Odkrywanie kluczowych graczy odporności humoralnej: zaawansowany i zoptymalizowany protokół izolacji limfocytów z plastrów mysich Peyera

Ta metoda może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące fenotypu mysich podzbiorów komórek T i B izolowanych za pomocą łatki Peyera. W szczególności populacje komórek T pomocniczych pęcherzyków i komórek B centrum rozrodczego. Główną zaletą tej techniki jest to, że rezygnuje ona z kilku pracochłonnych etapów przygotowania, takich jak trawienie oparte na kolagenazie, które pogarszają jakość i tożsamość izolowanych limfocytów.

Zacznij od umieszczenia myszy w pozycji leżącej na plecach i wysterylizowania brzucha 70% etanolem. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej przez skórę i otrzewną od łona do klatki piersiowej, aby otworzyć jamę okołokształtną i zlokalizować jelito ślepe i połączenie krętniczo-kątnicze. Wykonaj jak najbardziej dystalne cięcie na skrzyżowaniu, aby oddzielić jelito cienkie od jelita ślepego.

Przetnij krezkę nożyczkami, aby ostrożnie usunąć całe jelito cienkie aż do zwieracza odźwiernika. Przeciąć połączenie między odźwiernikiem a dwunastnicą, aby całkowicie odłączyć jelito cienkie od jamy brzusznej i umieścić wyizolowane jelito cienkie w jednym dołku 6-dołkowej płytki zawierającej zimną pożywkę RPMI uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą lub FBS na lodzie. Następnie delikatnie mieszaj tkanki ręcznie, aż wszystkie segmenty zostaną zanurzone w zimnym podłożu.

Po pobraniu wszystkich jelit użyj kleszczy, aby chwycić tłuszcz krezkowy z jednej krawędzi jelita i umieść próbkę krezkową stroną do dołu na ręczniku papierowym. Zwilż cały odcinek jelita RPMI 10% FBS, aby uniknąć odwodnienia tkanek i lepkości oraz zlokalizuj plamy Peyera, które pojawiają się jako białe, wielopłatkowe agregaty o kształcie przypominającym kalafior po stronie przeciwkrezkowej ściany jelita. Aby zebrać plastry Peyera, użyj zakrzywionych nożyczek chirurgicznych z krzywą skierowaną do góry, aby delikatnie wyciąć każdy plaster z jego dystalnych i proksymalnych granic, uważając, aby wykluczyć otaczającą tkankę jelitową, i umieść łaty Peyera w indywidualnych dołkach 12-dołkowej płytki zawierającej lodowaty RPMI 10% FBS na lodzie podczas ich zbierania.

Po uzyskaniu wszystkich plastrów użyj nożyczek, aby przeciąć końcówkę 1-milimetrowej końcówki mikropipety, tak aby średnica była wystarczająco duża, aby zassać poszczególne plastry Peyera i przenieść plastry Peyera do 150-milimetrowych stożkowych probówek na mysz zawierających 25 mililitrów 37 stopni Celsjusza RPMI 10%FBS. Następnie umieść rurkę w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym mieszaniem przy 125-150 obr./min przez 10 minut. Pod koniec mieszania przenieś plastry Peyera na sitko o pojemności 140 mikrometrów na mysz i użyj gumowej końcówki jednego 10-mililitrowego tłoka strzykawki na zwierzę, aby delikatnie rozbić plastry Peyera przez siatkę do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów.

Przepłucz sitka 15-20 mililitrami zimnego RPMI 10% FBS i zbierz komórki przez odwirowanie. Po ostrożnym odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić komórki w stężeniu około 1 razy 10 do 7 komórek na mililitr RPMI 10% FBS w celu zliczenia. Następnie przenieś 2-2,5 razy 10 do 6 komórek na 200 mikrolitrów pożywki do każdej studzienki 96-dołkowej okrągłej płytki dolnej i osadzaj komórki przez odwirowanie.

Po odrzuceniu supernatantu z delikatnym strzepywaniem, odwirować komórki w 200 mikrolitrach stojącego buforu. Oznaczyć komórki w 100 mikrolitrach utrwalanego barwnika żywotności, rozcieńczonego w buforze bez białka przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chronić przed światłem, a następnie przepłukać 2 razy i świeży bufor barwiący. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić granulki w 20 mikrolitrach bloku FC na 15 minut inkubacji w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie dodać 80 mikrolitrów koktajlu przeciwciał pierwotnych na powierzchni ziemi, na 30 minut na lodzie, chronionym przed światłem.

Pod koniec powierzchniowej inkubacji przeciwciał odwirować przepłukać komórki dwa razy w nadmiarze objętości buforu barwiącego i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach wtórnego roztworu do barwienia powierzchni, uzupełnionego streptawidyną. Po 15 minutach na lodzie chronionym przed światłem, odwirować przemyć komórki 2 razy w świeżym buforze barwiącym i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach roztworu roboczego do utrwalania, permeablacji na nie więcej niż 20 minut inkubacji na lodzie, chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji natychmiast odwirować płytkę, a następnie odwirować w 200 mikrolitrach buforu permeablacyjnego na studzienkę.

Następnie ponownie zawieś komórki w 20 mikrolitrach bloku FC, rozcieńczonego w buforze permeablacyjnym, jak pokazano, a następnie dodaj 80 mikrolitrów interesującego nas wewnątrzkomórkowego koktajlu przeciwciał, przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronionej przed światłem. Przemyć komórki 100 mikrolitrami buforu do permeablizacji, a następnie ponownie przepłukać 200 mikrolitrami buforu do permeablizacji. Następnie ponownie zawieś granulki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego i przenieś komórki do odpowiednich 5 mililitrowych probówek do analizy cytometrycznej przepływu, w końcowej objętości 400 mikrolitrów buforu barwiącego na probówkę.

Plamy Peyera nie są równomiernie rozmieszczone w jelicie cienkim, ale są zlokalizowane gęściej w kierunku dystalnego i proksymalnego końca tkanki. Protokół ten ułatwia izolację populacji limfocytów z plamą Peyera, która wykazuje rozproszoną dystrybucję po stronie przodu, podobną do obserwowanej w przypadku splenocytów, z większą niż 95% żywotnością komórek. Podwójnie dodatnie komórki CD4 CD19 stanowią około 1% całkowitej populacji limfocytów plamowych Peyera.

Wyrażają one wysokie poziomy CXCR5 i GL7, które, jeśli nie są wykluczone, mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wyników w bramkowaniu odpowiednio komórki B pęcherzyka T-pomocniczego i centrum rozrodczego. W porównaniu z innymi wtórnymi narządami limfatycznymi, łaty Peyera wykazują znacznie wyższy stosunek komórek B centrum rozrodczego, w zakresie 2-10% całkowitej populacji komórek B w warunkach stanu stacjonarnego. Podobnie jak komórki B centrum rozrodczego, frakcja pęcherzykowych komórek pomocniczych T różni się również u poszczególnych nieszczepionych myszy, z zakresem 10-20% całkowitej populacji limfocytów T z plamą Peyera CD4-dodatniej.

Trawienie enzymatyczne oparte na kolagenazie prowadzi do masywnego zmniejszenia ekspresji komórek pęcherzykowych CXCR5 T-helper, pozostawiając nienaruszoną ekspresję innych cząsteczek powierzchniowych. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę do identyfikacji kluczowych czynników komórkowych w płatach Peyera, które są zaangażowane w odporność błony śluzowej i kości ramiennej.