Name: Metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Poznaj metodę oceny integralności bariery krew-jądro u myszy C57Black/6 przy użyciu inuliny-FITC. Ta technika pozwala badać wpływ czynników genetycznych i środowiskowych na płodność męską.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2016YFA0500902), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31471228, 31771653), Fundację Naukową Jiangsu dla Wybitnych Młodych Uczonych (BK20150047), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) oraz Program Innowacyjny i Przedsiębiorczy Prowincji Jiangsu dla K.Z.

Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komitet Uniwersytetu Medycznego w Nankinie. Samce myszy C57BL/6 trzymano w kontrolowanych warunkach fotoperiodycznych i zaopatrywano je w pokarm i wodę.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Kapilary mikroiniekcyjne
	<ol>
		<li>Stosować kapilary do mikroiniekcji o średnicy zewnętrznej, średnicy wewnętrznej i długości odpowiednio 1,0 mm, 0,8 mm i 10,0 cm.</li>
		<li>Pociągnij szklane kapilary za pomocą ściągacza kapilarnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Przetestuj i dostosuj ustawienia w zależności od używanej ściągacza kapilary.</li>
		<li>Połamać końcówki pipet kleszczami, aby uzyskać kapilary o średnicy 50 μm na końcówce. 
		Uwaga: Końcówki mogą być zbyt długie, aby przeniknąć do jądra.</li>
		<li>Naostrz końcówkę pod kątem 30° za pomocą ukosowarki do mikropipet (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczynniki
	<ol>
		<li>Przygotować 1% pentobarbital sodu: rozpuścić pentobarbital sodu 100 mg w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (krok 2.3.3).</li>
		<li>Przygotować 10 mg/ml inuliny-FITC: rozpuścić inulinę-FITC 1 mg w 100 μl PBS (krok 2.1.6).</li>
		<li>Przygotować 4% paraformaldehydu: rozpuścić paraformaldehyd (PFA) 4 g w 100 ml PBS (krok 2.3.3).</li>
		<li>Przygotować 30% sacharozy: rozpuścić sacharozę 3 g w 10 ml PBS (krok 2.3.4).</li>
		<li>Przygotować 0,1% chlorek kadmu: rozpuścić chlorek kadmu 10 mg w 10 ml PBS (etap 2.1.1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Metody
<ol>
	<li>Anestezjologia i przygotowanie przedoperacyjne
	<ol>
		<li>Zważyć 8-tygodniowe samce myszy C57BL/6 i obliczyć wymaganą dawkę CdCl2. Leczyć grupę myszy (n = 3) CdCl2 (5 mg/kg m.c., i.p.) przez 3 dni przed operacją. Potraktuj inną grupę 8-tygodniowych samców myszy C57BL / 6 (n = 3) z PBS jako kontrolą.</li>
		<li>Wykonuj operację w warunkach aseptycznych przy użyciu sterylnej strzykawki, igły, nożyczek i kleszczy.</li>
		<li>Przygotuj świeżo roztwór roboczy do znieczulenia. Wymagana dawka znieczulenia to 70 mg pentobarbitalu sodu/kg masy ciała. Średnio dorosła mysz C57BL/6 w wieku 8 tygodni waży ~25 g, co odpowiada 175 μl 1% pentobarbitalu sodu (1,75 mg na mysz). 
		UWAGA: Sól sodowa pentobarbitalu rozpuszcza się w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Roztwór jest filtrowany przez jednostkę filtrującą 0,22 um przed użyciem.</li>
		<li>Oczyść obszar do zabiegu 75% etanolem i przykryj obszar czystym ręcznikiem tkankowym.</li>
		<li>Włącz grzałkę termostatyczną i ustaw temperaturę na 37 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy inulina-FITC (10 mg/ml) w dniu zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zabiegu chirurgicznego
	<ol>
		<li>Zważ 8-tygodniowe samce myszy C57BL/6 i oblicz wymaganą dawkę znieczulenia.</li>
		<li>Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml. Trzymaj mysz w czystej klatce.</li>
		<li>Obserwuj reakcję odruchową oka i wzorzec oddychania myszy, aby upewnić się, że jest ona w pełnym znieczuleniu. 
		UWAGA: Zwykle potrzeba 10 - 15 minut, aż mysz zostanie głęboko znieczulona, przy całkowitym braku reakcji na szczypanie palców u nóg i utrzymaniu powolnego, równomiernego oddechu.</li>
		<li>Przesuń mysz do obszaru operacyjnego i przykryj okolice oczu wilgotną bibułą, aby uniknąć wysuszenia podczas znieczulenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
		<li>Ogol włosy na brzuchu golarką i zdezynfekuj obszar operacji 75% etanolem.</li>
		<li>Ostrymi nożyczkami wykonaj 1-centymetrowe nacięcie skóry nad gruczołami napletkowymi, aby odsłonić ścianę brzucha. Podnieś ścianę brzucha za pomocą małych kleszczy i wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie, aby odsłonić jamę otrzewnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby poszukać poduszek tłuszczowych wokół najądrza i jądra. Ostrożnie wyciągnij poduszeczki tłuszczowe, aby wyraźnie odsłonić przyczepione jądro (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C i 2D). Zazwyczaj operuj na jednym jądrze na raz. 
		UWAGA: Unikaj dotykania poduszek tłuszczowych i jąder rękami.</li>
		<li>Umieść papier (o średnicy 9 cm) pod poduszeczkami tłuszczowymi i jądrem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Wstrzyknąć inulinę-FITC do pipety do mikroiniekcji i podłączyć ją do jednostki mikromanipulatora (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Delikatnie włożyć pipetę do mikroiniekcji pod osłonkę białawą i załadować łącznie 20 μl inuliny-FITC do śródmiąższu jądra (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2E i 2F). 
		UWAGA: Ostrożnie wciśnij pipetę do mikroiniekcji, aby jej nie przesuwać.</li>
		<li>Monitoruj ruch inuliny-FITC w jądrze (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
		<li>Po zakończeniu wstrzyknięcia należy natychmiast umieścić jądro z powrotem w jamie brzusznej.</li>
		<li>Powtórz procedurę na przeciwległym jądrze. Do tego jądra wstrzykuje się 20 μl PBS jako kontrolę.</li>
		<li>Zamknij skórę szwem chirurgicznym i przesuń mysz do poduszki grzewczej grzejnika termostatycznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Podawać dawkę 1 mg leku przeciwbólowego (buprenorfiny) na 1 kg masy ciała we wstrzyknięciu podskórnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór jąder i przygotowanie zamrożonych części
	<ol>
		<li>40 minut po wstrzyknięciu należy poddać eutanazji mysz biorcy przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi pielęgnacji i stosowania zwierząt.</li>
		<li>Użyj ostrych nożyczek, aby zebrać jądra. Umieść jądra w 1 ml lodowatego PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia krwi.</li>
		<li>Utrwalić jądra w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C przez 12 - 24 godziny. Wyrzuć 4% PFA i umyj tkankę 3x 1,5 ml 1% PBS w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwodnić tkankę w 30% sacharozy przez noc. Umieść jądro w ramce do osadzania i przykryj tkankę związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Po zamrożeniu OCT wypełnij ramkę osadzającą OCT, aby całe jądro mogło być pokryte OCT.</li>
		<li>Wytnij zamrożone przekroje jąder o grubości 5 μm w kriostacie w temperaturze -20 °C i pozwól im przylegać do szkiełek mikroskopowych. 
		UWAGA: Ponowne zamrożenie tkanek osadzonych w suchym lodzie może zwiększyć sztywność cięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapotrzebowanie na obrazy
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka w nawilżonym pudełku. Podgrzewaj szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
		<li>Przemyj sekcje 3x solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Suszyć na powietrzu przez 5 minut w ciemności. Zetrzyj wszelkie resztki TBS papierem bezpyłowym.</li>
		<li>Pokryj przekroje 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI). Umieść odwrócone szkiełko nakrywkowe na szkiełku mikroskopowym.</li>
		<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Całkowite 20-krotne powiększenie jest na ogół wystarczające do wykrycia jasno fluorescencyjnego sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
<li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).</li>
<li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+seamless+trespass%3A+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li>
<li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+testis+in+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li>
<li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Mechanisms+In+Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li>
<li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier%3A+Its+Biology+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Review%22%5BJournal%5D)">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li>
<li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li>
<li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li>
<li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li>
<li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li>
<li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+%27blood-testis+barrier%27+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li>
<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Spermatogeneza zachodzi w nabłonku nasiennym i jest wysoce uporządkowanym i dynamicznym procesem, którym zarządzają komórki rozrodcze i komórki somatyczne (np. komórki Sertoliego)13. Struktura BTB, która jest budowana przez komórki Sertoliego, dzieli nabłonek nasienny na przedział podstawowy i wierzchołkowy. Rozwój mejotycznych i haploidalnych komórek rozrodczych zachodzi w przedziale wierzchołkowym, który tworzy barierę immunologiczną14.
<p class="jov...

Spermatogeneza ssaków jest uważana za wysoce ustrukturyzowany proces, który obejmuje samoodnowę i różnicowanie się spermatogoniów przez spermatocyty do haploidalnych plemników poprzez mitozę, mejozę i spermiogenezę, podczas których zachodzą dramatyczne zmiany biochemiczne i morfologiczne. Rozwijające się komórki rozrodcze są stopniowo transportowane od podstawy kanalika nasiennego w kierunku światła. Proces ten jest regulowany przez kontakty komórka-komórka między komórkami rozrodczymi a komórkami Sertoliego1,2. Sąsiednie komórki Sertoliego tworzą BTB, który znajduje się w pobliżu podstawy kanalika nasiennego. BTB fizycznie dzieli nabłonek na przedział podstawowy i adluminalny. Podczas etapów VIII - IX cyklu nabłonkowego spermatocyty preleptotenu/leptotenu z przedziałów podstawnych migrują przez BTB, wchodząc do przedziałów adluminalnych3. Dlatego funkcją BTB jest zapewnienie immunouprzywilejowanego mikrośrodowiska do zakończenia mejozy i spermiogenezy4,5,6. W przeciwieństwie do innych barier krew-tkanka (np. bariera krew-mózg), które składają się tylko ze ścisłych połączeń (TJ), BTB jest utworzona przez cztery różne połączenia (TJ, specjalizacje ektoplazmatyczne, połączenia szczelinowe i pośrednie desmosomy oparte na włóknach) między komórkami Sertoliego1,7.
Wiele badań wykorzystywało genetycznie modyfikowane myszy, infekcje wirusowe i toksyny środowiskowe do zbadania mechanizmów integralności BTB7,8,9. Zaburzenie BTB indukuje upośledzoną spermatogenezę i niepłodność lub niepłodność. Ponieważ potwierdzono, że na powstawanie i integralność BTB mają wpływ kontakty między komórkami Sertoliego8, do badania BTB zastosowano model in vitro oparty na pierwotnej hodowli izolowanych komórek Sertoliego. Jednak model ten nie może dokładnie naśladować dynamiki BTB in vivo. Co więcej, nie ustalono, że taka kohodowla komórek rozrodczych z komórkami Sertoliego jest w stanie odzwierciedlić wszystkie istotne składniki strukturalne i funkcjonalne BTB10,11.
Ogólnie, testy integralności BTB in vivo są zazwyczaj oparte na małych cząsteczkach, takich jak EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna i inulina sprzężona z FITC (inulina-FITC). Zwykle dyfuzja biotyny lub inuliny-FITC z przedziału podstawowego jest blokowana przez strukturę BTB. Dlatego jesteśmy w stanie wykorzystać tę metodę do oceny stopnia uszkodzenia BTB w porównaniu z grupami kontrolnymi. Podczas gdy BTB może być zagrożony przez niektóre rodzaje bodźców, takie jak leczenie chlorkiem kadmu (CdCl2)12, BTB staje się dostępny dla małych cząsteczek, które ostatecznie dostają się do przedziału świetlnego jako wskaźniki.
Wczesny test integralności BTB in vivo polega na wstrzyknięciu biotyny lub inuliny-FITC do żyły szyjnej, co wiąże się z operacją i jest inwazyjne, skomplikowane i czasochłonne. Poza tym, ponieważ substancje reporterowe dyfundują przez całe ciało przez krążenie, miejscowe stężenie biotyny lub inuliny-FITC w kanalikach nasiennych jest ograniczone. Ponadto narażenie ogólnoustrojowe może wywoływać reakcje immunologiczne. W tym miejscu przedstawiamy prosty i skuteczny test integralności BTB in vivo umożliwiający bezpośrednie wstrzyknięcie małej porcji inuliny-FITC do śródmiąższu jądra. Dzięki metodzie znakowania fluorescencyjnego proces barwienia jest wygodny, ponieważ przeciwciała wtórne nie są wymagane. Tutaj wizualizuje się proces wnikania barwnika fluorescencyjnego do jądra.

<table><tbody><tr><td>Ściągacz kapilarny&nbsp;</td><td>SUTTER INSTRUMENT (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclon (USA)</td><td>SH30258,01</td><td>rozcieńczenie do 1&razy; w ddH2O</td></tr><tr><td>4',6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma (USA)</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe adhezyjne</td><td>CITOGLAS (Chiny)</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek kadmu</td><td>Sigma (USA)</td><td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss (Niemcy)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Papier bezpyłowy</td><td>Kimberly-Clark (USA)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inulina-FITC</td><td>Sigma (USA)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary mikroiniekcyjne</td><td>Zhengtianyi (Chiny)</td><td>BJ-40</td><td>1,0 mm & razy; 0,8 mm&nbsp; &times; 100 mm</td></tr><tr><td>Ukosowarka do mikropipet</td><td>NARISHIGE (JAPONIA)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>SAKURA (JAPONIA)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma (USA)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodowy</td><td>Merck (Niemcy)</td><td>Golarka P11011</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Yashen (Chiny)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon (JAPONIA)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (Chiny)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Mocniejsze (Chiny)</td><td></td><td>nożyczki, kleszcze, uchwyt na igłę</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>KDL (Chiny)</td><td>20163150518</td><td>0,45 mm i razy 0,16 mm RW LB</td></tr><tr><td>Grzejnik termostatyczny</td><td>KELL (Nanjing, Chiny)</td><td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS, pH 7,6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 mln Tris</td><td>Sangon Biotech (Chiny)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1,37 mln Nacl</td><td>Sangon Biotech (Chiny)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro myszy

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogeneza to rozwój spermatogonii w dojrzałe plemniki w kanalikach nasiennych jądra. Proces ten jest wspierany przez połączenia komórek Sertoliego na barierze krew-jądro (BTB), która jest najściślejszą barierą tkankową w ciele ssaków i segreguje nabłonek nasienny na dwa przedziały, podstawowy i przybiegunowy. BTB tworzy unikalne mikrośrodowisko dla komórek rozrodczych w mejozie I/II oraz dla rozwoju plemników postmejotycznych w plemniki poprzez spermiogenezę. Tutaj opisujemy wiarygodny test do monitorowania integralności BTB jąder myszy in vivo. Nienaruszony BTB blokuje dyfuzję inuliny sprzężonej z FITC z przedziału podstawnego do wierzchołkowego kanalików nasiennych. Technika ta jest odpowiednia do badania kandydatów na geny, wirusów lub toksyn środowiskowych, które mogą wpływać na funkcję lub integralność BTB, przy łatwej procedurze i minimalnym wymaganiu umiejętności chirurgicznych w porównaniu z metodami alternatywnymi.

Układ doświadczalny do przeprowadzenia testu szczelności BTB przedstawiono na Ryc. 1. Wyciągnij i zaostrz kapilary do mikroiniekcji, odpowiednio za pomocą wyciągacza kapilar oraz urządzenia do skosowania mikropipet (Ryc. 1A i 1C). Grzałka termostatyczna oraz sprzęt do mikroiniekcji zilustrowano na Ryc. 1B i 1D.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page...

Tutaj prezentujemy protokół oceny integralności bariery krew-jądro poprzez wstrzykiwanie inuliny-FITC do jąder. Jest to skuteczna metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro, która może być zagrożona przez elementy genetyczne i środowiskowe.

Metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro myszy

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące bariery krew-jądro w dziedzinach biologii dotyczących kandydatów na geny, wirusów lub toksyn środowiskowych, które mogą wpływać na funkcję lub integralność bariery krew-jądro. Trzy dni przed operacją należy codziennie podawać co najmniej trzem ośmiotygodniowym myszom C57Black/6 samców chlorku kadmu w dawce pięciu miligramów na kilogram masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym. W dniu zabiegu umieść czystą chusteczkę na obszarze operacyjnym wysterylizowanym etanolem w 75% i ustaw grzałkę termostatyczną na 37 stopni Celsjusza.Umieść znieczuloną mysz na tkance, a następnie potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca. Ogol włosy na brzuchu golarką i zdezynfekuj odsłoniętą skórę 75% etanolem. Wykonaj jednocentymetrowe nacięcie skóry nad gruczołami napletkowymi, aby odsłonić ścianę brzucha, i użyj małych kleszczyków, aby podnieść skórę, aby wykonać 0,5-centymetrowe nacięcie w otrzewnej.Użyj kleszczy, aby poszukać poduszek tłuszczowych wokół najądrza i jądra, ostrożnie wyciągając poduszeczki tłuszczowe, aby odsłonić jedno przyczepione jądro. Umieść dziewięciocentymetrowy kawałek papieru pod poduszeczkami tłuszczowymi i jądrami, a następnie naładuj pipetę do mikroiniekcji świeżo przygotowanym roztworem inuliny-FITC. Podłącz pipetę do mikromanipulatora i za pomocą mikroskopu preparacyjnego delikatnie wsuń końcówkę pipety do mikroiniekcji pod osłonkę białawą.Powoli obracaj dźwignią operacyjną, aby dostarczyć 20 mikrolitrów inuliny-FITC do śródmiąższu jądra. Jeśli poród się powiedzie, jądro zmieni kolor na jasnozielono-żółty. Natychmiast zwróć jądro do jamy brzusznej i wstrzyknij do przeciwległego jądra 20 mikrolitrów PBS, a następnie zamknij skórę szwem chirurgicznym.I umieść mysz na poduszce grzewczej grzejnika termostatycznego. 40 minut po wstrzyknięciu użyj ostrych nożyczek, aby pobrać jądra od każdej myszy i umyć tkanki w jednym mililitrze lodowatego PBS. Następnie utrwal jądra w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 12 do 24 godzin, a następnie trzy płukania po 1,5 mililitra 1% PBS na pranie.Po 30% odwodnieniu sacharozy przez noc, przenieś próbki do indywidualnych ramek do zatapiania i przykryj tkanki związkiem o optymalnej temperaturze cięcia. Ustaw temperaturę kriostatu na minus 20 stopni Celsjusza i umieść ramki w kriostacie na około 10 minut, aż OCT zostanie zamrożone. Następnie wypełnij każdą ramkę osadzania świeżym OCT, aż całe jądro zostanie pokryte każdą formą.Gdy druga warstwa OCT zamarznie, należy uzyskać przekroje poprzeczne każdego jądra o grubości pięciu mikrometrów, przechwytując skrawki tkanki na szklanych szkiełkach mikroskopowych w miarę ich uzyskiwania. Aby zobrazować próbki, najpierw ogrzej szkiełka w nawilżonym pudełku w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach umyj szkiełka trzy razy w świeżej soli fizjologicznej buforowanej Tris na jedno mycie i pozostaw sekcje do wyschnięcia na pięć minut, chroniąc przed światłem.Użyj papieru bezpyłowego, aby usunąć resztki soli fizjologicznej i zamontuj próbki za pomocą nośnika montażowego uzupełnionego DAPI. Następnie przykryj każdą próbkę odwróconym szkiełkiem nakrywkowym i zobrazuj próbki pod obiektywem 20X mikroskopu konfokalnego. Trzy dni leczenia chlorkiem kadmu powoduje uszkodzenie bariery krew-jądro, umożliwiając dyfuzję inuliny-FITC z przedziału podstawnego do przedziału wierzchołkowego nabłonka nasiennego.W przeciwieństwie do tego, ta dyfuzja jest blokowana w kontrolnych jądrach traktowanych PBS. Stopień uszkodzenia bariery krew-jądro określa się, obliczając stosunek odległości dyfuzji inuliny-FITC do promienia tego samego kanalika nasiennego. Co więcej, nienaruszona bariera krew-jądro u heterozygotycznych myszy z nokautem Rictora blokuje dyfuzję inuliny przez barierę do przedziału wierzchołkowego, podczas gdy warunkowe myszy z nokautem Rictora mają naruszoną barierę krew-jądro, która umożliwia dyfuzję inuliny.Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o dostarczeniu inuliny-FITC przygotowanej w dniu eksperymentu i ochronie tkanki przed światłem, ponieważ FITC jest cząsteczką wrażliwą na światło. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię upośledzonej spermatogenezy, ponieważ funkcją bariery krew-jądro jest zapewnienie uprzywilejowanego immunologicznie mikrośrodowiska do zakończenia mejozy w spermatogenezie. Po opracowaniu technika ta umożliwia naukowcom zajmującym się medycyną reprodukcyjną badanie niepłodności i niepłodności u myszy.Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odzieży i masek na twarz.

an-in-vivo-method-to-study-mouse-blood-testis-barrier-integrity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Ten artykuł opisuje mikroiniekcję i elektroporację jąder myszy in vivo jako technikę transfekcji komórek jąder myszy w celu zbadania unikalnych procesów spermatogenezy. Prezentowany protokół obejmuje etapy przygotowania kapilar szklanych, mikroiniekcji przez przewód odprowadzający oraz transfekcji za pomocą elektroporacji.

In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Dwie metody są tutaj przedstawione do określenia funkcji bariery jelitowej. Miernik nabłonka (wolt/om) służy do pomiarów transnabłonkowej rezystancji elektrycznej nabłonka hodowanego bezpośrednio w studzienkach do hodowli tkankowych. U myszy metodę zgłębnika FITC-dekstranu stosuje się do określenia przepuszczalności jelit in vivo.

Metody in vitro i in vivo w celu określenia przepuszczalności komórek nabłonka jelitowego

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Tutaj prezentujemy protokół eCLIP do określania głównych celów RNA kandydatów na RBP w jądrach.

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Korzystając z mikroskopii przyżyciowej, przedstawiona tutaj metoda umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym wydalania komórek nabłonka jelitowego u żywych zwierząt. W związku z tym miejscowo wybarwiona błona śluzowa jelit (akryflawina i rodamina B-dekstran) znieczulonych myszy jest obrazowana do rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej do oceny przepuszczalności jelit i wydajności wydalania komórek nabłonkowych

Ten protokół opisuje wspomaganą transiluminacją mikrodysekcję segmentów kanalików nasiennych dorosłych myszy reprezentujących określone etapy cyklu nabłonkowego nasienia i typy komórek w nim, a następnie barwienie immunologiczne preparatów dyni i nienaruszonych segmentów kanalików.

Wspomagana transiluminacją dyssekcja określonych etapów cyklu nabłonka nasiennego myszy w celu dalszych analiz immunobarwiących

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

W obecnym protokole, funkcja bariery śródbłonkowej gruczołu podżuchwowego (SMG) została oceniona poprzez wstrzyknięcie różnych molekularnych znaczników fluorescencyjnych do żył kątowych badanych modeli zwierzęcych in vivo pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

W obecnym badaniu, dekstran znakowany fluoresceiną izotiocyjanianem (FITC) jest podawany myszom przez zgłębnik doustny w celu oceny przepuszczalności jelit zarówno in vivo, jak i w próbkach osocza i kału. Ponieważ funkcja bariery jelitowej jest zaburzona w wielu procesach chorobowych, ten bezpośredni i ilościowy test może być stosowany w różnych obszarach badawczych.

Ocena integralności bariery jelitowej u myszy przy użyciu dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny

Poznaj metodę oceny integralności bariery krew-jądro u myszy C57Black/6 przy użyciu inuliny-FITC. Ta technika pozwala badać wpływ czynników genetycznych i środowiskowych na płodność męską.

Metoda in vivo do badania integralności bariery krew-jądro myszy

Przeglądaj więcej filmów