Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR
16 października 2018
Tutaj prezentujemy protokół produkcji i testów przedklinicznych mysich limfocytów T CD19 CAR metodą transdukcji retrowirusowej i wykorzystania jako terapii przeciwko ustalonemu syngenicznemu chłoniakowi B-komórkowemu A20 u myszy BALB/c z lub bez kondycjonowania wstępnego limfodepletingu.
Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii immunologicznej limfocytów T CAR, takie jak genetyczna modyfikacja limfocytów T CAR i połączenie z innymi terapiami immunologicznymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia porównania między ustawieniami Lympho replete i Lympho deexhausted. To pozwala nam dostrzec rolę endogennych komórek odpornościowych zarówno w progresji choroby, jak i ich interakcji z terapeutycznymi limfocytami T CAR.Implikacje tej techniki jako 10 do terapii w rozpoznaniu guza litego, ponieważ wnioski wyciągnięte z tego modelu można bezpośrednio przełożyć na dom cukierków z innymi celami, takimi jak CEA.To rozpocząć tę procedurę. Najpierw przygotuj wszystkie potrzebne nośniki i komórki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pierwszego dnia w kompletnym DMEM do 15 centymetrów kwadratowych naczyń hodowlanych. Wysiewaj 7,5 miliona platynowych komórek E w tych szalkach i inkubuj przez noc w temperaturze 37
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół produkcji mysich komórek CAR T skierowanych przeciwko CD19 poprzez transdukcję retrowirusową. Eksplorowane jest ich zastosowanie w terapii utrwalonego syngenicznego chłoniaka z komórek B A20 u myszy BALB/c, z zastosowaniem lub bez zastosowania limfodeplecyjnego przygotowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunoterapia
- Onkologia
- Biologia komórki
Wstęp
- Terapia CAR T-cell jest obiecującym podejściem w leczeniu nowotworów.
- Zrozumienie interakcji między komórkami CAR T a endogennymi komórkami odpornościowymi ma kluczowe znaczenie.
- Badanie koncentruje się na porównaniu warunków z zachowaniem oraz po uszczupleniu limfocytów.
- Uzyskane spostrzeżenia mogą mieć zastosowanie w przypadku guzów litych i innych celów terapeutycznych.
Cel badania
- Opracowanie protokołu generowania komórek CAR T skierowanych przeciwko CD19.
- Ocena skuteczności tych komórek w leczeniu chłoniaka.
- Zbadanie roli środowiska immunologicznego w wynikach terapii.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywek i komórek zgodnie z opisanym protokołem.
- Wysiew platynowych E-Cells do naczyń hodowlanych.
- Inkubacja komórek w kontrolowanych warunkach.
- Ocena funkcjonalności limfocytów CAR T w różnych konfiguracjach immunologicznych.
Główne wyniki
- Skuteczna produkcja mysich komórek CAR T skierowanych przeciwko CD19.
- Wykazane różnice w skuteczności terapeutycznej w zależności od kondycjonowania odpornościowego.
- Wgląd w rolę endogennych komórek odpornościowych w odpowiedzi na terapię.
- Potencjalne implikacje dla szerszych zastosowań w onkologii.
Wnioski
- Protokół ten stanowi cenny instrument w badaniach nad limfocytami CAR-T.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia interakcji limfocytów CAR-T in vivo.
- Przyszłe badania mogą rozwinąć te wnioski w celu usprawnienia terapii nowotworowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Niniejszy protokół umożliwia przedkliniczną ocenę komórek CAR-T CD19 w syngenicznym modelu chłoniaka mysiego, co wspiera walidację celu oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w procesach rozwoju immunoonkologicznych. Poprzez porównanie warunków z pełną liczbą limfocytów oraz po limfodeplecji, pozwala on na określenie wiarygodności prognostycznej w zakresie skuteczności komórek CAR-T i oddziaływań z mikrośrodowiskiem immunologicznym. Model ten wspiera wczesne decyzje badawcze dotyczące konstruktów CAR-T oraz terapii skojarzonych przed etapem badań umożliwiających złożenie wniosku o IND.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie konstruktów CAR T-cell przeciwko ustalonym liniom chłoniaka z komórek B w celu walidacji związania z celem oraz swoistości antygenowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system oceny funkcjonalności CAR T-cell ex vivo z wykorzystaniem cytometrii przepływowej, luminometrii i testu ELISA.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zwalidowanych mysich komórek CAR T do późniejszego przesiewu modyfikacji genetycznych i uzbrajania w cytokiny (np. IL-12).
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procesy produkcji i transdukcji retrowirusowej z wykorzystaniem komórek Plat-E, konstruktów MP71 oraz wirowania wspomaganego fibronektyną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na badanie aktywności komórek CAR-T in vivo za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz monitorowanie progresji choroby w modelach systemowego chłoniaka.
- Wartość operacyjna: Umożliwia porównanie warunków lymphoreplete i lymphodepleted w celu ograniczenia ryzyka związanego z mechanizmami terapeutycznymi i opracowania strategii skojarzonych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, wspierając identyfikację wiodących projektów CAR-T oraz dostarczając informacji do walidacji przedklinicznej poprzez modelowanie kontekstu immunologicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów działania CAR T-cell oraz oddziaływań endogennych komórek odpornościowych w chłoniaku.
- Screening: Dostarcza zestandaryzowane, mierzalne produkty CAR T-cell w celu zapewnienia powtarzalnych warunków analizy.
- Analityka: Wykorzystuje bioluminescencję, cytometrię przepływową oraz test ELISA do generowania porównawczych odczytów w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Modeluje istotność choroby u gospodarzy syngenicznych, aby połączyć etap odkryć z przedkliniczną oceną skuteczności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny iteracji CAR T-cell, kombinacji cytokin oraz terapii wspomagających.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu oraz wgląd w mechanizmy dynamiki interakcji między limfocytami CAR-T a mikrośrodowiskiem immunologicznym.
- Wartość operacyjna: Powtarzalna produkcja limfocytów CAR-T oraz walidacja funkcjonalna w oparciu o odczyty ex vivo i in vivo.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do decyzji go/no-go poprzez wykazanie skuteczności zależnej od limfodeplecji oraz potencjału terapii skojarzonej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na limfocyty CAR-T z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o reaktywność na kontekst immunologiczny.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Doświadczenie w produkcji wektorów retrowirusowych, hodowli komórkowej oraz w testach immunologicznych.
- Dostęp do komórek E-Cells platinum, rekombinowanych fragmentów fibronektyny oraz infrastruktury poziomu biosafety level 2.
- Standaryzacja wydajności transdukcji i walidacja ekspresji CAR w różnych partiach.
- Kwestie adaptacyjne dotyczące różnych konstruktów CAR, antygenów docelowych oraz mysich modeli chłoniaka.
- Ograniczenia praktyczne obejmują specyficzną dla modelu ekspresję antygenów oraz różnice między mysim układem odpornościowym a fizjologią człowieka.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:55
Days 1 & 2: Preparation and Transfection of Plat-E Retroviral Packaging Cell Line
2:11
Day 3: Preparation of Virus-Containing Supernatant for Transduction and Isolation and In Vitro Activation of Mouse Splenic T Cells
4:27
Day 4: Transduction of Mouse T Cells
6:43
Day 5: Round 2 of Transduction
8:33
In Vitro Validation of CAR T Cell Activity
9:53
Results: Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells
11:32
Conclusion
