Name: Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo zakażeń związanych z biomateriałem. Ta metoda umożliwia analizę odpowiedzi immunologicznej na Staphylococcus aureus w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane finansowo przez projekt IBIZA programu BioMedical Material (BMM) i współfinansowane przez holenderskie Ministerstwo Spraw Gospodarczych. Autorzy pragną podziękować prof. dr Grahamowi Lieschke z Monash University w Australii za dostarczenie transgenicznej linii danio pręgowanego (mpeg1:Gal4/UAS:Kaede).

W tym protokole, utrzymanie dorosłych ryb zebry jest zgodne z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt, zatwierdzonymi przez lokalny komitet ds. dobrostanu zwierząt. Eksperymenty na zarodkach przeprowadzono zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE.
1. Przygotowanie zawiesin "tylko dla bakterii" i mikrosfer bakterii
UWAGA: Używany jest szczep S. aureus RN4220 wyrażający fluorescencyjne białko mCherry (S. aureus-mCherry). Szczep S. aureus RN4220 jest zmutowany w genie regulatora wirulencji agrA (dodatkowy regulator genu A)34, a zatem może mieć stosunkowo niską zjadliwość w modelu zarodka danio pręgowanego. Można stosować inne szczepy S. aureus lub inne gatunki bakterii do BAI.
<ol>
	<li>Pobrać od 4 do 5 kolonii bakterii S. aureus RN4220 z tryptycznych płytek hodowlanych agaru sojowego uzupełnionych 10 μg/ml chloramfenikolu i wyhodować bakterie do środkowej logarytmicznej fazy wzrostu w 10 ml tryptycznego bulionu sojowego uzupełnionego 10 μg/ml chloramfenikolu w temperaturze 37 °C pod wstrząsem.
	<ol>
		<li>Podczas hodowli rozcieńczyć 100 μl zawiesiny bakteryjnej w 900 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w kuwecie (o szerokości 1 cm) w celu pomiaru gęstości optycznej (OD) przy 620 nm (OD620). Hoduj bakterie, aż OD620 osiągnie 0,4–0,8, 
		UWAGA: OD620 0,1 na ogół odpowiada 3,0 x 107 jtk/ml S. aureus. OD620 inokulum bakterii w środkowej logarytmicznej fazie wzrostu wynosi od 0,4 do 0,8. W przypadku innych gatunków i szczepów bakterii mogą być potrzebne różne okresy hodowli.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować bakterie w stężeniu 3 500 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić granulowane bakterie w 1 ml sterylnego PBS. Następnie przemyj bakterie sterylnym PBS 2 razy, a na koniec ponownie zawiesij bakterie w 1,1 ml 4% (w/v) roztworu poliwinylopirolidonu40 (PVP40) w PBS.</li>
	<li>Zwirować tę zawiesinę bakteryjną i rozcieńczyć 100 μl zawiesiny w 900 μl sterylnego PBS w kuwecie do pomiaru OD620. Dostosuj stężenie zawiesiny bakteryjnej za pomocą roztworu PVP40. Jest to zawiesina "Tylko bakterie".</li>
	<li>Biomateriały można dowolnie dobierać do mieszania z zawiesiną bakteryjną. W niniejszej pracy wykorzystano komercyjne mikrosfery polistyrenowe (PS) (niebieska fluorescencja, 10 μm). Aby wytworzyć zawiesinę mikrosfer bakterii, należy odwirować mikrosfery przez 1 minutę w temperaturze 1,000 x g w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić mikrosfery w zawiesinie "tylko bakterie" (w roztworze PVP40).</li>
	<li>Aby wstrzyknąć w przybliżeniu równe dawki bakterii w obecności i bez mikrosfer, stężenie zawiesiny bakterii-mikrosfer musi wynosić dwie trzecie stężenia zawiesiny "tylko bakterie" (bez mikrosfer). Osiąga się to poprzez rozcieńczenie zawiesiny bakterii-mikrosfer 0,5 objętości roztworu PVP40. Wymieszaj zawiesiny przez wirowanie. Warto zauważyć, że stosunek ten (dwie trzecie) został oceniony dla S. aureus. Jest on również odpowiedni dla S. epidermidis, ale zaleca się sprawdzenie, czy stosunek ten dotyczy również innych gatunków bakterii i innych rozmiarów (niż 10 μm) lub kształtów biomateriałów (niż mikrosfery), które mają być wstrzykiwane.</li>
	<li>Sprawdzić stężenie zawiesiny "tylko bakterie" i mikrosfery bakterii poprzez ilościową hodowlę 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych, jak poniżej: przenieść 100 μl zawiesin na płytkę 96-dołkową i seryjnie rozcieńczyć, przenosząc 10 μl podwielokrotności zawiesiny do 90 μl sterylnego PBS. Na płytkach agarozowych powielić 10 μl podwielokrotności nierozcieńczonych i rozcieńczonych zawiesin, inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc, policzyć kolonie i obliczyć liczbę bakterii (jednostek tworzących kolonie. CFU).</li>
</ol>
2. Hodowla, zbiór i utrzymanie zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z ogólnymi procedurami opisanymi wcześniej35,36 dla hodowli, zbioru i utrzymania zarodków danio pręgowanego, z modyfikacjami opisanymi poniżej. Skrzyżuj rodzinę dzikich typów zebry Tupfel długopłetwy (TL) lub danio pręgowanego wybranej linii transgenicznej (tutaj, Mpeg1: Kaede) w zbiorniku z dodaną siatką, aby skłonić dorosłe samice do produkcji jaj po włączeniu światła, a następnie oddzielić dorosłe osobniki od wyprodukowanych jaj.</li>
	<li>Zbierz zarodki następnego dnia i wyrzuć te nieprzezroczyste, które nie są zdolne do życia. Przechowywać około 60 zarodków na szalce Petriego (o średnicy 100 mm) w pożywce E337 i inkubować w temperaturze 28 °C. Usunąć martwe i nieprawidłowe zarodki i codziennie odświeżać pożywkę E3.</li>
</ol>
3. Przygotowanie igieł iniekcyjnych
<ol>
	<li>Przygotować szklane igły mikrokapilarne do wstrzykiwań za pomocą ściągacza do mikropipet. Użyj następujących ustawień: ciepło: 772, uciąg: 100, vel: 200, czas: 40, gaz: 75.</li>
	<li>Przełamać końcówkę igły kleszczami w miejscu, w którym igła ma średnicę zewnętrzną około 20 μm (dla mikrosfer 10 μm), używając mikroskopu świetlnego ze skalą w okularze. Należy unikać igieł o bardzo dużym rozmiarze otworu, ponieważ zagrażają one przetrwaniu zarodków. 
	UWAGA: Otwór może być mniejszy lub większy, w zależności od wielkości i kształtu biomateriałów, które mają być wstrzykiwane. W literaturze donoszono, że wstrzyknięcia przy użyciu igieł o otworze około 50 μm powodują znaczne zmniejszenie przeżywalności zarodków38.</li>
</ol>
4. Wstrzykiwanie zawiesiny "tylko bakterii" lub mikrosfer bakteryjnych do zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Podgrzej roztwór agarozy (1–1,5% (wag.) w demi-wodzie) za pomocą kuchenki mikrofalowej i wlej do 100-milimetrowej szalki Petriego. Umieść plastikowy szablon formy na roztworze agarozy na szalce Petriego, aby utworzyć wgłębienia w agarozie w celu umieszczenia zarodków we właściwych pozycjach, ułatwiając wstrzyknięcia. Inkubować w temperaturze pokojowej i usunąć pleśń, gdy roztwór agarozy zastygnie.</li>
	<li>W 3 dni po zapłodnieniu umieść zarodki na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 0,02% (w/v) kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina) w celu ich znieczulenia. Po 5 minutach przenieść zarodki na płytkę agarozową pokrytą pożywką E3 zawierającą 0,02% (w/v) trikainy i ustawić je w jednej orientacji do wstrzyknięcia. W przypadku Mpeg1: linia transgeniczna Kaede najpierw znieczula zarodki w pożywce E3 zawierającej 0,02% (w/v) trikainy. Następnie wybierz zarodki wykazujące ekspresję zielonych białek fluorescencyjnych za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Napełnić igłę około 10 μl zawiesiny "Tylko bakterie" lub "Bakterie-mikrosfery" za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki. Zamontuj igłę na mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza. Dla zastosowanego tutaj wtryskiwacza (patrz Tabela materiałów) należy zastosować następujące ustawienia dla iniekcji 2–3 nL: ciśnienie: 300–350, ciśnienie wsteczne: 0, czas: 2 ms. 
	UWAGA: Ustawienia mikrowtryskiwacza zależą od zastosowanego wtryskiwacza. Może być konieczne dostosowanie ustawień wtryskiwacza do wstrzykiwań bakterii zmieszanych z biomateriałami o innych kształtach lub rozmiarach.
	<ol>
		<li>Do wstrzykiwania zawiesiny "Tylko bakterie" i zawiesiny mikrosfer należy używać igieł z tym samym otworem. Jeśli igła jest złamana lub zatkana, należy zawsze wymienić igłę na nową do dalszych wstrzyknięć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wbić igłę w tkankę mięśniową zarodków pod mikroskopem świetlnym (<silna klasa="xfig">Ryc. 1), pod kątem 45–60° między igłą a ciałem zarodka. Dostosuj położenie igły w tkance, delikatnie przesuwając ją do przodu i do tyłu. Wstrzyknąć zarodki za pomocą pedału nożnego podłączonego do mikrowstrzykiwacza.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu bakterii fluorescencyjnych należy ocenić zarodki pod kątem udanej infekcji pod mikroskopem stereofluorescencyjnym. Wyrzuć zarodki z wynikiem ujemnym (brak widocznych bakterii fluorescencyjnych lub brak widocznych mikrosfer fluorescencyjnych). Utrzymuj zarodki pojedynczo w pożywce E3 na płytkach 48-dołkowych. Odświeżaj podłoże codziennie.</li>
</ol>
5. Zgniatanie zarodków, mikroskopowe ocenianie i ilościowa hodowla bakterii
<ol>
	<li>Oceń wszystkie zarodki pod mikroskopem pod kątem obecności bakterii fluorescencyjnych za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego, zaczynając natychmiast po wstrzyknięciach i każdego kolejnego dnia, aż zarodki zostaną losowo wybrane do hodowli ilościowej.</li>
	<li>Losowo wybierz kilka żywych zakażonych zarodków (od 5 do 6 w niniejszym badaniu) wkrótce po wstrzyknięciu i przenieś je pojedynczo do oddzielnych mikroprobówek o pojemności 2 ml za pomocą sterylnych końcówek. Usunąć pożywkę, delikatnie umyć zarodki sterylnym PBS i dodać 100 μl sterylnego PBS.</li>
	<li>Dodać 2-3 sterylne kulki cyrkonu (o średnicy 2 mm) do każdej fiolki i rozdrobnić zarodki za pomocą homogenizatora (patrz tabela materiałów) z prędkością 3 500 obr./min przez 30 s. Hodować homogenat ilościowo, jak opisano w kroku 1.3. 
	UWAGA: Inne homogenizatory mogą wymagać innych ustawień.</li>
	<li>Losowo wybierz wiele zarodków w kolejnych dniach po wstrzyknięciu do hodowli ilościowej zgodnie z krokiem 5.3.</li>
</ol>
6. Mikroskopia fluorescencyjna progresji infekcji i sprowokowanej infiltracji komórek w zarodkach danio pręgowanego
<ol>
	<li>Znieczulić zarodki zgodnie z opisem w kroku 4.2. Pobrać pipetą 500 μl roztworu metylocelulozy PBS-2% (mt) na szalkę Petriego zawierającą pożywkę E3 z 0,02% (m/v) trikainą. Umieść zarodki w roztworze metylocelulozy i utrzymuj je prosto i poziomo. 
	UWAGA: Roztwór metylocelulozy jest stosowany jako "klej", który ze względu na swoją lepkość może tymczasowo unieruchomić zarodki w najlepszej orientacji do obrazowania.</li>
	<li>Użyj stereomikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w jasne pole, mCherry, zielone białko fluorescencyjne (GFP) i filtry UV, aby zobrazować poszczególne zarodki przy identycznych zoptymalizowanych ustawieniach (np. intensywności, wzmocnieniu i czasie ekspozycji) przy 160-krotnym powiększeniu. Ustaw płaszczyznę ogniskowej w taki sposób, aby uszkodzenie tkanki spowodowane wstrzyknięciem było ostre, używając filtra jasnego pola. Ustaw głębokość stosu Z na 10 μm i rozmiar kroku na 5 μm, co pozwala na nagrywanie 3 kolejnych obrazów.</li>
	<li>Obrazuj poszczególne zarodki raz dziennie od 5 godzin po wstrzyknięciu do 2 dni po wstrzyknięciu. Wykluczyć martwe zarodki (bez bicia serca lub zarodek częściowo zdegradowany) do dalszego obrazowania i analizy. Utrzymuj zarodki pojedynczo w pożywce E3 na płytkach 48-dołkowych. Odświeżaj podłoże codziennie.</li>
</ol>
7. Analiza ilościowa intensywności fluorescencji progresji infekcji i sprowokowanej infiltracji komórek przy użyciu pliku projektu obiektu J "Danio pręgowany-immunotest"
<ol>
	<li>Pobierz "Zebrafish-Immunotest" i szczegółową instrukcję z linku: <https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, zgodnie z opisem w poprzednim badaniu33. Krótko mówiąc, otwórz obrazy do analizy za pomocą "Zebrafish-Immunotest", działającego w ramach darmowego programu Image J. Na każdym załadowanym obrazie należy ręcznie oznaczyć miejsce wstrzyknięcia na podstawie zaobserwowanych uszkodzeń tkanek zarodków. 
	UWAGA: Oznaczone miejsce jest używane przez "Zebrafish-Immunotest" jako centralny punkt do wykrywania piku fluorescencji w odległości 50 μm. Wykryty pik fluorescencji jest następnie wykorzystywany jako środek znormalizowanego obszaru (średnica 100 μm) do pomiaru fluorescencji.</li>
	<li>Kliknij "obliczenia" w menu Obiekt J, aby uruchomić pomiar fluorescencyjny dla wielu kanałów, jeśli ma to zastosowanie, automatycznie dla wszystkich obrazów. Eksportuj dane i analizuj je za pomocą odpowiednich metod testów statystycznych.</li>
</ol>

<ol><li>Williams, D. F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961209007261">On the nature of biomaterials.</a> Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).</li>
<li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-Associated+Infection%3A+Locating+the+Finish+Line+in+the+Race+for+the+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface.</a> Science Translational Medicine. 4, 153rv10(2012).</li>
<li>Otto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+epidermidis+-+the+%27accidental%27+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).</li>
<li>Moriarty, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopaedic+device-related+infection%3A+current+and+future+interventions+for+improved+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22EFORT+Open+Reviews%22%5BJournal%5D)">Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment.</a> EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).</li>
<li>Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+infection+related+to+orthopedic+devices+and+issues+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance.</a> Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).</li>
<li>Schierholz, J. M., Beuth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+infections%3A+a+haven+for+opportunistic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Implant infections: a haven for opportunistic bacteria.</a> Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).</li>
<li>Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+foreign+body+infection.+Evidence+for+a+local+granulocyte+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect.</a> Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).</li>
<li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jid/article-abstract/181/4/1337/856408">Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).</li>
<li>Broekhuizen, C. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).</li>
<li>Riool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+epidermidis+originating+from+titanium+implants+infects+surrounding+tissue+and+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterial%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells.</a> Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).</li>
<li>Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+tissue+as+a+niche+for+biomaterial-associated+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection.</a> Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).</li>
<li>Broekhuizen, C. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+epidermidis+is+cleared+from+biomaterial+implants+but+persists+in+peri-implant+tissue+in+mice+despite+rifampicin%2Fvancomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).</li>
<li>Broekhuizen, C. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peri-implant+tissue+is+an+important+niche+for+Staphylococcus+epidermidis+in+experimental+biomaterial-associated+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice.</a> Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).</li>
<li>Zimmerli, W., Sendi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+implant-associated+infection%3A+the+role+of+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host.</a> Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).</li>
<li>Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra035415">Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants.</a> New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).</li>
<li>Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+biomedical+device+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing.</a> Frontiers in Chemistry. 5, 63(2017).</li>
<li>Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrooks%2C+BD+%22Biomaterials+Associated+Infection%22">Biomaterials Associated Infection</a>. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).</li>
<li>Sjollema, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+bio-optical+imaging+of+biomaterial-associated+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo.</a> Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).</li>
<li>Suri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+of+biomaterial-associated+inflammation+and+infection+in+a+minimally+invasive+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).</li>
<li>Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+characterization+of+immune+responses+to+biomedical+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants.</a> Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).</li>
<li>van Oosten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+invasive-+and+biomaterial-associated+bacterial+infections+using+fluorescently+labelled+vancomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin.</a> Nature Communications. 4, 2584(2013).</li>
<li>Lesley, R., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+early+mycobacterial+pathogenesis+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish.</a> Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).</li>
<li>Brannon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+Type+III+secretion+system+interacts+with+phagocytes+to+modulate+systemic+infection+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos.</a> Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).</li>
<li>Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+zebrafish+to+probe+the+divergent+virulence+potentials+and+toxin+requirements+of+extraintestinal+pathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathogens. 5, e1000697(2009).</li>
<li>Prajsnar, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+novel+vertebrate+model+to+dissect+enterococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).</li>
<li>Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+vertebrate+model+of+Staphylococcus+aureus+infection+reveals+phagocyte-dependent+resistance+of+zebrafish+to+non-host+specialized+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens.</a> Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).</li>
<li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255(2013).</li>
<li>Renshaw, S. A., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+450+million+years+in+the+making%3A+zebrafish+and+vertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+and+Mechanism%22%5BJournal%5D)">A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity.</a> Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).</li>
<li>Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+and+genetic+dissection+of+host-microbe+interactions+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish.</a> Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).</li>
<li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li>
<li>Riool, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chlorhexidine-releasing+epoxy-based+coating+on+titanium+implants+prevents+Staphylococcus+aureus+experimental+biomaterial-associated+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+and+Materials%22%5BJournal%5D)">A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection.</a> European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117, E49-E56 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+embryo+as+a+model+to+quantify+early+inflammatory+cell+responses+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).</li>
<li>Traber, K., Novick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slipped-mispairing+mutation+in+AgrA+of+laboratory+strains+and+clinical+isolates+results+in+delayed+activation+of+agr+and+failure+to+translate+delta-+and+alpha-haemolysins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins.</a> Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. 61, 3781(2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=zS-5CKOjCIgC&oi=fnd&pg=PA5&dq=Brand,+M+%22Keeping+and+raising+zebrafish%22&ots=mrgZq1GQaQ&sig=tYJFJ_JxwClFEr74DfLfm8Rhr8I">Zebrafish, A Practical Approach</a>. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).</li>
<li>Chaplin, W. T. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+a+microinjection+platform+for+the+examination+of+host-biomaterial+interactions+in+zebrafish+embryos%22">Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos</a>. , Queen's University. Master thesis (2017).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.6b00760">Host-biomaterial interactions in zebrafish.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).</li>
<li>Anderson, J. M. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.31.1.81">Biological responses to materials.</a> Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).</li>
<li>Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+biocompatibility+of+implantable+devices%3A+current+challenges+to+overcome+foreign+body+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response.</a> Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).</li>
<li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Screen+for+Tuberculosis+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression.</a> PLoS One. 6, e16779(2011).</li>
<li>Stockhammer, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+Traf6+function+in+the+innate+immune+response+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos.</a> Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3, 59(2007).</li>
<li>Prajsnar, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+privileged+intraphagocyte+niche+is+responsible+for+disseminated+infection+of+Staphylococcus+aureus+in+a+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model.</a> Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zakażenie związane z biomateriałem (BAI) jest poważnym powikłaniem klinicznym. Lepsze zrozumienie patogenezy BAI in vivo dostarczyłoby nowych informacji, które pozwoliłyby na poprawę profilaktyki i leczenia BAI. Jednak obecne eksperymentalne modele zwierzęce BAI, takie jak modele mysie, są kosztowne, pracochłonne i wymagają specjalistycznego personelu przeszkolonego w zakresie złożonych technik chirurgicznych. W związku z tym modele te nie nadają się do analizy o wysokiej przepływności. Ponieważ wymagania dotyczące model...

Różnorodne urządzenia medyczne (określane jako "biomateriały") są coraz częściej używane w nowoczesnej medycynie do przywracania lub zastępowania części ludzkiego ciała1. Jednak wszczepienie biomateriałów predysponuje pacjenta do infekcji, zwanej infekcją związaną z biomateriałem (BAI), która jest głównym powikłaniem implantów w chirurgii. Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis to dwa najbardziej rozpowszechnione gatunki bakterii odpowiedzialne za BAI2,3,4,5,6. Wszczepione biomateriały tworzą powierzchnię podatną na tworzenie się biofilmu bakteryjnego. Co więcej, miejscowa odpowiedź immunologiczna może być zaburzona przez wszczepione biomateriały, powodując zmniejszenie skuteczności klirensu bakteryjnego. Początkowe usuwanie bakterii infekujących odbywa się głównie przez infiltrację neutrofili, które mają znacznie zmniejszoną zdolność bakteriobójczą w obecności wprowadzonego lub wszczepionego biomateriału7. Co więcej, makrofagi infiltrujące tkankę po początkowym napływie neutrofili będą fagocytozować pozostałe bakterie, ale nie mogą ich skutecznie zabić wewnątrzkomórkowo, z powodu zaburzonej sygnalizacji immunologicznej, która jest konsekwencją połączonej obecności biomateriału i bakterii8. Tak więc obecność biomateriałów może ułatwić wewnątrzkomórkowe przetrwanie bakterii9,10,11,12,13 i tworzenie biofilmu na wszczepionych biomateriałach4,14. W związku z tym BAI może prowadzić do niepowodzenia i konieczności wymiany wszczepionych biomateriałów, powodując zwiększoną zachorowalność i śmiertelność oraz przedłużoną hospitalizację z dodatkowymi kosztami2,15.
Rozwijana jest coraz większa liczba strategii anty-BAI2,16,17. Niezbędna jest ocena in vivo skuteczności tych strategii w odpowiednich modelach zwierzęcych. Jednak tradycyjne eksperymentalne modele zwierzęce BAI (np. modele mysie) są zwykle kosztowne, czasochłonne, a zatem nie nadają się do wysokoprzepustowych testów wielu strategii18. Niedawny rozwój technik obrazowania biooptycznego opartych na znakowaniu bioluminescencyjnym/fluorescencyjnym komórek gospodarza i bakterii może pozwolić na ciągłe monitorowanie progresji BAI i interakcji gospodarz-patogen/gospodarz-materiał u pojedynczych małych zwierząt, takich jak myszy18,19,20,21. Jednak ta technika jest stosunkowo złożona i wciąż w powijakach, a kilka kwestii musi zostać poruszonych w celu analizy ilościowej BAI18. Na przykład do wizualizacji kolonizacji bakteryjnej wymagana jest wysoka dawka prowokacyjna. Ponadto należy również zająć się rozpraszaniem światła i adsorpcją sygnałów bioluminescencyjnych/fluorescencyjnych w tkankach badanych ssaków18,19,21. W związku z tym nowatorskie, opłacalne modele zwierzęce, pozwalające na wizualizację przyżytkową i analizę ilościową w czasie, są cennymi systemami uzupełniającymi do badania BAI in vivo.
Danio pręgowany (zarodki) były używane jako wszechstronne narzędzie in vivo do analizowania interakcji gospodarz-patogen i patogenezy infekcji kilku gatunków bakterii, takich jak mycobacteria22, Pseudomonas aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25, oraz gronkowce26,27. Zarodki danio pręgowanego mają wiele zalet, takich jak przezroczystość optyczna, stosunkowo niskie koszty utrzymania i posiadanie układu odpornościowego bardzo podobnego do tego u ssaków28,29. To sprawia, że zarodki danio pręgowanego są wysoce ekonomicznym, żywym organizmem modelowym do przyżyciowej wizualizacji i analizy postępu infekcji i związanych z nią reakcji gospodarza28,29. Aby umożliwić wizualizację zachowania komórek in vivo, opracowano transgeniczne linie danio pręgowanego z różnymi typami komórek odpornościowych (np. makrofagami i neutrofilami), a nawet z fluorescencyjnie znakowanymi strukturami subkomórkowymi28,29. Ponadto wysoki współczynnik reprodukcji danio pręgowanego daje możliwość opracowania wysokowydajnych systemów testowych z automatycznym wstrzykiwaniem robotów, zautomatyzowaną kwantyfikacją fluorescencji i analizą sekwencji RNA27,30.
W obecnym badaniu naszym celem było opracowanie modelu zarodka danio pręgowanego dla infekcji związanej z biomateriałem przy użyciu technik obrazowania fluorescencyjnego. W tym celu opracowaliśmy procedurę wstrzykiwania bakterii (S. aureus) w obecności mikrosfer biomateriałowych do tkanki mięśniowej zarodków danio pręgowanego. Użyliśmy S. aureus RN4220 eksprymującego białko fluorescencyjne mCherry (S. aureus-mCherry), które zostało skonstruowane zgodnie z opisem w innym miejscu dla innego szczepu S. aureus 10,31. Zastosowano transgeniczną linię zebrygowanego (mpeg1: UAS/Kaede) wykazującą ekspresję białka zielonej fluorescencji Kaede w makrofagach32 oraz niebieskie fluorescencyjne mikrosfery polistyrenowe. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że domięśniowe wstrzyknięcie mikrosfer do zarodków danio pręgowanego w celu naśladowania implantacji biomateriału jest wykonalne33. Aby ilościowo przeanalizować postęp BAI i związaną z nim infiltrację komórek w pojedynczych zarodkach w czasie, użyliśmy pliku projektu "Zebrafish-Immunotest", który jest obsługiwany w "ObjectJ" (wtyczka do ImageJ) w celu ilościowego określenia intensywności fluorescencji bakterii przebywających i makrofagów infiltrujących w pobliżu miejsca wstrzyknięcia mikrosfer33. Ponadto określiliśmy liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) bakterii w obecności i braku mikrosfer w zarodkach, aby zbadać potencjalny wpływ biomateriałów na infekcję. Nasze obecne badania pokazują, że dzięki opracowanym tu metodom, zarodek danio pręgowanego jest obiecującym, nowym modelem zwierzęcym kręgowców do badania infekcji związanych z biomateriałem in vivo.

<table><tbody><tr><td>Agar sojowy tryptyczny</td><td>BD Difco</td><td>236950</td><td>Jednostka przygotowania pożywki w AMC</td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>BD Difco 211825</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon40</td><td>Applichem</td><td>A2259.0250</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Mikrosfery polistyrenowe o średnicy m (niebieska fluorescencja)</td><td>Technologia życia/ThemoFisher</td><td>F8829</td><td></td></tr><tr><td>Szklana mikrokapilarka (1 mm średnicy zewnętrznej x 0,78 mm średnicy)</td><td>Aparat Harvarda</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td>Flaming p-97</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny LM 20</td><td>Leica</td><td>MDG33 10450123</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3-aminobenzoesowy (Trikaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza MP</td><td>Roche</td><td>11388991001</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny LM80</td><td>Końcówki</td> do pipet Leica <td>MDG3610450126</td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator M3301 ze stojakiem M10</td><td>World Precision Instruments</td><td>00-42-101-0000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz FemtoJet express</td><td>Eppendorf</td><td>5248ZO100329</td><td></td></tr><tr><td>Microtrube 2 mL pp</td><td>Sarstedt</td><td>72.693.005</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki cyrkonowe</td><td>Bio-connect</td><td>11079124ZX</td><td></td></tr><tr><td>MagNA lyser</td><td>Roche</td><td>41416401</td><td></td></tr><tr><td>MSA-2 płytki (Mannitol Salt Agar-2)</td><td>Biomerieux</td><td>43671</td><td>Chapmon 2 medium</td></tr><tr><td>Metyloceluloza 4000cp</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MO512-250G</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka żyroskopowa (do rozwoju bakterii)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G10</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator ryb pręgowanych</td><td>Kuwety VWR</td><td>Incu-line</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td> marki 759015 <td></td><td></td> Spektrometr Hettich-Zentrifugen ROTANTA 460R <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Pharmacia biotech Ultrospec&reg;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> 2000</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521-1EA</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki</td><td>Greiner bio-one</td><td>677180</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe Szalka</td><td>Petriego Greiner bio-one</td><td>655161</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Sokół</td><td>353003</td><td></td></tr> Szalka <tr><td>Petriego</td><td>Biomerieux</td><td>NL-132</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy Nie dotyczy</td><td>link: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>GraphPad 7.0</td><td>Prism</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Infekcja związana z biomateriałem (BAI) jest główną przyczyną awarii biomateriałów/urządzeń medycznych. Staphylococcus aureus jest jednym z głównych patogenów BAI. Obecne eksperymentalne modele zwierzęce ssaków BAI, takie jak modele mysie, są kosztowne i czasochłonne, a zatem nie nadają się do analizy o wysokiej przepustowości. W związku z tym pożądane są nowe modele zwierzęce jako systemy uzupełniające do badania BAI in vivo. W niniejszej pracy naszym celem było opracowanie modelu zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji bakteryjnej w obecności biomateriałów w oparciu o mikroskopię fluorescencyjną. Ponadto badano sprowokowaną odpowiedź makrofagów. W tym celu wykorzystaliśmy fluorescencyjne zarodki S. aureus z ekspresją białek fluorescencyjnych oraz transgeniczne zarodki danio pręgowanego wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w swoich makrofagach i opracowaliśmy procedurę wstrzykiwania bakterii samodzielnie lub razem z mikrosferami do tkanki mięśniowej zarodków. Aby monitorować postęp infekcji bakteryjnej w żywych zarodkach w czasie, opracowaliśmy prostą, ale niezawodną metodę mikroskopowej oceny bakterii fluorescencyjnych. Wyniki oceny mikroskopowej wykazały, że wszystkie zarodki z więcej niż 20 jednostkami tworzącymi kolonie (CFU) bakterii dawały dodatni sygnał fluorescencyjny bakterii. Aby zbadać potencjalny wpływ biomateriałów na zakażenie, określiliśmy liczbę CFU S. aureus z mikrosferami polistyrenu 10 μm (PS10) i bez nich jako modelowymi biomateriałami w zarodkach. Ponadto wykorzystaliśmy plik projektu ObjectJ "Zebrafish-Immunotest" działający w ImageJ do ilościowego określenia intensywności fluorescencji infekcji S. aureus z PS10 i bez niego w czasie. Wyniki obu metod wykazały większą liczbę S. aureus w zakażonych zarodkach z mikrosferami niż w zarodkach bez mikrosfer, co wskazuje na zwiększoną podatność na infekcje w obecności biomateriału. W związku z tym niniejsze badanie pokazuje potencjał modelu zarodka danio pręgowanego do badania BAI za pomocą opracowanych tu metod.

Niniejsze badanie oceniło przydatność zarodków zebrafish jako nowego kręgowca modelowego do badania infekcji związanych z biomateriałem. Technika mikroiniekcji jest powszechnie stosowana do wprowadzania różnych gatunków bakterii do zarodków zebrafish w celu wywołania infekcji22,26,27,30,36. Stosując procedurę przedstawioną na <...

Niniejsze badanie opisuje model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej infekcji związanej z biomateriałem w czasie na podstawie mikroskopii fluorescencyjnej. Model ten jest obiecującym systemem uzupełniającym modele zwierzęce ssaków, takie jak modele mysie, do badania zakażeń związanych z biomateriałem in vivo.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób biomateriały wpływają na podatność na infekcje, jak wpływają na postęp takich infekcji i jak wpływają na zachowanie komórek odpornościowych wokół takich biomateriałów in vivo. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona nowatorski model zwierzęcy, który umożliwia wizualizację in vivo i analizę przyżyciową zakażeń związanych z biomateriałem. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wstrzykiwanie mikrosfer biomateriału jest bardzo delikatną procedurą.Aby wytworzyć zawiesinę zawierającą tylko bakterie, najpierw przenieś cztery do pięciu kolonii fluorescencyjnego szczepu Staph aureus mCherry, hodowanego na tryptycznych płytkach do uprawy soi uzupełnionych 10 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu do 10 mililitrów tryptycznego bulionu sojowego uzupełnionego chloramfenikolem, do wzrostu w środkowej fazie wzrostu w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem. Gdy kultura osiągnie pomiar gęstości optycznej przy 620 nanometrach od 0,4 do 0,8, zbierz bakterie przez odwirowanie i umyj komórki dwa razy jednym mililitrem sterylnego PBS na pranie. Po drugim praniu ponownie zawieś granulkę w 1,1 mililitra PVP i odwiruj zawiesinę bakteryjną przed ponownym pomiarem gęstości optycznej.Następnie dostosuj stężenie zawiesiny bakteryjnej za pomocą PVP zgodnie z wymaganiami eksperymentalnymi, aby wytworzyć zawiesinę tylko dla bakterii. Aby wytworzyć zawiesinę mikrosfery bakteryjnej, należy odwirować komercyjne mikrosfery polistyrenowe PS-10 i ponownie zawiesić osad mikrosfery w zawiesinie zawierającej tylko bakterie. Rozcieńczyć zawiesinę mikrosfery bakteryjnej w 1/2 objętości PVP, aby osiągnąć odpowiednie stężenie bakterii w zawiesinie, które wynosi około 2/3 stężenia w zawiesinie zawierającej tylko bakterie.Wymieszać zawiesinę przez wirowanie. Aby sprawdzić stężenie zawiesiny mikrosfery zawierającej tylko bakterie i bakterie, dodaj 100 mikrolitrów każdej zawiesiny do poszczególnych studzienek 96-dołkowej płytki. Seryjnie rozcieńczyć 10 mikrolitrów podwielokrotności zawiesin w 90 mikrolitrach sterylnego PBS w kolejnych studzienkach, używając świeżych końcówek dla każdego etapu rozcieńczania.Nałożyć podwójne 10-mikrolitrowe podwielokrotności nierozcieńczonych i rozcieńczonych zawiesin bakteryjnych na płytki agarowe i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka policz kolonie, aby obliczyć liczbę bakterii w przygotowanych zawiesinach mikrosfer tylko dla bakterii i bakterii. Po zebraniu zarodków danio pręgowanego należy odrzucić wszelkie nieprzezroczyste, niezdolne do życia zarodki i wysiadywać około 60 zarodków na 100-mililitrową szalkę Petriego w temperaturze 28 stopni Celsjusza na świeżym podłożu E3.Po znieczuleniu należy sekwestrować zarodki GFP-dodatnie do mikroskopii fluorescencyjnej. Przenieś je na 100-mililitrową szalkę Petriego z podłożem E3. Aby stworzyć formę wtryskową, napełnij 100-mililitrową szalkę Petriego jednym do 1,5% płynnej agarozy.Użyj plastikowego szablonu formy, aby utworzyć rowki w agarozie. Gdy agaroza zastygnie, usuń pleśń i przykryj agar pożywką E3 uzupełnioną 0,02% trikainą. Jednego dnia trzy po zapłodnieniu użyj kleszczy, aby złamać końcówkę wyciągniętej szklanej igły mikrokapilarnej, aby uzyskać końcówki o średnicy zewnętrznej około 20 mikrometrów pod mikroskopem świetlnym z paskiem skali w okularze.Regulacja otworu końcówki igły jest praktyczna w przypadku wstrzykiwania mikrosfer. Średnicę otworu należy dostosować do mikrosfer o różnych rozmiarach. Następnie za pomocą końcówki pipety Microloader załaduj do igły około 20 mikrolitrów mikrosfery bakteryjnej lub zawiesiny zawierającej tylko bakterie i zamontuj igłę na mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza.Teraz przenieś wybrane zarodki na rowkowaną płytkę agarozową. Po odczekaniu pięciu minut na znieczulenie zarodków, należy ustawić zarodki w rowkach w jednej orientacji do ich wstrzyknięcia. Ustawić mikrowstrzykiwacz na odpowiednie ustawienia wstrzyknięcia i wprowadzić igłę do tkanki mięśniowej pierwszego zarodka pod kątem 45 do 60 stopni pod mikroskopem stereoskopowym.Delikatnie przesuwaj igłę do przodu i do tyłu, aby w razie potrzeby dostosować położenie w tkance, a następnie użyj pedału nożnego mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć obciążoną zawiesinę. Podczas wstrzykiwania zawiesiny mikrosfery bakteryjnej do tkanki zarodków danio pręgowanego, igłę należy wprowadzać delikatnie, ale pewną ręką. Po udanym włożeniu, przed wstrzyknięciem należy stworzyć miejsce na materiały.Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy ocenić zarodki pod kątem udanego wstrzyknięcia pod mikroskopem stereofluorescencyjnym i utrzymywać zarodki w pożywce E3 bez tricainy w indywidualnych dołkach 48-dołkowych płytek z codziennymi zmianami podłoża. Aby monitorować postęp infekcji poprzez kwantyfikację jednostek tworzących kolonie, losowo przenieś pięć do sześciu zdolnych do życia zakażonych zarodków do pojedynczych dwumililitrowych mikroprobówek wkrótce po wstrzyknięciu i delikatnie umyj zarodki sterylnym PBS. Po wyrzuceniu popłuczyn dodaj 100 mikrolitrów sterylnego PBS do każdej probówki, a następnie dwa do trzech sterylnych kulek cyrkonu o średnicy dwóch milimetrów.Następnie zmiażdżyć zarodki w homogenizatorze z prędkością 3 500 obr./min przez 30 sekund i wyhodować homogenat, jak pokazano. Umieścić 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą pożywkę E3 uzupełnioną 0,02% trikainą na stoliku mikroskopu stereofluorescencyjnego i dodać 500 mikrolitrów 2% metylocelulozy do szalki Petriego. Aby monitorować postęp infekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, należy wyposażyć się w odpowiednie filtry jasnego pola i fluorescencyjne, ustawić znieczulone zakażone zarodki poziomo w miejscu metylocelulozy na szalce Petriego.Użyj filtra jasnego pola, aby ustawić ostrość uszkodzonej tkanki, którą wstrzyknięto w 160-krotnym powiększeniu. Ustaw głębokość stosu Z na 10 mikrometrów, a rozmiar kroku na pięć mikrometrów, aby umożliwić rejestrację trzech kolejnych obrazów. Następnie zobrazuj poszczególne zarodki w identycznych, zoptymalizowanych ustawieniach w powiększeniu 160x.Użyj wtyczki ObjectJ w ImageJ, aby przeanalizować obrazy. Domięśniowe wstrzyknięcie gronkowca złocistego inicjuje zależne od dawki zakażenie w zarodkach, z realną progresją infekcji obserwowaną u zarodków, którym podawano wysokie dawki prowokacyjne w pierwszym i drugim dniu po wstrzyknięciu. Jak wykazano, możliwe jest wstrzyknięcie podobnej liczby bakterii w obecności lub bez mikrosfer.Zazwyczaj wszystkie zarodki z więcej niż 20 jednostkami tworzącymi kolonie Staph aureus mCherry są dodatnie pod względem fluorescencji w ocenie mikroskopowej, chociaż obecność mikrosfer wydaje się nie wpływać znacząco na postęp infekcji w zarodkach prowokowanych niską dawką. W przypadku zarodków prowokowanych wysokimi dawkami ocena mikroskopowa nie wykazuje żadnych różnic w częstości występowania zakażonych zarodków z mikrosferami lub bez, ale hodowla ilościowa ujawnia wyższą liczbę jednostek tworzących kolonie pobranych z zarodków w grupie gronkowca złocistego plus mikrosfery w porównaniu z tymi pobranymi z grupy tylko gronkowca złocistego dwa dni po wstrzyknięciu. Obecność biomateriału wpływa zarówno na odpowiedź immunologiczną komórki, jak i na początkową podatność na zakażenie.Na przykład po pięciu godzinach od wstrzyknięcia infiltracja makrofagów w odpowiedzi na wstrzyknięcie tylko gronkowca złocistego jest znacznie wyższa niż w odpowiedzi na wstrzyknięcie gronkowca złocistego i mikrosfer, podczas gdy po jednym dniu po wstrzyknięciu zarodki z mikrosferami wykazują znacznie wyższy poziom zakażenia gronkowcem złocistym niż zarodki bez mikrosfer. Ważne jest, aby pamiętać, aby zawsze dostosować rozwarcie końcówki igły do wielkości biomateriałów oraz dostosować stosunek stężenia bakterii w zawiesinie tylko bakterii do zawiesiny mikrosfery bakterii. Ten model zarodka danio pręgowanego umożliwia wizualizację in vivo i analizę przyżyciową postępu infekcji i sprowokowanych odpowiedzi komórek odpornościowych w obecności i bez obecności biomateriałów.Technika ta zapewnia nowy model obejmujący całe zwierzęta do opracowywania biomateriałów przeciwdrobnoustrojowych i strategii leczenia bezpiecznych wyrobów medycznych.

a-zebrafish-embryo-model-for-vivo-visualization-intravital-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przezroczyste zarodki rybek danio-ostrolepisnych okazały się użytecznymi modelami gospodarzy do wizualizacji i funkcjonalnego badania oddziaływań między komórkami odporności wrodzonej a wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi, takimi jak Salmonella typhimurium oraz Mycobacterium marinum. Mikrowstrzykiwanie bakterii oraz wielobarwne obrazowanie fluorescencyjne to kluczowe techniki stosowane w modelach infekcji zarodków rybek danio-ostrolepisnych.

Zakażanie zarodków danio pręgowanego wewnątrzkomórkowymi patogenami bakteryjnymi

Szybki rozwój, niewielki rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego stanowią ogromne zalety w badaniach nad wrodzonym immunologicznym kontrolowaniem infekcji1-4. W niniejszej pracy prezentujemy techniki zakażania larw danio pręgowanego grzybiczym patogenem Candida albicans za pomocą mikroiniekcji – metodologii wykorzystanej niedawno do wykazania roli aktywności NADPH oksydazy fagocytów w kontrolowaniu dimorfizmu grzybów5.

Nieinwazyjne obrazowanie rozsianej kandydozy u larw rybek danio

Źródło: Zhang, X., et al. Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Film przedstawia obrazowanie fluorescencyjne zarodków danio pręgowanego, którym wstrzyknięto Staphylococcus aureus, umożliwiając ilościowe określenie progresji infekcji i rozmieszczenia bakterii w celu oceny wpływu mikrosfer biomateriału na interakcje gospodarz-patogen in vivo.

 Obrazowanie fluorescencyjne infekcji bakteryjnej związanej z biomateriałem w zarodkach danio pręgowanego

Źródło: Zhang, X. i wsp., Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia model zarodka danio pręgowanego do badania infekcji związanych z wszczepionymi biomateriałami. Wstrzykiwanie Staphylococcus aureus mikrosferom polistyrenowym zwiększa przeżywalność bakterii, potwierdzając rolę wszczepionych materiałów w promowaniu infekcji.

Analiza in vivo zakażeń bakteryjnych związanych z implantami przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Źródło: Niu, L. i in. Wizualizacja śmierci limfocytów makrofagów podczas zakażenia mykobakteriami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii śródwitalnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje zastosowanie mikroskopii konfokalnej wewnątrzżyciowej do wizualizacji litycznej śmierci komórek makrofagów u zarodków danio pręgowanego po zakażeniu Mycobacterium marinum .

Obrazowanie na żywo śmierci komórek makrofagów podczas infekcji mykobakterią w zarodkach danio dano pręgowanego

Źródło: Bernut, A. i inni. Rozszyfrowanie i obrazowanie patogenezy oraz układania rdzenia ropnia Mycobacterium absceptus w zarodkach danio dano dano. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje protokół wykorzystujący transgeniczne zarodki danio danio ekspresyjne ekspresujące makrofagi fluorescencyjne i zakażone fluorescencyjnym szczepem Mycobacterium abscessus rough do wizualizacji interakcji żywiciel-patogen. Pokazuje, jak pozakomórkowe przewody umożliwiają unikanie odporności, wspierając...

Obrazowanie na żywo interakcji żywiciel-patogen w zarodkach danio dano zakażonych Mycobacterium abscessus

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

Optycznie przezroczyste embriony danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania i wizualizacji w czasie rzeczywistym interakcji między patogennymi mikroorganizmami a wrodzonymi komórkami odpornościowymi. Mikroiniekcja Mycobacterium abscessus, w połączeniu z obrazowaniem fluorescencyjnym, służy do badania podstawowych cech chorobotwórczych, takich jak tworzenie się pępowiny w zarodkach danio pręgowanego.

Rozszyfrowywanie i obrazowanie patogenezy i sznurowania Mycobacterium abscessus w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje technikę wizualizacji zachowania i śmierci makrofagów u embrionalnego danio pręgowanego podczas infekcji Mycobacterium marinum. Uwzględniono etapy przygotowania bakterii, zakażenia zarodków i mikroskopii przyżyciowej. Technika ta może być stosowana do obserwacji zachowania komórek i śmierci w podobnych scenariuszach obejmujących infekcję lub sterylny stan zapalny.

Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Poznaj model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo zakażeń związanych z biomateriałem. Ta metoda umożliwia analizę odpowiedzi immunologicznej na Staphylococcus aureus w czasie rzeczywistym.

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem (Wideo) | JoVE Journal

Model zarodka danio pręgowanego do wizualizacji in vivo i analizy przyżyciowej zakażenia Staphylococcus aureus związanego z biomateriałem

Przeglądaj więcej filmów