Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób biomateriały wpływają na podatność na infekcje, jak wpływają na postęp takich infekcji i jak wpływają na zachowanie komórek odpornościowych wokół takich biomateriałów in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona nowatorski model zwierzęcy, który umożliwia wizualizację in vivo i analizę przyżyciową zakażeń związanych z biomateriałem. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wstrzykiwanie mikrosfer biomateriału jest bardzo delikatną procedurą.

Aby wytworzyć zawiesinę zawierającą tylko bakterie, najpierw przenieś cztery do pięciu kolonii fluorescencyjnego szczepu Staph aureus mCherry, hodowanego na tryptycznych płytkach do uprawy soi uzupełnionych 10 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu do 10 mililitrów tryptycznego bulionu sojowego uzupełnionego chloramfenikolem, do wzrostu w środkowej fazie wzrostu w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Gdy kultura osiągnie pomiar gęstości optycznej przy 620 nanometrach od 0,4 do 0,8, zbierz bakterie przez odwirowanie i umyj komórki dwa razy jednym mililitrem sterylnego PBS na pranie. Po drugim praniu ponownie zawieś granulkę w 1,1 mililitra PVP i odwiruj zawiesinę bakteryjną przed ponownym pomiarem gęstości optycznej.

Następnie dostosuj stężenie zawiesiny bakteryjnej za pomocą PVP zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi, aby wytworzyć zawiesinę tylko dla bakterii. Aby wytworzyć zawiesinę mikrosfery bakteryjnej, należy odwirować komercyjne mikrosfery polistyrenowe PS-10 i ponownie zawiesić osad mikrosfery w zawiesinie zawierającej tylko bakterie. Rozcieńczyć zawiesinę mikrosfery bakteryjnej w 1/2 objętości PVP, aby osiągnąć odpowiednie stężenie bakterii w zawiesinie, które wynosi około 2/3 stężenia w zawiesinie zawierającej tylko bakterie.

Wymieszać zawiesinę przez wirowanie. Aby sprawdzić stężenie zawiesiny mikrosfery zawierającej tylko bakterie i bakterie, dodaj 100 mikrolitrów każdej zawiesiny do poszczególnych studzienek 96-dołkowej płytki. Seryjnie rozcieńczyć 10 mikrolitrów podwielokrotności zawiesin w 90 mikrolitrach sterylnego PBS w kolejnych studzienkach, używając świeżych końcówek dla każdego etapu rozcieńczania.

Nałożyć podwójne 10-mikrolitrowe podwielokrotności nierozcieńczonych i rozcieńczonych zawiesin bakteryjnych na płytki agarowe i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka policz kolonie, aby obliczyć liczbę bakterii w przygotowanych zawiesinach mikrosfer tylko dla bakterii i bakterii. Po zebraniu zarodków danio pręgowanego należy odrzucić wszelkie nieprzezroczyste, niezdolne do życia zarodki i wysiadywać około 60 zarodków na 100-mililitrową szalkę Petriego w temperaturze 28 stopni Celsjusza na świeżym podłożu E3.

Po znieczuleniu należy sekwestrować zarodki GFP-dodatnie do mikroskopii fluorescencyjnej. Przenieś je na 100-mililitrową szalkę Petriego z podłożem E3. Aby stworzyć formę wtryskową, napełnij 100-mililitrową szalkę Petriego jednym do 1,5% płynnej agarozy.

Użyj plastikowego szablonu formy, aby utworzyć rowki w agarozie. Gdy agaroza zastygnie, usuń pleśń i przykryj agar pożywką E3 uzupełnioną 0,02% trikainą. Jednego dnia trzy po zapłodnieniu użyj kleszczy, aby złamać końcówkę wyciągniętej szklanej igły mikrokapilarnej, aby uzyskać końcówki o średnicy zewnętrznej około 20 mikrometrów pod mikroskopem świetlnym z paskiem skali w okularze.

Regulacja otworu końcówki igły jest praktyczna w przypadku wstrzykiwania mikrosfer. Średnicę otworu należy dostosować do mikrosfer o różnych rozmiarach. Następnie za pomocą końcówki pipety Microloader załaduj do igły około 20 mikrolitrów mikrosfery bakteryjnej lub zawiesiny zawierającej tylko bakterie i zamontuj igłę na mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza.

Teraz przenieś wybrane zarodki na rowkowaną płytkę agarozową. Po odczekaniu pięciu minut na znieczulenie zarodków, należy ustawić zarodki w rowkach w jednej orientacji do ich wstrzyknięcia. Ustawić mikrowstrzykiwacz na odpowiednie ustawienia wstrzyknięcia i wprowadzić igłę do tkanki mięśniowej pierwszego zarodka pod kątem 45 do 60 stopni pod mikroskopem stereoskopowym.

Delikatnie przesuwaj igłę do przodu i do tyłu, aby w razie potrzeby dostosować położenie w tkance, a następnie użyj pedału nożnego mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć obciążoną zawiesinę. Podczas wstrzykiwania zawiesiny mikrosfery bakteryjnej do tkanki zarodków danio pręgowanego, igłę należy wprowadzać delikatnie, ale pewną ręką. Po udanym włożeniu, przed wstrzyknięciem należy stworzyć miejsce na materiały.

Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy ocenić zarodki pod kątem udanego wstrzyknięcia pod mikroskopem stereofluorescencyjnym i utrzymywać zarodki w pożywce E3 bez tricainy w indywidualnych dołkach 48-dołkowych płytek z codziennymi zmianami podłoża. Aby monitorować postęp infekcji poprzez kwantyfikację jednostek tworzących kolonie, losowo przenieś pięć do sześciu zdolnych do życia zakażonych zarodków do pojedynczych dwumililitrowych mikroprobówek wkrótce po wstrzyknięciu i delikatnie umyj zarodki sterylnym PBS. Po wyrzuceniu popłuczyn dodaj 100 mikrolitrów sterylnego PBS do każdej probówki, a następnie dwa do trzech sterylnych kulek cyrkonu o średnicy dwóch milimetrów.

Następnie zmiażdżyć zarodki w homogenizatorze z prędkością 3 500 obr./min przez 30 sekund i wyhodować homogenat, jak pokazano. Umieścić 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą pożywkę E3 uzupełnioną 0,02% trikainą na stoliku mikroskopu stereofluorescencyjnego i dodać 500 mikrolitrów 2% metylocelulozy do szalki Petriego. Aby monitorować postęp infekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, należy wyposażyć się w odpowiednie filtry jasnego pola i fluorescencyjne, ustawić znieczulone zakażone zarodki poziomo w miejscu metylocelulozy na szalce Petriego.

Użyj filtra jasnego pola, aby ustawić ostrość uszkodzonej tkanki, którą wstrzyknięto w 160-krotnym powiększeniu. Ustaw głębokość stosu Z na 10 mikrometrów, a rozmiar kroku na pięć mikrometrów, aby umożliwić rejestrację trzech kolejnych obrazów. Następnie zobrazuj poszczególne zarodki w identycznych, zoptymalizowanych ustawieniach w powiększeniu 160x.

Użyj wtyczki ObjectJ w ImageJ, aby przeanalizować obrazy. Domięśniowe wstrzyknięcie gronkowca złocistego inicjuje zależne od dawki zakażenie w zarodkach, z realną progresją infekcji obserwowaną u zarodków, którym podawano wysokie dawki prowokacyjne w pierwszym i drugim dniu po wstrzyknięciu. Jak wykazano, możliwe jest wstrzyknięcie podobnej liczby bakterii w obecności lub bez mikrosfer.

Zazwyczaj wszystkie zarodki z więcej niż 20 jednostkami tworzącymi kolonie Staph aureus mCherry są dodatnie pod względem fluorescencji w ocenie mikroskopowej, chociaż obecność mikrosfer wydaje się nie wpływać znacząco na postęp infekcji w zarodkach prowokowanych niską dawką. W przypadku zarodków prowokowanych wysokimi dawkami ocena mikroskopowa nie wykazuje żadnych różnic w częstości występowania zakażonych zarodków z mikrosferami lub bez, ale hodowla ilościowa ujawnia wyższą liczbę jednostek tworzących kolonie pobranych z zarodków w grupie gronkowca złocistego plus mikrosfery w porównaniu z tymi pobranymi z grupy tylko gronkowca złocistego dwa dni po wstrzyknięciu. Obecność biomateriału wpływa zarówno na odpowiedź immunologiczną komórki, jak i na początkową podatność na zakażenie.

Na przykład po pięciu godzinach od wstrzyknięcia infiltracja makrofagów w odpowiedzi na wstrzyknięcie tylko gronkowca złocistego jest znacznie wyższa niż w odpowiedzi na wstrzyknięcie gronkowca złocistego i mikrosfer, podczas gdy po jednym dniu po wstrzyknięciu zarodki z mikrosferami wykazują znacznie wyższy poziom zakażenia gronkowcem złocistym niż zarodki bez mikrosfer. Ważne jest, aby pamiętać, aby zawsze dostosować rozwarcie końcówki igły do wielkości biomateriałów oraz dostosować stosunek stężenia bakterii w zawiesinie tylko bakterii do zawiesiny mikrosfery bakterii. Ten model zarodka danio pręgowanego umożliwia wizualizację in vivo i analizę przyżyciową postępu infekcji i sprowokowanych odpowiedzi komórek odpornościowych w obecności i bez obecności biomateriałów.

Technika ta zapewnia nowy model obejmujący całe zwierzęta do opracowywania biomateriałów przeciwdrobnoustrojowych i strategii leczenia bezpiecznych wyrobów medycznych.