Name: Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Poznaj metodę generowania mysich limfocytów T CD19 CAR do terapii chłoniaka z komórek B w modelu syngenicznym u myszy BALB/c. Protokół umożliwia ocenę skuteczności w różnych warunkach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Bloodwise za finansowanie tych badań (grant 13031) oraz jednostce zasobów biologicznych CRUK Manchester, ośrodku obrazowania i cytometrii oraz biologii molekularnej za wsparcie tych prac.

<ol><li>Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf ">https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf </a> (2017).</li>
<li>Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf ">https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf </a> (2017).</li>
<li>Liu, Y., Zeng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+and+Innate+Immune+System+Interactions%3A+Translational+Potentials+for+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).</li>
<li>Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+cancer+metastasis%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune system in cancer metastasis: friend or foe.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79(2017).</li>
<li>Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+System+in+Cancer+Pathogenesis%3A+Potential+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 13(2016).</li>
<li>Vinay, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+evasion+in+cancer%3A+Mechanistic+basis+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies.</a> Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).</li>
<li>Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16699366">Immune Suppression in the Tumor Microenvironment.</a> Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).</li>
<li>Munn, D. H., Bronte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppressive+mechanisms+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment.</a> Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).</li>
<li>Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+in+immune-mediated+diseases%3A+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 85(2002).</li>
<li>Hardwick, N., Chain, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+contributes+to+effective+immunotherapy+in+metastatic+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients.</a> Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).</li>
<li>Makkouk, A., Weiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Immunotherapy+and+Breaking+Immune+Tolerance-New+Approaches+to+an+Old+Challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge.</a> Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).</li>
<li>Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CD8%28%2B%29+T-cell+tolerance+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://ascopubs.org/doi/abs/10.1200/jco.2011.29.15_suppl.2534">Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells.</a> Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534(2011).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+persistence+of+adoptively+transferred+autologous+CD19-targeted+T+cells+in+patients+with+relapsed+or+chemotherapy+refractory+B-cell+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias.</a> Blood. 118 (18), 4817(2011).</li>
<li>Hay, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+Biomarkers+of+Severe+Cytokine+Release+Syndrome+after+CD19+Chimeric+Antigen+Receptor-modified+T+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy.</a> Blood. 130, 2295-2306 (2017).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+CD19+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+treatment+of+B+cell+malignancies+in+phase+I+clinical+trials%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).</li>
<li>Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19+CAR+T+Cells+Expressing+IL-12+Eradicate+Lymphoma+in+Fully+Lymphoreplete+Mice+through+Induction+of+Host+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity.</a> Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).</li>
<li>Engels, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vectors+for+high-level+transgene+expression+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes.</a> Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).</li>
<li>Parkinson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Necropsy+and+Selected+Tissue+and+Sample+Collection+in+Rats+and+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966(2011).</li>
<li>Kueberuwa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7%28%2B%29+selected+gene-modified+T+cells+maintain+a+central+memory+phenotype+and+display+enhanced+persistence+in+peripheral+blood+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14(2017).</li>
</ol>

David Gilham pracuje dla firmy Celyad, która jest zaangażowana w produkcję limfocytów CAR T. Reszta autorów nie ma nic do ujawnienia.

Mysie modele syngeniczne umożliwiają testowanie progresji choroby i terapii przy jednoczesnym utrzymaniu nienaruszonego układu odpornościowego. Ma to zasadnicze znaczenie, jeśli chodzi o terapie, które oddziałują na układ odpornościowy, a w szczególności w przypadku leków immunoterapeutycznych.
Opisany tutaj protokół ma dwa krytyczne strumienie pracy, z których pierwszym jest genetyczna modyfikacja mysich limfocytów T w celu ekspresji CAR. Wymaga to 7 dni od rozpoczęcia do walidacji transdukcji. Równolegle z wytwarzaniem limfocytów CAR T dochodzi do powstania chłoniaka układowego u myszy. Jeśli produkcja komórek CAR T nie powiedzie się lub jakość jest niewystarczająca, zazwyczaj nie ma wystarczająco dużo czasu na wyprodukowanie komórek zastępczych, zanim myszy ulegną chłoniakowi. Dlatego tak ważne jest, aby naukowcy korzystający z tych modeli dokładnie przeprowadzili badania nad dawkowaniem guza i progresją choroby, aby skutecznie określić czas produkcji limfocytów CAR T do podawania terapeutycznego.
Typowe przyczyny niskiej wydajności transdukcji limfocytów T obejmują słabą wydajność transfekcji komórek produkcyjnych, zwykle spowodowaną niską czystością plazmidu lub niedokładnym określeniem pH pożywki transfekcyjnej. Zaleca się sprawdzenie skuteczności transfekcji komórek producenta przed przystąpieniem do pełnego protokołu, ponieważ słaba transfekcja ograniczy skuteczność transdukcji komórek T. Rekombinowane fragmenty ludzkiej fibronektyny mogą być zbierane i przechowywane w temperaturze -20 °C w celu ponownego wykorzystania, jednak wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie powoduje zmniejszenie wydajności transdukcji. Szybkie przetwarzanie śledziony myszy po pobraniu jest również ważne dla uzyskania wysokiej wydajności żywotnych limfocytów T.
Należy zauważyć, że opisany tutaj protokół wykorzystuje komórki A20 eksprymujące lucyferazy. Jest to preferowane, ponieważ zapewnia możliwość pomiaru ogólnoustrojowego obciążenia guzem za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Jednak w obecności funkcjonalnego układu odpornościowego odpowiedzi na lucyferazy mogą zniekształcić wyniki. Wcześniej testowaliśmy reakcje immunologiczne myszy, które przeżyły, na transgeny markerowe17. Kluczowe jest powtórzenie kluczowych eksperymentów z wykorzystaniem komórek A20 wolnych od transgenów, aby potwierdzić, że nie odgrywają one znaczącej roli w eradykacji guza przez komórki odpornościowe.
Podczas gdy środki kliniczne mogą być stosowane tylko in vivo u myszy z niedoborem odporności, zastosowanie mysich komórek CAR T przeciwko mysim komórkom rakowym pozwala nam ocenić wkład układu odpornościowego w skuteczność terapeutyczną lub postęp choroby. Protokół ten może być wykorzystany do przedklinicznej oceny CAR ukierunkowanych na chłoniaka z komórek B lub inne CAR z dodatkowymi modyfikacjami, takimi jak wydzielanie IL-12, jak opisano tutaj. Należy zauważyć, że chociaż wzajemne oddziaływanie między komórkami odpornościowymi można ocenić w syngenicznych modelach myszy, mogą one nie odzwierciedlać dokładnie interakcji u ludzi in vivo. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że ludzkie i mysie CAR będą różnić się strukturą, co może mieć dalsze konsekwencje; optymalna aktywacja i warunki hodowli komórkowej dla wzrostu limfocytów T są różne20, rozkład tkankowy ekspresji docelowego antygenu może się różnić między ludźmi i myszami, a doświadczane toksyczności mogą być radykalnie różne. Dlatego konieczne jest wykorzystanie modeli ex vivo i ksenogenicznych w celu potwierdzenia wyników.
Podsumowując, syngeniczny model chłoniaka limfodepletowanego i limforedowego podsumowuje pacjentów z wcześniejszą chemioterapią / radioterapią i bez niej. Zapewnia to modelowy system, w którym można naśladować warunki kliniczne, aby umożliwić testowanie szeregu strategii terapeutycznych, które będą ważne w przypadku nadchodzącej fali nowych środków terapii immunologicznej.
Dzięki zastosowaniu kondycjonowania wstępnego można zauważyć, że wszystkie myszy zazwyczaj usuwają chłoniaka. Przy wskaźnikach całkowitej odpowiedzi u ludzi do 90% jest to reprezentatywne. Jednak wyzwania związane z terapią limfocytami T CD19 CAR będą zależeć od zapobiegania wysokiej częstotliwości obserwowanych nawrotów, które często są CD19. W tym modelu nie obserwowano nawrotów do 100 dni, a często nawet dłużej. Modyfikacje naśladujące nawroty obserwowane w klinice mogą pomóc w sprostaniu przyszłym wyzwaniom związanym z terapią komórkami T CD19 CAR.

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CAR) wykazała zdumiewający sukces kliniczny w leczeniu nowotworów złośliwych CD19+, co doprowadziło do zatwierdzenia tisagenlecleucel w nawrotowej ostrej białaczce limfoblastycznej 1 i axicabtagene ciloleucel dla postępującego chłoniaka nieziarniczego z dużych komórek B2 w 2017 roku.
Coraz bardziej doceniane jest znaczenie interakcji między rakiem a układem odpornościowym zarówno w postępie choroby, jak i mechanizmach terapeutycznych3,4,5. Na przykład jest dobrze udokumentowane, że mikrośrodowisko guza (TME) jest zalane czynnikami, które mogą tłumić funkcje efektorowe komórek odpornościowych6,7,8. Alternatywnie, pobudzanie endogennych komórek odpornościowych i rozprzestrzenianie się epitopów może być kluczem do eradykacji guza i długoterminowej odporności na prowokację nowotworową9,10. Oba te zjawiska nie mogą być oceniane w modelach ksenogenicznych, które nie mają układu odpornościowego. Podobnie, systemy wykorzystujące białka transgeniczne nie odzwierciedlają dokładnie wyzwania, jakim jest przełamanie tolerancji immunologicznej, która jest wymagana do rozprzestrzeniania się epitopów11,12. Model syngeniczny z w pełni funkcjonalnym układem odpornościowym ma zatem zasadnicze znaczenie dla modelowania tych ważnych aspektów progresji choroby nowotworowej i terapii immunologicznej.
Ważnym zastrzeżeniem terapii limfocytami T CAR jest to, że do osiągnięcia sukcesu terapeutycznego wymagane jest wstępne kondycjonowanie limfodeplecyjne13,14. Zazwyczaj osiąga się to u pacjentów poprzez podanie chemioterapii przed infuzją limfocytów CAR T15,16. Jako standardową metodę, w celu naśladowania limfodeplecji stosowanej w warunkach pacjenta, podajemy napromienianie całego ciała 5 Gy (TBI) w celu uzyskania limfodeplecji przed podaniem terapeutycznych komórek CAR T myszom z układowym chłoniakiem z komórek B A20.
Podczas gdy wstępne kondycjonowanie limfodeplecji limfologicznej nie stanowi problemu dla większości pacjentów, toksyczność związana z chemioterapeutykami oznacza, że pacjenci o niskim stanie sprawności nie kwalifikują się do terapii limfocytami T CAR. Aby stworzyć system testowy, który reprezentuje pacjentów niekwalifikujących się do limfodeplecji, ustaliliśmy syngeniczny model myszy limforepletowej, w którym modelujemy terapię chłoniaka limfocytami T CAR. W tym modelu wykazaliśmy, że wydzielanie IL-12 z limfocytów CAR T może prowadzić do eradykacji utrwalonego chłoniaka ze wskaźnikiem sukcesu ~ 25%17. Ponadto wykazaliśmy, że endogenne komórki odpornościowe są zaangażowane w eradykację raka.
Tutaj szczegółowo opisujemy protokół produkcji mysich komórek CAR T, tworzenia chłoniaka u myszy syngenicznych oraz leczenia chłoniaka limfocytami CAR T z użyciem lub bez użycia kondycjonowania wstępnego limfodepletingu. Można to wykorzystać do badań skojarzonych limfocytów CAR T z innymi lekami, testowania limfocytów CAR T z innymi transgenami lub do stosowania innych strategii adoptywnej terapii komórkowej lub immunoterapii przeciwko chłoniakowi.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Appleton Woods</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Appleton Woods</td><td>FC122</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml tłuczek i mikroprobówka</td><td>VWR</td><td>431-0098</td><td></td></tr><tr><td>100X penicylina-streptomycyna-glutamina (PSG)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek blastycydyny</td><td>S Sigma- Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>Filtr górny do butelek (0,2 i mikro; m)</td> <td>Laboratorium Naukowe dostarcza</td><td>FIL8192</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 przeciwciało anty-mysie CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100759</td><td>rozcieńczeniu barwienia 1 na 100. Clone 53-6,7</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 anty-mysie przeciwciało CD4</td><td>BioLegend</td><td>100552</td><td>rozcieńczeniu barwienia 1 na 100. Klon RM4-5</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki do liczenia komórek &ndash; CountBright absolutne koraliki do liczenia</td><td>Sondy molekularne</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 100&mu; m</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat cyklofosfamidu</td><td>Merck</td><td>239785-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) - Wysoka glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-03</td><td>Sprzedawane przez Sigma- Aldrich</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy - LSR Fortessa x20</td><td>BD Biosciences</td><td>658222R1</td><td></td></tr> Hemacytometr <tr><td>płodowo-bydlęcy</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Appleton Woods</td><td>HC001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H0887&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-12 p70 Mysz niepowlekany zestaw ELISA</td><td>Invitrogen</td><td>88-7121-76</td><td></td></tr><tr><td>IL2, Proleukin</td><td>Novartis</td><td>PL 00101/0936<</td><td></td></tr><tr><td>em>in vivo system obrazowania bioluminescencji &ndash; system obrazowania in vivo xtreme II</td><td>Bruker</td><td>T149094</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna Sól wapniowa</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Żywa/martwa plama - Zombie Violet Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423114</td> Luminometr <td>do barwienia 1 na 100</td></tr><tr><td>- Lumistart Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-301</td><td></td></tr><tr><td>Mysi IFN-&gamma; Zestaw ELISA</td><td>Diaklon</td><td>861.050.010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP229540</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octanu (PMA) Phorbol 12-mirystynian 13 octanu (PMA)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Platinum E cell</td><td>Biolabs</td><td>RV-101</td><td>(RRID:CVCL_B488)</td></tr><tr><td>Oczyszczony klon NA/LE Chomik przeciw myszom CD28</td><td>BD Bioscience</td><td>553294</td> s <td>&nbsp; 37.51</td></tr><tr><td>Oczyszczony NA/LE Chomik Anti-Mouse CD3&epsilon;</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td>klon &nbsp; 145-2C11&nbsp;</td></tr><tr><td>Oczyszczony szczurzy anty-mysi CD16 / CD32 (mysi blok BD Fc)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>rozcieńczeniu barwienia 1 na 100. Klon 2.4G2</td></tr><tr><td>Dichlorowodorek puromycyny</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny - Odczynnik retronektyny</td><td>TaKaRa</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-7 (bez nośnika)</td><td>BioLegend</td><td>577806</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>eBioscience</td><td>004-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna - roztwór EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T3924&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Lucyferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

syngeniczny model chłoniaka z komórek b myszy do przedklinicznej oceny limfocytów t cd19 car

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Zdumiewający sukces kliniczny terapii limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) CD19 doprowadził do zatwierdzenia dwóch chimerycznych receptorów antygenowych drugiej generacji (CAR) dla ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) i chłoniaka nieziarniczego (NHL). Naukowcy koncentrują się obecnie na naśladowaniu tych sukcesów w innych nowotworach hematologicznych, w których obserwuje się mniej imponujące wskaźniki całkowitej odpowiedzi. Dalsza inżynieria limfocytów CAR T lub jednoczesne stosowanie innych metod leczenia może skutecznie przezwyciężyć przeszkody na drodze do skutecznej terapii w innych stanach nowotworowych.
Dlatego prezentujemy model, w którym inni mogą przeprowadzać testy przedkliniczne limfocytów T CD19 CAR. Wyniki tego dobrze przetestowanego modelu chłoniaka z komórek B mogą być ogólnie pouczającą terapią komórkami T CAR.
Ten protokół pozwala na powtarzalne wytwarzanie mysich komórek CAR T poprzez transfekcję fosforanu wapnia komórek produkcyjnych Plat-E z retrowirusowymi konstruktami MP71 i plazmidem pakującym pCL-Eco, a następnie zbieranie wydzielanych cząstek retrowirusowych i transdukcję za pomocą rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny oraz wirowanie. Opisano również walidację transdukcji retrowirusowej i potwierdzenie zdolności limfocytów CAR T do zabijania docelowych komórek chłoniaka ex vivo, poprzez zastosowanie cytometrii przepływowej, luminometrii i testu immunoenzymatycznego (ELISA).
Opisano protokoły testowania limfocytów T CAR in vivo u myszy syngenicznych limforepletowych i limfodepletowych, z ustalonym, układowym chłoniakiem. Aktywność przeciwnowotworowa jest monitorowana przez bioluminescencję in vivo i progresję choroby. Pokazujemy typowe wyniki eradykacji ustalonego chłoniaka z komórek B przy użyciu CAR 1 lub 2generacji w połączeniu ze wstępnym kondycjonowaniem limfodepletingu oraz mniejszości myszy osiągających długoterminową remisję przy użyciu limfocytów T CAR eksprymujących IL-12 u myszy z pulą limforudyczną.
Te protokoły mogą być używane do oceny limfocytów T CD19 CAR z różnymi dodatkowymi modyfikacjami, kombinacjami limfocytów CAR T i innymi środkami terapeutycznymi lub przystosowane do użycia limfocytów CAR T przeciwko różnym antygenom docelowym.

Aby zapewnić wysoką wydajność transdukcji limfocytów T, konieczne jest uzyskanie świeżych cząsteczek retrowirusowych. Transfekcja linii komórkowej Plat-E plazmidem producentem pCL-Eco oraz plazmidem retrowirusowym pMP71 prowadzi do wydzielania cząsteczek retrowirusowych do supernatantu komórkowego. W przypadku kodowania w retrowirusie genu markera fluorescencyjnego, takiego jak mCherry, pomyślną transfekcję można potwierdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 1). Do transdukcji limfocytów T wykorzystuje się supernatant zawierający wirusy z przetransfekowanych komórek Plat-E poprzez 2 rundy spinfekcji na płytkach pokrytych fragmentem fibronektyny. Wydajność transdukcji można określić 4 dni po transdukcji. poprzez cytometria przepływowa. Pomyślnie transdukowane komórki wykazują ekspresję genu markera zakodowanego w retrowirusie (Rysunek 2). Wydajność transdukcji wynosi od ok. 50% do 90% w przypadku receptorów pierwszej generacji oraz od ok. 10% do 40% w przypadku konstruktów CAR zbliżonych do maksymalnej pojemności pakowania retrowirusowego. Choć ekspresja genu markerowego świadczy o pomyślnej transdukcji retrowirusowej, kluczowe jest wykazanie funkcjonalności komórek CAR-T po wejściu w interakcję z komórkami wykazującymi ekspresję antygenu docelowego na powierzchni. Linie komórek docelowych zmodyfikowane w celu ekspresji lucyferazy mogą być wykorzystywane w testach lucyferazowych do bezpośredniego badania stopnia cytotoksyczności komórek CAR-T (Rysunek 3A). Uwalnianie cytokin efektorowych z komórek CAR-T podczas kokultury z komórkami docelowymi, określone za pomocą testu ELISA, może być również wykorzystane jako pośrednia miara cytotoksyczności komórek CAR-T (Rysunek 3B i 3C).
Komórki CAR-T otrzymane zgodnie z niniejszym protokołem można ocenić u myszy z zachowaną populacją limfocytów poprzez wywołanie systemowego chłoniaka A20 za pomocą dawki 10 mg/kg cyklofosfamidu (podanego dożylnie) na 1 dzień przed dożylną iniekcją 5 x 105 komórki A20 (Rysunek 4). Iniekcja domięśniowa lucyferyny i rejestracja obrazu za pomocą in vivo obrazownik bioluminescencyjny może być wykorzystywany do monitorowania masy guza przy zastosowaniu stałej ROI i czasu ekspozycji przez cały okres (Rycina 5A-C). Komórki CAR-T zmodyfikowane w celu ekspresji IL-12 są zdolne do eradykacji chłoniaka systemowego przy zastosowaniu limfodeplecyjnego przygotowania, co skutkuje przeżyciem bez choroby u około 25% myszy (Rysunek 5D). Kondycjonowanie limfodeplecyjne, przeprowadzone poprzez całkowite naświetlanie ciała (TBI) w dawce 5 Gy na 1 dzień przed dożylną administracją komórek CAR-T, znacząco poprawia przeżywalność i zagnieżdżenie przeszczepu (Rycina 6). W tym modelu CAR-T komórki pierwszej generacji są zdolne do eliminacji systemowego chłoniaka A20, zazwyczaj indukując przeżycie wolne od choroby u 10% myszy (Rysunek 7).
<img alt="Porównanie mikroskopowe; fluorescencja vs pole jasne; analiza rozkładu komórkowego; skala 300µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Potwierdzenie pomyślnej transfekcji komórek Plat E. Komórki Plat-E transfekowane retroviralnym konstruktem CAR oraz plazmidowym DNA wektora pakującego pMP71 i pcl-Eco. Pomyślną transfekcję wykazuje ekspresja genu markera fluorescencyjnego mCherry. A) mikroskopia w polu jasnym, B) mikroskopia fluorescencyjna i C) Przedstawiono nałożone obrazy. Powiększenie = 50X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna, różnicowanie podzbiorów limfocytów T CD4/CD8, wykresy A-C przedstawiające bramkowanie singletów oraz żywych/martwych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Oznaczanie wydajności transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometrię przepływową wykorzystano do oznaczenia wydajności transdukcji limfocytów T myszy w 4. dniu po transdukcji, stosując Zombie UV live/dead, mCherry, BV71 i BV785 odpowiednio do detekcji komórek żywych, konstruktu CAR, CD4 oraz CD8. Reprezentatywne wyniki A) Nietransdukowane, B) mCherry.αmCD19.mCD3z oraz C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 przedstawiono wraz z bramowaniem dla: 1) singletów, 2) żywych komórek, 3) CD4 i CD8, oraz 4) i 5) oceny komórek mCherry-dodatnich wykazujących ekspresję CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy i punktowy przedstawiający dane dotyczące odpowiedzi immunologicznej. Pomiary obejmują poziomy RLU, IFN-γ oraz IL12." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Walidacja aktywności limfocytów CAR-T. Komórki CAR T αmCD19 współhodowano z komórkami chłoniaka A20 zmodyfikowanymi w celu ekspresji lucyferazy (1 x 1041 x 104) przez 16 h na płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Po kokulturze komórki odwirowano, a nadeświetle zebrano. A) Komórki resuspendowano w PBS, a do oceny żywotności komórek docelowych wykorzystano luminometrię. W supernatantach z kokultury oceniano obecność IFNγ (B) oraz IL-12 (C). Stosunek komórek CAR-T do komórek docelowych oraz czas trwania kokultywacji muszą zostać zoptymalizowane dla każdego konstruktu CAR i linii komórek docelowych. Jako kontrolę pozytywną w celu potwierdzenia jakości limfocytów T oraz ich zdolności do odpowiedzi można zastosować inkubację z PMA i jonomycyną. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (SD). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). *** p &lt; 0,01). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza graficzna liczby, przepływu i przeżywalności WBC w czasie w badaniu nad cyklofosfamidą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4. Ustanowienie chłoniaka A20 bez limfodeplecji. Cyklofosfamid może zwiększyć efektywność indukcji chłoniaka, nie powodując jednocześnie limfodeplecji. A) Morfologia krwi myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni po dożylnym podaniu cyklofosfamidu w dawce 100 mg/kg. Słupki błędu przedstawiają SD B) Obciążenie chłoniakiem u myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni po dożylnym podaniu 10 mg/kg cyklofosfamidy lub soli fizjologicznej w dniu -1 oraz dożylnym podaniu 5 x 105 Komórki A20 w dniu 0 zmierzone przy użyciu luminometru. C) Przeżywalność myszy w B)Słupki błędów przedstawiają SD. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu dwuczynnikowej analizy wariancji (2-way ANOVA). ** p &lt; 0.01, *** p &lt; 0,01). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Kueberuwy it al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obrazowanie bioluminescencyjne myszy, efekty terapii limfocytami T; wykres wzrostu guza; wykres analizy przeżywalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5. Monitorowanie obciążenia chłoniakiem i przeżywalności. Myszy z chłoniakiem A20 wykazującym ekspresję lucyferazy otrzymują 100 µL dożylne (IP) iniekcje lucyferyny w stężeniu 30 mg/mL, a obrazowanie wykonano za pomocą in vivo system obrazowania bioluminescencyjnego A) Myszy eksponowano przez 1 min stronę brzuszną, a następnie niezwłocznie obrócono, aby obrazować stronę grzbietową w celu wykrycia mas guzów po obu stronach ciała. (B). C) Reprezentatywne wyniki obciążenia chłoniakiem u myszy BALB/c otrzymujących różne dawki komórek αmCD19 CAR T bez limfodeplecji. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej (SEM). D) Wskaźnik przeżywalności tych samych myszy. Rysunek zmodyfikowany na podstawie opracowania Kueberuwy i inni17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki terapii komórkami CAR-T; trendy dla WBC, limfocytów i monocytów; wykres CD4/CD8; dane eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Efekty limfodeplecji. A) Morfologia krwi myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni po otrzymaniu dawki 5 Gy TBI przy mocy dawki 0,02 Gy/min; słupki błędów przedstawiają SD. Analiza statystyczna przeprowadzona za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). * p &lt; 0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt; 0.001. B) Monitorowanie CD4+ oraz CD8+ Analiza komórek CAR-T we krwi obwodowej myszy za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem markerowego genu mCherry 7 dni po podaniu. Słupki błędów przedstawiają SD. Rysunek zmodyfikowano na podstawie publikacji Kueberuwa it al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wpływ terapii komórkami CAR-T na myszy: A) Wyniki obrazowania, B) Wykres bioluminescencji, C) Wykres przeżywalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Aktywność komórek CAR-T przy limfodeplecyjnym przygotowaniu wstępnym. Typowe wyniki pokazujące efekt TBI w dawce 5 Gy w dniu poprzedzającym podanie limfocytów CAR-T. A) Obrazowanie i (B) wyświetlacze graficzne obrazowania myszy po 100 µL do brzuszne (IP) wstrzyknięcia lucyferyny w stężeniu 30 mg/ml przy użyciu in vivo system obrazowania bioluminescencyjnego. Słupki błędów przedstawiają SEM. C) Przeżywalność tych samych myszy. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Kueberuwa i inni17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i testów przedklinicznych mysich limfocytów T CD19 CAR metodą transdukcji retrowirusowej i wykorzystania jako terapii przeciwko ustalonemu syngenicznemu chłoniakowi B-komórkowemu A20 u myszy BALB/c z lub bez kondycjonowania wstępnego limfodepletingu.

Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii immunologicznej limfocytów T CAR, takie jak genetyczna modyfikacja limfocytów T CAR i połączenie z innymi terapiami immunologicznymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia porównania między ustawieniami Lympho replete i Lympho deexhausted. To pozwala nam dostrzec rolę endogennych komórek odpornościowych zarówno w progresji choroby, jak i ich interakcji z terapeutycznymi limfocytami T CAR.Implikacje tej techniki jako 10 do terapii w rozpoznaniu guza litego, ponieważ wnioski wyciągnięte z tego modelu można bezpośrednio przełożyć na dom cukierków z innymi celami, takimi jak CEA.To rozpocząć tę procedurę. Najpierw przygotuj wszystkie potrzebne nośniki i komórki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Pierwszego dnia w kompletnym DMEM do 15 centymetrów kwadratowych naczyń hodowlanych. Wysiewaj 7,5 miliona platynowych komórek E w tych szalkach i inkubuj przez noc w temperaturze 37

a-syngeneic-mouse-b-cell-lymphoma-model-for-pre-clinical-evaluation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie prezentujemy procedurę aktywacji CD40 i ekspansji mysich limfocytów B z splenocytów myszy C57BL/6, które mogą służyć jako model komórki prezentującej antygen (APC) do badania indukcji odporności.

Mysi model aktywacji limfocytów B przez CD40

Ten film demonstruje test in vitro w celu sprawdzenia aktywności limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR). Komórki chłoniaka z komórek B eksprymujące antygen CD19 i lucyferazy cytoplazmatycznej są hodowane wspólnie z komórkami CAR T specyficznymi dla CD19. Wiązanie CAR z CD19 na guzie indukuje limfocyty CAR T do uwalniania cytokin i toksyn, które powodują cytotoksyczność komórek nowotworowych. Aktywność limfocytów CAR T ocenia się poprzez ilościowe określenie uwolnionej cytokiny...

Test in vitro w celu oceny aktywności przeciwnowotworowej komórek CAR T specyficznych dla nowotworu

Przerzutowe rozprzestrzenianie się raka jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Przedstawiamy szczegółowy opis naszej metodologii chirurgii przeżycia w celu ustanowienia "podobnego do pacjenta" ortotopowego syngenicznego modelu myszy do badania mechanizmów przerzutów w guzach narządów litych.

"Podobny do pacjenta" ortotopowy syngeniczny mysi model przerzutów raka wątrobowokomórkowego

Implementacja ortotopowego modelu raka nerkowokomórkowego u myszy immunokompetentnych daje badaczowi klinicznie istotny system zdefiniowany przez obecność pierwotnego guza nerki i przerzutów do płuc u tego samego zwierzęcia. System ten może być stosowany do przedklinicznego testowania różnych metod leczenia in vivo.

Syngeniczny mysi model przerzutowego raka nerkowokomórkowego do ilościowej i podłużnej oceny terapii przedklinicznych

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Tutaj opisujemy metodę tworzenia kropelek podwójnej emulsji otaczających jedną limfocyt T i komórkę docelową raka, aby zbadać zabijanie komórek na poziomie pojedynczej komórki. Metoda ta pozwala na podwójną kwantyfikację zarówno cząsteczek cytotoksycznych, jak i apoptozy komórek docelowych w dużej populacji limfocytów T.

Test cytotoksyczności oparty na kropelkach w celu oceny limfocytów T receptora antygenu chimerycznego na poziomie pojedynczej komórki

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Poznaj metodę generowania mysich limfocytów T CD19 CAR do terapii chłoniaka z komórek B w modelu syngenicznym u myszy BALB/c. Protokół umożliwia ocenę skuteczności w różnych warunkach immunologicznych.

Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR

Przeglądaj więcej filmów