Name: Wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem Agrobacterium ekstremofitu Schrenkiella parvula (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Poznaj metodę floral-dip do transformacji Agrobacterium u ekstremofitu Schrenkiella parvula. Protokół umożliwia tworzenie stabilnych linii transgenicznych i badanie adaptacji roślin do ekstremalnych warunków środowiskowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez nagrodę National Science Foundation MCB 1616827.

1. Wzrost roślin
<ol>
	<li>Sterylizacja nasion (opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Przygotuj 50% wybielacz w podwójnie destylowanej wodzie (ddH2O) z 1 lub 2 kroplami niejonowego detergentu (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 50 ml. Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać roztwór. 
		nuta: Zaleca się przeprowadzanie sterylizacji nasion w komorze laminarnej z powierzchnią sterylizowaną promieniami UV przez 15 minut.</li>
		<li>Dodaj roztwór wybielacza do ~100–200 nasion S. parvula w probówce o pojemności 1,5 ml. Dokładnie wymieszaj i odstaw rurkę na 5 minut.</li>
		<li>Wyjmij wybielacz z tubki i dodaj 70% etanolu. Umyj nasiona, pipetując kilka razy, a następnie natychmiast usuń roztwór etanolu.</li>
		<li>Umyj nasiona w wysterylizowanej wodzie, aby usunąć nadmiar wybielacza i etanolu, a następnie usuń wodę. Powtórz ten krok od 5 do 6 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stratyfikacja nasion
	<ol>
		<li>Zanurz nasiona w wysterylizowanej wodzie i przechowuj przez 5 do 7 dni w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, wysuszone, niesterylizowane nasiona wysiewaj bezpośrednio na mokrej glebie i umieść tackę na glebę na 5 do 7 dni w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa roślin w ramach przygotowań do transformacji
	<ol>
		<li>Napełnij mieszankę gleby (patrz tabela materiałów) dodoniczek o wymiarach 7 x 6 cm 2, namocz doniczki w wodzie i spryskaj wodą od góry, aby zapewnić równomiernie mokre podłoże wzrostowe. Dodaj 5 – kulki nawozu (patrz Tabela materiałów) na powierzchni gleby każdej doniczki. 
		nuta: Z tego, co wiemy, S. parvula dobrze rośnie na każdej mieszance gleby, w której może rosnąć A. thaliana.</li>
		<li>Za pomocą mokrej wykałaczki przenieś 20 ~ 25 nasion na doniczkę na powierzchnię gleby. 
		nuta: Wygodną praktyką jest umieszczenie partii 4-5 nasion w czterech rogach i na środku doniczki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1, dzień 15, lewy panel).</li>
		<li>Przykryj tacę doniczkową przezroczystą kopułą, aby nasiona były pod wysoką wilgotnością podczas kiełkowania.</li>
		<li>Tace na rośliny należy przechowywać w komorze wzrostowej o natężeniu światła ustawionym na 130 μmol m−2 s−1 światła, temperaturę 22–24 °C i 14 godzin dziennie/10 godzin na cykl nocny. Usuń kopuły po 7 - 10 dniach od wykiełkowania. Dodaj wodę z dna tacy, aby gleba była równomiernie nawilżona na pożądanym poziomie.</li>
		<li>Usuń dodatkowe sadzonki i pozostaw tylko 4-5 zdrowych sadzonek w doniczce dobrze oddzielonych od siebie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, Dzień 15, prawy panel).</li>
		<li>Delikatnie podlewaj rośliny co dwa dni i nawozić 0,2x roztworem Hoaglanda16 raz na dwa tygodnie. 
		nuta: Utrzymanie wilgotności gleby na jednolitym poziomie jest kluczem do konsekwentnej i zdrowej uprawy S. parvula.</li>
		<li>Kontynuuj uprawę roślin przez 8–10 tygodni, aż z wielu kwiatostanów wytworzy się 100–150 pąków kwiatowych na roślinę (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1, dzień 60–80). W dniu planowanym na przemianę na bazie zanurzenia kwiatowego (krok 4.5) należy usunąć z roślin wszystkie dojrzałe i rozwijające się krzemionki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Klonowanie interesującego elementu genu/genomu do wektora do transformacji roślin
<ol>
	<li>Amplifikuj docelowy fragment DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)17 i wyizoluj produkt PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz tabela materiałów) zgodnie z protokołem zestawu lub inną odpowiednią metodą oczyszczania DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym17,18. Sprawdź sekwencję wyizolowanego produktu PCR za pomocą sekwencjonowania Sangera19.</li>
	<li>Sklonuj żądany produkt PCR do wektora klonowania i przekształć sklonowany konstrukt w kompetentne komórki E. coli za pomocą zestawu do klonowania na bazie topoizomerazy (patrz tabela materiałów) zgodnie z wytycznymi producenta.</li>
	<li>Rozprowadzić 50 μl przetworzonych produktów na pożywce bakteryjnej Luria-Bertani20 (LB) (Tabela 1) z odpowiednimi antybiotykami, np. 50 μg/ml spektynomycyny (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia wybierz 5-10 pojedynczych kolonii, zaszczep je w płynnej pożywce LB odpowiednimi antybiotykami i inkubuj z delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Wyizoluj plazmidy za pomocą zestawu do izolacji plazmidów (patrz Tabela materiałów) i sprawdź za pomocą sekwencjonowania Sangera19, czy sekwencja docelowa amplifikowana w 2.1 jest prawidłowo sklonowana.</li>
	<li>Przenieść sklonowany i zweryfikowany produkt PCR do wektora docelowego w celu transformacji roślin zgodnego z klonowaniem opartym na rekombinacji (patrz tabela materiałów), przy użyciu zestawu do mieszania enzymów rekombinazy (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta zestawu. Powtórz od kroku 2.3 do kroku 2.5, aby wyizolować i zweryfikować klony zawierające odpowiednie konstrukcje plazmidowe.</li>
</ol>
3. Przekształcanie konstruktu wektorowego do transformacji roślin w Agrobacterium tumefaciens
<ol>
	<li>Przekształć plazmid konstruktu wektorowego z 2,6 w szczep A. tumefaciens GV3101:pMP90RK21, który zawiera gen oporności na ryfampicynę do selekcji tła chromosomowego. Stosować odpowiednie antybiotyki, np. Gentamycynę lub Kanamycynę (patrz Tabela Materiałów), w celu doboru konstruktu przemiany roślinnej (plazmid Ti). Krótki protokół transformacji A. tumefaciens za pomocą elektroporacji znajduje się w sekcji 3.2.</li>
	<li>Transformacja A. tumefaciens przez elektroporację
	<ol>
		<li>Rozmrozić kompetentne komórki A. tumefaciens 22 na lodzie. Zmieszać 0,1–1 μg plazmidu przygotowanego z 2,6, rozpuszczonego w 1–2 μl ddH2O, z właściwymi komórkami na lodzie. Przenieść mieszaninę do kuwety elektroporacyjnej (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przeprowadzić elektroporację na mieszaninie plazmidów i właściwych ogniw z ppkt 3.2.1 za pomocą elektroporatora (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z wytycznymi producenta. 
		nuta: Oczyść powierzchnię kuwety przed rozpoczęciem elektroporacji.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę reakcyjną z kuwety do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1,5 ml cieczy LB, dobrze wymieszać pipetowaniem i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 28 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształcić A. tumefaciens z sekcji 3.2 na płytkach LB zawierających antybiotyki o odpowiedniej selekcji (np. Kanamycyna 25 μg/ml, spektynomycyna 50 μg/ml, Gentamycyna 25 μg/ml i ryfampicyna 50 μg/ml) i inkubować w temperaturze 28 °C przez 3 dni.</li>
</ol>
4. Przemiana S. parvula za pośrednictwem Agrobacterium
<ol>
	<li>Zaszczepić pojedyncze przekształcone kolonie z płytek do 10 ml płynnej pożywki LB zawierającej antybiotyki (tak samo jak w ppkt 3.3) w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml (patrz Tabela Materiałów). Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze z wytrząsaniem (patrz tabela materiałów) w temperaturze 250 obr./min w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Przenieść roztwór bakteryjny z 3.4.1 do sterylnej kolby o pojemności 250 ml, dodać 40 ml płynnej pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami i inkubować przez 12 godzin, aż gęstość optyczna przy długości fali 600 nm (OD600) osiągnie około 2,0.</li>
	<li>Odwirować kulturę A. tumefaciens przy 3 100 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulturę bakteryjną w 40 ml roztworu infiltracyjnego A. tumefaciens (Tabela 1).</li>
	<li>Rozcieńczyć ponownie zawieszony A. tumefaciens roztworem infiltracyjnym do końcowego OD600 0,8. Dodać 25 μl roztworu środka powierzchniowo czynnego (Tabela 1) do 50 ml rozcieńczonego roztworu A. tumefaciens i wymieszać przez kilkakrotne odwrócenie.</li>
	<li>Zanurzyć kwiatostan roślin w roztworze A. tumefaciens przygotowanym w sekcji 4.4 na 20 s. Użyć świeżego roztworu bakteryjnego po zanurzeniu kwiatostanu w sześciu doniczkach. Upewnij się, że wszystkie kwiaty mają kontakt z roztworem. Roztwory bakteryjne należy pipetować bezpośrednio na kwiaty znajdujące się w dolnej części kwiatostanu, jeśli nie można ich zanurzyć w roztworze. 
	nuta: W pierwszej rundzie transformacji upewnij się, że usunąłeś wszystkie dojrzałe i rozwijające się krzemionki za pomocą ostrego skalpela lub małych nożyczek. Nie usuwaj silikon, jeśli wykonujesz transformację po raz drugi.</li>
</ol>
5. Pielęgnacja roślin po transformacji i druga transformacja
<ol>
	<li>Umieść rośliny zanurzone w kwiatach poziomo na czystych tacach z kopułami, aby przykryć rośliny i umieść w ciemnym pomieszczeniu do wzrostu na 1-2 dni. 
	nuta: Na tym etapie ważne jest utrzymanie kwiatów w warunkach wysokiej wilgotności (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, Rośliny po transformacji).</li>
	<li>Przywróć rośliny do pozycji pionowej i przenieś je do pomieszczenia do wzrostu o natężeniu 14 godzin w ciągu dnia / 10 godzin w nocy, natężeniu światła 130 μmol m-2 s-1 i temperaturze od 22 do 24 °C.</li>
	<li>Monitoruj zanurzone kwiatostany w następnym tygodniu. Jeśli znaczna liczba kwiatów zostanie usunięta (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), powtórz opadanie kwiatowe (krok 4) po około 4 tygodniach lub po tym, jak duża liczba kwiatów zacznie się rozwijać. 
	nuta: W przeciwieństwie do etapu przygotowania do pierwszej transformacji (krok 1.3.7), nie usuwaj wcześniej istniejących lub rozwijających się krzemionek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2) przed drugą rundą transformacji.</li>
	<li>Uprawiaj rośliny, aż nasiona dojrzeją i zbierz nasiona po ~21 tygodniach.</li>
	<li>Suszyć nasiona przez 2-3 tygodnie w temperaturze pokojowej w hermetycznym pojemniku wypełnionym środkami osuszającymi (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
6. Wybór transformantów dodatnich
<ol>
	<li>Posadź nasiona T1 zgodnie z opisem dla nasion typu dzikiego w krokach od 1.2 do 1.3.</li>
	<li>Uprawiaj rośliny, aż rozwiną się pierwsze 2 prawdziwe liście, około 10–14 dni po wykiełkowaniu.</li>
	<li>Wykonaj pierwszą selekcję odporności na herbicydy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A i 3B), jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć herbicyd glufosynatowo-amonowy (11,3%) (lub BASTA) (Tabela 1) do proporcji 1:1 000 (v/v). Spryskaj sadzonki rozcieńczonym roztworem BASTA i przykryj rośliny kopułami na noc.</li>
		<li>Oprysk BASTA należy powtarzać 2–3 razy co 5–7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj drugi wybór, korzystając z testu upuszczania BASTA, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj rośliny, które przeżywają po 3-4 krotnym oprysku roztworem BASTA. Hoduj rośliny przez kolejne 2-3 tygodnie, aż 3-5 liści rozwinie stosunkowo dużą powierzchnię.</li>
		<li>Wybierz największy dojrzały liść na roślinę, delikatnie przetrzyj powierzchnię liścia palcem, aby usunąć warstwę wosku i umieść kroplę rozcieńczonego roztworu BASTA (od kroku 6.3.1). 
		nuta: Zaznacz położenie liścia nałożonego kroplą BASTA, umieszczając taśmę papierową na najbliższej łodydze.</li>
		<li>Monitoruj liście nałożone kroplą BASTA pod kątem oznak więdnięcia przez okres do jednego tygodnia. Wybierz rośliny, których liście nie są uszkodzone przez krople BASTA. 
		nuta: Liście większości roślin fałszywie dodatnich zaczynają więdnąć w ciągu dwóch dni, podczas gdy liście z prawdziwie dodatnich są nienaruszone nawet po wyschnięciu kropli roztworu BASTA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź dodatnie transformanty za pomocą genomowej PCR.
	<ol>
		<li>Zbierz 2–3 liście z roślin, które przetrwały, w kroku 6.4.5.</li>
		<li>Wyodrębnij genomowe DNA z liści za pomocą metody CTAB23 lub innej odpowiedniej metody ekstrakcji DNA.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR przy użyciu wyekstrahowanych próbek genomowego DNA z roślin docelowych, roślin typu dzikiego (jako kontrola negatywna) oraz konstruktu plazmidowego z kroku 3.1 (jako kontrola pozytywna). Należy użyć odpowiedniej pary starterów PCR specyficznych dla genu markera selektywnego, np. dla genu oporności na BASTA (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (do przodu) i GTCAACCACTACATCGAGACAA (do tyłu).
		<ol>
			<li>Dla przykładowych starterów PCR ukierunkowanych na gen bar należy zastosować następujące warunki PCR: początkowy etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 30 s, następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 59 °C przez 30 s i przedłużanie w temperaturze 72 °C przez 30 s; oraz końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min. 
			nuta: Aby zapewnić insercję całego T-DNA, zalecamy również wykonanie genomowego PCR przy użyciu startera PCR z genu markera selektywnego i innego startera PCR specyficznego dla sekwencji docelowej sklonowanego do wektora transformacji rośliny na etapie</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Potwierdź obecność oczekiwanej wielkości produktu PCR z amplifikowaną sztabką za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym17 dla próbek docelowych (Rysunek 4A), a także poprzez sekwencjonowanie wyizolowanego produktu PCR19, stosując tę samą procedurę, co w kroku 2.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dassanayake, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21822265">The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula.</a> Nature Genetics. 43 (9), 913-918 (2011).</li>
<li>Oh, D. -H., Dassanayake, M., Bohnert, H. J., Cheeseman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+at+the+extreme%3A+lessons+from+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Life at the extreme: lessons from the genome.</a> Genome Biology. 13 (3), 241(2012).</li>
<li>Whited, J. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(15)01125-3.pdf">The Next Top Models.</a> Cell. 163 (1), 18-20 (2015).</li>
<li>Dassanayake, M., Yun, D. O. D., Bressan, R. A., Cheeseman, J. M., Bohnert, J. H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012381466100002X">The scope of things to come: New paradigms in biotechnology.</a> Plant Biotechnology and Agriculture: Prospects for the 21st Century. , 19-34 (2009).</li>
<li>Dittami, S. M., Tonon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomes+of+extremophile+crucifers%3A+New+platforms+for+comparative+genomics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Genomes of extremophile crucifers: New platforms for comparative genomics and beyond.</a> Genome Biology. 13 (8), 166(2012).</li>
<li>Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+evolution%3A+Thellungiella+generates+new+knowledge+on+essential+and+critical+components+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Learning from evolution: Thellungiella generates new knowledge on essential and critical components of abiotic stress tolerance in plants.</a> Molecular Plant. 2 (1), 3-12 (2009).</li>
<li>Oh, D. -H., Hong, H., Lee, S. Y., Yun, D. -J., Bohnert, H. J., Dassanayake, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+structures+and+transcriptomes+signify+niche+adaptation+for+the+multiple-ion-tolerant+extremophyte+Schrenkiella+parvula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Genome structures and transcriptomes signify niche adaptation for the multiple-ion-tolerant extremophyte Schrenkiella parvula.</a> Plant Physiology. 164 (4), 2123-2138 (2014).</li>
<li>Orsini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+salt+tolerance+parameters+in+11+wild+relatives+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A comparative study of salt tolerance parameters in 11 wild relatives of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 61 (13), 3787-3798 (2010).</li>
<li>Uzilday, B., Ozgur, R., Sekmen, A. H., Yildiztugay, E., Turkan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+alternative+electron+sinks+and+antioxidant+defence+in+chloroplasts+of+the+extreme+halophyte+Eutrema+parvulum+%28Thellungiella+parvula%29+under+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Changes in the alternative electron sinks and antioxidant defence in chloroplasts of the extreme halophyte Eutrema parvulum (Thellungiella parvula) under salinity.</a> Annals of Botany. 115 (3), 449-463 (2015).</li>
<li>Teusink, R. S., Rahman, M., Bressan, R. A., Jenks, M. A. <a target="_blank" href="https://www.journals.uchicago.edu/doi/10.1086/338825">Cuticular waxes on Arabidopsis thaliana close relatives Thellungiella halophila and Thellungiella parvula.</a> International Journal of Plant Sciences. 163 (2), 309-315 (2002).</li>
<li>Jarvis, D. E., Ryu, C. H., Beilstein, M. A., Schumaker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+SOS1+in+the+convergent+evolution+of+salt+tolerance+in+Eutrema+salsugineum+and+Schrenkiella+parvula%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for SOS1 in the convergent evolution of salt tolerance in Eutrema salsugineum and Schrenkiella parvula.</a> Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 2094-2107 (2014).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+A+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Journal. 16 (6), 735-743 (1998).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20409266">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Bai, J., Wu, F., Mao, Y., He, Y. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/protocolexchange/protocols/2769">In planta transformation of Brassica rapa and B. napus via vernalization-infiltration methods.</a> Protocol Exchange. 10, 1028(2013).</li>
<li>Sparrow, P. A. C., Goldsack, C. M. P., Østergaard, L. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/251150135_Transformation_Technology_in_the_Brassicaceae">Transformation technology in the Brassicaceae.</a> Genetics and Genomics of the Brassicaceae. , 505-525 (2011).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="https://archive.org/details/watercultureme3450hoag">The water-culture method for growing plants without soil.</a> California Agricultural Experiment Station Circular. 347 (347), 1-32 (1950).</li>
<li>Saiki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+dna+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A Quick, cost-free method of purification of dna fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/271968">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14888646">Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Eschericia coli.</a> Journal of Bacteriolgy. 62 (3), 293-300 (1951).</li>
<li>Koncz, C., Martini, N., Szabados, L., Hrouda, M., Bachmair, A., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-94-011-0511-8_4">Specialized vectors for gene tagging and expression studies.</a> Plant Molecular Biology Manual. , 53-74 (1994).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="https://europepmc.org/abstract/med/22484681">Transformation of Agrobacterium using electroporation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (30), (2006).</li>
<li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Research. 8 (19), 4321-4326 (1980).</li>
<li>Inan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+cress.+a+halophyte+and+cryophyte+Arabidopsis+relative+model+system+and+its+applicability+to+molecular+genetic+analyses+of+growth+and+development+of+extremophiles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salt cress. a halophyte and cryophyte Arabidopsis relative model system and its applicability to molecular genetic analyses of growth and development of extremophiles.</a> Plant Physiol. 135 (3), 1718-1737 (2004).</li>
<li>Ghedira, R., De Buck, S., Nolf, J., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+is+determined+not+only+by+the+Agrobacterium+strain+used+but+also+by+the+physiology+and+the+ecotype+of+the+dipped+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">The efficiency of Arabidopsis thaliana floral dip transformation is determined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotype of the dipped plant.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (7), 823-832 (2013).</li>
<li>Shaohong, F. U., Xianya, W. E. I., Yingze, N. I. U., Shixing, G. U. O. <a target="_blank" href="http://gcirc.org/fileadmin/documents/Proceedings/IRCWuhan2007vol2/Biotechnology/45-49.pdf">Transformation of Brassica napus with the method of floral-dip.</a> Biotechnology: Genomics and Its Applications. , 45-49 (2005).</li>
<li>Li, J., Tan, X., Zhu, F., Guo, J. <a target="_blank" href="http://www.ccsenet.org/journal/index.php/ijb/article/view/4778">A rapid and simple method for Brassica napus floral-dip transformation and selection of transgenic plantlets.</a> International Journal of Biology. 2 (1), 127(2010).</li>
<li>Li, H. Q., Xu, J., Chen, L., Li, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+leaf+disc+transformation+of+Thellungiella+halophila%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated leaf disc transformation of Thellungiella halophila.</a> Plant Cell Reports. 26 (10), 1785-1789 (2007).</li>
<li>Wu, G., Rossidivito, G., Hu, T., Berlyand, Y., Poethig, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+lines%3A+New+tools+for+genetic+analysis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Traffic lines: New tools for genetic analysis in Arabidopsis thaliana.</a> Genetics. 200 (1), 35-45 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Stan fizjologiczny rośliny znacząco wpływa na efektywność przemian25. Wykorzystanie zdrowych i energicznych roślin do transformacji jest kluczowym warunkiem udanej transformacji S. parvula. Rośliny zestresowane wodą lub światłem będą miały mniej kwiatów w porównaniu ze zdrowymi roślinami idealnymi do transformacji (Rysunek 1, panel środkowy). S. parvula może rosnąć przy natężeniu światła mniejszym niż 130 μmol m-2 s-1, ale rośli...

W tym protokole opisujemy wzrost i tworzenie stabilnych linii transgenicznych dla modelu ekstremofitu Schrenkiella parvula. Dostępność wydajnego systemu transformacji jest cechą charakterystyczną każdego wszechstronnego modelu genetycznego. Rośliny, które rozwijają się w ekstremalnych środowiskach, określane jako ekstremofity, stanowią kluczowe źródło informacji na temat adaptacji roślin do stresów środowiskowych. Schrenkiella parvula (dawniej Thellungiella parvula i Eutrema parvulum) jest jednym z takich modeli ekstremofitów, z rozszerzającymi się zasobami genomowymi1,2,3,4,5. Jednak protokoły transformacji nie zostały jeszcze zgłoszone dla S. parvula w opublikowanych badaniach.
Genom S. parvula jest pierwszym opublikowanym genomem ekstremofitów u Brassicaceae (rodzina gorczyco-kapustowatych) i wykazuje rozległą ogólną syntenyczność genomu z modelem nie-ekstremofitowym, Arabidopsis thaliana1. W związku z tym badania porównawcze między A. thaliana i S. parvula mogą skorzystać z bogactwa badań genetycznych przeprowadzonych na A. thaliana w celu sformułowania pouczających hipotez na temat tego, w jaki sposób genom S. parvula ewoluował i regulował się w różny sposób, aby radzić sobie z ekstremalnymi stresami środowiskowymi5,6,7. S. parvula jest jednym z najbardziej tolerancyjnych na sól gatunków (na podstawie glebowego NaCl LD50) wśród znanych dzikich krewnych A. thaliana8. Oprócz tolerancji NaCl, S. parvula przeżywa i kończy swój cykl życiowy w obecności wielu jonów soli w wysokich stężeniach toksycznych dla większości roślin7. W odpowiedzi na stresy abiotyczne panujące w jego naturalnym środowisku, wyewoluował różne cechy, z których kilka zostało przebadanych na poziomie biochemicznym lub fizjologicznym 8,9,10,11.
Od 2010 roku pojawiło się ponad 400 publikacji, które używały S. parvula jako gatunku docelowego lub używały go w porównaniu z innymi genomami roślin. Można jednak zidentyfikować wyraźne wąskie gardło przy bliższym przyjrzeniu się, jakiego rodzaju badania zostały przeprowadzone. Większość z tych doniesień omawia potencjalne zastosowanie S. parvula w przyszłych badaniach lub wykorzystanie go w porównawczych badaniach genomicznych lub filogenomicznych. Ze względu na brak protokołu transformacji potwierdzającego słuszność koncepcji ustanowionego dla S. parvula, nie został on wykorzystany w funkcjonalnych badaniach genomicznych, pomimo posiadania jednego z najwyższej jakości dostępnych do tej pory genomów roślinnych (>5 Mb contig N50) złożonych i opisanych w pseudocząsteczkach na poziomie chromosomów1.
Metoda transformacji kwiatowej za pośrednictwem Agrobacterium stała się najpowszechniej stosowaną metodą tworzenia linii trasngenicznych u A. thaliana, a rozwój powtarzalnego systemu transformacji był kluczowym czynnikiem jej sukcesu jako modelu genetycznego12,13. Wykazano jednak, że nie wszystkie gatunki Brassicaceae zostały pomyślnie przekształcone przy użyciu metody zanurzania kwiatów opracowanej dla A. thaliana. Szczególnie gatunki Brassicaceae Lineage II, które obejmują S. parvula, były oporne na metody transformacji oparte na zanurzeniu kwiatowym14,15.
Nieokreślony pokrój kwitnienia S. parvula, w połączeniu z jego wąską morfologią liści, utrudnił przyjęcie standardowej metody przemiany kwiatowej za pośrednictwem Agrobacterium. W tym badaniu przedstawiamy opracowany przez nas zmodyfikowany protokół odtwarzalnej transformacji S. parvula.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-762</td><td>Środek sprzedający agar Bacto, BD Diagnostics</td></tr><tr><td>Witaminy B5</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1019</td><td>Gamborg' s</td></tr><tr><td>Osuszacz</td> w <td>roztworze witamin W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td><td>22005</td><td>Wskazujący DRIERITE 6 mesh</td></tr><tr><td>Wektor docelowy dla transformacji roślin</td> Wektor <td>TAIR</td><td>: 6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>Kuweta do elektroporacji, okrągła nasadka, odstęp 0,2 cm</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td><td>1652100</td><td>Elektroporator MicroPulser</td></tr><tr><td>Kulki nawozowe</td><td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td><td>N/A</td><td>Osmocote Smart-Release Pokarm dla roślin&nbsp; Kwiat & Zestaw</td></tr><tr><td>do ekstrakcji żelu</td> roślinnego <td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin Zestaw do oczyszczania całkowitego fragmentu DNA</td></tr><tr><td>Gentamyna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1914-5G</td><td>Siarczan gentamycyny</td></tr><tr><td>Glufosynat amonowy (11,3%) herbicyd (BASTA)</td><td>Bayer environmental science, Montvale,</td><td>NJ N/A</td><td>FINALE herbicyd</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>200004-444</td><td>Monosiarczan kanamycyny</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld, Dublin, OH</td><td>41320024-2</td><td>MES, Sól MS wolnokwasowa</td></tr><tr><td></td><td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td><td>092621822</td><td>Zmodyfikowana mieszanina soli bazowych Hoaglanda</td></tr><tr><td>N6-benzyloaminopuryna (BA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>B3274</td><td>Roztwór 6-benzyloaminopuryny</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Alrich</td><td>S7653</td><td>Chlorek sodu</td></tr><tr><td>Niejonowy detergent</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji plazmidu</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D4036</td><td>Zestawy plazmidów Zyppy</td></tr><tr><td>Zestaw do mieszania enzymów rekombinazy</td><td>Life Technology</td><td>11791-020</td><td>Gateway LR Clonase II Mieszanka enzymatyczna</td></tr><tr><td>Rifampicyna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R3501-1G</td><td>Ryfampicyna, proszek, 
&#8805; 97% (HPLC)</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 Wytrząsarki orbitalne</td></tr><tr><td>stołowe Mieszanka gleby</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki stożkowe 50 ml</td><td>USA Scientific, Ocala, FL</td><td>1500-1811</td><td>50 ml stożkowe probówki z nakrętką, kopolimer, stojaki, sterylne</td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>57-50-1</td><td>Sacharoza, ACS</td></tr><tr><td>Roztwór środka powierzchniowo czynnego</td><td>Nasiona Lehle, Round Rock, TX</td><td>VIS-02</td><td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania na bazie topoizomerazy</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>K240020</td><td>Zestaw do klonowania pENTR/D-TOPO, z One Shot TOP10 Chemicznie kompetentni E. coli</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto Trypton, BD Biosciences</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-722&nbsp;</td><td>Ekstrakt z drożdży BD Bacto, BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem agrobacterium ekstremofitu schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula to ekstremofit przystosowany do różnych stresów abiotycznych, w tym wielokrotnych stresów toksyczności jonowej. Pomimo wysokiej jakości zasobów genomicznych dostępnych do badania, w jaki sposób rośliny przystosowują się do stresów środowiskowych, jego wartość jako funkcjonalnego modelu i narzędzia genomicznego jest ograniczona przez brak wykonalnego systemu transformacji. W tym protokole opisujemy, jak wygenerować stabilne transgeniczne linie S. parvula za pomocą metody zanurzania kwiatowego za pośrednictwem Agrobacterium. Zmodyfikowaliśmy protokół transformacji zastosowany dla A. thaliana, aby uwzględnić unikalne cechy S. parvula, takie jak nieokreślony pokrój kwitnienia i wysoka zawartość wosku naskórkowego na liściach. Krótko mówiąc, nasiona S. parvula były rozwarstwiane w temperaturze 4 °C przez pięć dni przed sadzeniem. Rośliny uprawiano w fotoperiodzie 14 godzin światła i 10 godzin ciemności oraz natężeniu światła 130 μmol m-2 s-1, w temperaturze od 22 °C do 24 °C. Do transformacji wybrano rośliny w wieku od ośmiu do dziewięciu tygodni z wieloma kwiatostanami. Kwiatostany te zanurzono w roztworze naciekającym Agrobacterium tumefaciens GV3101 przenoszącym plazmid pMP90RK. Przeprowadziliśmy dwie rundy zanurzania kwiatów w odstępie od trzech do czterech tygodni, aby zwiększyć wydajność transformacji. Nasiona T1 zebrano i suszono przez cztery tygodnie w pojemniku ze środkami osuszającymi przed wykiełkowaniem w celu przesiewu pod kątem potencjalnych przekształconych linii. Odporność na BASTA wykorzystano do przesiewania roślin T1. Spryskaliśmy roztwór BASTA trzy razy w odstępie trzech dni, zaczynając od dwutygodniowych roślin, aby zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich. Test upuszczania BASTA przeprowadzono na pojedynczych roślinach, które przeżyły, w celu zidentyfikowania prawdziwie dodatnich transformantów. Wydajność transformacji wyniosła 0,033%, dając 3–4 rośliny transgeniczne na 10 000 rozmnożonych nasion T1.

Opracowaliśmy protokół transformacji, który umożliwia pozyskiwanie T0 nasiona w ciągu 150 dni, stosując metodę zanurzeniową kwiatów (floral-dip) zmodyfikowaną z metody dla *A. thaliana*. Rycina 1 przedstawia podsumowanie harmonogramu i S. parvula rośliny reprezentujące optymalny etap do przeprowadzenia transformacji metodą floral-dip. Wybrano *S. parvula* rośliny z 70–80 kwiatami w wielu kwiatostanach w 60–80 dni po kiełk...

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą metody zanurzania kwiatów może być z powodzeniem wykorzystana do stworzenia stabilnych linii transgenicznych modelu ekstremofitu Schrenkiella parvula. Przedstawiamy protokół zmodyfikowany w stosunku do tego dla Arabidopsis thaliana, biorąc pod uwagę różne nawyki wzrostu i cechy fizjologiczne ekstremofitu.

Wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem Agrobacterium ekstremofitu Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Metoda ta, będąca powtarzalnym protokołem transformacji Schrenkiella parvula, może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu genomu porównawczego i funkcjonalnego roślin, zwłaszcza badań nad adaptacją roślin do trudnych warunków. Technika ta umożliwia badanie rutynowych funkcji Schrenkiella parvula na ekstremofit przystosowany do wielojonowych stresów solnych. Umożliwia również badania porównawcze, które obejmują również jego bliskiego krewnego, rodzica matki Aribidopsis Thaliana.Porównanie Schrenkiella Parvula z Aribidopsis Thaliana może dostarczyć informacji na temat różnic w regulacji i funkcji genów, które umożliwiają unikalną adaptację Schrenkiella parvula. Protokół transformacji Arabidopsis Thaliana jest już dobrze znany. Metoda umożliwia obecnie badania porównawcze z wykorzystaniem transgenicznych roślin Schrenkiella Parvula.Ogólnie rzecz biorąc, badacze, którzy są nowicjuszami w tej metodzie, będą mieli trudności z kwitnieniem, pokrojem i morfologią liści roślin Schrenkiella Parvula, co utrudnia skuteczną transformację za pomocą zanurzenia flory, a także wybór prawdziwych transformantów. Na początek użyj mokrej wykałaczki, aby przenieść około 20 do 25 nasion S.Parvula na mokrą glebę. Następnie rozwarstwiaj nasiona w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć do siedmiu dni.Po rozwarstwieniu umieść nasiona z powrotem w komorze wzrostowej na siedem do 10 dni. Gdy wszystkie sadzonki wykiełkują, pozostaw tylko jedną sadzonkę w każdym z czterech rogów i na środku doniczek. Hoduj rośliny przez osiem do 10 tygodni w komorze wzrostowej, aż zakwitną.W dniu przemiany wybierz rośliny S.Parvula zgodnie z protokołem tekstowym. Użyj kleszczy i małych nożyczek, aby usunąć wszelkie zapylone kwiatostany, które już przekształcają się w krzemianki. Gdy rośliny będą gotowe, przygotuj roztwór infiltracji agrobacterium.Następnie zanurz kwiatostan S.Parvula w roztworze infiltracyjnym agrobacterium na 20 sekund. Pokazano tutaj najwcześniejszy etap roślin, które można wykorzystać do transformacji, o ile już rozwinięte krzemionki zostaną usunięte przed transformacją, można użyć starszych roślin o większej liczbie kwiatów. Po przemianie umieść rośliny zanurzone w kwiatach poziomo na czystych tacach z kopułami, aby przykryć rośliny.Następnie umieść rośliny w ciemnym pomieszczeniu do wzrostu na jeden do dwóch dni. Przywróć rośliny do pozycji pionowej i przenieś je do pomieszczenia wzrostu. W następnym tygodniu monitoruj zanurzone kwiatostany.Dziesięć dni po pierwszym zanurzeniu kwiatowym rośliny S.Parvula będą nadal wytwarzać nowe kwiatostany i krzemianki. Można wykonać drugą rundę zanurzania kwiatowego, aby jeszcze bardziej przekształcić nowo pojawiające się kwiatostany. Uprawiaj rośliny, aż nasiona dojrzeją i zbierz nasiona około 21 tygodni.Susz nasiona przez dwa do trzech tygodni w temperaturze pokojowej w hermetycznym pojemniku wypełnionym środkami osuszającymi. Posadź nasiona T one zgodnie z protokołem tekstowym. Hoduj rośliny, aż rozwiną się pierwsze dwa do trzech prawdziwych liści.Aby przeprowadzić pierwszą selekcję odporności na herbicydy, rozcieńczyć herbicyd amonowy glufosynat i spryskać nim sadzonki. Przykryj sadzonki kopułami na noc. Włóż tace z powrotem do pomieszczenia do wzrostu i zdejmij kopułę.Poczekaj, aż większość sadzonek zostanie wybrana przez herbicyd. Aby rozpocząć drugą selekcję, zidentyfikuj rośliny, które przeżyły po trzykrotnym lub czterokrotnym oprysku roztworem BASTA. Po uprawie roślin przez kolejne dwa do trzech tygodni, wybierz największy dojrzały liść na każdej roślinie.Następnie delikatnie przetrzyj powierzchnię liścia palcem, aby usunąć warstwę wosku. Następnie umieść kroplę rozcieńczonego roztworu BASTA na liściu. Monitoruj liście potraktowane roztworem BASTA pod kątem oznak więdnięcia przez okres do jednego tygodnia.Na koniec wybierz rośliny, których liście nie zostały naruszone przez krople BASTA do dalszej analizy. W tym protokole S.Parvula została przekształcona w agrobacterium przy użyciu metody zanurzania kwiatowego. Zakażenie agrobacterium spowodowało poronienie niektórych kwiatów.Jednak rośliny S. Parvula nadal wytwarzały nowe kwiaty po pierwszym zanurzeniu kwiatów i mogły być ponownie przekształcone. Za pomocą testów natryskowych i kroplowych BASTA można dokładnie zidentyfikować prawdziwie dodatnie transformanty. Liczba próbek badanych za pomocą potwierdzenia PCR może zostać zmniejszona.Chociaż metoda ta jest podobna do transformacji Arabidopsis Thaliana, ważne jest, aby pamiętać o różnicach we wzroście i morfologii Schrenkiella Parvula. Modyfikacja protokołu w celu odzwierciedlenia tych różnic ma kluczowe znaczenie dla pomyślnej transformacji. Technika ta może pomóc naukowcom w zbadaniu ewolucji zmian genomowych prowadzących do wielu adaptacji stresu solnego w modelu ekstremofitów Schrenkiella Parvula.Połączenie tej techniki z informacjami na temat funkcji Aradopsis Thaliana, innej rośliny blisko spokrewnionej z Schrenkiella Parvula. Naukowcy mogą badać różnice w regulacji i funkcjach, że są to dwie odrębne struktury między tymi dwoma gatunkami. Podczas procesu przemiany ważne jest, aby cały roztwór infiltracyjny agrobacterium przechowywać w pojemnikach nadających się do sterylizacji w autoklawie.Wysterylizuj i bezpiecznie wyrzuć wszystkie materiały, które miały kontakt z agrobacterium, w tym rękawiczki, końcówki do makropipet i ręczniki papierowe.

plant-growth-agrobacterium-mediated-floral-dip-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy artykuł przedstawia metodę floral-dip w transformacji Arabidopsis thaliana za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens. Poprzez wprowadzenie do Arabidopsis promotora-reportera regulowanego cyklem komórkowym, pTSO2::β-glucuronidase (GUS), obrazujemy sposób wykrywania ekspresji reportera GUS w siewkach transgenicznych.

Transformacja Arabidopsis thaliana metodą floral-dip w celu zbadania ekspresji genu reporterowego pTSO2::β-glucuronidase

Źródło: Lee, H. i wsp., Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia metodę monitorowania infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych za pomocą komplementacji dzielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Podejście to umożliwia precyzyjną wizualizację translokacji efektorowej do cytozolu komórki gospodarza.

Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych

W tym filmie demonstrujemy generację transgenicznych roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję stabilnego transgenu poprzez transformację binarnego sztucznego genu bakteryjnego opartego na chromosomach za pośrednictwem Agrobacterium.

Binarna transformacja genów oparta na sztucznym wektorze chromosomowym u roślin Arabidopsis: technika generowania roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii

Tutaj prezentujemy protokół przekształcania lnu za pomocą transformacji roślin za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą dipu kwiatowego. Protokół ten jest prosty do wykonania i niedrogi, a mimo to zapewnia wyższy współczynnik transformacji niż obecnie dostępne metody transformacji lnu.

Przemiana lnu w zanurzeniu kwiatowym (Linum usitatissimum) w celu wytworzenia transgenicznych potomków o wysokim współczynniku transformacji

Korzystanie z wektora binarnego pBIBAC-GW sprawia, że generowanie roślin transgenicznych z nienaruszonymi pojedynczymi kopiami jest łatwym procesem. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów, które prowadzą czytelnika przez proces generowania transgenicznych roślin Arabidopsis oraz testowania roślin pod kątem nienaruszalności i liczby kopii wkładek.

Generowanie roślin transgenicznych z insercją pojedynczej kopii przy użyciu wektora binarnego BIBAC-GW

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Tutaj prezentujemy dwa protokoły przekształcania roślin ziemniaka. Transformacja Agrobacterium tumefaciens prowadzi do kompletnej rośliny transgenicznej, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes wytwarza transgeniczne owłosione korzenie w pędach typu dzikiego, które mogą się samodzielnie rozmnażać. Następnie wykrywamy aktywność promotora poprzez barwienie GUS w przekształconych korzeniach.

Przemiana ziemniaka w ziemniaku za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes oraz aktywność promotorowa genu suberyny przez barwienie GUS

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Ten protokół opisuje wykorzystanie transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens (AMT) do integracji interesujących genów z genomem jądrowym zielonej mikroalgi Chlorella vulgaris, co prowadzi do produkcji stabilnych transformantów.

Inżynieria genetyczna zielonych mikroalg za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, Chlorella vulgaris

Przedstawiamy wydajny, zoptymalizowany protokół transformacji apłciowej obojburzliwej odmiany Brassicaceae, Rorippa aquatica, wywoływanej przez Agrobacterium, bez wymagających zasobów procedur hodowli tkanek sterylnych. Wykorzystanie markera transformacji wizualnej i pipeline'u regeneracji pędów skutecznie wygenerowało transformanty bliskie klonalne, co przyczyniło się do dalszych badań nad adaptacją roślin do środowiska podwodnego.

Efektywna transformacja agrobakterii oparta na regeneracji bezpłciowego gatunku z rodziny kapustnych, Rorippa aquatica

Przedstawiamy prosty, skuteczny i powtarzalny protokół transformacji Phytophthora palmivora, pośredniczonego przez Agrobacterium, który jest również stosowany do P. capsici.

Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

Poznaj metodę floral-dip do transformacji Agrobacterium u ekstremofitu Schrenkiella parvula. Protokół umożliwia tworzenie stabilnych linii transgenicznych i badanie adaptacji roślin do ekstremalnych warunków środowiskowych.

Wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem Agrobacterium ekstremofitu Schrenkiella parvula

Przeglądaj więcej filmów