Name: Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj wizualizację endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster za pomocą sond molekularnych i mikroskopii konfokalnej. Ta metoda pozwala śledzić transport RNA w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Salvatore A.E. Marras (Centrum Instytutu Badań nad Zdrowiem Publicznym, Uniwersytet Rutgers) za syntezę, oznakowanie i oczyszczanie molekularnych latarni morskich, oraz Danielowi St Johnstonowi (The Gurdon Institute, University of Cambridge) za transgeniczne muchy oskar-MS2/MCP-GFP. Prace te były wspierane przez National Science Foundation CAREER Award 1149738 oraz Professional Staff Congress-CUNY Award dla DPB.

<ol><li>Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+RNA+distribution+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells.</a> Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).</li>
<li>Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+live-cell+RNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for live-cell RNA detection.</a> Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).</li>
<li>Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+techniques+for+visualizing+RNA+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Current techniques for visualizing RNA in cells.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+observation+of+transcription+initiation+and+elongation+on+an+endogenous+yeast+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).</li>
<li>Garcia, J. F., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS2+coat+proteins+bound+to+yeast+mRNAs+block+5%27+to+3%27+degradation+and+trap+mRNA+decay+products%3A+implications+for+the+localization+of+mRNAs+by+MS2-MCP+system%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system.</a> RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).</li>
<li>Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+Fluorescent+probes+for+detection+of+endogenous+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).</li>
<li>Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+distribution+and+transport+of+mRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).</li>
<li>Tyagi, S., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons%3A+probes+that+fluoresce+upon+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.</a> Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon-based+approach+for+live-cell+imaging+of+RNA+transcripts+with+minimal+target+engineering+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+microRNAs+by+combining+molecular+beacon+probes+with+T7+exonuclease-assisted+cyclic+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).</li>
<li>Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+quantification+of+specific+microRNA+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons.</a> Nucleic Acids Research. 40 (2), e13(2012).</li>
<li>Ko, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+color-tunable+molecular+beacon+to+sense+miRNA-9+expression+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis.</a> Scientific Reports. 4, 4626(2014).</li>
<li>Vet, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+four+pathogenic+retroviruses+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+Unites+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).</li>
<li>Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacons+for+protein-DNA+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacons for protein-DNA interaction studies.</a> Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).</li>
<li>Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functional+Roles+of+Molecular+Beacon+as+a+MicroRNA+Detector+and+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).</li>
<li>Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Beacon+Nano-Sensors+for+Probing+Living+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells.</a> Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).</li>
<li>Ban, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+Purification+of+Ventricular+Cardiomyocytes+from+Differentiating+Embryonic+Stem+Cells+through+Molecular+Beacons+Targeting+IRX-4%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4.</a> Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).</li>
<li>Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+beacon-based+real-time+PCR+detection+of+primary+isolates+of+Salmonella+Typhimurium+and+Salmonella+Enteritidis+in+environmental+and+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples.</a> BMC Microbiology. 9, 97(2009).</li>
<li>McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+Oogenesis%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).</li>
<li>Bastock, R., St Johnston, D. <a target="_blank" href="https://www.cell.com/current-biology/abstract/S0960-9822(08)01196-2">Drosophila oogenesis.</a> Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).</li>
<li>Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+oskar+RNA+regulates+oskar+translation+and+requires+Oskar+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein.</a> Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).</li>
<li>Mhlanga, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+colocalisation+of+oskar+mRNA+and+trans-acting+proteins+revealed+by+quantitative+imaging+of+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte.</a> PLoS One. 4 (7), e6241(2009).</li>
<li>Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2018/04/03/294447.abstract">PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiencies+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+contact-mediated+quenching+in+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), e122(2002).</li>
<li>Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+molecular+beacons+for+in+vivo+mRNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).</li>
<li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+%28pulling%29+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor%22%5BJournal%5D)">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Alami, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+of+TDP-43+mRNA+granules+is+impaired+by+ALS-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations.</a> Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).</li>
<li>Jackson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Hairpin+DNA-Functionalized+Gold+Nanoparticles+for+Imaging+mRNA+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells.</a> Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).</li>
<li>Zimyanin, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+oskar+mRNA+transport+reveals+the+mechanism+of+posterior+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization.</a> Cell. 134 (5), 843-853 (2008).</li>
<li>Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiny+molecular+beacons%3A+LNA%2F2%27-O-methyl+RNA+chimeric+probes+for+imaging+dynamic+mRNA+processes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells.</a> ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cytosolic+delivery+of+molecular+beacon+conjugates+and+flow+cytometric+analysis+of+target+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), e69(2008).</li>
<li>Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-linked+molecular+beacons+for+efficient+delivery+and+rapid+mRNA+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 32 (6), e58(2004).</li>
<li>Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+false-positive+signals+with+nuclease-vulnerable+molecular+beacons+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells.</a> Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).</li>
<li>Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analysis+of+RNA+Secondary+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure.</a> Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+germ+granules+are+structured+and+contain+homotypic+mRNA+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commununications%22%5BJournal%5D)">Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters.</a> Nature Commununications. 6, 7962(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Wizualizacja na żywo transportu endogennego mRNA w komorach jajowych Drosophila opiera się na użyciu specyficznych, wydajnych i odpornych na nukleazy MB, które można teraz łatwo zaprojektować za pomocą oprogramowania PinMol . MB to specyficzne sondy przeznaczone do wykrywania unikalnych sekwencji w docelowym mRNA (najlepiej regionów wolnych od struktury drugorzędowej), co umożliwia wykrywanie transkryptu w wysokiej rozdzielczości. Jedynym ograniczeniem przy stosowaniu tej techniki/protokołu dla innych t...

Badania biologii komórki, które wizualizują dynamiczne zdarzenia z rozdzielczością przestrzenną i czasową, stały się możliwe dzięki rozwojowi technik obrazowania żywych komórek opartych na fluorescencji. Obecnie wizualizację mRNA in vivo uzyskuje się za pomocą technologii opartych na interakcjach aptamer-białko RNA, indukowanej aptamerem RNA fluorescencji barwników organicznych i wyżarzaniu sondy kwasów nukleinowych1,2,3. Wszystkie oferują wysoką specyficzność, czułość i stosunek sygnału do tła. Jednak podejścia skoncentrowane na aptamerach RNA wymagają rozległej manipulacji genetycznej, w której transgen jest modyfikowany do ekspresji RNA ze sztucznymi motywami strukturalnymi, które są wymagane do wiązania białka lub barwnika organicznego. Na przykład system MS2/MCP wymaga koekspresji transgenu wyrażającego konstrukt RNA zawierający wiele tandemowych powtórzeń sekwencji wiążącej białko płaszcza MS2 bakteriofaga (MCP) oraz innego transgenu kodującego białko fluorescencyjne połączone z MCP4,5. Dodanie takich drugorzędowych motywów strukturalnych do RNA, wraz z masywnym, fluorescencyjnie znakowanym białkiem, wzbudziło obawy, że może to mieć wpływ na natywne procesy RNA6. Technologią, która rozwiązuje ten problem i oferuje dodatkowe unikalne korzyści, jest podejście oparte na kwasach nukleinowych, molekularne latarnie (MB). MB pozwalają na multipleksowe wykrywanie endogennych mRNA, rozróżnianie zmian pojedynczych nukleotydów i szybką kinetykę hybrydyzacji z docelowym mRNA7,8. MB to sondy oligonukleotydowe, które pozostają w wygaszonym fałdzie spinki do włosów przed poddaniem się fluorogenicznej zmianie konformacyjnej po hybrydyzacji do swoich celów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C)9. Kilka grup odniosło sukces w użyciu MB do wykrywania zarówno niekodujących RNA (mikroRNA i lncRNA)10,11,12,13, retrowirusy RNA14, jak i dynamiczne interakcje DNA-białko15. Zostały one z powodzeniem wykorzystane do obrazowania w różnych organizmach i tkankach, takich jak zarodki danio pręgowanego16, neurons13, tumor tissue17, różnicowanie kardiomiocytów18 i Salmonella19.
Tutaj opisujemy podejście, podejście do projektowania, dostarczania i wykrywania endogennych mRNA w żywych komorach jajowych D. melanogaster w połączeniu z zestawem mikroskopowym, który jest wystarczająco szybki, aby uchwycić dynamiczny zakres aktywnego transportu molekularnego. Komora jajowa D. melanogaster posłużyła jako idealny wielokomórkowy system modelowy dla szerokiego zakresu badań rozwojowych, od wczesnego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej i ekspresji genów matki po generowanie segmentalnego planu ciała 20,21. Komory jajowe są łatwe do odizolowania, duże i przezroczyste oraz są w stanie wytrzymać wielogodzinne analizy ex vivo, co czyni je bardzo podatnymi na eksperymenty obrazowe. Wiele prac koncentrowało się na asymetrycznej lokalizacji matczynych transkryptów w dyskretnych regionach subkomórkowych przed aktywną translacją. W szczególności lokalizacja mRNA oskar i jego późniejsza translacja na tylnym biegunie oocytu musi odbywać się w ściśle regulowany sposób, aby uniknąć śmiertelnego dwuogonowego fenotypu zarodka22. mRNA oskar jest transkrybowane w 15 komórkach linii rozrodczej, zwanych komórkami pielęgniarskimi, i aktywnie transportowane przez mostki cytoplazmatyczne, zwane kanałami pierścieniowymi, do oocytu, komórki linii rozrodczej, która staje się dojrzałą komórką jajową i ostatecznie zostaje zapłodniona (<silna klasa = "xfig">Figura 1A). Znaczna ilość dostępnych już informacji na temat dynamicznej rekrutacji i wymiany czynników białkowych do i z oskar mRNP, wraz z jego dalekimi podróżami wewnątrzkomórkowymi, sprawiają, że oskar jest preferowanym kandydatem do badania wielu procesów cyklu życiowego mRNA. MB odegrały kluczową rolę w ujawnieniu szczegółów dotyczących procesu lokalizacji mRNA oraz rozszyfrowaniu regulacji i funkcji czynników białkowych, które kontrolują transport mRNA podczas oogenezy Drosophila. W szczególności, poprzez mikrowstrzykiwanie MB do komórek pielęgniarskich i przeprowadzanie eksperymentów obrazowania żywych komórek, możliwe jest śledzenie endogennych mRNA8,23.
Przedstawiona tutaj mapa drogowa oferuje etapy kompletnego procesu, od przeprowadzenia eksperymentu z obrazowaniem żywych komórek za pomocą MBs, pozyskiwania danych obrazowania, do przeprowadzenia analizy danych w celu śledzenia endogennego mRNA w jego naturalnym środowisku komórkowym. Kroki mogą być modyfikowane i dalej optymalizowane, aby sprostać potrzebom badaczy pracujących z innymi typami tkanek/komórek w ich własnych warunkach laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon</td><td>n/a</td><td>Spektrofluorometr zliczania fotonów</td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td><td>Fireflysci (dawniej Precision Cells Inc.)</td><td>Pęseta 701MFL</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501985</td><td>Cienkie pęsety są bardzo ważne do oddzielenia poszczególnych komór na jajka</td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe nr 1 22 mm x 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-048</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>CO2 podkładka anestezjologiczna dla muszek owocowych</td><td>Genesee Scienific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td> <td>konfokalny z wirującym dyskiemMikroskop odwrócony Leica DMI-4000B wyposażony w tarczę obrotową Yokogawa CSU 10 Leica Microsystems Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PatchMan NP 2 Micromanipulator</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920000037</tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz FemtoJet</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>920010504</tr><tr><td>Igła do wstrzykiwań: Femtotips II</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930000043</tr><tr><td>Końcówka ładowania: 20 &mu; L Mikroładowarka</td><td>Eppendorf Inc.</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>Okulary Micro Cover nr 1 lub 1,5, 22 mm x 40 mm</td><td>VWR</td><td>48393-026; 48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Suche drożdże</td><td>Dowolny sklep spożywczy</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Komputer, > 20 GB RAM</td><td></td><td></td><td>Chociaż przetwarzanie można przeprowadzić na większości komputerów, większe możliwości zwiększą szybkość przetwarzania</td></tr></tbody></table>

wizualizacja i śledzenie endogennych mrna w żywych komorach jajowych drosophila melanogaster

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Techniki obrazowania oparte na fluorescencji, w połączeniu z rozwojem mikroskopii świetlnej, zrewolucjonizowały sposób, w jaki biolodzy komórkowi prowadzą badania obrazowania żywych komórek. Metody wykrywania RNA znacznie się rozszerzyły od czasu, gdy badania powiązały lokalizację mRNA specyficzną dla miejsca z regulacją ekspresji genów. Dynamiczne procesy mRNA można teraz wizualizować za pomocą podejść wykrywających mRNA, w połączeniu z zestawami mikroskopowymi, które są wystarczająco szybkie, aby uchwycić dynamiczny zakres zachowania molekularnego. Technologia latarni molekularnej to podejście oparte na hybrydyzacji, zdolne do bezpośredniego wykrywania endogennych transkryptów w żywych komórkach. Latarnie molekularne to wewnętrznie wygaszone, dyskryminujące pojedyncze nukleotydy sondy kwasów nukleinowych, które fluoryzują tylko po hybrydyzacji z unikalną sekwencją docelową. W połączeniu z zaawansowaną mikroskopią fluorescencyjną i obrazowaniem w wysokiej rozdzielczości umożliwiają one przestrzenne i czasowe śledzenie wewnątrzkomórkowego ruchu mRNA. Chociaż technologia ta jest jedyną metodą zdolną do wykrywania endogennych transkryptów, biolodzy komórkowi nie przyjęli jeszcze w pełni tej technologii ze względu na trudności w projektowaniu takich sond do obrazowania żywych komórek. Nowa aplikacja, PinMol, pozwala na ulepszone i szybkie projektowanie sond najlepiej nadających się do efektywnej hybrydyzacji z docelowymi regionami mRNA w żywej komórce. Ponadto akwizycja obrazów w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości i obecne oprogramowanie do analizy obrazów typu open source pozwalają na uzyskanie wyrafinowanych danych, co prowadzi do dokładniejszej oceny złożoności leżącej u podstaw dynamicznych procesów związanych z cyklem życia mRNA.
Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół projektowania i dostarczania molekularnych latarni do komór jajowych Drosophila melanogaster. Bezpośrednie i wysoce specyficzne wykrywanie i wizualizacja endogennych matczynych mRNA odbywa się za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Dane obrazowe są przetwarzane i analizowane za pomocą wykrywania i śledzenia obiektów w oprogramowaniu Icy w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat dynamicznego ruchu mRNA, które są transportowane i lokalizowane w wyspecjalizowanych regionach oocytu.

Za pomocą PinMol można zaprojektować kilka MB dla jednego celu mRNA (Rysunek 1B-C). Po syntezie i oczyszczaniu wybrane MB są charakteryzowane i porównywane za pomocą analizy in vitro.
<img alt="Ekspresja genów w oocycie; schematy struktury RNA, wyniki analizy molekularnej, dane PinMol." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58545/58545fig1.jpg" data-altupdatedat="178825001...

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii RNA dotyczące mechanizmu i funkcji lokalizacji spolaryzowanego RNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym endogennego transportu RNA w żywych tkankach. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii chorób związanych z RNA, ponieważ ma ona potencjał do odkrycia nowych celów terapeutycznych.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w procesy RNA w komorze jajowej muszki owocowej, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak danio pręgowany lub komórki hodowlane. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z powodu wyzwań związanych z projektowaniem i dostarczaniem rekwizytów do latarni molekularnych. W przypadku mikroiniekcji z sygnalizatorem molekularnym wybierz obiektyw olejowy 40X i zamontuj szkiełko nakrywkowe z wypreparowaną komorą na jaja na stoliku mikroskopu.Zlokalizuj komorę jajową w środkowej lub późnej fazie rozwoju, która jest odpowiednio zorientowana na mikrowstrzyknięcie. Następnie należy ustawić mikrowtryskiwacz o odpowiednim ciśnieniu wtrysku i kompensacji. Za pomocą joysticka mikromanipulatora delikatnie opuść igłę załadowaną jednym mikrolitrem roztworu latarni molekularnej do kropli oleju.Ustaw ostrość końcówki na obrzeżach pola widzenia. Wykonać funkcję czyszczenia, aby usunąć powietrze z końcówki igły i upewnić się, że jest przepływ z igły, a następnie ustawić igłę w pozycji wyjściowej. Skoncentruj się na komorze na jaja, która ma być mikroiniekcja, i ustaw igłę z powrotem w ostrości w pobliżu krawędzi komory na jaja.Wykonaj precyzyjną regulację położenia z obiektywu, tak aby błona oddzielająca komórki pęcherzykowe od komórek pielęgniarskich była ostra. Wprowadzić igłę do komórki pielęgniarskiej w celu wstrzyknięcia radiolatarni molekularnych przez okres od dwóch do pięciu sekund. Aby zapewnić powtarzalny sukces mikroiniekcji, należy dokładnie skupić się na błonie oddzielającej komórki pęcherzykowe i komórki pielęgniarskie, które zostaną wstrzyknięte, jednocześnie skupiając końcówkę igły za pomocą mikromanipulatora.Po wstrzyknięciu wszystkich sygnalizatorów molekularnych delikatnie wyjmij igłę i wycofaj ją do pozycji wyjściowej. Zmień obiektyw na żądane powiększenie w celu uzyskania obrazu. Następnie skoncentruj się na komorze jajowej pod nowym obiektywem i rozpocznij akwizycję obrazu.W celu wykrycia punktowego sygnalizatorów molekularnych otwórz obrazy na obrazie J.Użyj narzędzia do konwersji na ICY, aby przekonwertować obrazy z powrotem na ICY. Podziałka skali zostanie automatycznie nałożona na stos. W razie potrzeby edytuj podziałkę liniową za pomocą okna inspektora.Następnie dezaktywuj ikonę oka dla paska skali na karcie warstwy, aby usunąć podziałkę liniową z oryginalnego stosu. Wybierz detekcję i śledzenie, detekcję i detektor punktowy, a następnie potwierdź, że bieżąca detekcja wejścia sekwencji i kanał zerowy są wybrane odpowiednio dla parametrów wejściowych i przetwarzania wstępnego. W przypadku detektora wybierz opcję wykryj jasną plamę na ciemnym tle, używając siły użycia długości fal 2D dla 3D tylko wtedy, gdy w stosach nie ma wystarczającej liczby plasterków z do przeprowadzenia analizy.Wybierz skale i czułość dla każdej skali, dodając więcej skal dla większych plam i potwierdź, że obszar zainteresowania z sekwencji jest ustawiony dla obszaru zainteresowania. W przypadku filtrowania upewnij się, że nie ustawiono żadnego filtrowania, i wybierz odpowiedni format pliku w obszarze Dane wyjściowe. Jeśli wyniki detektora punktowego mają być używane do analizy śledzenia, wybierz eksport do basenu.W celu analizy kolokalizacji powtórz wykrywanie punktowe dla drugiego kanału. Aby śledzić plamki latarni molekularnej, wybierz wykrywanie i śledzenie, śledzenie, śledzenie punktowe i uruchom detektor punktowy przy użyciu tych samych parametrów, co w przypadku wykrywania punktowego. Kliknij przycisk Oszacuj parametry i wybierz żądany ruch docelowy w wyskakującym oknie szacowania parametrów.Następnie kliknij przycisk uruchom śledzenie. Aby zwizualizować ścieżki, wybierz opcje Wykrywanie i śledzenie, Śledzenie i Menedżer ścieżek. W polu Color Track Processor (procesor ścieżek kolorów) wybierz opcję enable (włącz) i wybierz kolor ścieżek.W obszarze Dodaj procesor ścieżek wybierz klip czasowy procesora ścieżek. W oknie kontrolnej maszynki do strzyżenia wprowadź liczbę wykryć, które mają być wyświetlane przed i po bieżącym punkcie czasu. Zapisz informacje o ścieżce jako plik ścieżki XML i użyj ikony aparatu, aby uzyskać zrzut ekranu wyników.Aby wyświetlić stos wzdłuż kierunku z, użyj paska wyszukiwania, aby znaleźć wtyczkę i wybierz maksymalną projekcję z menu rozwijanego. W oknie inspektora wybierz kartę sekwencji, płótno i obrót, aby dostosować obraz do żądanej orientacji i uzyskać zrzut ekranu obróconego obrazu. Następnie wybierz obszar zainteresowania, obszar zainteresowania 2D, wybierz kształt obszaru zainteresowania i wybierz obszar zainteresowania na obrazie do przycięcia.Zainstaluj wtyczkę nakładki znacznika czasu i dodaj znacznik czasu, postępując zgodnie z instrukcjami w wyskakującym okienku, aby uzyskać wskazówki dotyczące umieszczania i formatowania znacznika czasu. Aby zmienić lub dodać interwał czasu, kliknij przycisk edytuj w oknie właściwości sekwencji. Aktywuj ikonę oka, aby dodać z powrotem pasek skali pod zakładką warstwy w oknie inspektora.Następnie uzyskaj zrzut ekranu wyników ze znacznikiem czasu i zapisz obraz w formatach TIFF i AVI. Korzystając z tej metody, jak wykazano, możliwe jest uwidocznienie wzorców transportu i lokalizacji endogennych mRNA za pomocą znaczników molekularnych na różnych etapach oogenezy, a w szczególności na i po środkowej oogenezie. Po wstrzyknięciu indywidualnie do komór jajowych tego samego etapu, różne specyficzne dla oskara latarnie molekularne wykazują ten sam wzorzec lokalizacji.Latarnie molekularne wstrzyknięte do cytoplazmy komórki pielęgniarskiej będą swobodnie dyfundować do sąsiednich komórek pielęgniarskich, a także do oocytu. W ten sposób beacony są w stanie hybrydyzować się ze swoimi celami i generować sygnały fluorescencyjne w innych miejscach niż miejsce mikroiniekcji. W transgenicznych komorach jajowych oskar GFP w połowie oogenezy analiza danych akwizycji wykazuje rozległą kolokalizację sygnału fluorescencji genetycznie zmodyfikowanego mRNA oskara znakowanego GFP z sygnałem fluorescencyjnym wykrytym za pomocą latarni molekularnych.Co więcej, stosy 5D mogą być dalej analizowane w celu wyznaczenia trajektorii mRNA oskara dla transportu na duże odległości zarówno w cytoplazmie komórek pielęgniarskich, jak i oocytów. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią RNA do zbadania endogennego transportu i lokalizacji mRNA matki w komorze jajowej Drosophila.

visualizing-tracking-endogenous-mrnas-live-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Ze względu na ich duży rozmiar i stosunkowo prostą organizację, komórki pielęgniarskie Drosophila idealnie nadają się do badań obrazowania żywych komórek. Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania związków egzogennych do komórek, a przedstawiony protokół demonstruje procedurę z fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi zwanymi latarniami molekularnymi (MB) używanymi do wizualizacji endogennych transkryptów mRNA.

Mikroiniekcja komórek pielęgniarskich Drosophila: metoda dostarczania wewnątrzkomórkowego

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Migracja jądrowa w oocycie Drosophila

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj wizualizację endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster za pomocą sond molekularnych i mikroskopii konfokalnej. Ta metoda pozwala śledzić transport RNA w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów