Name: Połączone genetyczne i chemiczne modyfikacje kapsydów wektorów transferu genów opartych na adenowirusie do ekranowania i celowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę chemicznej modyfikacji kapsydów adenowirusa do terapii genowej i szczepień genetycznych. Technika umożliwia precyzyjne modyfikowanie wektorów genowych w celu badania interakcji z gospodarzem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UWAGA: Poniżej szczegółowo opisano protokół genetyczno-chemicznej pegilacji wektora Ad . Aby umożliwić specyficzne sprzężenie ugrupowania PEG, wektor Ad5 został wcześniej zmodyfikowany genetycznie poprzez wprowadzenie reszty cysteiny do białka heksonu w hiperzmiennej pętli 5, jak opisano w poprzedniej publikacji36, a jako związek sprzęgający zastosowano związek PEG aktywowany maleimidem.
1. Przygotowanie do oczyszczania wektorów za pomocą gradientów krokowych CsCL
<ol>
	<li>Przygotuj 400 ml buforu adenowirusa (bufor Ad), dodając 50 mM HEPES (4,76 g/400 ml) i 150 mM NaCl (3,504 g/400 ml) do podwójnie destylowanej wody (ddH2O). 350 ml tego buforu jest potrzebne do przygotowania następujących trzech wariantów buforu AD.
	<ol>
		<li>Wariant A: dostosować 150 ml buforu Ad do pH 7,6 za pomocą NaOH.</li>
		<li>Wariant B: dodać końcowe stężenie 10 mM TCEP [tris(2-karboksetylo)fosfina), 0,143 g] do 50 ml i dostosować do pH 7,2 za pomocą HCl.</li>
		<li>Wariant C: dodać końcowe stężenie 0,5 mM TCEP (0,022 g) do 150 ml i dostosować do pH 7,2 za pomocą HCl.</li>
		<li>Przygotować w ddH2O i chemikaliach o czystości analitycznej. Użyć po 100 ml wariantu A i wariantu C do przygotowania CsCl (patrz kroki 1.2 i 1.3; 50 ml każdego z nich) niezbędnych do stopniowego gradientu CsCl (patrz kroki 3.2.6 i 3.2.18).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bufora gradientu krokowego CsCl (ρCsCl = 1,41 g/cm3) w Ad-buffer 
	UWAGA: Ten bufor będzie potrzebny w dwóch różnych wariantach:
	<ol>
		<li>Odważyć dwie podwielokrotności dokładnie 27,42 g CsCl do probówek o pojemności 50 ml.</li>
		<li>ρCsCl = 1,41/bufor TCEP: rozpuścić CsCl w 40 ml wariantu C buforu Ad.</li>
		<li>ρCsCl = bufor 1,41: rozpuścić CsCl w 40 ml wariantu A buforu Ad.</li>
		<li>Sprawdź i, jeśli to konieczne, dostosuj pH za pomocą HCl. Napełnij dokładnie do 50 ml odpowiednim wariantem buforu AD. Aby osiągnąć najlepsze wyniki separacji, kluczowe znaczenie ma dokładne stężenie CsCl i pH.</li>
		<li>Sprawdzić gęstość (zawartość CsCl), ważąc 1 ml (1,41 g) każdego buforu gradientowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bufora gradientu krokowego CsCl (ρCsCl = 1,27 g/cm3) w Ad-buffer 
	UWAGA: Ten bufor jest potrzebny w dwóch różnych wariantach:
	<ol>
		<li>Zważyć dwie podwielokrotności dokładnie 18,46 g CsCl w probówkach o pojemności 50 ml.</li>
		<li>ρCsCl = 1,27/TCEP bufor: rozpuścić CsCl w 40 ml wariantu C buforu Ad.</li>
		<li>ρCsCl = bufor 1,27: rozpuścić CsCl w 40 ml wariantu A buforu Ad.</li>
		<li>Sprawdź i, jeśli to konieczne, dostosuj pH za pomocą HCl. Na koniec napełnij dokładnie do 50 ml odpowiednim wariantem bufora reklamowego. Aby osiągnąć najlepsze wyniki separacji, kluczowe znaczenie ma dokładne stężenie CsCl i pH.</li>
		<li>Sprawdzić gęstość (zawartość CsCl), ważąc 1 ml (1,27 g) każdego buforu gradientowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie (AD i gradientu krokowego CsCl) przez filtrację (przy użyciu rozmiaru porów siatki 0,45 μm) do sterylnych butelek.</li>
	<li>Po sterylizacji, aby zapobiec utlenianiu TCEP, należy nasycić i nałożyć zawierające TCEP argonem, spryskiwając gazowym argonem przez około 30 s. Należy uważać, aby podczas stosowania argonu używać wyłącznie sterylnych urządzeń (np. sterylnych końcówek pipet) i używać butelek wystarczająco dużych, aby umożliwić wyciek tłuszczu argonowego. 
	UWAGA: Wszystkie powinny być przygotowane świeże i chronione przed światłem i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka dni (szczególnie CsCl o stopniowym nachyleniu, które powinny być przechowywane tylko przez kilka dni).</li>
</ol>
2. Ugrupowania sprzęgające: przechowywanie i przygotowanie
UWAGA: Cząsteczki używane do łączenia się z cysteinami muszą posiadać grupy reagujące z tiolami. Związki aktywowane maleimidem będą tworzyć stabilne wiązania tioeterowe z genetycznie wprowadzonymi cysteinami. Alternatywnie można zastosować związki aktywowane orto-pirydylodisiarczkiem (OPSS), które tworzą bioczułe mostki dwusiarczkowe między cząstkami wektora a ugrupowaniem sprzęgającym. Liofilizowany malPEG-750, podobnie jak większość innych odczynników sprzęgających, jest wrażliwy na hydrolizę i powinien być przechowywany w stanie suchym w postaci liofilizowanych proszków w temperaturze -80 °C.
<ol>
	<li>Aby zapobiec gromadzeniu się skraplającej się wody podczas rozmrażania fiolek, należy przechowywać fiolki w większych probówkach (np. probówkach o pojemności 50 ml) wypełnionych poduszką z kulek żelu krzemionkowego. Przechowuj te probówki w odpowiednim większym pojemniku, również wypełnionym poduszką z kulkami z żelu krzemionkowego.</li>
	<li>Przed szczelnym zamknięciem każdej rurki i pojemnika należy wymienić powietrze na argon. Można to osiągnąć, umieszczając otwarte rurki i pojemniki w eksykatorze, a następnie usuwając i zastępując powietrze argonem. Ponieważ argon jest cięższy od powietrza, rurki i pojemniki są wypełnione argonem i można je teraz umieszczać jedna w drugiej, z każdą pokrywą szczelnie zamkniętą.</li>
	<li>Przechowywać w pojemnikach w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Podczas rozmrażania umieść pojemniki na kulkach krzemionkowych w eksykatorze i powoli podgrzej je do temperatury pokojowej, a następnie otwórz pojemnik.</li>
	<li>Przeprowadzając reakcję sprzęgania, świeżo rozpuść ilość potrzebnego substratu sprzęgającego do odpowiedniego rozpuszczalnika. Należy uważać, aby nie dodać więcej niż 10% roztworu sprzęgającego do końcowej reakcji sprzęgania, zwłaszcza jeśli DMF lub DMSO jest używany jako rozpuszczalnik dla podłoża sprzęgającego.</li>
</ol>
3. Amplifikacja, oczyszczanie i chemiczna modyfikacja wektorów reklamowych:
<ol>
	<li>Amplifikacja wektorów reklamowych 
	UWAGA: Poniższe czynności należy wykonać przy użyciu szafy bezpieczeństwa zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Transfekcja wektora Ad z niedoborem replikacji ∆E1 zawierającego jedną (lub kilka) genetycznie wprowadzonych reszt cysteinowych do komórek HEK 293, zgodnie z opisem Kratzera i Krepela38.</li>
		<li>Zgodnie z protokołem38, amplifikuj wektor przez sekwencyjne reinfekcje, aż do końcowej infekcji przygotowawczej 15-20 dużych (15 cm) płytek do hodowli komórkowych (około 1-2 x 107 komórek/płytkę). 
		UWAGA: Optymalnie, ostatnia reinfekcja powinna być zaplanowana tak, aby komórki wykazywały pełny efekt cytopatyczny (CPE) w poranek oczyszczania i modyfikacji (patrz Rycina 2).</li>
		<li>Po ostatnim etapie amplifikacji komórki ponownie zawieszone w buforze Ad + 10 mM TCEP (wariant B) można zamrozić w temperaturze -80 °C; jednak w celu uzyskania optymalnej wydajności cząstek wektora zaleca się natychmiastowe monitorowanie lizy komórek oraz oczyszczania i modyfikacji wektora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie i modyfikacja chemiczna wektorów reklamowych 
	UWAGA: Oczyszczanie wektorów odbywa się zgodnie z protokołem oczyszczania adenowirusa opisanym w38, ale w warunkach nieutleniających. Pobieranie i liza komórek, a także oczyszczanie wektorów i modyfikacja chemiczna mogą być przeprowadzone w ciągu jednego dnia. Zbierz i poddaj lizie zainfekowane komórki zgodnie z protokołem opisanym wcześniej38.
	<ol>
		<li>Zebrać komórki, zeskrobując płytki i przenosząc supernatant do probówek wirówkowych o pojemności 200-500 ml.</li>
		<li>Wirować roztwór komórek przez 10 minut w temperaturze 400 x g.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 4 ml buforu AD + 10 mM TCEP (pH 7,2) (wariant B) i przenieść do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Jeśli wydajność komórek jest niska lub wywołano tylko słaby CPE, ponownie zawieś go w 2 ml.</li>
		<li>Uratuj wektor przez 3 cykle zamrażania (w ciekłym azocie) i rozmrażania (w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C).</li>
		<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Podczas wirowania przygotuj dwa równe gradienty stopniowe CsCl:
		<ol>
			<li>Najpierw, jako dolną fazę, dodaj 3 ml 1,41 g/cm3 ρCsCl w buforze Ad + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, wariant C) do probówek ultrawirówek. Zaznacz poziom dolnej fazy na rurze przed załadowaniem górnej fazy.</li>
			<li>Ostrożnie ułożyć górną fazę 5 ml 1,27 g/cm3 ρCsCl w buforze AD + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, wariant C), bardzo powoli pipetując objętość 5 ml wzdłuż ścianek probówki na dolną fazę. 
			UWAGA: Ponieważ podczas sprzęgania wysokie stężenie TCEP może reagować z resztą maleimidową malPEG-750 i prowadzić do zmniejszenia wydajności sprzężenia, oczyszczanie za pomocą gradientu krokowego CsCl musi być już przeprowadzone przy obniżonym stężeniu TCEP.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Załaduj supernatant na gradient CsCl [albo równo podzielić supernatant na oba gradienty, albo, w przypadku niskiej wydajności wektora (patrz wyżej), załaduj supernatant tylko do jednej kolumny] i wypełnij oba gradienty równomiernie do góry buforem Ad + 10 mM TCEP (pH 7,2, wariant B).</li>
		<li>Dostosuj wagę przeciwległych rurek do różnicy wagowej 0.0 g.</li>
		<li>Ultrawirować przez 2 godziny przy 176 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Za pomocą zacisku przymocuj probówkę do ultrawirówki do stojaka, pozostawiając dostępny obszar wokół oznaczenia dolnego poziomu fazy. Umieść lampę na gęsiej szyi nad rurką. Wokół znaku, na granicy między dolną i górną fazą, powinno być widoczne wyraźne pasmo (wiriony wektorowe) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A-3C).</li>
		<li>Zbierz wektory, nakłuwając rurkę igłą i zasysając opaskę wektora do strzykawki. Przenieś zebrane wiriony wektorowe do probówki o pojemności 15 ml. 
		UWAGA: Słabsze pasma powyżej pasma wektora Ad zawierają niekompletne cząstki wektorowe i należy ich unikać w przypadku aspiracji. Szczątki komórkowe i białko zielonej fluorescencji (EGFP) wektorów Ad-wektorów eksprymujących EGFP zgromadzą się w górnej części probówki ultrawirówki (patrz <silna klasa = "xfig">Rysunek 3A i 3B). Ten i następne kroki aż do sprzężenia (krok 3.2.16) powinny być wykonane szybko, ponieważ wektory są teraz wrażliwe na wiązania dwusiarczkowe ze względu na niskie stężenie TCEP.</li>
		<li>Aby obliczyć ilość substratu sprzęgającego potrzebnego do skutecznego całkowitego związania substratu ze wszystkimi resztami cysteiny w preparacie wektorowym, zmierz OD260:
		<ol>
			<li>Zgodnie z protokołem opisanym przez Kratzera i Krepela38, należy wprowadzić wir mieszaniny 10 μL zebranych wirionów wektorowych, 89 μL buforu Ad i 1 μL 10% SDS. Jako ślepą sondę należy zawirować 99 μl buforu AD i 1 μl 10% SDS.</li>
			<li>Aby zdenaturować wiriony, należy je inkubować w temperaturze 56 °C przez 10 minut.</li>
			<li>Określ OD260.</li>
			<li>Obliczyć miano wektora fizycznego na μl, korzystając z następującego równania: OD260 x współczynnik rozcieńczenia x empirycznie określony współczynnik ekstynkcji Ad (1,1 x 109 cząstek wektorowych = 1 OD260 jednostek/μL). W związku z tym zmierzony OD260 wynoszący 1,36 wektora rozcieńczonego 1:10 wynosiłby: 1,36 x 10 x 1,1 x 109 = około 1,5 x10 10 cząstek wektorowych/μL. 
			UWAGA: To miano jest tylko przybliżonym oszacowaniem; Jest jednak wystarczająco dokładny, aby można go było wykonać w obliczeniach stechiometrycznych przedstawionych poniżej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W zależności od białka zmodyfikowanego przez wprowadzenie cysteiny, należy określić ilość substratu sprzęgającego (w gramach) dla efektywnej reakcji sprzęgania, zgodnie z następującym równaniem ogólnym: Miano wirusa x Objętość x Liczba cystein x Nadmiar ugrupowania x Masa cząsteczkowa ugrupowania / 6,022 x 1023 = gramy substratu sprzęgającego. 
		UWAGA: W tym równaniu: 1) miano wirusa to miano/μl, określone przez OD260, jak opisano powyżej, 2) objętość odpowiada objętości w μL aspirowanego wektora użytego w reakcji sprzęgania, 3) liczba cystein to liczba białek, do których reszta cysteiny została wprowadzona na cząstkę wektora, 4) nadmiar ugrupowania jest czynnikiem nadmiaru ugrupowania niezbędnym do efektywnej reakcji sprzęgania (50x), oraz 5) masa cząsteczkowa ugrupowania musi być wprowadzona jako Da (nie kDa).</li>
		<li>Świeżo rozpuszczoną ilość związku (lub możliwą ilość) potrzebną w odpowiednim rozpuszczalniku. 
		UWAGA: Ponieważ ilość potrzebnego substratu sprzęgającego jest niska i trudna do zważenia, ale kosztowna, należy zważyć minimalną możliwą ilość związku i rozpuścić go w odpowiednim stężeniu do zastosowania w reakcji sprzęgania.</li>
		<li>Przenieść roztwór wektorowy do probówki o odpowiedniej wielkości (np. probówki o pojemności 2 ml) i dodać do wektora obliczoną ilość roztworu podstawowego związku sprzęgającego.</li>
		<li>Delikatnie mieszać roztwór, obracając go nad głową przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Napełnij roztwór wektora do całkowitej objętości 6 ml buforem Ad (pH 7,6, wariant A). 
		UWAGA: Ten krok należy wykonać przed nałożeniem roztworu na gradient krokowy, aby upewnić się, że roztwór wektorowy, który nadal zawiera CsCl z gradientu pierwszego kroku, ma gęstość poniżej 1,27 g / ml.</li>
		<li>W drugim etapie pasmowania CsCl należy oczyścić wektor z nieprzereagowanego ugrupowania sprzęgającego:
		<ol>
			<li>Przygotuj dwa równe gradienty kroku CsCl, wykonując następujące kroki dla każdego z nich: 1) Dolna faza: 3 ml 1,41 g/cm3 ρCsCl w buforze Ad (pH 7,6, wariant A), 2) zaznacz poziom dolnej fazy na probówce przed załadowaniem górnej fazy, oraz 3) górna faza: 5 ml 1,27 g/cm3 ρCsCl w buforze AD (pH 7,6, wariant A). 
			UWAGA: Po zajściu sprzężenia stosuje się bez TCEP, ponieważ na kapsydach wektorowych nie powinny być teraz obecne żadne wolne grupy tiolowe.</li>
			<li>Załaduj supernatant na gradient CsCl i wypełnij oba gradienty równomiernie do góry buforem AD (pH 7,6, wariant A).</li>
			<li>Dostosuj ciężary przeciwległych rurek do różnicy wagowej 0.0 g.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ultrawirować przez 2 godziny przy 176 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Na krótko przed zakończeniem ultrawirowania należy 5-krotnie zrównoważyć kolumnę PD-10 z 5 ml buforu AD (pH 7,6, wariant A).</li>
		<li>Jak wykonano w kroku 3.2.10, zamocuj rurkę ultrawirówki tak, aby stała, pozostawiając dostępny obszar wokół znaku dolnego poziomu fazy. Umieść lampę na gęsiej szyi nad rurką. Ponownie, wokół granicy między dolną i górną fazą, powinno być widoczne wyraźne pasmo (wiriony wektorowe) (ryc. 3C).</li>
		<li>Zbierz wektory, nakłuwając probówkę igłą i zasysając pasmo wektora do strzykawki, a następnie przenieś wektor do probówki o pojemności 15 ml. Uważaj, aby zebrać wiriony z obu probówek gradientowych razem jako całkowitą objętość 2.5 ml lub mniejszą. Jeśli zostanie zebrana mniejsza objętość, napełnij buforem Ad (wariant A) do uzyskania całkowitej objętości 2,5 ml.</li>
		<li>Załaduj 2.5 ml na zrównoważoną kolumnę wyładowań niezupełnych. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Dodać 3 ml buforu Ad (wariant A) do kolumny i zebrać przepływ (zawierający oczyszczone wiriony wektorów).</li>
		<li>Dodać glicerol (333 μl) w celu uzyskania końcowego stężenia 10% i podzielić na odpowiednie podwielokrotności (np. 400 μl każdy) i dołączyć podwielokrotność 20 μl w celu określenia miana przez pomiar OD260.</li>
		<li>Przechowywać roztwór wektorowy w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Określić miano wektora, mierząc OD260 z 20 μl roztworu wektorowego, 79 μl buforu AD (wariant A) i 1 μl 10% SDS, jak opisano w kroku 3.2.12. Jako ślepą próbę użyj 79 μl buforu AD (wariant A), 10 μl 10% glicerolu i 1 μl 10% SDS.</li>
		<li>Oblicz miano wektora jako: OD260 x współczynnik rozcieńczenia x 1,1 x 109 cząstek wektorowych/μL. 
		Jak przygotowany w kroku 3.2.27, oblicz: OD260 x 5 x 1,1 x 109 cząstek wektorowych/μL</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Weryfikacja sprzężenia przez SDS-PAGE:
UWAGA: Jeśli do sprzężenia z wirionami Ad używane są związki o wystarczająco dużej masie cząsteczkowej, sprzężenie można zweryfikować za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Udane sprzężenie powinno następnie spowodować przesunięcie prążka białkowego odpowiadającego zmodyfikowanemu białku Ad virion w porównaniu z białkiem w niezmodyfikowanym Ad virionie (patrz ryc. 4).
<ol>
	<li>Zgodnie z obliczonym mianem wektora (krok 3.2.28), oddziel 1-2 x10 10 cząstek wektorowych za pomocą SDS-PAGE (8%).</li>
	<li>Rozwijaj żel poprzez barwienie srebrem żelu39, aby wykryć nawet słabe prążki białkowe:
	<ol>
		<li>Przygotuj do barwienia srebrem (ilości potrzebne na 100 ml buforu podano w nawiasach):
		<ol>
			<li>Przygotuj bufor 1, mieszając 38 ml ddH2O, 50% MeOH (50 ml 100 MeOH), 12% AcOH (12 ml 100% AcOH) i 0,0185% HCHO (50 μL 37% HCHO).</li>
			<li>Przygotować bufor 2, dodając 50% EtOH (50 ml 100% EtOH) do 50 ml ddH2O.</li>
			<li>Przygotować bufor 3, dodając 0,127 g/l Na2S2O3 (12,744 mg) do 100 ml ddH2O.</li>
			<li>Przygotować bufor 4, dodając 2 g/l AgNO3 (0,2 g) i 0,0185% HCHO (50 μl z 37% HCHO) do 100 ml ddH2O.</li>
			<li>Przygotować bufor 5, dodając 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0,0185% HCHO (50 μL z 37% HCHO) i 2,5 mg/L Na2S2O3 (0,256 mg) do ddH2O, aby uzyskać końcową objętość 100 ml.</li>
			<li>Przygotuj bufor 6, mieszając 38 ml ddH2O, 50% MeOH (50 ml 100% MeOH) i 12% AcOH (12 ml 100% AcOH).</li>
			<li>Przygotuj bufor 7, mieszając 60 ml ddH2O, 30% MeOH (30 ml 100% MeOH) i 10% gliceryny (10 ml 100% gliceryny).</li>
			<li>Przygotować bufor 8, mieszając 10% gliceryny (10 ml 100% gliceryny) z 90 ml ddH2O.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonywanie barwienia srebra
	<ol>
		<li>Utrwal żel w buforze 1 na 30 minut.</li>
		<li>Myć żel w buforze 2 przez 15 minut.</li>
		<li>Żel należy wstępnie przygotować w buforze 3 przez 1 minutę.</li>
		<li>Umyj żel 3 razy w ddH2O przez 20 s.</li>
		<li>Impregnować żel w buforze 4 przez 20 min.</li>
		<li>Umyj żel 2 razy w ddH2O przez 20 s.</li>
		<li>Rozwijać żel w buforze 5 do momentu uwidocznienia prążków (10 s do 10 min).</li>
		<li>Umyj żel 2 razy w ddH2O przez 2 min.</li>
		<li>Zatrzymaj rozwój w buforze 6 na 5 minut.</li>
		<li>Przechowywać żel w buforze 7 przez 20 minut.</li>
		<li>Przechowywać żel w buforze 8, 
		UWAGA: Wydajność sprzężenia można określić przez densytometryczną kwantyfikację zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych pasm docelowego kapsomeru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-05597-7_1">Molecular evolution of adenoviruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).</li>
<li>Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+content+and+evolution+of+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic content and evolution of adenoviruses.</a> Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).</li>
<li>Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cytopathogenic+agent+from+human+adenoids+undergoing+spontaneous+degeneration+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).</li>
<li>van Oostrum, J., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+adenovirus+type+2+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the adenovirus type 2 virion.</a> Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).</li>
<li>Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+imaging+of+adenovirus%3A+bridging+the+resolution+gap+between+X-ray+crystallography+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22TheEMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy.</a> TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).</li>
<li>Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstruction+reveals+the+complex+molecular+organization+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus.</a> Cell. 67, 145-154 (1991).</li>
<li>Meier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+triggers+macropinocytosis+and+endosomal+leakage+together+with+its+clathrin-mediated+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake.</a> Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Qiu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+natural+IgM+concentration+on+gene+therapy+with+adenovirus+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors.</a> Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).</li>
<li>Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+rates+of+adenovirus+type+5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice.</a> Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).</li>
<li>Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+systemically+delivered+adenovirus+vectors+with+Kupffer+cells+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver.</a> Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).</li>
<li>Schiedner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemodynamic+response+to+intravenous+adenovirus+vector+particles+is+caused+by+systemic+Kupffer+cell-mediated+activation+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells.</a> Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).</li>
<li>Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+adenovirus+by+Kupffer+cells+is+mediated+by+scavenger+receptors%2C+natural+antibodies%2C+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement.</a> Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).</li>
<li>Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenovirus+serotype+5+hexon+regions+that+interact+with+scavenger+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors.</a> Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).</li>
<li>Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR-A+and+SREC-I+binding+peptides+increase+HDAd-mediated+liver+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction.</a> Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).</li>
<li>Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+scavenger+receptors+and+host-derived+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands.</a> Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).</li>
<li>Ganesan, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clearance+of+blood-borne+virus+by+liver+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium.</a> PLoS Pathogen. 7, e1002281(2011).</li>
<li>Cichon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titer+determination+of+Ad5+in+blood%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note.</a> Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).</li>
<li>Carlisle, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+erythrocytes+bind+and+inactivate+type+5+adenovirus+by+presenting+Coxsackie+virus-adenovirus+receptor+and+complement+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1.</a> Blood. 113, 1909-1918 (2009).</li>
<li>Waddington, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+mediates+liver+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer.</a> Cell. 132, 397-409 (2008).</li>
<li>Kalyuzhniy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+is+critical+for+virus+infection+of+hepatocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).</li>
<li>Vigant, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616322833">Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).</li>
<li>Jonsson, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factors+IX+and+X+enhance+binding+and+infection+of+adenovirus+types+5+and+31+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells.</a> Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).</li>
<li>Bradshaw, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+receptor+engagement+during+infection+by+adenovirus+complexed+with+blood+coagulation+factor+X%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X.</a> PLoS Pathogen. 6, e1001142(2010).</li>
<li>Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+basic+amino+acids+in+the+factor+X+serine+protease+mediates+surface+attachment+of+adenovirus%2FFX+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes.</a> Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Zaiss, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+Heparan+Sulfate+Is+Required+for+Adeno-Associated+Virus+2+but+Dispensable+for+Adenovirus+5+Liver+Transduction+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo.</a> Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).</li>
<li>Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uses+and+properties+of+PEG-linked+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Therapeutic+Drug+Carrier+Systems%22%5BJournal%5D)">The uses and properties of PEG-linked proteins.</a> Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).</li>
<li>Parveen, S., Sahoo, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+clinical+applications+of+polyethylene+glycol+conjugated+proteins+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs.</a> Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).</li>
<li>O'Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylation+of+adenovirus+with+retention+of+infectivity+and+protection+from+neutralizing+antibody+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo.</a> Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).</li>
<li>Subr, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coating+of+adenovirus+type+5+with+polymers+containing+quaternary+amines+prevents+binding+to+blood+components%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components.</a> Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).</li>
<li>Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001605001012">Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).</li>
<li>Corjon, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S152500161632679X">Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Krutzke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+blood+coagulation+factor+X-binding+to+Ad5+by+position-specific+PEGylation%3A+Preventing+vector+clearance+and+preserving+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity.</a> Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+bioresponsive+shielding+of+adenovirus+hexon+with+HPMA+copolymers+maintains+transduction+capacity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo.</a> PloS One. 9, e82716(2014).</li>
<li>Kratzer, R. F., Kreppel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+Purification%2C+and+Titration+of+First-Generation+Adenovirus+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Skuteczność, z jaką genetycznie wprowadzone cysteiny mogą być modyfikowane chemicznie, wynosi zwykle 80-99%, a pewne zmienne wpływają na tę wydajność. Po pierwsze, niezwykle ważne jest, aby genetycznie wprowadzone cysteiny nie ulegały przedwczesnemu utlenianiu. Będąc dobrze chronionym w środowisku redukującym komórek produkcyjnych, konieczne jest zapewnienie środowiska nieutleniającego po uwolnieniu cząstek wektorowych z komórek produkcyjnych i podczas modyfikacji chemicznej. W tym celu można stosować odczynniki redukują...

Adenowirusy (Ad), członkowie rodziny Adenoviridae, to bezotoczkowe wirusy DNA, których do tej pory zidentyfikowano ponad 70 typów (http://hadvwg.gmu.edu). W zależności od właściwości hemaglutynacji, struktury genomu i wyników sekwencjonowania, 70 typów Ad można podzielić na siedem gatunków (ludzkie adenowirusy od A do G)1,2. Ludzki genom Ad ma rozmiar 38 kb i jest otoczony dwudziestościennym nukleokapsydem3. Ze względu na ich obfitość, sześciokąt białka kapsydu, zasada pentonowa i błonnik są określane jako główne białka kapsydu. Najliczniejszy i największy sześciokąt białka kapsydu tworzy 20 faset kapsydu, z których każdy składa się z 12 homotrimerów heksonów4,5. Penton, znajdujący się na każdej dwudziestościennej krawędzi (wierzchołku), składa się z pentamerów o podstawie pentonowej i reprezentuje podstawę dla kolca wierzchołkowego, który jest zbudowany z trymerów włókien glikozylowanych5,6. Natywny wpis w komórce reklamy składa się zasadniczo z dwóch głównych kroków. Po pierwsze, gałka włókna wiąże się z pierwotnym receptorem. W typach Ad z gatunków A, C, E i F jest to receptor Coxsackie i adenowirusa (CAR). Ta interakcja sprawia, że wirion znajduje się w przestrzennej bliskości powierzchni komórki, ułatwiając w ten sposób interakcje między integrynami komórkowymi a motywem RGD w zasadzie pentonowej, a w konsekwencji wywołując odpowiedzi komórkowe. Po drugie, zmiany w cytoszkielecie prowadzą do internalizacji wirionu i transportu do endosome7. Po częściowym rozkładzie w endosomie, wirion jest uwalniany do cytoplazmy i ostatecznie przemieszcza się do jądra w celu replikacji.
Podczas gdy reklama może być dostarczana lokalnie (np. do szczepień genetycznych), ogólnoustrojowe dostarczanie przez krwioobieg, jak jest to wymagane w onkowirusoterapii, napotyka kilka barier. Krążąc w krwiobiegu, wstrzyknięte wiriony napotykają system obronny układu odpornościowego gospodarza, co prowadzi do szybkiej neutralizacji wektorów opartych na wirusie i sprawia, że wektory oparte na AD są wyjątkowo nieefektywne w zastosowaniach ogólnoustrojowych. Co więcej, naturalny hepatotropizm Ad zakłóca dostarczanie ogólnoustrojowe i musi zostać rozwiązany tak, aby przekierować Ad do nowych komórek docelowych.
Naturalne przeciwciała IgM wrodzonego układu odpornościowego kodowane przez linię zarodkową szybko rozpoznają i wiążą wysoce powtarzalne struktury na powierzchni wirionu8,9. Te kompleksy immunologiczne następnie aktywują klasyczne i nieklasyczne szlaki układu dopełniacza, prowadząc do szybkiej neutralizacji dużej części wirionów za pośrednictwem dopełniacza8. Drugi szlak prowadzący do znacznego usunięcia wirionów Ad jest pośredniczony przez makrofagi10 i związany z ostrymi toksycznymi i hemodynamicznymi skutkami ubocznymi11,12. W szczególności w przypadku AD, komórki Kupffera znajdujące się w wątrobie wiążą się z wirionami Ad i fagocytycznie je pobierają za pośrednictwem specyficznych receptorów zmiatających, eliminując je w ten sposób z klasy krew<sup="xref">13,14,15. Specyficzne receptory zmiatacza zostały również zidentyfikowane na sinusoidalnych komórkach śródbłonka wątroby (komórkach LSE)16, a komórki LSE również wydają się przyczyniać do eliminacji wektorów17, ale w jakim stopniu nadal wymaga wyjaśnienia. Co więcej, niektóre typy Ad i ich wektory pochodne są skutecznie sekwestrowane przez ludzkie erytrocyty18, z którymi wiążą się poprzez CAR lub receptor dopełniacza CR119. Warto zauważyć, że ten mechanizm sekwestracji nie może być badany w systemie modelu mysim, ponieważ w przeciwieństwie do ludzkich erytrocytów, erytrocyty myszy nie wykazują ekspresji CAR.
Specyficzne przeciwciała anty-Ad generowane przez adaptacyjny układ odpornościowy po ekspozycji na Ad z powodu wcześniejszych infekcji Ad lub po pierwszym podaniu w aplikacjach ogólnoustrojowych stanowią kolejną barierę dla efektywnego wykorzystania wektorów Ad i powinny być unikane w efektywnym dostarczaniu ogólnoustrojowym.
Na koniec, silny hepatotropizm niektórych typów Ad (w tym Ad5) poważnie utrudnia zastosowanie Ad w terapii systemowej. Ten tropizm powodujący transdukcję hepatocytów wynika z wysokiego powinowactwa wirionu Ad do czynnika krzepnięcia krwi X (FX), w którym pośredniczy oddziaływanie FX z białkiem heksonu Ad20,21,22. FX łączy wirion z glikanami siarczanu heparyny (HSPG) na powierzchni hepatocytów20,23,24,25. Kluczowym czynnikiem tej interakcji wydaje się być specyficzny zakres N- i O-siarczanowania HSPG w komórkach wątroby24, który różni się od HSPG na innych typach komórek. Oprócz tego szlaku, w którym pośredniczy FX, ostatnie badania sugerują inne szlaki, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane, a które powodują transdukcję Ad hepatocytów26,27,28.
Ostatnio wykazano, że FX nie tylko bierze udział w transdukcji AD przez hepatocyty, ale także poprzez wiązanie, wirion osłania cząsteczkę wirusa przed neutralizacją przez układ dopełniacza26. Zmniejszenie transdukcji hepatocytów poprzez zapobieganie wiązaniu FX stworzyłoby zatem niepożądany efekt uboczny w postaci zwiększenia neutralizacji Ad przez wrodzony układ odpornościowy.
Dogłębna wiedza na temat złożonych interakcji między wektorami a organizmami gospodarza jest zatem niezbędna do opracowania bardziej wydajnych wektorów do zastosowań systemowych, które omijają przeszkody narzucane przez organizm gospodarza.
Jedna ze strategii, która była pierwotnie stosowana w przypadku białek terapeutycznych, została zaadaptowana do wektorów AD, aby przynajmniej częściowo pokonać wyżej opisane bariery. Antygenowość i immunogenność terapeutycznych związków białkowych można zmniejszyć poprzez sprzężenie z glikolem polietylenowym (PEG)29,30. W związku z tym kowalencyjne sprzężenie polimerów, takich jak PEG lub poli[N-(2-hydroksypropylo)metakryloamid] (pHPMA) z powierzchnią kapsydu, chroni wektor przed niepożądanymi interakcjami wektor-gospodarz. Zwykle sprzężenie polimerowe jest ukierunkowane na grupy ε-aminowe z reszt bocznych lizyny, które są losowo rozmieszczone na powierzchni kapsydu. Cząstki wektorowe w roztworze są, ze względu na hydrofilowy charakter przyłączonych polimerów, otoczone stabilną powłoką wodną, która zmniejsza ryzyko rozpoznania komórek odpornościowych lub degradacji enzymatycznej. Ponadto wykazano, że pegylowane wektory Ad unikają neutralizacji przez przeciwciała anty-heksonowe in vitro i u wstępnie uodpornionych myszy in vivo31. W przeciwieństwie do genetycznych modyfikacji kapsydu, chemiczne sprzęganie polimerów odbywa się po wyprodukowaniu i oczyszczeniu, co pozwala nie tylko na wykorzystanie konwencjonalnych komórek produkcyjnych i produkcję zapasów wektorów o wysokim mianie, ale także na jednoczesną modyfikację tysięcy aminokwasów na powierzchni kapsydu. Jednak ekranowanie skierowane aminami zachodzi losowo na całej powierzchni kapsydu, co skutkuje dużą niejednorodnością i nie pozwala na modyfikację określonych kapsomerów. Co więcej, duże ugrupowania polimerowe wymagane do uzyskania korzystnych efektów upośledzają bioaktywność wirusa32.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, Kreppel et al. 33 wprowadził genetyczno-chemiczną koncepcję re- i detargetowania wektorów. Cysteiny zostały genetycznie wprowadzone do kapsydu wirusa w miejscach narażonych na działanie rozpuszczalnika, takich jak włókno HI-loop33, białko IX34 i hexon35,36. Chociaż nie występują naturalnie, wektory Ad zawierające cysteinę mogą być wytwarzane przy wysokich mianach w normalnych komórkach produkcyjnych. Co ważne, insercja cystein w niektórych kapsomerach i w różnych pozycjach w obrębie jednego kapsomeru pozwala na wysoce specyficzne modyfikacje ugrupowań reagujących z grupami tiolowymi. Wykazano, że to genetyczno-chemiczne podejście pokonuje wiele przeszkód w projektowaniu wektorów reklam. Udowodniono, że połączenie pegylacji opartej na aminie w celu detargetowania i sprzężenia transferyny na bazie tiolu z pętlą HI-loop włókna z powodzeniem przekierowuje zmodyfikowane wektory Ad do komórek z niedoborem CAR33. Ponieważ hekson bierze udział w większości niepożądanych interakcji (przeciwciała neutralizujące, czynnik krzepnięcia krwi FX), strategie modyfikacji oparte na tiolach zastosowano również w przypadku heksonu. Sprzężenie małych ugrupowań PEG z HVR5 heksonu uniemożliwiło cząstkom wektora Ad transdukcję komórek SKOV-3 w obecności FX, podczas gdy duże ugrupowania PEG zwiększały transdukcję hepatocytów14,35. Wykazano, że cząstki wektora ad przenoszące mutacje w gałce włókien hamującej wiązanie CAR i w HVR7 hamującej wiązanie FX (i zawierające cysteiny wstawione w HVR1 w celu PEGylacji specyficznej dla pozycji) unikają neutralizacji za pośrednictwem przeciwciał i dopełniacza, a także wychwytu za pośrednictwem receptora zmiatacza bez utraty zakaźności. Co ciekawe, pomimo braku naturalnej tarczy FX, pegylacja ponownie poprawiła transdukcję hepatocytów w funkcji PEG size36. Wykazano jednak, że ekranowanie kowalencyjne ma wpływ na procesy transportu wewnątrzkomórkowego. Prill i wsp. porównano nieodwracalne i biowrażliwe osłony oparte na pHPMA i wykazano, że ani tryb ekranowania, ani ładunek kopolimeru nie miały wpływu na wnikanie do komórki, ale wpływały na transport cząstek do jądra. Zastosowanie bioczułej osłony z dodatnio naładowanymi kopolimerami pHPMA pozwoliło na transport cząstek do jądra, utrzymując wysoką wydajność transdukcji wektorów Ad in vitro i in vivo37.
Podsumowując, dane te wskazują, że nawet przy założeniu, że wszystkie interakcje wektor-gospodarz były znane i brane pod uwagę, konieczne są nadmierne modyfikacje powierzchni kapsydu, aby pokonać przeszkody związane z systemowym dostarczaniem wektorów.
Tutaj udostępniamy protokół do przeprowadzania specyficznych dla miejsca modyfikacji chemicznych kapsydów wektorów adenowirusowych w celu osłony i/lub retargetowania cząstek wektorów adenowirusowych i wirusów onkolitycznych opartych na adenowirusie. Koncepcja tej technologii została przedstawiona na rysunku 1. Umożliwia ekranowanie niektórych regionów kapsydu przed niepożądanymi interakcjami poprzez kowalencyjne przyłączanie polimerów syntetycznych. Jednocześnie zapewnia również środki do przyłączania ligandów i łączenia ekranowania i celowania. Korzystając z prostej chemii, eksperymentatorzy będą w stanie kowalencyjnie modyfikować powierzchnię wektora adenowirusa za pomocą szerokiej gamy cząsteczek, w tym peptydów/białek, węglowodanów, lipidów i innych małych cząsteczek. Ponadto protokół zawiera ogólną koncepcję modyfikacji chemicznej biologicznie aktywnych wektorów pochodzących od wirusa przy zachowaniu ich biologicznej integralności i aktywności.

<table><tbody><tr><td>Vector oczyszczanie i modyfikacja chemiczna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Air liquide</td><td>lokalny dealer</td><td></td>gazu</tr><tr><td>Liquid Liquid</td><td></td><td>Liquid lokalny dealer</td><td></td>gazu</tr><tr><td>500 ml probówki wirówkowe</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Express Plus 0,22 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-10g</td><td></td></tr><tr><td>2 ml (3mL) Norm Ject (strzykawki)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>Igły Fine-Ject do jednorazowego użytku (żółte 0,9 x 40 mm)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710009040</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu 99,999% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>8627.1</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki z żelu krzemionkowego</td><td>Applichem</td><td>A4569.2500</td><td></td></tr><tr><td>Maleimid glikolu metoksypolietylenowego - 750 (PEG mal-750)</td><td>Iris Biotech</td><td></td><td>sklep w kulkach z żelu krzemionkowego pod kątem -80 &; C</td></tr><tr><td>13,2 ml Ultra przezroczyste ultrawirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>otwarte tylko w kapturze</td></tr><tr><td>Kolumna chromatograficzna wykluczająca rozmiar PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>przechowywać pod adresem 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A1069.1000</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem</td><td>A1112,0500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A1123.1000</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td> Materiał do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-0231SP</td><td></td></tr><tr><td>FBS Dobry</td><td>PAN Biotech</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do filtrów biosfery (różne rozmiary)</td>Pipety serologiczne <td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(różne rozmiary)</td>Probówki reakcyjne <td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(różne rozmiary)</td><td>Płytki TC Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiał do protokołu barwienia srebrem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T.Baker</td><td>8045</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>AppliChem</td><td>1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>AppliChem</td><td>A0820,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>AppliChem</td><td>A0877,0250</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>AppliChem</td><td>A1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>AppliChem</td><td>1,418,791,210</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>AppliChem</td><td>A3944.0025</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>AppliChem</td><td>A3900,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Specjalny sprzęt laboratoryjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Nalgene</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roter do Megafuge TX750 + Adapter i Llids do probówek 500 ml</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel</td> <td>wodnaKonwencjonalna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultrawirówka np. Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nadaje się do rotora Ultrazentrifuge np. SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Konwencjonalny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak z zaciskami</td><td>Konwencjonalny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa na gęsią szyję</td><td>Konwencjonalny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirnik górny</td><td>Konwencjonalny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>blok termiczny</td><td>Konwencjonalny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fotometr (OD 260)</td><td>Konwencjonalny</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączone genetyczne i chemiczne modyfikacje kapsydów wektorów transferu genów opartych na adenowirusie do ekranowania i celowania

Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

Wektory adenowirusowe są potężnymi narzędziami do szczepień genetycznych i wirusoterapii onkolitycznej. Są one jednak podatne na wiele niepożądanych interakcji wektor-gospodarz, zwłaszcza po dostarczeniu in vivo. Panuje zgoda co do tego, że ograniczenia narzucone przez niepożądane interakcje wektor-gospodarz mogą zostać przezwyciężone tylko wtedy, gdy zostaną przeprowadzone zdefiniowane modyfikacje powierzchni wektora. Modyfikacje te obejmują ekranowanie cząstek przed niepożądanymi interakcjami i celowanie poprzez wprowadzenie nowych ligandów. Celem przedstawionego tutaj protokołu jest umożliwienie czytelnikowi wygenerowania ekranowanych i, w razie potrzeby, ponownie ukierunkowanych wektorów transferu genów ludzkiego adenowirusa lub wirusów onkolitycznych. Protokół umożliwi naukowcom modyfikację powierzchni kapsydów wektorów adenowirusowych poprzez specyficzne chemiczne przyłączanie syntetycznych polimerów, węglowodanów, lipidów lub innych biologicznych lub chemicznych ugrupowań. Opisano w nim najnowocześniejszą technologię połączonych genetycznych i chemicznych modyfikacji kapsydu, które, jak wykazano, ułatwiają zrozumienie i pokonanie barier w dostarczaniu wektorów adenowirusowych in vivo. Podano szczegółowy i skomentowany opis kluczowych etapów przeprowadzania określonych reakcji chemicznych z biologicznie aktywnymi wirusami lub wektorami pochodzącymi od wirusów. Technologia opisana w protokole opiera się na genetycznym wprowadzeniu (naturalnie nieobecnych) reszt cysteiny do odsłoniętych rozpuszczalnikiem pętli wektorów pochodzących z adenowirusa. Te reszty cysteiny zapewniają specyficzną reaktywność chemiczną, która może, po wytworzeniu wektorów do wysokich mian, być wykorzystana do wysoce specyficznego i wydajnego kowalencyjnego sprzężenia chemicznego cząsteczek z wielu różnych klas substancji z cząstkami wektora. Co ważne, protokół ten można łatwo dostosować do wykonywania szerokiej gamy różnych (nieopartych na tiolu) modyfikacji chemicznych kapsydów wektorów adenowirusowych. Wreszcie, jest prawdopodobne, że wektory transferu genów oparte na wirusie bez otoczki, inne niż adenowirus, mogą być modyfikowane na podstawie tego protokołu.

Rysunek 2 przedstawia przykłady efektu cytopatycznego (CPE) w komórkach 293 (HEK 293), które wskazują na prawidłową produkcję wektora. Komórki powinny wykazać odpowiednią morfologię (Rysunek 2C) od 40 do 48 godzin po inokulacji wektorem wirusowym. Wybór właściwego momentu zbioru jest kluczowy, aby uniknąć utraty cząsteczek wirusa w wyniku lizy komórek oraz zapobiec utlenianiu genetycznie wprowadzonych grup tiolowych. Jeśli cząste...

Opisany tutaj protokół umożliwia badaczom specyficzne modyfikowanie kapsydów adenowirusa w wybranych miejscach za pomocą prostej chemii. Można generować osłonięte cząsteczki wektorów adenowirusa i ukierunkowane wektory transferu genów, a także badać interakcje wektora z gospodarzem.

Połączone genetyczne i chemiczne modyfikacje kapsydów wektorów transferu genów opartych na adenowirusie do ekranowania i celowania

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu Terapii Genowej, Onkolizy i Szczepień Genetycznych. Ułatwia zrozumienie i modulację interakcji wektorów przenoszących geny adenowirusa, które są najczęściej stosowanym typem wektora w dotychczasowych badaniach klinicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że kapsułki adenowirusa mogą być specyficznie modyfikowane w ściśle określony sposób w wybranych pozycjach i w różnym stopniu za pomocą prostej chemii.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię, ponieważ modyfikacja wektora gospodarza może być nie tylko analizowana, ale także modulowana w sposób zorientowany na pacjenta. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w specyficzne interakcje wektora z gospodarzem, może być również stosowana do znakowania i śledzenia cząstek wirusa w organizmach żywych, takich jak myszy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z unikalnym połączeniem wirusologii i chemii organicznej, które wymaga praktycznej wiedzy z obu dziedzin.Specjalna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ tutaj metody z chemii organicznej spotykają się z metodami biologii komórki i wirusologii, w tym sztuczki obsługi specyficzne dla danej dziedziny. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wszystkie zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zważyć jeden mililitr każdego bufora gradientu, aby sprawdzić jego gęstość.Po wysterylizowaniu wszystkich, zawierające TCEP należy spryskać argonem przez około 30 sekund, aby zapobiec utlenianiu TCEP. Przechowywać fiolki zawierające stałe sproszkowane ugrupowanie sprzęgające w większych probówkach, z których każda jest wypełniona poduszką z kulek żelu krzemionkowego, aby zapobiec gromadzeniu się skraplającej się wody podczas rozmrażania fiolek. Umieść te rurki w eksykatorze.Usunąć powietrze z eksykatora i zastąpić je argonem. Następnie szczelnie zamknij każdą tubkę i przenieś ją do większego pojemnika z kulkami żelu krzemionkowego. Po przeniesieniu wszystkich probówek zamknij pojemnik.Przechowuj pojemnik w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Gdy pojemnik będzie gotowy do rozmrożenia, umieść go w warstwie kulek krzemionkowych w eksykatorze. Pozwól pojemnikowi powoli ogrzać się do temperatury pokojowej, a następnie otwórz pojemnik.Gdy komórki osiągną optymalny efekt cytopatyczny, zbierz je, zeskrobując płytki i przenosząc supernatant do probówek wirówkowych. Wirować zawiesinę komórkową 400 razy G przez 10 minut. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w czterech mililitrach buforu Ad zawierającego 10 milimolowy TCEP i przenieść powstały roztwór do sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów.Zamrozić roztwór w ciekłym azocie, a następnie rozmrozić go w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania trzy razy, aby uratować wektor. Wirować w temperaturze 5000 G i czterech stopniach Celsjusza przez dziesięć minut.Podczas wirowania ustaw dwie ultra probówki wirówkowe, aby rozpocząć przygotowanie dwóch równych gradientów stopniowych chlorku cezu. Dodaj trzy mililitry dolnej fazy do każdej z tych probówek. Zaznacz poziom dolnej fazy na rurze przed załadowaniem górnej fazy.Następnie ostrożnie ułóż pięć mililitrów górnej fazy do dolnej fazy, pipetując ją bardzo powoli wzdłuż ścianek probówki. Po przygotowaniu gradientów i zakończeniu wirowania należy załadować supernatant z próbki równomiernie na oba gradienty. Wypełnij pozostałą przestrzeń w każdej rurce gradientowej buforem AD zawierającym dziesięciomilimolowy TCEP, upewniając się, że rurki są wypełnione do samej góry.Dostosuj wagę przeciwległych rur do zerowej różnicy masy. I zmieniaj wirówkę na 176000 razy G i 4 stopnie Celsjusza przez dwie godziny. Następnie użyj zacisku, aby przymocować jedną ultra probówkę wirówkową do stojaka.Upewnij się, że obszar wokół dolnego poziomu fazy jest oznaczony jako dostępny. Umieść lampę na gęsiej szyi nad rurką. Wokół znaku, na granicy między dolną i górną fazą, powinien być widoczny wyraźny pas.Nakłuć rurkę igłą i zassać opaskę wektora do strzykawki, aby zebrać wektor. Przenieś zebrane wirony wektorowe do 15-mililitrowej probówki i oblicz ilość potrzebnego substratu sprzęgającego, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie przenieś roztwór wektorowy do rurki o odpowiednim rozmiarze.I obliczona ilość roztworu podstawowego związków sprzęgających. Delikatnie mieszać przez obrót nad głową przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dostosuj całkowitą objętość roztworu wektorowego do sześciu mililitrów, dodając bufor AD.Oczyść wektor z nieprzereagowanego ugrupowania sprzęgającego za pomocą drugiego etapu wiązania chlorku cezu, jak opisano w protokole tekstowym. Nakłuć rurkę igłą i zassać opaskę wektorową do strzykawki. Przenieś zebrane wektory do 15-mililitrowej probówki.Jeśli łączna wartość z obu rurek gradientowych jest mniejsza niż 2,5 mililitra, dostosuj objętość do 2,5 mililitra, dodając bufor AD. Załaduj połączone wirony do równej ulepszonej kolumny Pd i odrzuć przepływ. Następnie dodaj trzy mililitry bufora Ad do kolumny i zbierz przepływ.Dodaj 333 mikrolitry glicerolu do zebranego przepływu, aby uzyskać końcowe stężenie dziesięciu procent. Podziel je na odpowiednie podwielokrotności. Upewnij się, że dołączyłeś podwielokrotność 20 mikrolitrów w celu dokładniejszego określenia za pomocą pomiaru OD 260.Roztwór wektorowy należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu użycia. Reprezentatywne wyniki wpływu na 293 komórki wskazują, że produkcja wektorów zakończyła się sukcesem. Komórki powinny wykazywać morfologię 40-48 godzin po zaszczepieniu wektorem wirusa.Zabarwiony srebrem SDS jest następnie wykorzystywany do oceny wydajności sprzężenia. Uruchamiane są wektory z cysteinami wprowadzonymi do bazy pentonowej kapsomeru zarówno z heksonem zmodyfikowanym, jak i niezmodyfikowanym. Pasma Hexon wykazują przesunięcie wskazujące na udaną modyfikację ponad 90 procent monomerów na kapsyd.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zapewnić środowisko redukujące dla niezmodyfikowanej cząstki wektorowej. Po modyfikacji odpowiednia jest regularna atmosfera. Precyzyjne obliczenia dokumentacyjne muszą zapewnić ilościową modyfikację wszystkich cząstek wektorowych.Rozwój tej techniki pomaga w badaniach w dziedzinie terapii genowej w dalszym badaniu bezpiecznych i niewystarczających strategii dostarczania wektorów. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak sprzęganie ligandów do celowania lub barwników fluorescencyjnych do znakowania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak użycie receptorów i dystrybucja biologiczna. Upewnij się, że przestrzegasz lokalnych przepisów dotyczących GMO i bezpieczeństwa pracy.

combined-genetic-chemical-capsid-modifications-adenovirus-based-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Prezentujemy podstawową technikę inżynierii molekularnej i ewolucji syntetycznych wektorów do terapii genowej opartych na wirusach towarzyszących adenowirusom (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA (DNA family shuffling). Ponadto przedstawiamy ogólne wytyczne oraz reprezentatywne przykłady selekcji i analizy poszczególnych chimerycznych kapsydów o ulepszonych właściwościach w odniesieniu do komórek docelowych w hodowli lub u myszy.

Inżynieria i ewolucja syntetycznych wektorów terapii genowej opartych na wirusach adeno-zależnych (AAV) za pomocą tasowania rodzin DNA

W ciągu ostatnich 15 lat, wektory pochodzące od psiego adenowirusa typu 2 (CAV2) udowodniły swoją skuteczność w transdukcji komórek in vitro i in vivo i są szeroko stosowane w szczepieniach i terapii genowej. W tym miejscu opisujemy procedurę konstruowania, wytwarzania i oczyszczania wektorów CAV2, w wyniku której powstają zawiesiny wirusa o wysokim mianie.

Produkcja i oczyszczanie niereplikacyjnych wektorów pochodnych adenowirusa psów typu 2

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wektora Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 o nazwie Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 poprzez wykorzystanie strategii inkorporacji antygenu kapsydu. Wykazano, że wektor ten wykazuje przydatność jakościową, zdolność do ucieczki z surowic Ad5-dodatnich in vitro oraz antygenowość i immunogenność w stosunku do włączonych antygenów.

Wykorzystanie strategii inkorporacji kapsydu antygenu do opracowania metod szczepień z wektorem 5 serowirusa

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

Tutaj opisujemy efektywną i powtarzalną strategię produkcji, mianowania i kontroli jakości partii wektorów wirusowych związanych z adeno. Pozwala na uzyskanie preparatu wektorowego o wysokim mianie (≥1 x10 13 genomów wektorowych/ml) i wysokiej czystości, gotowego do użycia in vitro lub in vivo.

Produkcja, oczyszczanie i kontrola jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Tutaj prezentujemy protokół produkcji adenowirusa za pomocą systemu pAdEasy. Technologia obejmuje rekombinację plazmidów pAdTrack i pAdEasy-1, pakowanie i amplifikację adenowirusa, oczyszczanie cząstek adenowirusa z lizatu komórkowego i pożywki hodowlanej, miareczkowanie wirusa oraz testowanie funkcjonalne adenowirusa.

Skuteczna metoda produkcji adenowirusa

AAV generowanie biblioteki wyświetlania peptydów i późniejsza walidacja poprzez kodowanie kreskowe kandydatów o nowych właściwościach do tworzenia AAV nowej generacji.

Izolacja wektorów terapii genowej nowej generacji poprzez inżynierię, kodowanie kreskowe i badania przesiewowe wariantów kapsydu wirusa związanego z adenowirusem (AAV)

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Poznaj metodę chemicznej modyfikacji kapsydów adenowirusa do terapii genowej i szczepień genetycznych. Technika umożliwia precyzyjne modyfikowanie wektorów genowych w celu badania interakcji z gospodarzem.

Połączone genetyczne i chemiczne modyfikacje kapsydów wektorów transferu genów opartych na adenowirusie do ekranowania i celowania (Wideo) | JoVE Journal

Połączone genetyczne i chemiczne modyfikacje kapsydów wektorów transferu genów opartych na adenowirusie do ekranowania i celowania

Przeglądaj więcej filmów