Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii RNA dotyczące mechanizmu i funkcji lokalizacji spolaryzowanego RNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym endogennego transportu RNA w żywych tkankach. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii chorób związanych z RNA, ponieważ ma ona potencjał do odkrycia nowych celów terapeutycznych.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w procesy RNA w komorze jajowej muszki owocowej, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak danio pręgowany lub komórki hodowlane. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności z powodu wyzwań związanych z projektowaniem i dostarczaniem rekwizytów do latarni molekularnych. W przypadku mikroiniekcji z sygnalizatorem molekularnym wybierz obiektyw olejowy 40X i zamontuj szkiełko nakrywkowe z wypreparowaną komorą na jaja na stoliku mikroskopu.

Zlokalizuj komorę jajową w środkowej lub późnej fazie rozwoju, która jest odpowiednio zorientowana na mikrowstrzyknięcie. Następnie należy ustawić mikrowtryskiwacz o odpowiednim ciśnieniu wtrysku i kompensacji. Za pomocą joysticka mikromanipulatora delikatnie opuść igłę załadowaną jednym mikrolitrem roztworu latarni molekularnej do kropli oleju.

Ustaw ostrość końcówki na obrzeżach pola widzenia. Wykonać funkcję czyszczenia, aby usunąć powietrze z końcówki igły i upewnić się, że jest przepływ z igły, a następnie ustawić igłę w pozycji wyjściowej. Skoncentruj się na komorze na jaja, która ma być mikroiniekcja, i ustaw igłę z powrotem w ostrości w pobliżu krawędzi komory na jaja.

Wykonaj precyzyjną regulację położenia z obiektywu, tak aby błona oddzielająca komórki pęcherzykowe od komórek pielęgniarskich była ostra. Wprowadzić igłę do komórki pielęgniarskiej w celu wstrzyknięcia radiolatarni molekularnych przez okres od dwóch do pięciu sekund. Aby zapewnić powtarzalny sukces mikroiniekcji, należy dokładnie skupić się na błonie oddzielającej komórki pęcherzykowe i komórki pielęgniarskie, które zostaną wstrzyknięte, jednocześnie skupiając końcówkę igły za pomocą mikromanipulatora.

Po wstrzyknięciu wszystkich sygnalizatorów molekularnych delikatnie wyjmij igłę i wycofaj ją do pozycji wyjściowej. Zmień obiektyw na żądane powiększenie w celu uzyskania obrazu. Następnie skoncentruj się na komorze jajowej pod nowym obiektywem i rozpocznij akwizycję obrazu.

W celu wykrycia punktowego sygnalizatorów molekularnych otwórz obrazy na obrazie J.Użyj narzędzia do konwersji na ICY, aby przekonwertować obrazy z powrotem na ICY. Podziałka skali zostanie automatycznie nałożona na stos. W razie potrzeby edytuj podziałkę liniową za pomocą okna inspektora.

Następnie dezaktywuj ikonę oka dla paska skali na karcie warstwy, aby usunąć podziałkę liniową z oryginalnego stosu. Wybierz detekcję i śledzenie, detekcję i detektor punktowy, a następnie potwierdź, że bieżąca detekcja wejścia sekwencji i kanał zerowy są wybrane odpowiednio dla parametrów wejściowych i przetwarzania wstępnego. W przypadku detektora wybierz opcję wykryj jasną plamę na ciemnym tle, używając siły użycia długości fal 2D dla 3D tylko wtedy, gdy w stosach nie ma wystarczającej liczby plasterków z do przeprowadzenia analizy.

Wybierz skale i czułość dla każdej skali, dodając więcej skal dla większych plam i potwierdź, że obszar zainteresowania z sekwencji jest ustawiony dla obszaru zainteresowania. W przypadku filtrowania upewnij się, że nie ustawiono żadnego filtrowania, i wybierz odpowiedni format pliku w obszarze Dane wyjściowe. Jeśli wyniki detektora punktowego mają być używane do analizy śledzenia, wybierz eksport do basenu.

W celu analizy kolokalizacji powtórz wykrywanie punktowe dla drugiego kanału. Aby śledzić plamki latarni molekularnej, wybierz wykrywanie i śledzenie, śledzenie, śledzenie punktowe i uruchom detektor punktowy przy użyciu tych samych parametrów, co w przypadku wykrywania punktowego. Kliknij przycisk Oszacuj parametry i wybierz żądany ruch docelowy w wyskakującym oknie szacowania parametrów.

Następnie kliknij przycisk uruchom śledzenie. Aby zwizualizować ścieżki, wybierz opcje Wykrywanie i śledzenie, Śledzenie i Menedżer ścieżek. W polu Color Track Processor (procesor ścieżek kolorów) wybierz opcję enable (włącz) i wybierz kolor ścieżek.

W obszarze Dodaj procesor ścieżek wybierz klip czasowy procesora ścieżek. W oknie kontrolnej maszynki do strzyżenia wprowadź liczbę wykryć, które mają być wyświetlane przed i po bieżącym punkcie czasu. Zapisz informacje o ścieżce jako plik ścieżki XML i użyj ikony aparatu, aby uzyskać zrzut ekranu wyników.

Aby wyświetlić stos wzdłuż kierunku z, użyj paska wyszukiwania, aby znaleźć wtyczkę i wybierz maksymalną projekcję z menu rozwijanego. W oknie inspektora wybierz kartę sekwencji, płótno i obrót, aby dostosować obraz do żądanej orientacji i uzyskać zrzut ekranu obróconego obrazu. Następnie wybierz obszar zainteresowania, obszar zainteresowania 2D, wybierz kształt obszaru zainteresowania i wybierz obszar zainteresowania na obrazie do przycięcia.

Zainstaluj wtyczkę nakładki znacznika czasu i dodaj znacznik czasu, postępując zgodnie z instrukcjami w wyskakującym okienku, aby uzyskać wskazówki dotyczące umieszczania i formatowania znacznika czasu. Aby zmienić lub dodać interwał czasu, kliknij przycisk edytuj w oknie właściwości sekwencji. Aktywuj ikonę oka, aby dodać z powrotem pasek skali pod zakładką warstwy w oknie inspektora.

Następnie uzyskaj zrzut ekranu wyników ze znacznikiem czasu i zapisz obraz w formatach TIFF i AVI. Korzystając z tej metody, jak wykazano, możliwe jest uwidocznienie wzorców transportu i lokalizacji endogennych mRNA za pomocą znaczników molekularnych na różnych etapach oogenezy, a w szczególności na i po środkowej oogenezie. Po wstrzyknięciu indywidualnie do komór jajowych tego samego etapu, różne specyficzne dla oskara latarnie molekularne wykazują ten sam wzorzec lokalizacji.

Latarnie molekularne wstrzyknięte do cytoplazmy komórki pielęgniarskiej będą swobodnie dyfundować do sąsiednich komórek pielęgniarskich, a także do oocytu. W ten sposób beacony są w stanie hybrydyzować się ze swoimi celami i generować sygnały fluorescencyjne w innych miejscach niż miejsce mikroiniekcji. W transgenicznych komorach jajowych oskar GFP w połowie oogenezy analiza danych akwizycji wykazuje rozległą kolokalizację sygnału fluorescencji genetycznie zmodyfikowanego mRNA oskara znakowanego GFP z sygnałem fluorescencyjnym wykrytym za pomocą latarni molekularnych.

Co więcej, stosy 5D mogą być dalej analizowane w celu wyznaczenia trajektorii mRNA oskara dla transportu na duże odległości zarówno w cytoplazmie komórek pielęgniarskich, jak i oocytów. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią RNA do zbadania endogennego transportu i lokalizacji mRNA matki w komorze jajowej Drosophila.