Name: Bezznacznikowe obrazowanie pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek za pomocą mikroskopii iSCAT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj technikę bezznacznikowej detekcji pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek przy użyciu mikroskopii iSCAT. Ta metoda umożliwia obserwację procesów biologicznych na poziomie molekularnym w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Towarzystwo Maxa Plancka, profesurę Alexandra-von-Humboldta oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Dziękujemy Stefanie Schaffer z Universitätsklinikum Erlangen za udostępnienie komórek Laz388 i za przydatne dyskusje. Dziękujemy Simone Ihloff i Maksimowi Schwabowi z MPL za wsparcie techniczne.

<ol><li>Hathout, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+the+study+of+the+cell+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Approaches to the study of the cell secretome.</a> Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).</li>
<li>Pandey, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+study+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomics to study genes and genomes.</a> Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).</li>
<li>Makridakis, M., Vlahou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+proteomics+for+discovery+of+cancer+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers.</a> Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).</li>
<li>Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+in+proteomics%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).</li>
<li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12454649">Protein microarrays and proteomics.</a> Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).</li>
<li>Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+quality+in+memory+and+protection%3A+implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/10.1063/1.1589587">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18229952">Optical biosensors.</a> Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).</li>
<li>Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Single+Protein+Using+a+Nanoplasmonic-Photonic+Hybrid+Microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity.</a> Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).</li>
<li>Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+of+single+non-absorbing+molecules+using+the+surface+plasmon+resonance+of+a+gold+nanorod%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).</li>
<li>Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein+detection+in+crowded+molecular+environments+in+cryo-EM+images%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images.</a> eLife. 6, e25648(2017).</li>
<li>Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Spectroscopy+of+Gold+Nanoparticles+Using+Supercontinuum+White+Light+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy.</a> Physical Review Letters. 93 (3), 037401(2004).</li>
<li>Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+optical+detection+and+tracking+of+very+small+gold+nanoparticles+at+a+water-glass+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface.</a> Optics Express. 14 (1), 405(2006).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nature Communications. 5, 4495(2014).</li>
<li>Roux, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+Structure+and+Function+as+Revealed+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).</li>
<li>McDonald, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Single-Cell+Secretion+Dynamics+with+Single-Protein+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity.</a> Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).</li>
<li>Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+nanoscopic+tracking+of+the+position+and+orientation+of+a+single+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus.</a> Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).</li>
<li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li>
<li>Spindler, S., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0022-3727/49/27/274002/meta">Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002(2016).</li>
<li>Lazarus, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+unique+cell+line+%28LAZ+221%29+from+human+acute+lymphocytic+%28%26%2334%3Bnull%26%2334%3B+cell%29+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic (&#34;null&#34; cell) leukemia.</a> Cancer Research. 38 (5), 1362-1367 (1978).</li>
<li>Mackensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+situ+amplification+of+cytotoxic+T-lymphocytes+with+antitumor+activity+in+a+human+regressive+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma.</a> Cancer Research. 53 (15), 3569-3573 (1993).</li>
<li>Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471747599.cac012">Primary Culture.</a> Culture of Animal Cells. , (2005).</li>
<li>Dahmardeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDahmardeh%2C+M+%22Unpublished+data%22">Unpublished data</a>. , (2018).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).</li>
<li>Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/biophysj/abstract/S0006-3495(13)04613-4">Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy.</a> Biophysical Journal. 106 (2), 606a(2014).</li>
<li>Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+Label-Free+Nanosensing+and+High-Speed+Tracking+of+Single+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins.</a> Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z najistotniejszych aspektów pozyskiwania użytecznych danych iSCAT jest możliwość odnalezienia poprawnej płaszczyzny ogniskowania na powierzchni szkiełka podstawowego, a ponadto utrzymanie tej pozycji przez długi czas. Zaniedbanie tego doprowadzi do poszerzenia PSF, słabych sygnałów iSCAT oraz artefaktów związanych z dryftem w analizach dynamiki. Okazuje się, że znalezienie płaszczyzny ogniskowania na czystej, pustej powierzchni szkiełka podstawowego nie jest łatwym zadaniem, ponieważ cechy powierzchni nie są widoczne na tle dużego tła wiązki odniesienia (patrz Rysunek 4d).
Surowe obrazy iSCAT są często przysłonięte sygnałami tła wynikającymi z niejednorodności frontu fali źródła wzbudzenia, co może utrudniać odnalezienie właściwej płaszczyzny obrazowania. Aktywne odejmowanie frontu fali jest przydatnym sposobem na rozwiązanie tego problemu i późniejsze monitorowanie ostrości iSCAT podczas pomiaru16. Jedną z metod realizacji tego procesu jest przestrzenna modulacja próbki. W skrócie, generator funkcji przykłada falę prostokątną o częstotliwości 50 Hz do zewnętrznego portu sterowania stolika piezoelektrycznego, co skutkuje przestrzenną modulacją próbki z zastosowaną częstotliwością (amplituda 290 nm). Synchroniczne akwizycje kamery są wyzwalane z tego samego źródła i, po połączeniu zgodnie z zasadami detekcji synchronicznej, dają w efekcie obraz z kompensacją frontu fali14,16. Uzyskany obraz zazwyczaj pokazuje chropowatość powierzchni szkiełka podstawowego (Rysunek 4e). Niewielkie defekty pozostające na szkle po czyszczeniu mogą być wykorzystane do ustawienia ostrości mikroskopu. Parametry stosowane w tym kroku aktywnego odejmowania tła mogą być zmieniane w zależności od częstotliwości klatek, czasu ekspozycji lub sprzętu.
Jak wspomniano powyżej, w układzie iSCAT (krok 1.2.1.) zaleca się stosowanie wysokiej jakości dzielnika wiązki, ponieważ artefakty obrazowania, takie jak powidoki lub interferencje powstające przy cienkich płaskich dzielnikach wiązki, będą wpływać na obraz i zakłócać pomiar. Rysunek 7 przedstawia porównanie wysokiej i niskiej jakości dzielnika wiązki. Oba surowe obrazy iSCAT pokazują ten sam obszar na szkiełku nakrywce zawierający kilka pozostałych cząsteczek. Do zarejestrowania obu obrazów wykorzystano ten sam układ iSCAT, wymieniono jedynie dzielnik wiązki. Rysunek 7a przedstawia obraz zarejestrowany przez kamerę przy użyciu grubszego (5 mm), powlekanego warstwą antyrefleksyjną (AR) i klinowego dzielnika wiązki. Dzięki klinowej konstrukcji wiązka odbita od tylnej powierzchni dzielnika wiązki jest antyrównoległa do odbicia powstającego z powierzchni przedniej i nie wpada do obiektywu. Nie występują artefakty interferencyjne. Rysunek 7b przedstawia to samo pole widzenia próbki, ale tym razem zastosowano cieńszy (1 mm) płaski dzielnik wiązki. Dwa odbicia od przedniej i tylnej powierzchni dzielnika wiązki są równoległe i propagują do kamery. Wyraźnie widoczne są artefakty interferencyjne.
<img alt="Obrazy z mikroskopii optycznej, schematy porównujące liczbę sygnałów fluorescencyjnych w analizie próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rycina 7: Porównanie obrazów iSCAT uzyskanych przy użyciu dzielników wiązki wysokiej i niskiej jakości. (a) Otrzymany surowy obraz iSCAT uzyskany przy użyciu klinowego dzielnika wiązki o grubości 5 mm z powłoką antyrefleksyjną (AR). (b) Otrzymany surowy obraz iSCAT tego samego obszaru z wykorzystaniem płaskiego dzielnika wiązki o grubości 1 mm. Oba dzielniki wiązki mają taki sam stosunek podziału (50% odbicia, 50% transmisji). Na obrazie uzyskanym za pomocą płaskiego dzielnika wiązki o grubości 1 mm wyraźnie widoczne są artefakty interferencyjne wynikające z odbić Fresnela. Paski skali: 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
W niniejszym protokole opisujemy schemat oświetlenia szerokopolowego dla iSCAT, ponieważ jest on szybki, łatwy w realizacji i umożliwia równoległe detekciecie na dużym obszarze14. Innym powszechnym podejściem jest zastosowanie akustyczno-optycznych deflektorów (AOD) i skanowanie próbki wiązką konfokalną12,17. Podejście to eliminuje potrzebę stosowania wysokiej jakości frontów falowych, lecz jest bardziej złożone eksperymentalnie niż konwencjonalne obrazowanie szerokopolowe. Ponadto prędkość oświetlenia konfokalnego jest ograniczona przez prędkość AOD. W zależności od wymaganych parametrów eksperymentalnych, do detekcji pojedynczych białek wydzielanych przez żywe komórki można w zasadzie wykorzystać zarówno schematy oświetlenia konfokalnego, jak i szerokopolowego.
Zgodnie z opisem w całym protokole, niezbędne jest zminimalizowanie bocznych fluktuacji mechanicznych w stoliku mikroskopu. Nawet nanometrowe odchylenia w pozycji próbki mogą prowadzić do różnic między kolejnymi klatkami obrazu z kamery i wywołać znaczny szum zewnętrzny w obrazie różnicowym. Zaleca się zatem stosowanie mechanicznie stabilnego stolika mikroskopu oraz tłumionego stołu optycznego (krok 1.1.1.) i osłonięcie całej aparatury kurtynami lub panelami optycznymi podczas eksperymentu (krok 3.5.).
W przypadku pomiarów długoterminowych można rozważyć zastosowanie schematu aktywnej stabilizacji ostrości. W tym podejściu do mikroskopu wbudowany zostaje drugi laser w układzie całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR), którego obraz jest następnie rzutowany na fotodiodę kwadratową. Zmiany ostrości układu przekładają się na przemieszczenia boczne plamki lasera TIR na diodzie kwadratowej, co może być następnie wykorzystane w aktywnym pętli sprzężenia zwrotnego do sterowania osią z piezoelektrycznego stolika 26. W ten sposób eliminowane są efekty długoterminowego dryftu w pionie.
W celu dostosowania przedstawionej techniki do konkretnych potrzeb eksperymentalnych można zastosować szereg modyfikacji i rozszerzeń. Na przykład dostępne są komercyjne inkubatory do stołu mikroskopowego, które można łatwo włączyć do systemu mikroskopu iSCAT w celu długoterminowego obrazowania komórek. Można również wdrożyć inne techniki uzupełniające obrazowanie iSCAT, takie jak konfokalna lub TIR fluorescencyjna mikroskopia17. Aby dostosować system do badanego układu, pomiary sekrecji iSCAT można przeprowadzać w innych mediach hodowlanych, takich jak DMEM lub DPBS; należy jednak unikać stosowania wskaźnika pH w postaci czerwieni fenolowej, ponieważ może on zakłócić eksperyment poprzez absorpcję światła laserowego. Dodatkowo suplementy takie jak płodowa surowica bydlęca (FCS) lub ludzki lizat płytek krwi (hPL) zawierają białka, które mogą interferować z detekcją iSCAT. W zależności od wymaganej czułości eksperymentu, suplementy te powinny zostać wykluczone z medium do mikroskopii.
Technika iSCAT opiera się na zdolności analitytu do rozpraszania światła — właściwości immanentnej dla wszystkich białek — i jest zatem z natury nieswoista. Niemniej jednak, pewien stopień swoistości jest możliwy, ponieważ sygnały iSCAT skalują się liniowo z masą białka14,27,28. Pozwala to na kalibrację systemu iSCAT przy użyciu standardowych próbek białek, takich jak albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i fibrynogen14,27,28. W rzeczywistości, całkiem niedawno, Young et al.28 rozwinęli prace Piliarika i Sandoghdara14, wykazując, że iSCAT może być wykorzystywany do wyznaczania masy cząsteczkowej białek tak małych jak streptawidyna (53 kDa) z rozdzielczością masy 19 kDa i dokładnością około 5 kDa. Kilka konwencjonalnych podejść może dodatkowo uzupełnić iSCAT, zapewniając dodatkowy poziom swoistości. Przykładem są enzymatyczne testy immunoabsorpcyjne (ELISA) i/lub inne modyfikacje powierzchni, które ograniczają zdarzenia wiązania białek w taki sposób, aby wykrywane było tylko białko docelowe16.
W niniejszym protokole opisaliśmy, w jaki sposób mikroskopia iSCAT może być wykorzystana do badania wydzielin komórkowych na poziomie pojedynczych białek z rozdzielczością czasową poniżej sekundy16. Technika ta jest uniwersalna i może zostać zaimplementowana w każdym komercyjnym lub własnoręcznie zbudowanym mikroskopie. W przeciwieństwie do metod fluorescencyjnych z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek, metoda ta nie jest podatna na fotoblaknięcie ani efekty migotania, a mimo to osiąga czułość na poziomie pojedynczego białka. Cechy te sprawiają, że iSCAT jest potężnym narzędziem w dziedzinie biosensorów i mikroskopii. Przyszłe zastosowania będą koncentrować się na wyjaśnianiu złożonych oddziaływań komórkowych, takich jak odpowiedź immunologiczna na bodziec czy komunikacja międzykomórkowa.

Białka wydzielnicze odgrywają istotną rolę w różnych procesach fizjologicznych1. Z tego powodu są one rutynowo badane jako zbiorowy zespół (proteomika) lub jako pojedyncze jednostki2,3. Proteomika tradycyjnie bada cały zestaw białek występujących w danym systemie biologicznym za pomocą np. testów immunoenzymatycznych (ELISA), cytometrii przepływowej lub spektrometrii mas4,5,6. Z kolei pojedyncze białka są zazwyczaj wykrywane przy użyciu różnych technik opartych na fluorescencji7,8, plazmonice9,10 lub kriomikroskopii elektronowej1. Wszystkie te techniki wykorzystują złożone instrumenty, znakowanie lub oba te elementy i często nie dostarczają informacji o dynamice, gdyż przekazują jedynie długoterminowe informacje na temat badanego systemu.
W niniejszej pracy wykorzystujemy mikroskopię iSCAT12,13 do detekcji pojedynczych białek wydzielniczych z rozdzielczością czasową poniżej jednej sekundy14. Co istotne, technika ta wykrywa słaby sygnał rozproszony właściwy dla każdego białka12,14. Ilość światła rozpraszanego przez małą bi cząsteczkę jest proporcjonalna do jej polaryzowalności. Przy założeniu, że kształt białka można przybliżyć jako efektywną sferę rozpraszającą14,15,16, a różne białka mają bardzo zbliżone współczynniki załamania światła, zmierzony sygnał można bezpośrednio powiązać z masą cząsteczkową (MW) białka. Empiryczna kalibracja kontrastu iSCAT w stosunku do masy cząsteczkowej za pomocą pomiarów referencyjnych pozwala odróżnić białka o różnych rozmiarach. Eksperymenty iSCAT można łatwo uzupełnić o mikroskopię fluorescencyjną17,18, odczynniki immunosorpcyjne, a także znaczniki fluorescencyjne lub rozpraszające, co umożliwia specyficzne wykrywanie dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania14,17,19.
W zasadzie iSCAT działa poprzez wzmacnianie słabego światła rozproszonego przez białko za pomocą mieszania interferometrycznego z wtórną falą odniesienia. Wykryta intensywność (<img alt="Schemat równowagi statycznej; ΣFx=0, ΣFy=0; ilustracja koncepcji równowagi sił." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">) w mikroskopie iSCAT jest opisane przez
<img alt="Schemat równania natężenia optycznego zawierający zmienne do analizy interferencyjnej." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2">
gdzie <img alt="Równanie stanu równowagi statycznej ΣFx=0 schemat; analiza wektorów sił, bilans, edukacja z zakresu fizyki." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> jest intensywność padania, <img alt="Układ spektroskopowy do rozdziału DNA z wykorzystaniem chromatografii; obejmuje równanie MA=0; schemat." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> jest współczynnikiem wkładu fali odniesienia, <img alt="Schemat równowagi statycznej ΣFx=0; obejmuje siły, momenty i analizę wektorową do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"> oznacza siłę rozpraszania badanego nanobiektu i <img alt="Równowaga statyczna, wzór ΣFx=0, równanie, pojęcie fizyczne, analiza stanu równowagi, obliczanie siły" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6"> jest przesunięciem fazowym pomiędzy falami rozproszoną a referencyjną14W zależności od przypadku, jako falę odniesienia wykorzystuje się zazwyczaj światło przechodzące lub światło odbite. <img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, MA=0, ilustruje równowagę sił, edukacyjny koncept z zakresu fizyki." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 7"> uwzględnia odpowiednio transmitancję lub refleksyjność komory próbki. Termin <img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0, MA=0; schemat równowagi sił; kluczowy zasób edukacyjny z zakresu fizyki" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 8"> jest proporcjonalne do przekroju czynnego rozpraszania białka i można go pominąć w porównaniu z wyrazem mieszanym. Zatem, przyjmując <img alt="φ=π symbol matematyczny równania dla kąta w koncepcjach geometrii lub fizyki." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 9"> w przypadku całkowitej interferencji destruktywnej wykrywane światło opisuje wzór <img alt="Równanie równowagi statycznej: I_det ≅ I_i(r² - 2rs); wzór do analizy sił w fizyce." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 10"> gdzie <img alt="Równanie prawa odwrotności kwadratu w optyce, symbol: r²Ii = Iref." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> czy natężenie referencyjne i <img alt="Równanie równowagi statycznej; wzór ΣFx=0; schemat przedstawiający koncepcję równowagi." src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 12"> jest natężeniem interferencji.
Mikroskopia iSCAT stanowi doskonałą metodę badania procesów biologicznych na poziomie pojedynczych cząsteczek. Jako przykład badamy komórki Laz38 — linię komórkową limfocytów B przekształconych przez wirusa Epsteina-Barra (EBV)20,21 — podczas wydzielania przez nie białek, takich jak przeciwciała IgG16. Metoda ta jest jednak uniwersalna i może być stosowana w wielu innych układach biologicznych. iSCAT jest z natury niespecyficzny i pozwala na detekcję dowolnego białka lub nanocząstki, ale może zostać rozszerzony o powszechne metody funkcjonalizacji powierzchni w celu specyficznej lub multipleksowej detekcji. Prostota i możliwość połączenia z innymi technikami optycznymi, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, czynią iSCAT cennym narzędziem uzupełniającym w biologii komórki.

<table><tbody><tr><td>Item/Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x / 1.46 NA obiektyw</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td>alpha Plan Apochromat oil immersion</td></tr><tr><td>20x / 0.4 NA</td><td>Leica</td><td>566049</td><td>N Plan</td></tr><tr><td>Piezo Stage</td><td>PI</td><td>P-517k020</td><td>3-osiowy stolik z 100x100x10&mikro; </td></tr><tr><td>Laser diodowy o zasięgu m (445 nm)</td><td>Lasertack</td><td>PD-01236</td><td></td></tr><tr><td>Optyka/Optomechanika</td><td>Thorlabs/Newport-soczewki</td><td></td><td>, lustra, słupki, mocowania</td></tr><tr><td>Źródło światła LED</td><td>Thorlabs</td><td>P30H</td> Thorlabs MCWHL5 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Filtr krótkoprzepustowy (580 nm)Omega Optical 580SP do modyfikacji widma diody LED dla <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> wzbudzenie fluorescencyjne</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy (500 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0500</td><td>do modyfikacji widma diody LED do wzbudzenia fluorescencji</td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki 70R/30T</td><td>Newport</td><td>20Q20BS.1</td><td></td></tr><tr><td>Ekonomiczny rozdzielacz wiązki</td><td>Thorlabs</td><td>EBS1</td><td>używany do porównania efektów prążkowych</td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki z płytką klinową</td><td>Thorlabs</td><td>BSW26</td><td>używany do porównania efekty prążków</td></tr><tr><td>Krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne (550 nm)</td><td>Edmund Optics</td><td>66249</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki 8R/92T Kamera</td> CMOS <td>Thorlabs</td><td>BP108</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Photonfocus</td><td>MV1-D1024E-160-CL</td><td>do akwizycji iSCAT</td></tr><tr><td>Kamery CMOS</td><td>Mightex</td><td>SCE-B013-U</td><td>do akwizycji jasnego pola / fluorescencji</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy (600 nm)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>FELH0600</tr><tr><td>Komputer</td><td>Fujitsu Siemens&nbsp;</td><td>-</td><td>Procesor Core i7, 16 GB pamięci RAM,</td></tr><tr><td>oprogramowanie do akwizycji</td> SSD <td>LabVIEW-Oprogramowanie</td><td></td> <td>do analizy pakietu LabVIEW 2016</td></tr><tr><td></td> Pakiet <td>Matlab-Matlab</td><td></td> <td>2014</td></tr><tr><td>Odkurzacz plazmowy</td><td>Diener</td><td>Diener pico</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Binder</td><td>Model Wirówka CB</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik/Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni</td><td>Gibco</td><td>11835063</td><td>bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59205C</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka osłonowe</td><td>Marienfeld</td><td>107052</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane ze szklanym dnem</td><td>ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery fluorescencyjne</td><td>Invitrogen</td><td>F8821</td><td>używany do kalibracji</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik z jodku propidyny</td><td>Invitrogen</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>Małe końcówki do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>30075005</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczne końcówki do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 99,8%</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulki</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>do przygotowania 0,2M roztworu NaOH</td></tr></tbody></table>

bezznacznikowe obrazowanie pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek za pomocą mikroskopii iscat

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Prezentujemy mikroskopię rozpraszania interferometrycznego (iSCAT), metodę zdolną do wykrywania pojedynczych, nieoznakowanych białek wydzielanych z pojedynczych żywych komórek w czasie rzeczywistym. W tym protokole omówiono podstawowe kroki do realizacji mikroskopu iSCAT i uzupełnienia go o dodatkowe kanały obrazowania w celu monitorowania żywotności badanej komórki. Następnie używamy metody do wykrywania w czasie rzeczywistym pojedynczych białek wydzielanych przez żywą komórkę, co demonstrujemy na unieśmiertelnionej linii komórek B (Laz388). Omówiono niezbędne kroki dotyczące przygotowania mikroskopu i próbki oraz analizy zarejestrowanych danych. Protokół wideo pokazuje, że mikroskopia iSCAT oferuje prostą metodę badania wydzielania na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Schemat mikroskopu iSCAT przedstawiono na Rycina 4aPrzedstawiono reprezentatywne obrazy w polu jasnym, fluorescencyjne oraz surowe obrazy iSCAT w Rysunek 4b, 4c, i 4dodpowiednio16. Rysunek 4e i 4f przedstawiono wyniki usuwania tła i różnicowego przetwarzania obrazu; dwa zaadsorbowane białka są widoczne jako plamki ograniczone dyfrakcyjnie w Rycina 4f. Rycina 6 przedstawia histogram wykrytych białek w czasie 125 s. Dane te uzyskano poprzez zastosowanie algorytmu wykrywania szczytów do przechwyconych obrazów w celu zliczenia zdarzeń wiązania i skatalogowania ich kontrastu16Wykryto łącznie 503 białka.
Następnie wydzielone cząsteczki są identyfikowane poprzez porównanie z pomiarami referencyjnymi wykonanymi na roztworach oczyszczonych białek lub poprzez dodatkowe pomiary z zastosowaniem funkcjonalizowanych powierzchni szklanych14,16. Dane iSCAT pozwalają tym samym na bezpośrednią wizualizację dynamiki sekrecji komórkowej w skali subsekundowej16. Przykładowo, wykazaliśmy wcześniej, że przeciwciała IgG stanowią główną frakcję sekretomu Laz388 i są uwalniane z komórki z szybkością ok. 10 cząsteczek na sekundę16. Dodatkowo komórki wydzielają inne cząsteczki o masie w zakresie 10 kDa - 10 kDa16. Opisana metoda może być dalej wykorzystana np. do badania przestrzennego gradientu stężenia wydzielin wokół komórki16 lub do określenia dynamiki czasowej lizy komórkowej16.
<img alt="Histogram przedstawiający rozkład liczby kontrastów, analiza danych, wykres statystyczny, badania naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rysunek 6: Ilościowe oznaczenie białek wydzielanych przez pojedynczą komórkę Laz38. Histogram przedstawia białka wykryte w okresie czasu wynoszącym 125 s. Wartości kontrastu są akumulowane w 1 x 10-4 przedziały kontrastu (niebieskie słupki). W trakcie tego pomiaru policzono łącznie 503 pojedyncze białka. Eksperyment powtórzono 10 razy, uzyskując podobne wyniki. Rycina została opracowana na podstawie pracy McDonald, M.P. i inni16. Copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiamy protokół do optycznego wykrywania pojedynczych, nieznakowanych białek w czasie rzeczywistym, gdy są wydzielane z żywych komórek. Opiera się to na mikroskopii rozpraszania interferometrycznego (iSCAT), która może być stosowana do wielu różnych systemów i konfiguracji biologicznych.

Bezznacznikowe obrazowanie pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek za pomocą mikroskopii iSCAT

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Po raz pierwszy zaprezentowaliśmy iSCAT w 2004 roku w kontekście detekcji i spektroskopii nanocząstek złota. W ciągu kolejnych 10 lat rozwinęliśmy tę technikę do wykrywania i śledzenia nanocząstek biologicznych, takich jak wirusy i małe białka. Istotą tej techniki jest to, że każdy obiekt materialny, bez względu na to, jak mały, ma skończony przekrój wygaszania.Główną zaletą tej techniki jest wykrywanie bez etykietowania. Oznacza to, że jeśli jesteśmy wystarczająco wrażliwi, możemy wykryć prawie wszystko, na przykład białka lub egzosomy wydzielane z pojedynczych komórek. Kwestią, na którą należy uważać, jest to, jak traktować rozproszone tło.Ogromną zaletą mikroskopu iSCAT jest to, że można go całkowicie zbudować w domu i dodać do istniejącego mikroskopu komercyjnego. Oznacza to, że można go łatwo łączyć z innymi technikami optycznymi, takimi jak fluorescencja, i jest to jeden z powodów, dla których wiele grup stosuje obecnie iSCAT i techniki pokrewne. Tutaj wykorzystujemy komórki LUZ jako system modelowy, aby pokazać wykrywanie pojedynczych i wydzielniczych białek.Jednak metoda ta może być również stosowana do badania prawie każdego procesu biologicznego na poziomie molekularnym. Aby uzyskać stabilny mikroskop, należy zacząć od wytłumionego stołu optycznego i sztywnego masywnego bloku do stolika na próbkę. Zbuduj stolik na próbki mikroskopu, który zawiera obiektyw o dużej aperturze numerycznej i jednostkę translacyjną, która umożliwia boczną translację próbki, a także zmianę pozycji ostrości obiektywu.Użyj pionowego zwierciadła sprzęgającego 45 stopni i soczewki singletowej o ogniskowej 50 centymetrów, aby skupić światło lasera diodowego o długości fali 445 nanometrów na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu. Ta soczewka szerokokątna tworzy skolimowaną wiązkę w przedniej ogniskowej obiektywu, która stanie się źródłem oświetlenia iSCAT. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw i umieść szklane szkiełko nakrywkowe w płaszczyźnie próbki stolika mikroskopowego.Spowoduje to powstanie wiązki, która odbija się z powrotem w dół przez obiektyw obrazowania. Aby ustawić ścieżkę obrazowania, należy wprowadzić rozdzielacz wiązki z powłoką antyrefleksyjną pod kątem 45 stopni w stosunku do wiązki padającej i około 10 centymetrów za soczewką szerokokątną. Upewnij się, że powłoka antyrefleksyjna jest skierowana w stronę źródła lasera.Zwróć uwagę, ponieważ gruby rozdzielacz wiązki wprowadzi znaczne przemieszczenie wiązki, dzięki czemu laser może już nie wchodzić prosto w obiektyw. W razie potrzeby wyrównaj ścieżkę wiązki laserowej przed rozdzielaczem wiązki, aby zapewnić prawidłową propagację przez obiektyw. Aby upewnić się, że płaszczyzna próbki i kamera są parafokalne, zacznij od umieszczenia wklęsłej soczewki o ujemnej ogniskowej 45 centymetrów w pozycji pięć centymetrów za soczewką szerokokątną na ścieżce padającej wiązki.Spowoduje to, że skolimowana wiązka wejdzie w tylny otwór obiektywu. Po umieszczeniu ekranu w odblaskowym ramieniu interferometru, przesuń obiektyw w kierunku pionowym, aby znaleźć zgrubną pozycję ogniskowej. Cel jest ostry, gdy wiązka uderzająca w ekran jest skolimowana.Usuń zarówno obiektyw o ujemnej ogniskowej, jak i ekran po zakończeniu zgrubnego ustawiania ostrości. Dodaj drugą soczewkę singletową o ogniskowej 50 centymetrów, aby skupić rozproszone światło i skolimować odbite światło. Upewnij się, że soczewka jest umieszczona w odległości 50 centymetrów od tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu, aby przesyłana wiązka laserowa została ponownie skolimowana.Aby zakończyć montaż konfiguracji iSCAT, umieść kamerę CMOS w odległości 50 centymetrów od obiektywu o ogniskowej 50 centymetrów i umieść wiązkę bezpośrednio na środku chipa. Aby skonfigurować dodatkowe kanały obrazowania, połącz moc wyjściową źródła światła LED z obiektywem o dużej odległości roboczej. Zainstaluj elementy mechaniczne nad komorą próbki, które umożliwiają ogniskowanie i boczne pozycjonowanie wyjścia LED na próbce.Przesuń górny obiektyw na boki, tak aby górny obiektyw szerokokątny i dolny obiektyw iSCAT były współliniowe. Określa się to poprzez umieszczenie ekranu pod dolnym obiektywem i maksymalizację intensywności przepuszczanego światła LED na ekranie. Teraz umieść krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne o długości krótkiego włókna 550 nanometrów, aby oddzielić przesyłane światło LED od ścieżki lasera iSCAT.Podziel tę wiązkę na dwa kanały za pomocą rozdzielacza wiązki o ośmioprocentowym współczynniku odbicia i 92-procentowej transmisyjnej. Ścieżka 92 procent to kanał fluorescencyjny, a ścieżka 8 procent jest używana do obrazowania w jasnym polu. Zobrazuj kanał jasnego pola na kamerze CMOS za pomocą achromatycznego obiektywu dubletowego o ogniskowej pięciu centymetrów.Zobrazuj kanał fluorescencji na oddzielnej kamerze CMOS za pomocą pięciocentymetrowego obiektywu dubletowego o ogniskowej achromatycznej. Użyj również filtra długoprzepustowego 600 nanometrów, aby zablokować światło wzbudzenia. Aby skonfigurować komputer i oprogramowanie, podłącz wszystkie kamery do komputera.W pełni zmontowanej konfiguracji obserwuj obraz iSCAT w kamerze CMOS i upewnij się, że jest ostry, znajdując resztki kurzu lub brudu na szklanym szkiełku nakrywkowym. Sprawdź, czy obraz cząstki jest kołowo symetryczną funkcją rozproszenia punktów. Funkcja rozproszenia punktowego nie będzie miała okrągłego kształtu, jeśli wiązka laserowa wpadnie do obiektywu mikroskopu pod niewielkim kątem.Można to skorygować poprzez lekką regulację lustra pod kątem 45 stopni, aby zapewnić proste sprzężenie z obiektywem. Porównaj obrazy z kamery w jasnym polu i kanałach fluorescencyjnych. Upewnij się, że oba są ostre i wyświetlaj ten sam obszar, obrazując koralik fluorescencyjny lub próbkę komórki.Sprawdź, czy położenie lasera iSCAT znajduje się w przybliżeniu na środku obrazu i zanotuj jego położenie do późniejszego wykorzystania. Aby zmienić położenie i pole widzenia jasnego pola i kanału fluorescencji, przesuń kamery na stole w stosunku do soczewek skupiających. Przygotuj się do eksperymentu zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Obejmuje to przygotowanie komórek i podłoża mikroskopowego, a także kuwety na próbki mikroskopowe. Upewnij się, że wiązka laserowa jest zablokowana, aby zapobiec bezpośredniemu wystawieniu komórek na działanie światła laserowego iSCAT. Wstrzyknąć około trzech mikrolitrów przygotowanej próbki komórki nieco poza środkiem do kuwety na próbkę.Delikatnie przyłożyć końcówkę pipety do szkiełka nakrywkowego i powoli wstrzyknąć roztwór komórek. Pozwól, aby komórki osiadły na szkiełku nakrywkowym. Sprawdź liczbę komórek w pobliżu lasera iSCAT.Jeśli liczba komórek jest zbyt mała, powtarzaj ten krok, aż dostępna będzie wystarczająca liczba. Jeśli pokrycie komórek jest zbyt gęste, należy użyć wstrzyknięcia około 20 mikrolitrów dodatkowego podłoża mikroskopowego, aby rozproszyć komórki na szkiełku nakrywkowym. Korzystając ze stolika do translacji piezoelektrycznej, przesuń próbkę na boki, aby umieścić komórkę blisko pola widzenia iSCAT.Upewnij się, że komórka nie wchodzi w pole widzenia iSCAT, ponieważ bezpośrednia ekspozycja na światło lasera o długości 445 nanometrów może być szkodliwa dla komórki. Odblokuj wiązkę lasera iSCAT i upewnij się, że powierzchnia szkiełka nakrywkowego jest nadal ostra. Dołącz stół izolacyjny, aby zminimalizować dryft i sprzężenie akustyczne z otoczenia.Rozpocznij pomiar od pozyskania obrazów z kamer iSCAT, jasnego pola i fluorescencji. Okresowo sprawdzaj żywotność komórki i skupienie systemu. W tym przypadku do wyświetlania obrazów z kamery używane jest samodzielnie napisane oprogramowanie mikroskopowe.W tym przypadku obrazowanie różnicowe odbywa się w czasie rzeczywistym poprzez odejmowanie kolejnych ramek, aby uwidocznić wiązania białek. Powoduje to przefiltrowany obraz, który jest widoczny na ekranie wraz z nieprzetworzonym obrazem z aparatu. Reprezentatywne wyniki eksperymentu z wydzielaniem komórkowym przeprowadzonego za pomocą iSCAT przedstawiono tutaj.Film pokazuje wydzieliny komórki LAZ w ciągu dwóch minut. Różnicowe obrazy iSCAT po lewej stronie wizualizują wchłanianie pojedynczych białek do szkła nakrywkowego. Obrazy w jasnym polu i kanał fluorescencyjny po prawej stronie służą do monitorowania żywotności komórek.Ten histogram pokazuje wykryte białka i ich zakres kontrastu w tym dwuminutowym okresie czasu. Dane zostały zebrane poprzez analizę poszczególnych zdarzeń powiązań w każdej klatce danych wideo iSCAT przy użyciu niestandardowego algorytmu wyszukiwania szczytów. Mikroskopia ISCAT jest nie tylko potężnym narzędziem w biodetekcji, ale także w mikroskopii, ponieważ pozwala na bezznacznikowe wykrywanie nanoobiektów w czasie rzeczywistym.W szczególności może być stosowany do różnych procesów, takich jak dyfuzja i transport białek. Ze względu na wyjątkową czułość na rozpraszanie światła, iSCAT może wykryć dowolne białko lub jednostkę w polu widzenia. Oczywiście oznacza to również, że technice tej brakuje specyficzności, jaką niesie ze sobą fluorescencja, ale aby obejść ten problem, można zastosować dodatkowe metody, takie jak funkcjonalizacja powierzchni, w celu wykrycia określonych białek będących przedmiotem zainteresowania.Nie zapominaj, że praca z laserami może być niebezpieczna, a podczas montażu i regulacji mikroskopu należy zawsze nosić odpowiednią ochronę oczu. Wykrywanie sekretomów w czasie rzeczywistym jest bardzo ekscytujące i stanowi duży skok w diagnostyce medycznej, która obecnie wymaga znacznie dłuższego czasu i jest bardzo daleka od czułości pojedynczego białka. Wciąż jest wiele miejsca na poprawę wydajności metody i rozszerzenie jej zastosowań.Mamy więc nadzieję, że ten film pomoże innym grupom przyłączyć się do tego ekscytującego wysiłku.

label-free-imaging-single-proteins-secreted-from-living-cells-via

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Poznaj technikę bezznacznikowej detekcji pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek przy użyciu mikroskopii iSCAT. Ta metoda umożliwia obserwację procesów biologicznych na poziomie molekularnym w czasie rzeczywistym.

Bezznacznikowe obrazowanie pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek za pomocą mikroskopii iSCAT

Przeglądaj więcej filmów