe, Inc.</td><td>#BB520-25</td><td></td></tr><tr><td>Rurka C-Flex, nieprzezroczysta biała 1/50"ID x 1/12" OD&nbsp; &nbsp;</td><td>Cole-Parmer Instrument Co.</td><td>06424-59</td><td></td></tr><tr><td>Dziecięcy cewnik Foleya (rozmiar 10F lub 8F)&nbsp;</td><td>Sigmed</td><td>0000 80305</td><td></td></tr><tr><td>Ligatury chirurgiczne 3/0</td><td>Yavo Sp. z o.o.&nbsp;</td><td>P48JE</td><td></td></tr><tr><td>Wchłanialne nici chirurgiczne - Poliglaktyna 910 4/0</td><td>KRUUSE Polska Sp. Zo.o.</td><td></td><td></td>152336</tr><tr><td>Klej tkankowy - Loctite 454Klej cyjanoakrylowy</td><td>Loctite&nbsp;</td><td></td><td></td>1370127</tr><tr><td>Jod powidonu</td><td>EGIS Pharmaceuticals PLC</td><td>4449 11</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna - Heparyna WZF&nbsp;</td><td>WZF Polfa S.A.</td><td>02BK0417</td><td>Rozcieńczyć 10 razy solą fizjologiczną</td></tr><tr><td>Gliceryna 86%</td><td>Laboratorium Farmaceutyczne Avena</td><td>5.90999E+12</td><td>Służy jako lubrykant w cewnikowaniu jelita grubego</td></tr><tr><td>Xylocaine 2%</td><td>AstraZenca&nbsp;</td><td></td><td></td>9941342</tr><tr><td>Uretan</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)&nbsp;</td><td>U2500-500G</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trimetyloaminy 45%</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)&nbsp;</td><td>92262-1L</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 2 ml</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna 250 ml</td><td>Fraesenius Kabi Polska Sp. z o.o.</td><td>15LL707WL</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne, proste, długość 115 mm, 4 1/2" końcówki</td><td>Braun</td><td>NS-010-115-PKM</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki tętnicze typu Micro-Adson wygięte, długość 140 mm 5 1/2</td>" <td>Braun</td><td>KN-008-140-ZMK</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze anatomiczne, długość 95 mm, 3 3/4" ostre 0,7x0,55</td><td>Braun</td><td>PO-001-007-ZMK</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki typu Vannas,&nbsp; prosty, długość 85 mm, 3 3/8" długość ostrzy 6 mm</td><td>Braun&nbsp;</td><td>NO-010-085-PMK</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski do ręczników typu Backhouse, długość 130 mm, 5 1/8"&nbsp;</td><td>Braun</td><td>HO-128-130-PMK</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty na igły, długość 150 mm, 6" t=0,4 1/2&nbsp;</td><td>Braun&nbsp;</td><td>IM-927-150-PZMK</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki delikatne, długość 110 mm, proste, 4 3/8" ostre&nbsp;</td><td>Braun</td><td>NO-052-110-PMK</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze anatomiczne, długość 95 mm, 3 3/4" ostre</td><td>Braun</td><td>PO-022-001-PMK</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

Bariera jelitowo-krwiodawcza (GBB) kontroluje przepływ składników odżywczych, metabolitów bakteryjnych i leków ze światła jelita do krwiobiegu. Integralność GBB jest zaburzona w chorobach przewodu pokarmowego, sercowo-naczyniowego i metabolicznych, co może skutkować łatwiejszym dostępem do krwiobiegu związków biologicznie czynnych, takich jak metabolity bakteryjne jelit. Tak więc przepuszczalność GBB może być markerem zarówno chorób jelitowych, jak i pozajelitowych. Ponadto zwiększona penetracja metabolitów bakteryjnych może wpływać na funkcjonowanie całego organizmu.
Powszechnie stosowane metody badania przepuszczalności GBB są wykonywane ex vivo. Dokładność tych metod jest ograniczona, ponieważ funkcjonowanie GBB zależy od przepływu krwi w jelitach. Z drugiej strony, powszechnie stosowane metody in vivo mogą być obciążone ze względu na wydolność wątroby i nerek, ponieważ metody te opierają się na ocenie stężenia markerów egzogennych w moczu i/lub krwi obwodowej. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni pomiar przepuszczalności GBB u szczurów za pomocą metody in vivo opartej na pobraniu próbki krwi wrotnej, która zachowuje przepływ krwi w jelitach i praktycznie nie ma wpływu na czynność wątroby i nerek. 
Cewniki poliuretanowe są wprowadzane do żyły wrotnej i żyły głównej dolnej tuż nad zbiegiem żył wątrobowych. Krew pobierana jest na początku badania i po podaniu wybranego markera do pożądanej części przewodu pokarmowego. W tym miejscu przedstawiamy kilka zastosowań metody, w tym (1) ocenę przepuszczalności jelita grubego dla TMA, metabolitu bakterii jelitowych, (2) ocenę klirensu TMA przez wątrobę oraz (3) ocenę szlaku krew-krew-wątroba-krew obwodowa krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych pochodzących z bakterii jelitowych. Ponadto protokół może być również wykorzystywany do śledzenia wchłaniania jelitowego i metabolizmu leków w wątrobie lub do pomiarów wrotnego ciśnienia krwi.

Pomyślnie zmierzyliśmy przepuszczalność GBB oraz klirens wątrobowy TMA u szczurów. Wykazaliśmy, że szczury z nadciśnieniem wykazują zwiększoną przepuszczalność jelita grubego dla TMA w porównaniu do szczurów z prawidłowym ciśnieniem tętniczym (Rysunek 2)4. W innym badaniu stwierdziliśmy, że wysokie spożycie soli nie wpływa na przepuszczalność GBB ani klirens wątrobowy TMA (Rysunek 3)14</s...

Dostęp składników odżywczych, metabolitów mikrobioty i leków do krążenia jest kontrolowany przez barierę jelitowo-krwionośną (GBB). Opisujemy bezpośrednią metodę pomiaru przepuszczalności GBB in vivo, na którą, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod pośrednich, praktycznie nie ma wpływu na funkcje wątroby i nerek.

Metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Bariera jelitowo-krwionośna to wielowarstwowy system, który kontroluje przepływ składników odżywczych, metabolitów bakteryjnych, leków i innych związków egzogennych ze światła jelita do krwiobiegu. Jak wiemy, integralność bariery może być zaburzona w chorobach przewodu pokarmowego, układu krążenia i niektórych chorobach metabolicznych, co może skutkować łatwiejszym dostępem do krwiobiegu związków biologicznie czynnych, takich jak metabolity bakteryjne jelit i może wpływać na funkcjonowanie całego organizmu. W związku z tym przepuszczalność bariery jelitowo-krwionośnej może być markerem zarówno chorób jelitowych, jak i pozajelitowych.W tym filmie prezentujemy bezpośredni pomiar przepuszczalności bariery jelitowo-krwionośnej u szczurów za pomocą pobierania krwi wrotnej po podaniu substancji badanej do przewodu pokarmowego. Szczegółowo opisujemy kategoryzację żyły wrotnej i żyły głównej dolnej tuż nad zbiegiem żyły wątrobowej. Pobieranie próbek krwi z żyły wrotnej i żyły głównej dolnej pozwala ocenić nie tylko przepuszczalność bariery jelitowo-krwionośnej, ale także klirens wątrobowy i szlak wchłaniania interesujących nas cząsteczek, takich jak bakterie jelitowe, metabolity czy leki.N

an-vivo-method-for-evaluating-gut-blood-barrier-liver-metabolism

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pooperacyjny niedrożność jelit (POI) jest powikłaniem operacji w obrębie jamy brzusznej, prowadzącym do zwiększonej zachorowalności i przedłużonego pobytu w szpitalu. Ze względu na brak strategii profilaktycznych lub terapeutycznych konieczne są intensywne badania. W związku z tym opracowaliśmy zstandaryzowany i wykonalny model mysi, aby zbadać patofizjologię POI oraz przestudiować potencjalne opcje terapeutyczne.

Funkcjonalna ocena motywności jelit i stanu zapalnego ściany jelita u gryzoni: analizy w zestandaryzowanym modelu manipulacji jelitowej

Źródło: Calatayud Arroyo, M., i inni. Ocena opłacalności syntetycznego konsorcjum bakteryjnego na interfejsie in vitro jelito-mikroorganizm. J. Vis. Exp. (2018).Ten film prezentuje model in vitro żywioł–mikrob do badania żywotności bakterii. Współhodowla komórek Caco-2 i HT29-MTX jest inkubowana z bakteriami wstępnie poddanymi zabiegom w symulowanych warunkach trawiennych. Integralność bariery nabłonkowej ocenia się za pomocą oporu elektrycznego nabłonka, a frakcje z ośrodka, rozpuszczonego...

Model jelit in vitro do oceny zrastów i internalizacji bakteryjnej

Ten protokół opisuje użycie wyciętych preparatów tkanki jelitowej lub "worków jelitowych" jako modelu ex vivo funkcji bariery jelitowej. Model ten może być stosowany do oceny integralności zarówno bariery nabłonkowej, jak i warstwy żelu śluzowego w określonych miejscach jelitowych w zwierzęcych modelach chorób układu pokarmowego.

Ex vivo Pęcherzyki jelitowe do oceny przepuszczalności błony śluzowej w modelach chorób przewodu pokarmowego

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Tutaj prezentujemy protokół hodowli mikrobioty jelitowej jelita grubego in vitro, przy użyciu szeregu bioreaktorów, które symulują warunki fizjologiczne przewodu pokarmowego.

Zastosowanie zaawansowanej technologii hodowli in vitro do badania mikrobioty jelitowej człowieka

Wystawiliśmy system mikrofizjologiczny (MPS) z organoidami jelitowymi i wątrobowymi na działanie paracetamolu (APAP). W artykule opisano metody produkcji organoidów oraz oceny właściwości farmakokinetycznych i toksykologicznych APAP w MPS. Opisano w nim również analizy funkcjonalności tkanek niezbędne do walidacji wyników.

Układ mikrofizjologiczny jelita/wątroby do oceny farmakokinetyki i toksykologicznej leku

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Poznaj metodę in vivo do oceny przepuszczalności bariery jelitowo-krwionośnej u szczurów z wykorzystaniem pobierania krwi z żyły wrotnej. Technika ta pozwala również mierzyć klirens wątrobowy metabolitów bakteryjnych.

Metoda in vivo do oceny bariery jelitowo-krwionośnej i metabolizmu wątrobowego produktów mikrobioty

Przeglądaj więcej filmów