Mechanizmy leżące u podstaw wydzielania hormonów jelitowych przy użyciu izolowanego perfuzji jelita cienkiego szczura

Metoda, którą tutaj opracowaliśmy, okazała się niezwykle przydatna w naszej pracy, próbując poznać molekularne mechanizmy wydzielania hormonów z jelit, ale także wchłaniania składników odżywczych i sprzężenia między nimi. Główną zaletą tej wysoce fizjologicznej techniki jest to, że jelito pozostawia się in situ, co pozwala na szczegółowe badania, które zwykle wykonuje się tylko w modelach in vitro. Najpierw umieść szczura na rozgrzanym stole operacyjnym, potwierdź brak reakcji na szczypanie palca u nogi i wykonaj wycięcie skóry i otrzewnej, aby odsłonić jamę brzuszną.

Przesuń jelito cienkie na bok, aby odsłonić końcowy obszar okrężnicy. I podwiązać naczynia krwionośne doprowadzające do okrężnicy. Stopniowo usuwaj okrężnicę, zaczynając od obszaru końcowego i przesuwając się w kierunku jelita cienkiego, nawadniając tkankę izotonicznym roztworem soli fizjologicznej i używając bawełnianych wacików do usunięcia tkanki łącznej, jeśli to konieczne.

Po usunięciu całej okrężnicy włóż 15-centymetrowy kawałek plastikowej rurki do bliższego końca światła jelita cienkiego i zabezpiecz rurkę szwami. Następnie użyj 10-mililitrowej strzykawki i pompy strzykawkowej, aby ostrożnie przepłukać jelito cienkie izotonicznym roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej o natężeniu przepływu 25 mililitrów na minutę. Gdy tkanka zostanie opróżniona z treści pokarmowej, wyreguluj tkanki tak, aby górna tętnica krezkowa była dostępna i usuń tkankę łączną i tkankę tłuszczową, aby odsłonić tętnicę.

Użyj cienkich kleszczy, aby umieścić dwa szwy pod tętnicą krezkową i dwa szwy pod żyłą wrotną. Napełnij plastikowy cewnik o rozmiarze 22 przymocowany do pompy rolkowej buforem perfuzyjnym i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć mały otwór w tętnicy krezkowej, natychmiast wprowadzając cewnik do nacięcia. Wprowadź cewnik w ciągu dwóch minut od wycięcia w tętnicy, w przeciwnym razie jelito prawdopodobnie ucierpi z powodu uszkodzenia niedokrwiennego.

Jak tylko cewnik zostanie zabezpieczony szwem, uruchom pompę walcową, aby zainicjować perfuzję przy natężeniu przepływu 7,5 mililitra na minutę. Kiedy naczynia krwionośne w jelitach i żyle wrotnej bledną, wytnij otwór w żyle wrotnej. Wprowadzić metalowy cewnik i zabezpieczyć metalowy cewnik innym szwem.

Zachowaj ostrożność podczas wprowadzania cewnika do żyły wrotnej, ponieważ żyła jest cienkościenna. Ponieważ jednak osłona jest obecnie perfektywna, szybkie włożenie nie jest kluczowe. Po zebraniu danych wyjściowych perfuzji przez jedną minutę zmierz objętość i kliknij wykonaj eksperyment w programie do rejestracji ciśnienia, aby rozpocząć zapisy akwizycji ciśnienia perfuzji.

Następnie przykryj jelito zwilżoną tkanką laboratoryjną, aby nie wyschło, i upewnij się, że dystalny koniec jelita nie jest zablokowany i może wyjść haploidalny światło. Aby zmierzyć ciśnienie parcjalne tlenu i dwutlenku węgla, należy pobrać bufor perfuzyjny przez trójdrogowy zawór odcinający bezpośrednio przed jego wejściem do narządu, po około trzech minutach perfuzji i z cewnika wprowadzonego do żyły wrotnej. Umieść próbki na lodzie i użyj automatycznego analizatora gazometrii, aby zmierzyć próbki wkrótce po pobraniu.

Użyj kolektora frakcji, aby uzyskać pierwsze próbki podstawowe. Po 10 do 15 minutach pobierania danych wyjściowych użyj pompy strzykawkowej, aby podać pierwszy stymulant do testu dotętniczego przez trójdrożny kurek odcinający przy natężeniu przepływu 35 mililitrów na minutę. Przeprowadzić stymulację światłem poprzez wstępne wstrzyknięcie boa stymulacyjnego dostarczane z prędkością przepływu 2,5 mililitra na minutę w ciągu pierwszych pięciu minut stymulacji, a następnie podanie roztworu testowego z natężeniem przepływu 5 mililitrów na minutę.

Po zakończeniu okresu stymulacji świetlnej przepłucz światło izotonicznym roztworem soli fizjologicznej z natężeniem przepływu 2,5 mililitra na minutę przez pięć minut. Następnie pobiera się próbki wyjściowe z prędkością 5 mililitrów na minutę przez 15 do 30 minut przed podaniem następnej substancji badanej. Na zakończenie doświadczenia należy podać odpowiednią, pozytywną kontrolę w celu zbadania reakcji preparatu przez pięć do 10 minut, zbierając i dodatkowe 10 do 15 minut próbek wyjściowych na koniec okresu stymulacji kontroli pozytywnej.

Poniżej przedstawiono przykład dobrej jakości danych, wykazujących glukagonopodobny peptyd-1 lub GLP-1, wydzielinę z izolowanego perfundowanego jelita cienkiego szczura pobieranego w odstępach jednominutowych. W warunkach podstawowych wydzielanie było stałe, podczas gdy zarówno przed, jak i po podaniu bodźca testowego i kontroli pozytywnej widoczna była silna odpowiedź wydzielnicza. Te dane dotyczące wydzielania GLP-1 uzyskane z izolowanego perfundowanego jelita cienkiego szczura są złej jakości, z niestabilnym wydzielaniem mierzonym w warunkach podstawowych, które dryfowało w górę przez cały czas trwania badania w sposób, który wydawał się być niezwiązany z podawaniem substancji badanej lub z kontrolą pozytywną.

W związku z tym niemożliwe jest stwierdzenie, czy zwiększone wydzielanie GLP-1 obserwowane pod koniec stymulacji fruktozy naczyniowej było reakcją za pośrednictwem fruktozy. Podczas wykonywania tej procedury należy zadbać o prawidłowe zabezpieczenie cewników i dokładne oczyszczenie sprzętu do perfuzji, ponieważ bufor perfuzyjny stanowi doskonałe podłoże dla rozwoju bakterii. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak badania in vitro na liniach komórkowych wydzielających hormony w pierwotnych hodowlach komórek jelitowych, w celu bezpośredniego zbadania wewnątrzkomórkowej produkcji cyklicznego AMP lub wewnątrzkomórkowego wapnia.

Tak więc wykorzystaliśmy już tę metodę do wyjaśnienia szeregu procesów stojących za wchłanianiem składników odżywczych i mechanizmem wydzielania hormonów i okazało się, że jest ona niezwykle przydatna. Nie zapominaj, że praca z blokerami lub aktywatorami miejsc molekularnych może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak używanie fartucha laboratoryjnego, rękawiczek i okularów ochronnych, powinny być zawsze zabrane pod uwagę podczas wykonywania tej procedury.