Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR)

Bakteryjny system CRISPR-Cas9 znacznie zwiększył możliwości eksperymentalne dla naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi. Jednak kilka podejść CRISPR zależy od jednoczesnego dostarczania wielu przewodnikowych RNA do pojedynczych komórek. Klonowanie gRNA z montażem ciągów umożliwia proste i szybkie generowanie wektorów ekspresji multipleksowych gRNA w jednym kroku klonowania.

Ale STAgR jest nie tylko prosty, ale także wydajny, tani i łatwy do dostosowania. Aby rozpocząć, dodaj sekwencje gRNA N20 do starterów amplifikacji do przodu dla ciągu DNA STAgR jako zwisające. Dodaj sekwencje gRNA z poczuciem sensu pięć pierwszych do startera do przodu, startera do przodu rusztowania, dla konwencjonalnego rusztowania lub do startera do przodu SAM dla rusztowania zawierającego MS2.

Następnie dodaj sekwencje gRNA N20 z odwrotnym dopełnieniem do sekwencji starterów odwrotnych, wybierając startery RP, w zależności od użytych konkretnych promotorów i ciągów. Aby rozpocząć generowanie poszczególnych fragmentów klonowania dla Gibson Assembly, przenieś 10 mikrolitrów bufora o wysokiej wierności do tuby. Dodaj jeden mikrolitr 10 milimolowych dNTP i 0,25 mikrolitra obu 100 mikromolowych wysięgów starterów.

Dodaj 10 nanogramów ciągu matrycy DNA lub wektora i 1,5 mikrolitra DMSO. Dodaj tyle wody, aby doprowadzić końcową objętość do 49,5 mikrolitra, a następnie dodaj 0,5 mikrolitra polimerazy HF. Inkubować reakcje na termocyklerze, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie weź 5,5 mikrolitra podwielokrotności z reakcji PCR. Dodaj barwnik ładujący do wszystkich porcji i załaduj go na 1% żel agarozowy. Załaduj odpowiednią drabinkę DNA do wymiarowania i uruchom żel w odpowiednim buforze do pracy z żelem o napięciu 120 woltów przez 30 minut.

Podczas działania żelu dodaj pięć mikrolitrów buforu dostarczonego z enzymem restrykcyjnym i 0,5 mikrolitra DpnI do pozostałych 44,5 mikrolitrów wektorowej reakcji PCR, aby usunąć resztkową matrycę plazmidową używaną podczas PCR. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Sprawdź, czy amplikony mają odpowiedni rozmiar.

Aby rozpocząć oczyszczanie DNA, dodaj 1,8 mikrolitra kulek magnetycznych na jeden mikrolitr produktu PCR i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Za pomocą magnesu oddziel kulki we fragmentach DNA od pozostałej cieczy.

Opłucz granulat 70% etanolem bez całkowitego ponownego zawieszania, aby umyć kulki. Powtórz to pranie jeszcze raz. Za pomocą pipety usuń cały etanol i pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu.

Następnie dodaj 15 do 20 mikrolitrów wody i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać i rozpuścić osad. Użyj magnesu, aby oddzielić kulki od płynu. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki.

Następnie użyj spektrofotometru, aby określić stężenia DNA. Najpierw przygotuj 5x bufor reakcji izotermicznej, jak opisano w protokole tekstowym. W przypadku Gibson Assembly Master Mix połącz 320 mikrolitrów 5x izotermicznego buforu reakcyjnego z 697 mikrolitrami wody.

Dodaj 3 mikrolitry egzonukleazy T5, 20 mikrolitrów polimerazy DNA i 160 mililitrów ligazy DNA Taq. Przenieś 7,5 mikrolitra Assembly Master Mix do świeżej probówki. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra wkładki w wektorze, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Próbki należy inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut. Następnie przechowuj próbki na lodzie lub w temperaturze 20 stopni Celsjusza w celu późniejszej transformacji. Gdy bakterie będą gotowe do przekształcenia, rozmroź na lodzie chemicznie kompetentne bakterie TOP10 E.Coli.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów Gibson Mix do 50 mikrolitrów kompetentnych bakterii i wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza lub bloku grzewczym na 45 sekund, aby wywołać szok cieplny bakterii.

Następnie umieść probówki z powrotem na lodzie. Dodaj 250 mikrolitrów pożywki SOC do bakterii i pozwól im dojść do siebie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze wstrząsającym przez 30 do 45 minut. Po wyzdrowieniu bakterii połóż je na płytkach agarowych o stężeniu 1,5% LB, które zawierają 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Na początek przygotuj co najmniej dwa zestawy 200 mikrolitrowych probówek reakcyjnych PCR dla każdego konstruktu. Napełnij jeden z zestawów probówek reakcyjnych pożywką o pojemności 100 mikrolitrów LB, zawierającą 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.

Za pomocą sterylnej końcówki pipety zdrap materiał biologiczny z jednej kolonii bakteryjnej i rozprowadź go na dnie pustej probówki reakcyjnej PCR o pojemności 200 mikrolitrów. Natychmiast przenieść końcówkę pipety do drugiej odpowiedniej probówki reakcyjnej, która zawiera pożywkę LB. Zakręć końcówką, aby upewnić się, że część bakterii została przeniesiona na podłoże LB.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Następnie przygotuj 10 mikrolitrów PCR Master Mix na probówkę reakcyjną, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać 10 mikrolitrów PCR Master Mix do oznakowanych probówek reakcyjnych PCR, bez pożywki LB.

Za pomocą termocyklera inkubuj reakcje zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj barwnik ładujący do amplifikowanych fragmentów i załaduj je na 1% żel agarozowy. Załaduj odpowiednią drabinkę DNA do wymiarowania i uruchom żel w odpowiednim buforze do pracy z żelem o napięciu 120 woltów przez 30 minut.

Oblicz teoretyczną wielkość amplikonu, sumując poszczególne rozmiary użytych promotorów, rusztowania gRNA i liczbę sekwencji N20. Na podstawie wyników PCR kolonii zidentyfikuj klony bakterii na podstawie prawidłowego rozmiaru pasma i czy istnieje prawdopodobieństwo, że zawierają one prawidłowe wektory. Używając odpowiedniej kultury o pojemności 100 mikrolitrów, zaszczepij 2,5 mililitrową kulturę LB na noc zawierającą 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Następnie użyj komercyjnego mini-zestawu plazmidowego, aby wyekstrahować DNA plazmidu, zgodnie z instrukcjami producenta. W tej procedurze klonowanie gRNA ze składaniem ciągów służy do szybkiego generowania plazmidów ekspresji gRNA.

Typowy wynik PCR używanych do otrzymywania fragmentów STAgR jest widoczny tutaj. Sześć amplikonów reprezentuje liniowe fragmenty DNA, z których każdy zawiera indywidualne sekwencje gRNA N20 na swoich końcach. Szkielet plazmidowy jest rozszerzony o sekwencje celujące gRNA1 i gRNA6, a zatem posiada wymagane nakładanie się na dwa inne PCR do składania Gibsona.

Po oczyszczeniu można osiągnąć wydajność DNA wynoszącą co najmniej jeden mikrogram dla wektorów i insertów. Po montażu Gibsona transformacja bakteryjna prowadzi do powstania od 100 do 700 kolonii bakteryjnych. Reprezentatywna analiza 22 kolonii bakteryjnych za pomocą PCR kolonii zgodnie z protokołem STAgR z sześcioma kasetami gRNA wskazuje, że siedem klonów wykazuje oczekiwany rozmiar amplikonu do pełnego złożenia.

Pozostałe klony prawdopodobnie otrzymały wektory STAgR, zawierające od jednej do pięciu kaset gRNA, podczas gdy jeden klon jest całkowicie pusty. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin. Prawidłowo wykonana pozwala na wygenerowanie wielu multipleksowych wektorów ekspresji gRNA w czasie krótszym niż tydzień roboczy.

Podczas wykonywania tej procedury należy zwrócić uwagę na prawidłowe przypisanie i kombinację podkładów wysięgowych N20. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć własne wektory ekspresji RNA przewodnika multipleksu.