Name: Oczyszczanie komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym Drosophila przy użyciu FACS. Ta technika umożliwia badanie różnorodności typów komórkowych i organizacji tkanek nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez NINDS National Institutes of Health pod numerem nagrody K01NS094545, oraz granty z Lefler Center for the Study of Neurodegenerative Disorders. Dziękujemy Liming Tan i Jasonowi McEwanowi za cenne rozmowy.

1. Planowanie przed eksperymentem
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu przeprowadź eksperyment pilotażowy na małą skalę, aby potwierdzić, czy genetyka działa zgodnie z oczekiwaniami, aby specyficznie oznaczyć pożądane komórki.
	<ol>
		<li>W pierwszym przejściu użyj immunohistochemii i mikroskopii świetlnej, aby określić, czy niechciane komórki są oznakowane. Idealnie byłoby, gdyby markery genetyczne były specyficzne w obrębie siatkówki i płata wzrokowego (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3). Tylko płaty wzrokowe są używane do dysocjacji komórek, więc etykietowanie w centralnym mózgu nie stanowi problemu. W tym samym czasie określ, ile komórek zainteresowania jest oznaczonych na mózg.</li>
		<li>Jeśli etykieta genetyczna (etykiety) ma pożądaną specyficzność, przeprowadź pilotażowy eksperyment FACS (<silna klasa="xfig">Rysunek 4), aby określić, czy czysta populacja komórek może być odtwarzalnie wyizolowana, a także ocenić, ile komórek będących przedmiotem zainteresowania można wyizolować z każdego mózgu. W razie potrzeby oceń czystość izolowanych komórek za pomocą ilościowego PCR, aby określić wzbogacenie lub odfermentowanie określonych genów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ liczbę krzyżówek potrzebnych do uzyskania pożądanej ilości materiału do eksperymentu. 
	UWAGA: Na podstawie doświadczenia eksperymentalnego, ~17-25% komórek znakowanych fluorescencyjnie jest konsekwentnie izolowanych za pomocą tego protokołu, a wysokiej jakości dane sekwencjonowania RNA uzyskuje się z zaledwie 1,000 oczyszczonych komórek FACS (mniejsza liczba komórek może być wystarczająca).
	<ol>
		<li>Aby uzyskać 1000 komórek do analiz sekwencyjnych RNA, upewnij się, że na każdy mózg przypada co najmniej 40 komórek będących przedmiotem zainteresowania znakowanych fluorescencyjnie (20 komórek na płat wzrokowy). Około ~10 komórek powinno zostać oczyszczonych na mózg, więc przeanalizuj 100 mózgów.</li>
		<li>Aby uzyskać ~100 much na odpowiednim etapie rozwoju do sekcji w każdym eksperymencie, użyj ~100 krzyżówek, jeśli wybierasz przeciwko balanserom (będzie się to różnić w zależności od genotypów rodziców). Jeśli muchy są homozygotyczne pod względem interesujących alleli/transgenów, można ustawić mniej krzyżówek.</li>
		<li>Ogranicz okno preparacji do 1 godziny, aby zmaksymalizować zdrowie komórek i zminimalizować niespecyficzne zmiany w ekspresji genów i organizacji genomu, które mogą wystąpić po sekcji mózgu, ale można to dostosować. Określ liczbę sekcji wymaganych do wypreparowania 100 mózgów w ciągu 1 godziny, która zależy od umiejętności sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Praca w locie
UWAGA: Muchy są hodowane w temperaturze 25 °C przy wilgotności ~50%, chyba że zaznaczono inaczej. Poniżej genotyp samic jest oznaczony jako Genotyp F, a genotyp męski jako Genotyp M.
<ol>
	<li>Rozszerzanie zapasów
	<ol>
		<li>Zdobądź ~100 fiolek młodych muszek (nie więcej niż tygodniowych) o genotypie F i ~30 fiolek o genotypie M.</li>
		<li>W czwartek pierwszego tygodnia przerzuć 100 fiolek genotypu F na świeżą żywność. Począwszy od piątku, odwracaj fiolki każdego dnia do wtorku tygodnia 2. Te 6 rzutów zostanie użytych do zbierania dziewic. Również w środę 2 tygodnia przerzuć muchy o genotypie M na świeży pokarm i usuń rodziców w piątek tygodnia 2. Te fiolki będą używane do zbierania samców na krzyżówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolekcjonowanie dziewic
	<ol>
		<li>Od poniedziałku 3 tygodnia zbieraj dziewice z fiolek o genotypie F. Zbieraj 2-3 razy dziennie i przechowuj dziewice w temperaturze 18 °C przy wilgotności ~50%. Powtarzaj to codziennie do wtorku tygodnia 4. Zdecydowanie zaleca się zebranie jak największej liczby dziewic, ponieważ wiele z nich umiera przed ustawieniem krzyży. Zazwyczaj należy zebrać ~2,500 dziewic, aby ustawić 100 krzyży.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie krzyżyków
	<ol>
		<li>W piątek 4 tygodnia ustal żądaną liczbę krzyżówek (zwykle 100-200 krzyżówek na eksperyment) z 15 dziewicami o genotypie F i 7 samcami o genotypie M dla każdej krzyżówki. Bardzo ważne jest, aby używać młodych i zdrowych samców z nienaruszonymi skrzydłami.</li>
		<li>Odwracaj krzyżyki codziennie od niedzieli do soboty tygodnia 5. Uzupełnij krzyżówki świeżymi dziewicami lub samcami, jeśli zostaną znalezione martwe muchy. Istotne jest, aby zapobiec wysychaniu żywności, dlatego w razie potrzeby należy podlewać fiolki. Sucha karma znacznie zmniejszy plony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola ujemna dla sortowania FACS
	<ol>
		<li>Uwzględnij kontrolę ujemną bez oznaczania żądanych komórek do sortowania FACS. Idealnie byłoby, gdyby kontrola ujemna miała osobę zgłaszającą (np. UAS-GFP), ale nie kierowcę (np. GAL4), tak aby można było określić podstawową ekspresję osoby zgłaszającej (konstrukcje UAS mogą być "nieszczelne") w celu ustawienia odpowiedniego bramkowania dla sortowania FACS. Odwróć muchy w celu kontroli negatywnej w tym samym czasie z muchami eksperymentalnymi i ułóż je w ten sam sposób.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poczwarki inscenizacyjne
	<ol>
		<li>Aby zebrać komórki na określonym etapie rozwoju poczwarki (np. 40 godzin po utworzeniu poczwarki [h APF]), należy umieścić poczwarki w 1-godzinnym oknie czasowym, aby dopasować je do okresu 1 godziny przeznaczonego na sekcje (omówione powyżej). FACS należy wykonać bezpośrednio po dysocjacji komórek, która następuje po rozbiorach i trwa ~40 min. W związku z tym dokładny czas etapu i sekcji zależy od dostępności FACS.</li>
		<li>Aby uzyskać poczwarki po 40 godzinach APF, przygotuj się w poniedziałek tygodnia 6 w określonym punkcie czasowym (np. 17), aby wyciąć poczwarki 40 godzin później (np. 9 rano w środę). Użyj mokrego pędzla, aby delikatnie wybrać białe poczwarki i umieścić je na ścianie w podgrzanych fiolkach. Wybieraj tylko poczwarki o pożądanym genotypie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrpróby biologiczne
	<ol>
		<li>Wykonaj co najmniej 3 powtórzenia biologiczne dla każdego eksperymentu. W prosty sposób powtórz eksperyment trzy razy w tym samym tygodniu (tydzień 6), używając tych samych krzyżówek. Na przykład poczwarki etapowe dla drugiej i trzeciej replikacji odbywają się odpowiednio we wtorek i środę. Rozetnij te poczwarki odpowiednio w czwartek i piątek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki
UWAGA: Wszystkie odczynniki użyte w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów do rozwarstwienia i dysocjacji tkanek
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy mieszaniny enzymów proteolitycznych (patrz tabela materiałów), rozpuszczając liofilizowany enzym za pomocą ddH2O do stężenia 26 jednostek Wünscha (Wu)/ml. W przypadku fiolki zawierającej 260 Wu (duża fiolka), dodać 10 ml ddH2O do fiolki i przygotować jednorazowe porcje (wymagane jest 4,2 μl na dysocjację). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C. Każdy eksperyment wymaga dysocjacji dwóch próbek (kontroli negatywnej i tkanki doświadczalnej).</li>
		<li>Przygotuj 10x roztwór Rinaldiniego (RS) i kompletną pożywkę Schneidera (CSM) dzień przed sekcją (poniedziałek 6 tygodnia). Przygotuj 5 ml CSM dla każdej dyssekcji i około 5 ml 1x RS i 5 ml CSM do dysocjacji 2 próbek (kontroli negatywnej i eksperymentalnej). Przechowuj 10x RS w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca, a CSM w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.
		<ol>
			<li>Aby przygotować 100 ml 10x RS, rozpuść 8 g NaCl, 200 mg KCl, 50 mg NaH2PO4, 1 g NaHCO3 i 1 g glukozy w 100 ml ddH2O w zlewce o pojemności 250 ml. Filtr sterylizować filtrem 0,22 mm.</li>
			<li>Dodaj 20 mg L-glutationu do 1 ml ddH2O w mikroprobówce.</li>
			<li>Aby przygotować 50 ml CSM, dodaj 5 ml inaktywowanej termicznie surowicy bydlęcej, 0,1 ml roztworu insuliny 10 mg/ml, 5 ml 200 ml roztworu L-glutaminy, 12,5 ml 20 mg/ml L-glutationu i 1 ml roztworu penicyliny-streptomycyny (5000 jednostek penicyliny i 5 mg streptomycyny/ml) do 38,9 ml pożywki Schneidera. Filtr sterylizować filtrem 0,22 mm.</li>
			<li>Rozcieńczyć 10x RS z ddH2O, aby uzyskać 1x RS roztwór roboczy. Przygotować 500 μL 1x RS w nieprzylepnych mikroprobówkach dla każdej próbki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 37 °C. Upewnij się, że temperatura jest dokładna za pomocą termometru. Kąpiel wodna musi mieć odpowiednią temperaturę przed aktywacją papainy. Zaleca się ustawienie temperatury wieczorem przed porannym rozwarstwieniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj mieszankę papainy i enzymów proteolitycznych 
	UWAGA: Przygotuj świeży roztwór papainy przed każdą dysocjacją.
	<ol>
		<li>We wtorek 6. tygodnia około 45 minut przed rozpoczęciem sekcji pobrać 1 fiolkę proszku papainy z 4 °C i inkubować w temperaturze pokojowej. Odłóż również CSM w probówce Eppendorfa w temperaturze pokojowej, aby później dodać do proszku papainy.</li>
		<li>min przed rozpoczęciem sekcji należy użyć strzykawki, aby dodać CSM o temperaturze pokojowej do fiolki z papainą (bezpośrednio przez nakrętkę), tak aby stężenie wynosiło 100 jednostek/ml (ilość proszku w każdej fiolce jest nieznacznie inna; w przypadku fiolki zawierającej 123 jednostki dodać 1,23 ml CSM). Aby wymieszać, należy najpierw odwrócić fiolkę, aby wychwycić proszek utknący po wewnętrznej stronie nakrętki, a następnie pipetować w górę i w dół.</li>
		<li>Dodać fiolkę do zlewki zawierającej 37 °C wody w łaźni wodnej. Upewnij się, że fiolka z roztworem papainy nie unosi się na wodzie. Aktywować papainę na 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Po dodaniu papainy do zlewki w łaźni wodnej, pobrać podwielokrotność mieszanki enzymów proteolitycznych (26 Wu/ml) z temperatury -20 °C i inkubować ją w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach od aktywacji inkubować papainę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcje
	<ol>
		<li>We wtorek 6 tygodnia przeprowadź sekcję mózgów poczwarek w zimnym CSM za pomocą czystych kleszczy i odetnij płaty wzrokowe, ściskając je na styku płata wzrokowego i centralnego mózgu.</li>
		<li>Dodać płaty na dno mikroprobówki zawierającej 500 μl 1x RS (jedna mikroprobówka dla tkanki doświadczalnej i jedna dla tkanki kontroli ujemnej). Zawsze trzymaj rurki na lodzie.</li>
		<li>Wypreparuj jak najwięcej płatów w ciągu 1 godziny. W przypadku tkanki kontroli ujemnej wystarczy 10 płatów. Pobrano wypreparowane płaty wzrokowe w pojedynczą mikroprobówkę, aby wyeliminować utratę tkanki podczas przenoszenia między mikrorurkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacja komórek
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjmij 1x RS z mikroprobówki z wypreparowanymi płatami wzrokowymi za pomocą pipety P200, pozostawiając tyle, aby zakryć płaty. Ostrożnie dodaj 500 μL 1x RS z boku tuby, aby jak najmniej przeszkadzać mózgowi. Zawsze trzymaj rurkę na lodzie.</li>
		<li>Niech płaty osiądą na dnie. Wystarczy raz pobrać 200 μl i odpipetować do wymieszania (płatki powinny się poruszać). Niech płaty ponownie się uspokoją.</li>
		<li>Dla dwóch próbek (doświadczalna i kontrola ujemna) podwielokrotność 600 μl aktywowanej papainy o temperaturze pokojowej do mikroprobówki. Dodać 4,2 μl mieszanki enzymów proteolitycznych o temperaturze pokojowej do 600 μl roztworu papainy, aby uzyskać końcowe stężenie 0,18 Wu / ml. Mieszać, pipetując w górę i w dół. To jest rozwiązanie dysocjacji.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć 1x RS z każdej próbki i dodać 300 μl roztworu dysocjacyjnego do płatów. Próbki inkubować w temperaturze 25 °C, 1 000 obr./min przez 15 minut w termomikserze z mikroprobówkami.</li>
		<li>W punktach czasowych 5 i 10 minut zatrzymaj termomikser i pozwól płatkom opaść na dno mikroprobówki. Zebrać 200 μl roztworu i odpipetować do wymieszania.</li>
		<li>Po 15 minutach pozwól płatom opaść na dno i ostrożnie usuń roztwór dysocjacyjny z płatów (staraj się nie naruszać płatów).</li>
		<li>Umyć dwa razy za pomocą 1x RS. Aby to zrobić, ostrożnie dodaj 500 μL 1x RS (staraj się nie przeszkadzać w płatach). Aby wymieszać, delikatnie odpipetować 200 μl, a następnie odpipetować do mikroprobówki. Niech płaty opaną na dno i powtórzą.</li>
		<li>Każdą próbkę należy przemyć dwukrotnie 500 μl CSM (tak samo jak w poprzednim kroku).</li>
		<li>Ostrożnie wyjąć CSM i dodać kolejne 200 μl CSM do probówki. Za pomocą pipety P200 należy rozbić tkankę, pipetując w górę i w dół bez spieniania, aż roztwór stanie się jednorodny (tj. nie będzie już widać żadnych resztek tkanki).</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez nasadkę siatkową 30 μm do probówki FACS o pojemności 5 ml na lodzie (użyj P200 i upewnij się, że cała zawiesina przechodzi przez lód). Dodaj kolejne 500 μl CSM, aby przepłukać mikroprobówkę dysocjacyjną i przefiltrować roztwór do probówki FACS.</li>
		<li>Ostrożnie zdjąć nakrętkę probówki FACS, zebrać roztwór pod filtrem siatkowym za pomocą P200 i dodać go do reszty zawiesiny w probówce FACS. Próbki są gotowe do FACS.</li>
		<li>Upewnij się, że masz wcześniej przygotowane mikroprobówki do zbierania oczyszczonych komórek FACS. W przypadku sekwencjonowania RNA należy posortować komórki z każdej próbki bezpośrednio do mikroprobówek zawierających 300 μl buforu RLT (buforu do lizy) z zestawu do oczyszczania RNA (przed użyciem dodać 1:100 2-merkaptoetanol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortowanie FACS 
	UWAGA: Po dysocjacji natychmiast posortuj komórki według FACS (maksymalnie 1 godzina). Upewnij się, że zarezerwowałeś sesje FACS odpowiednio podczas planowania eksperymentu. Zwykle stosuje się sortownik komórek z dyszą o rozmiarze 100 μm.
	<ol>
		<li>Porównaj rozmieszczenie komórek w kontroli ujemnej i próbce doświadczalnej, aby ustawić bramkowanie do sortowania. Idealnie byłoby, gdyby ustalono bramkowanie w pilotażowym eksperymencie FACS, a próbka kontroli ujemnej zapewni potwierdzenie lub precyzyjne dostrojenie wcześniej ustalonego bramkowania. Komórki będące przedmiotem zainteresowania powinny być dobrze oddzielone od komórek tła, które są obecne zarówno w kontroli negatywnej, jak i w próbie eksperymentalnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4) (przetestuj to w eksperymentach pilotażowych).</li>
		<li>Zbierz posortowane komórki w przygotowanych probówkach zbiorczych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie RNA
	<ol>
		<li>Po posortowaniu komórek bezpośrednio do 300 μl buforu RLT, pipetuj w górę iw dół, aby lizować komórki.</li>
		<li>Oczyszczanie RNA zgodnie ze standardowym protokołem oczyszczania całkowitego RNA z komórek zwierzęcych i ludzkich przy użyciu zestawu do oczyszczania (patrz Tabela materiałów) z trawieniem DNA na kolumnie7. Eluować RNA w 20 μl wody wolnej od RNaz.</li>
		<li>Próbki RNA należy zamrozić ciekłym azotem i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Dla każdego eksperymentu należy wykonać co najmniej 3 powtórzenia dla warunków kontrolnych i eksperymentalnych. Przygotuj biblioteki cDNA dla wszystkich próbek w tym samym czasie i uruchom wszystkie próbki na tej samej komórce przepływowej, aby kontrolować zmienność techniczną. Po przygotowaniu wszystkich próbek RNA użyj odkurzacza szybkoobrotowego, aby zmniejszyć objętość do 2–5 μl (każdej próbki).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie bibliotek cDNA i sekwencjonowanie za pomocą Smart-seq2
UWAGA: Aby zminimalizować zmienność techniczną, stwórz wszystkie biblioteki cDNA w tym samym czasie i zsekwencjonuj je na tej samej komórce przepływowej.
<ol>
	<li>Użyj danych wejściowych 1,5 μl skoncentrowanego RNA do utworzenia bibliotek cDNA, postępując zgodnie ze standardowym protokołem dla Smart-seq217, z wyjątkiem następujących modyfikacji: użyj innej głównej mieszanki PCR o wysokiej wierności (patrz Tabela materiałów) do amplifikacji PCR; użyj zestawu do oczyszczania PCR na kolumnie (patrz Tabela materiałów) zamiast kulek magnetycznych do oczyszczania produktów PCR.</li>
	<li>Protokół Smart-seq2 obejmuje etap wstępnej amplifikacji PCR po odwrotnej transkrypcji, a także końcowy etap wzbogacania PCR po tagmentacji. Liczba cykli amplifikacji PCR zależy od obfitości materiału wejściowego. Z 1,000 komórek jako wejściem, zwykle używa się 15 cykli na etapie wstępnej amplifikacji PCR i 12 cykli na końcowym etapie wzbogacania PCR.</li>
	<li>Połącz biblioteki i uporządkuj je w jednej komórce przepływu (np. na platformie NextSeq).</li>
</ol>

<ol><li>Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure.</a> Cell and Tissue Research. 258, 441-475 (1989).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li>
<li>Jenett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GAL4-driver+line+resource+for+Drosophila+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A GAL4-driver line resource for Drosophila neurobiology.</a> Cell Rep. 2 (4), 991-1001 (2012).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Tan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+Superfamily+ligand+and+receptor+pairs+expressed+in+synaptic+partners+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ig Superfamily ligand and receptor pairs expressed in synaptic partners in drosophila.</a> Cell. 163 (7), 1756-1769 (2015).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Fezf+coordinates+laminar-specific+connectivity+through+cell-intrinsic+and+cell-extrinsic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Drosophila Fezf coordinates laminar-specific connectivity through cell-intrinsic and cell-extrinsic mechanisms.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Krasnow, M. A., Cumberledge, S., Manning, G., Herzenberg, L. A., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+cell+sorting+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Whole animal cell sorting of Drosophila embryos.</a> Science. 251 (4989), 81-85 (1991).</li>
<li>Cumberledge, S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+analysis+of+pure+cell+populations+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation and analysis of pure cell populations from Drosophila.</a> Methods in Cell Biology. 44, 143-159 (1994).</li>
<li>Bryant, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+differentially+expressed+genes+in+purified+Drosophila+follicle+cells%3A+toward+a+general+strategy+for+cell+type-specific+developmental+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of differentially expressed genes in purified Drosophila follicle cells: toward a general strategy for cell type-specific developmental analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5559-5564 (1999).</li>
<li>Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+and+cell+division+in+the+Drosophila+wing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing.</a> Cell. 93 (7), 1183-1193 (1998).</li>
<li>Calvi, B. R., Lilly, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+BrdU+labeling+and+nuclear+flow+sorting+of+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary.</a> Methods in Molecular Biology. , 203-213 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (9), 2912-2917 (2004).</li>
<li>Bryantsev, A. L., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+cardiac+cells+from+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of cardiac cells from Drosophila embryos.</a> Methods. 56 (1), 44-49 (2012).</li>
<li>Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+Drosophila+larval+neuroblasts+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).</li>
<li>Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+gentle+and+scalable+method+for+dissociation+and+fluorescent+sorting+of+imaginal+disc+cells+for+mRNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing.</a> Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).</li>
<li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>Nern, A., Zhu, Y., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+N-cadherin+interactions+mediate+distinct+steps+in+the+targeting+of+lamina+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local N-cadherin interactions mediate distinct steps in the targeting of lamina neurons.</a> Neuron. 58 (1), 34-41 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten jest prosty i nie jest technicznie trudny do wykonania, ale istnieje kilka kluczowych kroków, które, jeśli zostaną zignorowane, spowodują znaczne zmniejszenie wydajności komórkowej. (Krok 2.3.2.) Bardzo ważne jest, aby krzyżówki były zdrowe, a żywność nie wysychała. Regularne podlewanie krzyżówek jest niezbędne, aby zmaksymalizować liczbę much dostępnych do sekcji, które mają odpowiedni genotyp i są na właściwym etapie rozwoju. To, jak często krzyżówki muszą być podlewane, będzie się różnić w zależności od u...

System wzrokowy Drosophila jest znakomitym modelem do badania genetycznych podstaw rozwoju i zachowania. Składa się ze stereotypowej architektury komórkowej1 oraz zaawansowanego zestawu narzędzi genetycznych do manipulowania określonymi typami komórek2,3. Główną zaletą tego systemu jest zdolność do autonomicznego badania funkcji genów w typach komórek będących przedmiotem zainteresowania z rozdzielczością pojedynczej komórki, przy użyciu metod mozaiki genetycznej4,5. Staraliśmy się połączyć te narzędzia genetyczne z najnowszymi osiągnięciami w sekwencjonowaniu nowej generacji, aby przeprowadzić analizy transkryptomiczne i genomiczne specyficzne dla typu komórki w klonach pojedynczych komórek w eksperymentach z mozaiką genetyczną.
Aby to osiągnąć, konieczne jest opracowanie solidnej i efektywnej metody selektywnego izolowania mało obfitych populacji komórek w mózgu. Wcześniej opracowaliśmy protokół izolowania określonych typów komórek w układzie wzrokowym podczas rozwoju poczwarki za pomocą FACS i określania ich transkryptomów za pomocą RNA-seq6. W tych eksperymentach zdecydowana większość komórek określonego typu (np. fotoreceptory R7) została znakowana fluorescencyjnie. Stosując tę metodę, w eksperymentach z mozaiką genetyczną, w których znakowany jest tylko podzbiór komórek tego samego typu, nie udało nam się wyizolować wystarczającej liczby komórek, aby uzyskać wysokiej jakości dane sekwencjonowania. Aby rozwiązać ten problem, staraliśmy się zwiększyć wydajność komórkową poprzez ulepszenie protokołu dysocjacji komórek.
Nasze podejście polegało na zmniejszeniu całkowitej długości protokołu, aby zmaksymalizować zdrowie zdysocjowanych komórek, poprawić zdrowie komórek poprzez zmianę rozwarstwiających i dysocjacyjnych oraz zmniejszyć ilość mechanicznych zakłóceń w wypreparowanej tkance. Przetestowaliśmy ulepszony protokół7 przy użyciu analizy mozaikowej z represyjnym markerem komórkowym5 (MARCM), który umożliwia generowanie pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie klonów określonych typów komórek, które są dzikie lub zmutowane dla genu będącego przedmiotem zainteresowania u inaczej heterozygotycznej muchy. Tam, gdzie w identycznych warunkach nasz wcześniejszy protokół nie był w stanie wygenerować wystarczającej ilości materiału do sekwencjonowania RNA, ulepszony protokół okazał się sukcesem. Powtarzalnie osiągamy wysoką wydajność komórkową (~25% znakowanych komórek) i uzyskujemy wysokiej jakości dane sekwencyjne RNA już z 1,000 komórek7.
Wcześniej opisano wiele protokołów izolowania określonych typów komórek u Drosophila6,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Te protokoły są głównie przeznaczone do izolowania komórek, których jest dużo w mózgu. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem izolowania populacji komórek o niskiej liczebności (mniej niż 100 komórek na mózg) w systemie wzrokowym przy użyciu FACS do późniejszych analiz transkryptomicznych i genomicznych. Dzięki temu protokołowi mamy na celu zapewnienie sposobu na powtarzalne izolowanie komórek o niskiej liczebności z systemu wzrokowego muchy za pomocą FACS i uzyskanie wysokiej jakości danych transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

<table><tbody><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>Mieszanka enzymów proteolitycznych</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutation</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna Roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana Schneidera</td><td>Gibco</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Zestaw do oczyszczania</td></tr><tr><td>RNA bez RNaz DNaza</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Life Technologies</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Rozwiązanie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór betainy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw indeksów Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Probówka z sitkiem do komórek Zatrzask</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Butelkowe systemy filtrów próżniowych</td><td>Corning</td><td>CLS431153</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACSAria</td><td>Eppendorf BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>System sekwencjonowania HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401&ndash; 2501</td><td></td></tr></tbody></table> szt.

oczyszczanie komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym drosophila

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Ostatnie ulepszenia w czułości sekwencjonowania nowej generacji ułatwiły zastosowanie analiz transkryptomicznych i genomicznych do małej liczby komórek. Wykorzystanie tej technologii do badania rozwoju układu wzrokowego Drosophila, który szczyci się bogactwem narzędzi genetycznych specyficznych dla typu komórki, zapewnia potężne podejście do zajmowania się molekularnymi podstawami rozwoju z precyzyjną rozdzielczością komórkową. Aby takie podejście było wykonalne, kluczowe jest posiadanie zdolności do niezawodnego i skutecznego oczyszczania komórek obecnych w mózgu w niewielkiej obfitości. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę, która pozwala na skuteczne oczyszczanie klonów pojedynczych komórek w eksperymentach z mozaiką genetyczną. Dzięki temu protokołowi konsekwentnie osiągamy wysoką wydajność komórkową po oczyszczeniu za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (~25% wszystkich znakowanych komórek) i z powodzeniem przeprowadziliśmy analizy transkryptomiczne na klonach pojedynczych komórek wygenerowanych w wyniku analizy mozaikowej z represyjnym markerem komórkowym (MARCM). Protokół ten jest idealny do stosowania analiz transkryptomicznych i genomicznych do określonych typów komórek w układzie wzrokowym, na różnych etapach rozwoju i w kontekście różnych manipulacji genetycznych.

Ogólny schemat 
Ogólny schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Protokół podzielono na trzy główne części: pracę z muchami, przygotowanie próbek, sekwencjonowanie oraz analizę danych. Dla uproszczenia w ogólnym schemacie pominięto sekcję protokołu dotyczącą „Planowania przed eksperymentem”.
Harmonogram 
Kalendarz głównych etapów protokołu (praca z muchami...

Tutaj prezentujemy protokół dysocjacji komórek do efektywnego izolowania komórek obecnych w niskiej obfitości w systemie wzrokowym Drosophila poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS).

Oczyszczanie komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym Drosophila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w biologii, takich jak to, w jaki sposób różne typy komórek są generowane i organizowane w struktury wyższego rzędu o określonych funkcjach. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona skuteczne oczyszczanie komórek obecnych w niewielkiej obfitości w systemie wzrokowym Drosophila w celu analizy transkryptomicznej i genomicznej. We wtorek szóstego tygodnia protokołu, 45 minut przed sekcjami, pobierz jedną fiolkę proszku papainy z czterech stopni Celsjusza i inkubuj ją w temperaturze pokojowej.Następnie odłóż Complete Schneider's Medium lub CSM do probówki Eppendorf w temperaturze pokojowej, aby później dodać do proszku papainy. Pięć do dziesięciu minut przed sekcją użyj strzykawki, aby dodać CSM o temperaturze pokojowej do fiolki papainy bezpośrednio przez nakrętkę do stężenia 100 jednostek na mililitr. Aby wymieszać, należy najpierw odwrócić fiolkę, aby wychwycić proszek przyklejony do wewnętrznej strony nakrętki, a następnie pipetować zawartość w górę i w dół.Po wymieszaniu odczynników doprowadzić wodę do 37 stopni Celsjusza w zlewce w łaźni wodnej. Następnie umieścić fiolkę w zlewce na 30 minut, aby aktywować papainę i up

purification-of-low-abundant-cells-in-the-drosophila-visual-system

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy metodę izolacji i oczyszczania neuronów obwodowych Drosophila z wykorzystaniem strategii szybkiego sortowania komórek wspomaganego magnetycznymi kulkami. RNA uzyskane z wyizolowanych komórek może być bezpośrednio wykorzystane w dalszych analizach, w tym w badaniach mikromacierzy.

Izolacja i oczyszczanie neuronów obwodowych Drosophila za pomocą sortowania magnetycznego z użyciem kulek

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Siatkówka Drosophila stanowi krystaliczną sieć złożoną z niewielkiej liczby typów komórek, które są generowane w sposób stereotypowy 1. Jej podatność na zaawansowane analizy genetyczne umożliwia badanie złożonych programów rozwojowych. Niniejszy protokół opisuje preparowanie oraz immunohistochemię siatkówek na trzech odrębnych etapach rozwoju, ze szczególnym uwzględnieniem różnicowania fotoreceptorów.

Disekcja i immunohistochemia siatkówek larwalnych, poczwarkowych i dorosłych Drosophila

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Metoda Tomato/GFP-FLP/FRT polega na wizualizacji mozaikowych komórek fotoreceptorowych u żywych Drosophila. Może być używany do śledzenia losów poszczególnych komórek fotoreceptorowych w siatkówce przez kilka dni lub tygodni. Metoda ta idealnie nadaje się do badań nad zwyrodnieniami siatkówki i chorobami neurodegeneracyjnymi czy rozwojem komórek fotoreceptorowych.

Metoda pomidorów/GFP-FLP/FRT do obrazowania na żywo mozaikowych dorosłych komórek fotoreceptorowych Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Na podstawie mechanizmu składania kompleksu białkowego INAD, w tym protokole, zmodyfikowano strategię oczyszczania powinowactwa i konkurencji w celu oczyszczenia endogennego kanału TRP Drosophila.

Oczyszczanie endogennych kanałów potencjału przejściowego receptora Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Poznaj metodę oczyszczania komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym Drosophila przy użyciu FACS. Ta technika umożliwia badanie różnorodności typów komórkowych i organizacji tkanek nerwowych.

Oczyszczanie komórek o niskiej liczebności w układzie wzrokowym Drosophila

Przeglądaj więcej filmów