Name: Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Naucz się metody STAgR do klonowania gRNA w aplikacjach CRISPR/Cas9. Ten protokół upraszcza multipleksowanie wektorów gRNA, czyniąc je efektywnym i dostosowywalnym narzędziem dla badaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Dr. Stephanowi Beckowi i Prof. Dr. Jovica Ninkovic za ich wkład, pomoc i wsparcie w rozwoju metody STAgR. Tobiasowi Klötzerowi, Annie Köferle i Valentinowi Baumannowi za pomocne komentarze. Prace były wspierane przez DFG (STR 1385/1-1).

1. Projektowanie strategii klonowania STAgR
<ol>
	<li>Zdecyduj, ile kaset gRNA zostanie uwzględnionych w jednym wektorze ekspresji i w jakiej kolejności. Określ, które promotory i rusztowania gRNA powinny być używane dla każdego z gRNA. Zaprojektuj gRNA za pomocą dowolnego narzędzia online (np. www.benchling.com).</li>
</ol>
2. Projektowanie podkładów klonujących STAgR z nawisami
UWAGA: Sekwencja protospacerowa sensu ostatniego gRNA i antysensowna pierwsza gRNA są dodawane odpowiednio do starterów PCR używanych do amplifikacji szkieletu wektora (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Pozostałe sekwencje są amplifikowane ze strun, dołączając w ten sposób gRNA sensowne i antysensowne w pożądanej kolejności. Pierwszy fragment struny jest amplifikowany starterem do przodu zawierającym pierwszą sekwencję gRNA N20 jako zwis i odwrotnym starterem z drugą sekwencją gRNA N20 (odwrotny dopełniacz) jako zwis. Wszystkie poniższe elementy są generowane odpowiednio.
<ol>
	<li>Dodaj sekwencje N20 gRNA do starterów amplifikacyjnych do przodu dla ciągu DNA STAgR jako zwisy (Tabela 1). Dodaj sekwencje gRNA sensu 5' do startera przedniego "scf-FP" (dla konwencjonalnego rusztowania) lub "sam-FP" (dla rusztowania zawierającego MS2). Startery FP wyżarzają się do rusztowania/części MS2 odpowiedniego ciągu STAgR (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Dodaj sekwencję N20 gRNA odwrotnego dopełniacza do odwrotnych sekwencji starterów. Wybierz startery RP w zależności od konkretnych promotorów i użytych strun (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).</li>
</ol>
3. Generowanie fragmentów klonowania STAgR
<ol>
	<li>Aby wygenerować poszczególne fragmenty klonowania do montażu Gibsona, należy przeprowadzić PCR, umieszczając 10 μl buforu o wysokiej wierności (HF), 1 μl 10 mM dNTP, 0,25 μl wysięgu startera (100 μM), 10 ng matrycy DNA (sznurek lub wektor), 0,5 μl polimerazy HF, 1,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodaćH2O, aby uzyskać końcową objętość 50 μL. 
UWAGA: Użyj plazmidu "STAgR_Neo" jako matrycy dla szkieletowego PCR, aby włączyć rusztowanie gRNA do ostatniego gRNA, jeśli wybrano rusztowanie SAM, użyj "STAgR_SAM". Na przykład w przypadku plazmidu STAgR z sześcioma kasetami gRNA konieczne jest sześć PCR, pięć z ciągami DNA jako matrycami i jeden ze szkieletem wektora jako matrycą.</li>
	<li>Inkubować reakcje na termocyklerze w następujących warunkach: 1 cykl w temperaturze 98 °C przez 1 min 30 s; 38 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 59 °C (w przypadku rusztowania gRNA) / 68 °C (w przypadku pętli SAM) przez 10 s, 72 °C w 30 s (w przypadku wstawek) / 1 min 30 s (w przypadku wektorów); 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
	<li>Usuń 5,5 μl z reakcji PCR, dodaj barwnik ładujący i przeanalizuj amplifikowane fragmenty na 1% żelu agarozowym. Załadować odpowiednią drabinkę DNA do wymiarowania (drabinka DNA 100 pz/drabinka DNA 1 kb) i uruchomić żel w odpowiednim buforze do pracy z żelem (np. buforem TLE) pod napięciem 120 V przez 30 minut.</li>
	<li>Podczas pracy żelu dodać 5 μl buforu dostarczonego z enzymem restrykcyjnym i 0,5 μl DpnI (10 jednostek) do pozostałych 44,5 μl reakcji PCR i inkubować przez 30 minut do 1 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj oczyszczanie DNA za pomocą kulek magnetycznych.
	<ol>
		<li>Dodać 1,8 μl kulek magnetycznych na 1 μl produktu PCR i mieszać, pipetując w górę i w dół. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Oddziel kulki i fragmenty DNA od pozostałej cieczy za pomocą magnesu. Umyj kulki dwukrotnie 70% etanolem, spłukując granulki bez całkowitego ponownego zawieszania.</li>
		<li>Usuń cały etanol za pomocą pipety i pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Rozpuścić osad w 15–20 μlH2O, pipetując w górę i w dół, a następnie oddzielić kulki od cieczy za pomocą magnesu. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki. 
		UWAGA: Alternatywnie można użyć zestawów do czyszczenia reakcji opartych na kolumnach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ stężenia DNA za pomocą spektrofotometru, jak opisano w innym miejscu29.</li>
</ol>
4. Reakcja zespołu Gibsona i transformacja bakteryjna
UWAGA: Poniższe kroki są zaczerpnięte z Gibson et al.30.
<ol>
	<li>Przygotuj domową mieszankę reakcyjną Gibsona lub użyj komercyjnego zestawu do klonowania Gibsona.
	<ol>
		<li>Połączyć 3 ml 1 M Tris (tris(hydroksymetylo)aminometanu)-HCl o pH 7,5, 300 μL 1 M MgCl, 60 μL 100 mM dGTP (trifosforan deoksyguanozyny), 60 μL 100 mM dATP (trifosforan deoksyadenozyny), 60 μL 100 mM dTTP (trifosforan deoksytymidyny), 60 μL 100 mM dCTP (trifosforan deoksycytydyny), 300 μL 1 M DTT (ditiotreitol), 1,5 g PEG-8000 (glikol polietylenowy), 300 μL 100 mM NAD (dinukleotyd nikotynamidoadeninowy) i dodaćH2O, aby otrzymać 6 ml 5× buforu do reakcji izotermicznej. 
		UWAGA: Podany bufor może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez co najmniej 12 miesięcy.</li>
		<li>W przypadku głównej mieszanki montażowej Gibsona połącz 320 μl 5x buforu reakcji izotermicznej z 697 μl H2O i dodaj 3 μl 10 U/μL egzonukleazy T5, 20 μl polimerazy DNA 2 U/μL i 160 μl 40 U/μL Ligazy DNA Taq. 
		UWAGA: Mieszanina ta może być porcjowana i przechowywana w temperaturze -20 °C przez co najmniej 12 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj 7,5 μl mieszanki wzorcowej zespołu z 2,5 μl wkładki i wektora. W przypadku reakcji 2x STAgR należy użyć stosunku wektora molowego do wstawienia wynoszącego 1:1, ale łącznie nie więcej niż 0,2 pmol DNA. W przypadku kaset ekspresyjnych więcej niż 2 gRNA należy użyć stosunku wektora do wstawienia 1:3, ale nie należy przekraczać całkowitej ilości DNA wynoszącej 0,5 pmol. 
	UWAGA: Wszystkie amplifikowane kasety ekspresji gRNA powinny być używane w ilościach równomolowych. Dołącz kontrolę plazmidu z identyczną ilością wektora, ale bez wstawek do kontroli niestrawionego wektora matrycowego (i/lub samoligacji).</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze 50 °C przez 45–60 minut. Próbki należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze -20 °C w celu późniejszego przekształcenia. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Bezpośrednio przekształć połowę mieszanki w chemicznie kompetentne bakterie.
	<ol>
		<li>Rozmrozić chemicznie kompetentne bakterie TOP10 E. coli na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 5 μl mieszanki Gibsona do 50 μl kompetentnych bakterii. Delikatnie wymieszaj, przesuwając spód tubki. Inkubować na lodzie przez 30 minut.</li>
		<li>Wykonaj szok termiczny, umieszczając rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C lub bloku grzewczym na 45 sekund.</li>
		<li>Umieść probówki z powrotem na lodzie. Dodać 250 μl pożywki SOC do bakterii i pozostawić je do odzyskania w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 30–45 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po odzyskaniu należy umieścić przekształcone bakterie na płytkach agarowych z 1,5% bulionu lizogennego (LB) zawierających ampicylinę (100 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Wybór klonów STAgR metodą Bacterial Colony PCR
<ol>
	<li>Przygotuj co najmniej dwa zestawy probówek reakcyjnych PCR o pojemności 200 μl (od 3 do 24) dla każdego konstruktu, które są identycznie oznakowane.</li>
	<li>Napełnij jeden zestaw 100 μl pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej końcówki pipety zeskrobać materiał biologiczny jednej kolonii bakteryjnej i rozprowadzić go na dnie pustej probówki reakcyjnej PCR o pojemności 100 μl. Natychmiast przenieść końcówkę do drugiej odpowiedniej probówki reakcyjnej zawierającej pożywkę LB.</li>
	<li>Delikatnie obracaj końcówką, aby upewnić się, że część bakterii została przeniesiona do pożywki LB i inkubuj w temperaturze 37 °C do późniejszego użycia.</li>
	<li>Ustawić główną mieszankę PCR (10 μl na reakcję).
	<ol>
		<li>Na 10 reakcji połącz 10 μl buforu Taq, 2 μl 10 mM dNTP, 0,5 μl startera (100 μM), 0,5 μl polimerazy Taq i dodajH2Odo objętości 100 μL.</li>
		<li>Użyj następujących starterów: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 10 μl głównej mieszanki PCR do znakowanych probówek reakcyjnych PCR bez pożywki LB.</li>
	<li>Inkubować reakcje na termocyklerze w następujących warunkach: 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 5 minut, 38 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 2 minuty; 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 10 minut 
	UWAGA: Czas elongacji (krok 72 °C) powinien być zwiększany wraz z liczbą kaset ekspresyjnych gRNA. Obliczyć teoretyczny rozmiar wkładek przy użyciu tabeli 2 i zastosować 1 minutę na 1 kb w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Dodaj barwnik ładujący i przeanalizuj amplifikowane fragmenty na 1% żelu agarozowym. Załaduj odpowiednią drabinkę DNA do wymiarowania (1kb DNA Ladder) i uruchom w odpowiednim żelu bufor do pracy (np. bufor TLE) pod napięciem 120 V przez 30 minut.</li>
	<li>Oblicz teoretyczną wielkość amplikonu za pomocą tabeli 2, sumując poszczególne wielkości użytych promotorów, rusztowań gRNA i liczbę sekwencji N20. Na podstawie wyników PCR kolonii zidentyfikuj klony bakterii na podstawie prawidłowego rozmiaru pasma i tego, czy są one siedliskiem prawidłowych wektorów.</li>
	<li>Zaszczepić 2,5 ml nocnej kultury LB (ze 100 μg/ml ampicyliny) odpowiednią kulturą o objętości 100 μl, założoną wcześniej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.</li>
	<li>Ekstrakcja DNA plazmidu za pomocą komercyjnego mini zestawu plazmidu i instrukcji producenta31.</li>
	<li>Sekwencjonuj plazmidy za pomocą następujących starterów: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGGGCACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) i StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) metodą sekwencjonowania Sangera.</li>
</ol>

<ol><li>Barrangou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+CRISPR-Cas+immune+systems+and+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines.</a> Genome Biol. 16, 247(2015).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Pulecio, J., Verma, N., Mejia-Ramirez, E., Huangfu, D., Raya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Engineering+of+the+Epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Engineering of the Epigenome.</a> Cell Stem Cell. 21 (4), 431-447 (2017).</li>
<li>Köferle, A., Stricker, S. H., Beck, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26089986">Brave new epigenomes: the dawn of epigenetic engineering.</a> Genome Med. 7 (1), 59(2015).</li>
<li>Stricker, S. H., Koferle, A., Beck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+profiles+to+function+in+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From profiles to function in epigenomics.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (1), 51-66 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Maeder, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNA-guided+activation+of+endogenous+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes.</a> Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).</li>
<li>Lekomtsev, S., Aligianni, S., Lapao, A., Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+and+reversion+of+chromosomal+translocations+using+CRISPR%2FCas+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient generation and reversion of chromosomal translocations using CRISPR/Cas technology.</a> BMC Genomics. 17 (1), 739(2016).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+site-specific+chromosomal+translocations+in+embryonic+stem+cells+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of site-specific chromosomal translocations in embryonic stem cells by CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 6, 21918(2016).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+genomic+fragment+deletion+and+functional+gene+cassette+knock-in+via+Cas9+protein+mediated+genome+editing+in+one-cell+rodent+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Large genomic fragment deletion and functional gene cassette knock-in via Cas9 protein mediated genome editing in one-cell rodent embryos.</a> Scientific Reports. 5, 17517(2015).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+genomic+fragment+deletions+and+insertions+in+mouse+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Large genomic fragment deletions and insertions in mouse using CRISPR/Cas9.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0120396(2015).</li>
<li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+modification+by+CRISPR-Cas9+nickase+with+minimal+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient genome modification by CRISPR-Cas9 nickase with minimal off-target effects.</a> Nature Methods. 11 (4), 399-402 (2014).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+evolving+homing+CRISPR+barcodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapidly evolving homing CRISPR barcodes.</a> Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).</li>
<li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li>
<li>Bultmann, S., Stricker, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+post-epigenomic+age%3A+back+to+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Entering the post-epigenomic age: back to epigenetics.</a> Open Biology. 8 (3), (2018).</li>
<li>Vora, S., Tuttle, M., Cheng, J., Church, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+stop+for+the+CRISPR+revolution%3A+RNA+guided+epigenetic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Next stop for the CRISPR revolution: RNA guided epigenetic regulators.</a> FEBS Journal. , (2016).</li>
<li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25337876">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li>
<li>Nageshwaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Guide+RNA+Cloning+for+Mammalian+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2018).</li>
<li>Wrighton, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+Multiplex+genome+engineering+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: Multiplex genome engineering in eukaryotes.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (1), 6-7 (2018).</li>
<li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+enhanced+by+Drosha-mediated+sgRNA-shRNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure.</a> Scientific Reports. 6, 38970(2016).</li>
<li>Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+CRISPR%2FCas9-based+genome+engineering+from+a+single+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector.</a> Nucleic Acids Research. 42 (19), 147(2014).</li>
<li>Cress, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPathBrick%3A+Modular+Combinatorial+Assembly+of+Type+II-A+CRISPR+Arrays+for+dCas9-Mediated+Multiplex+Transcriptional+Repression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPathBrick: Modular Combinatorial Assembly of Type II-A CRISPR Arrays for dCas9-Mediated Multiplex Transcriptional Repression in E. coli.</a> ACS Synthetic Biology. 4 (9), 987-1000 (2015).</li>
<li>Port, F., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmenting+CRISPR+applications+in+Drosophila+with+tRNA-flanked+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs.</a> Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS ONE. 13 (4), 0196015(2018).</li>
<li>Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1982).</li>
<li>Koferle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CORALINA%3A+a+universal+method+for+the+generation+of+gRNA+libraries+for+CRISPR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CORALINA: a universal method for the generation of gRNA libraries for CRISPR-based screening.</a> BMC Genomics. 17 (1), 917(2016).</li>
<li>Koferle, A., Stricker, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Universal+Protocol+for+Large-scale+gRNA+Library+Production+from+any+DNA+Source%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56264(2017).</li>
<li>Vidigal, J. A., Ventura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+one-step+generation+of+paired+gRNA+CRISPR-Cas9+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries.</a> Nature Communications. 6, 8083(2015).</li>
<li>Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+in+human+cells+using+all-in-one+CRISPR%2FCas9+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system.</a> Scientific Reports. 4, 5400(2014).</li>
<li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+CRISPR%2FCas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół dla STAgR pozwalający na szybkie i proste generowanie plazmidów ekspresyjnych gRNA o różnych rozmiarach. Protokół ten może być stosowany do jednoetapowego generowania plazmidów gRNA z kasetami ekspresyjnymi 2-8 gRNA (z lub bez dwóch aptamerów MS2 RNA) do wektora ekspresji gRNA STAgR_Neo oraz przy użyciu ludzkich promotorów U6, mysiego U6, ludzkiego 7sK i ludzkiego H1 28,32,33. Jeśli wymagane są więcej niż cztery kasety, zaleca się użycie co najmniej dwóch różnych typów promotorów/rusztowań w celu zwiększenia wydajności. Inne wektory, promotory i kombinacje promotorów, a także więcej niż 8 kaset gRNA mogą być również wykonalne; Nie zostało to jednak przetestowane. Chociaż z naszego doświadczenia wynika, że metoda działa niezawodnie i powtarzalnie, określiliśmy krytyczne kroki i strategie rozwiązywania problemów, jeśli oczekiwany wynik nie nastąpi natychmiast. Z naszego doświadczenia wynika, że niektóre kroki mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tego podejścia: przede wszystkim ważne jest, aby na etapie montażu Gibsona (3:1) zastosować prawidłowe proporcje molowe wkładek do szkieletu wektorowego (3:1). Zauważyliśmy jednak, że w przypadku niektórych zestawów gRNA stosunek wstawień do wektora 1:1 jest korzystny, nawet jeśli liczba kaset gRNA przekracza dwa. Po drugie, okres reakcji montażu Gibsona powinien być odpowiednio długi (zalecane co najmniej 45 minut).
STAgR może być stosowany z dużą liczbą modyfikacji. Sekwencje docelowe, liczby gRNA i rusztowania, promotory i szkielety wektorów można dostosowywać i dowolnie łączyć. Jednak każda kombinacja może mieć nieco inne wymagania. Z naszego doświadczenia wynika, że jeśli pożądana jest średnia lub duża liczba kaset gRNA (>4), ale nie uzyskana natychmiast, zwykle najszybszym sposobem przezwyciężenia tego problemu jest zmiana kolejności poszczególnych kaset gRNA w wektorze. Podobnie, połączenie różnych promotorów i rusztowań gRNA poprawia wydajność (a tym samym obniża wymaganą liczbę PCR kolonii, które muszą zostać ocenione), gdy klonowanych jest wiele kaset gRNA. Odkryliśmy, że niepoprawne klony są zwykle generowane przez spontaniczną koniunkcję powtarzających się sekwencji podczas montażu Gibsona. Chociaż może to zmniejszyć skuteczność metody, powoduje to również jednoczesne generowanie wektorów z funkcjonalnymi podzbiorami gRNA28.
Generowanie multipleksowanych wektorów gRNA zawierających więcej niż jedną kasetę ekspresji gRNA opisano za pomocą wielu różnych metod 21,22,23,24,25,26,27. Podczas gdy niektóre wykorzystują jednoczesne lub sekwencyjne klonowanie par gRNA22,34, inne polegają na montażu Golden Gate i kilku sekwencyjnych krokach klonowania25,35. Specjalne podejście zostało zastosowane przez Xie i wsp., wykorzystując endogenny komórkowy system przetwarzania tRNA do wycięcia kilku gRNA z jednego transkryptu progenitorowego36. Zaletą tej metody jest wymóg tylko jednego promotora; wadą jest potrzeba nowo zsyntetyzowanych fragmentów DNA dla każdej kombinacji gRNA. Każda metoda multipleksowania gRNA ma zalety i wady; STAgR łączy prostotę z wydajnością, dużą liczbę możliwych kaset gRNA z niskimi kosztami.
STAgR (i inne systemy multipleksowania) prawdopodobnie odegrają zasadniczą rolę w umożliwieniu skutecznego (i jednoczesnego) zakłócenia wielu genów in vivo, jak to zapoczątkowano w mózgach danio pręgowanego28. Innym przyszłym zastosowaniem wektorów multipleksujących gRNA jest obietnica manipulacji kompletnymi programami transkrypcyjnymi, w przeciwieństwie do indukcji lub represji pojedynczych genów. Prawdopodobnie te podejścia pozwolą na przekształcanie komórek i narządów w dowolnym stopniu w znacznie większym stopniu niż jest to możliwe obecnie.

Klonowanie gRNA (STAgR) to metoda umożliwiająca efektywne generowanie przez noc wektorów ekspresyjnych zawierających wiele kaset ekspresyjnych gRNA w jednym kroku klonowania. Protokół STAgR nie jest zależny od specjalistycznej wiedzy ani materiałów i oferuje wiele opcji dostosowania.
Bakteryjne białko CRISPR Cas9 ma unikalną zdolność. Jest w stanie znaleźć i selektywnie związać tylko te sekwencje DNA, które są zakodowane w naturalnie występujących crRNA lub zmodyfikowanych gRNAs1. Jego wykorzystanie jako narzędzia molekularnego umożliwiło wiele podejść, które do niedawna były niemożliwe, niewykonalne lub ograniczały się tylko do niektórych modeli komórkowych. Należą do nich ukierunkowane mutacje genów2, inżynieria genomu3, epigenome editing4,5,6, aktywacja transkrypcyjna i wyciszanie genów7,8. O ile nam wiadomo, CRISPR jest uniwersalny, ponieważ istnieją doniesienia o jego zastosowaniu dla szerokiego zakresu miejsc docelowych, typów komórek i gatunków. Jednak wiele zastosowań CRISPR zależy bezpośrednio lub pośrednio od dostarczania wielu gRNA, w tym serii manipulacji genomowych (translokacje9,10, medium11 i dużych zmian genomowych12,13), inżynieria genomu (użycie Cas9 nickases14, generowanie alleli warunkowych11,15 lub mutacje seryjne16) i strategie śledzenia17. Co więcej, dla innych podejść (inżynieria transkrypcyjna18, epigenome engineering19,20) wiele stron docelowych nie jest ściśle obowiązkowych, jednak osiągają maksymalny efekt często tylko w tym warunku.
Opisano kilka użytecznych metod generowania wektorów gRNA zawierających więcej niż jedną kasetę z wyrażeniami gRNA21,22,23,24,25,26,27. W tym miejscu przedstawiamy protokół STAgR, klonowania gRNA ze składaniem ciągów, który wyróżnia się połączeniem prostoty i szybkości (potrzebny jest tylko jeden etap klonowania przez noc), niskiego kosztu (ponieważ matryce DNA mogą być wielokrotnie wykorzystywane), możliwości dostosowania (dla różnych systemów gRNA i promotorów) i skuteczności (pozwala na generowanie wektorów zawierających dużą liczbę kaset gRNA)28.
STAgR może być w zasadzie używany do generowania wektorów ekspresyjnych z niewielką liczbą (1-2 gRNA), kilkoma (3-5 gRNA) i jedną z najwyższych liczby kaset ekspresyjnych zgłoszonych do tej pory (6-8 gRNA)28. Podobnie STAgR ma zastosowanie do dowolnej sekwencji gRNA, szkieletu lub promotora. Ponieważ jednak STAgR opiera się głównie na reakcjach łańcuchowych polimerazy (PCR) i składaniu Gibsona, gRNA o dużym podobieństwie sekwencji powinny być generowane przy użyciu metody alternatywnej.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności Phusion Polimeraza</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>dla Gibson Master Mix, a także wszystkie PCR,</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0191</td><td>dNTPs dla wszystkich PCR,</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Life Technology</td><td>R0141</td><td>dNTPs dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Life Technology</td><td>R0151</td><td>dNTP dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Life Technology</td><td>R0161</td><td>dNTP dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dTTP</td><td>Life Technology</td><td>R0171</td><td>dNTP dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>Tris HCL</td><td>Roth</td><td>9090.2</td><td>dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Life Technology</td><td>R0861</td><td>dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC-077</td><td>dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>T5 Egzonukleaza</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligaza</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>dla Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 1 kb Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencje</td><td></td><td></td><td>plazmidowe i starterowe Wszystkie sekwencje dostępne w Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q).</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td><td>dla buforu TLE</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td> dla chemicznie <td>kompetentnych bakterii Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Top10</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td>dla bulion lizogeniczny (LB Media)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>do bulionu lizogenicznego (LB Media)</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>do bulionu lizogenicznego (LB Media)</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>do bulionu lizogenicznego (LB Media)</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

konfigurowalny protokół klonowania grna ze składaniem ciągów (stagr)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

Bakteryjny system CRISPR/Cas9 znacznie zwiększył możliwości metodologiczne dla naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi. Ze względu na jego wykorzystanie, inżynieria genetyczna i genomiczna znalazła zastosowanie w szerokim zakresie systemów. Co więcej, wiele podejść inżynierii transkrypcyjnej i epigenomicznej jest obecnie po raz pierwszy powszechnie wykonalnych. Jednym z powodów szerokiego zastosowania CRISPR jest jego dwuczęściowy charakter. Małe gRNA determinują cele genomowe kompleksu, warianty białka Cas9 i lokalne konsekwencje molekularne. Jednak wiele podejść CRISPR opiera się na jednoczesnym dostarczaniu wielu gRNA do pojedynczych komórek. W tym miejscu przedstawiamy konfigurowalny protokół klonowania gRNA (STAgR), metodę, która umożliwia proste, szybkie i wydajne generowanie multipleksowanych wektorów ekspresji gRNA w jednym kroku klonowania. STAgR jest opłacalny, ponieważ (w tym protokole) poszczególne sekwencje docelowe są wprowadzane przez startery o krótkim zwisie, podczas gdy długie matryce DNA kaset ekspresyjnych gRNA mogą być wielokrotnie wykorzystywane. Co więcej, STAgR umożliwia jednoetapową inkorporację dużej liczby gRNA, a także kombinacji różnych wariantów gRNA, wektorów i promotorów.

Postępowanie zgodnie z niniejszym protokołem umożliwia opracowanie spersonalizowanych wektorów gRNA do multipleksowania (Rysunek 1). Reprezentatywne wyniki podejść STAgR z wykorzystaniem sześciu różnych kaset gRNA przedstawiono w Rycina 2. Rysunek 2A przedstawia typowy wynik reakcji PCR wykorzystanych do otrzymania fragmentów STAgR (protokół 3.1-3.3). Sześć amplikonów (BB, S1-S5) stanowi liniowe fragmenty DNA zawierające na końcach poszczególne sekwencje N20 gRNA. Szkielet plazmidu (BB) jest obecnie rozszerzony o sekwencje celujące gRNA1 i gRNA6, a zatem posiada wymagane nakładki z dwiema innymi produktami PCR (S1 i S5) niezbędne do montażu metodą Gibsona (Rysunek 2A, Tabela 3). Po oczyszczaniu uzyskano wydajność DNA na poziomie co najmniej 1 µg można uzyskać w przypadku wektorów i insertów.
Po przeprowadzeniu Gibson assembly transformacja bakteryjna powinna doprowadzić do powstania od 100 do 700 kolonii bakteryjnych. Rysunek 2B przedstawia reprezentatywną analizę 10 kolonii bakteryjnych za pomocą metody colony PCR, zgodnie z protokołem STAgR z wykorzystaniem sześciu kaset gRNA. Elektroforeza w żelu wskazuje, że trzy klony wykazują oczekiwaną wielkość amplikonu dla pełnego montażu (Tabela 2). Inne klony prawdopodobnie otrzymały wektory STAgR zawierające od jednej do pięciu kaset gRNA, natomiast jeden klon (Rycina 2B, nr 18) jest puste.
<img alt="Schemat edycji genów z starterami, niciami i matrycami szkieletowymi; integracja sekwencji promotora." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd projektowania starterów STAgR. Najpierw wybierany jest numer gRNA i rusztowania (scaffolds), następnie kolejność gRNA i promotor, a na koniec typ wektora. Dla każdego gRNA projektowany jest specyficzny starter prawy (forward) z sekwencją celującą gRNA w orientacji sens oraz częścią wspólną „scf-FP” lub „sam-FP”. Podobnie, aby wygenerować poszczególne startery lewe (reverse), odpowiednia sekwencja promotora (RP) jest łączona z odwróconym dopełnieniem sekwencji N20 kolejnego gRNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Elektroforeza żelu PCR; analiza nici/wektora; wyniki gRNA; wizualizacja fragmentów DNA; schemat eksperymentu" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki metod STAgR z użyciem sześciu różnych kaset gRNA. (A) Reprezentatywny przykład PCR pięciu insertów oraz wektora STAgR_Tomato. (B) Colony PCR reakcji 6x STAgR z użyciem promotorów hU6 i mU6 oraz kanonicznego gRNA i rusztowań SAM. Przeanalizowano 22 kolonie bakterii, z których 7 wykazało oczekiwany prążek wskazujący na pełny montaż. Marker: 1 kb plus, liczby w parach zasad (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Starter forward dla String i Vector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter odwrotny dla String i Vector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Sekwencje starterów dla rusztowań gRNA i promotorów.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Wielkości promotorów i rusztowań.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rusztowanie gRNA</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMloop + rusztowanie gRNA</td>
			<td>143 pz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Teoretyczne wielkości każdej kasety ekspresyjnej do obliczenia wyniku PCR kolonii.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Wielkości promotorów i rusztowań.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+74 bp</td>
			<td>+67 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM</td>
			<td>428 pz</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Obliczone rozmiary fragmentów STAgR po PCR.

Tutaj prezentujemy klonowanie gRNA (STAgR), metodę łatwego multipleksowania wektorów gRNA dla podejść CRISPR/Cas9. STAgR sprawia, że multipleksowanie gRNA jest proste, wydajne i konfigurowalne.

Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Bakteryjny system CRISPR-Cas9 znacznie zwiększył możliwości eksperymentalne dla naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi. Jednak kilka podejść CRISPR zależy od jednoczesnego dostarczania wielu przewodnikowych RNA do pojedynczych komórek. Klonowanie gRNA z montażem ciągów umożliwia proste i szybkie generowanie wektorów ekspresji multipleksowych gRNA w jednym kroku klonowania.Ale STAgR jest nie tylko prosty, ale także wydajny, tani i łatwy do dostosowania. Aby rozpocząć, dodaj sekwencje gRNA N20 do starterów amplifikacji do przodu dla ciągu DNA STAgR jako zwisające. Dodaj sekwencje gRNA z poczuciem sensu pięć pierwszych do startera do przodu, startera do przodu rusztowania, dla konwencjonalnego rusztowania lub do startera do przodu SAM dla rusztowania zawierającego MS2.Następnie dodaj sekwencje gRNA N20 z odwrotnym dopełnieniem do sekwencji starterów odwrotnych, wybierając startery RP, w zależności od użytych konkretnych promotorów i ciągów. Aby rozpocząć generowanie poszczególnych fragmentów klonowania dla Gibson Assembly, przenieś 10 mikrolitrów bufora o wysokiej wierności do tuby. Dodaj jeden mikrolitr 10 milimolowych dNTP i 0,25 mikrolitra obu 100 mikromolowych wysięgów starterów.Dodaj 10 nanogramów ciągu matrycy DNA lub wektora i 1,5 mikrolitra DMSO. Dodaj tyle wody, aby doprowadzić końcową objętość do 49,5 mikrolitra, a następnie dodaj 0,5 mikrolitra polimerazy HF. Inkubować reakcje na termocyklerze, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie weź 5,5 mikrolitra podwielokrotności z reakcji PCR. Dodaj barwnik ładujący do wszystkich porcji i załaduj go na 1% żel agarozowy. Załaduj odpowiednią drabinkę DNA do wymiarowania i uruchom żel w odpowiednim buforze do pracy z żelem o napięciu 120 woltów przez 30 minut.Podczas działania żelu dodaj pięć mikrolitrów buforu dostarczonego z enzymem restrykcyjnym i 0,5 mikrolitra DpnI do pozostałych 44,5 mikrolitrów wektorowej reakcji PCR, aby usunąć resztkową matrycę plazmidową używaną podczas PCR. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Sprawdź, czy amplikony mają odpowiedni rozmiar.Aby rozpocząć oczyszczanie DNA, dodaj 1,8 mikrolitra kulek magnetycznych na jeden mikrolitr produktu PCR i mieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Za pomocą magnesu oddziel kulki we fragmentach DNA od pozostałej cieczy.Opłucz granulat 70% etanolem bez całkowitego ponownego zawieszania, aby umyć kulki. Powtórz to pranie jeszcze raz. Za pomocą pipety usuń cały etanol i pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu.Następnie dodaj 15 do 20 mikrolitrów wody i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać i rozpuścić osad. Użyj magnesu, aby oddzielić kulki od płynu. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki.Następnie użyj spektrofotometru, aby określić stężenia DNA. Najpierw przygotuj 5x bufor reakcji izotermicznej, jak opisano w protokole tekstowym. W przypadku Gibson Assembly Master Mix połącz 320 mikrolitrów 5x izotermicznego buforu reakcyjnego z 697 mikrolitrami wody.Dodaj 3 mikrolitry egzonukleazy T5, 20 mikrolitrów polimerazy DNA i 160 mililitrów ligazy DNA Taq. Przenieś 7,5 mikrolitra Assembly Master Mix do świeżej probówki. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra wkładki w wektorze, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Próbki należy inkubować w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 45 do 60 minut. Następnie przechowuj próbki na lodzie lub w temperaturze 20 stopni Celsjusza w celu późniejszej transformacji. Gdy bakterie będą gotowe do przekształcenia, rozmroź na lodzie chemicznie kompetentne bakterie TOP10 E.Coli.Następnie dodaj pięć mikrolitrów Gibson Mix do 50 mikrolitrów kompetentnych bakterii i wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza lub bloku grzewczym na 45 sekund, aby wywołać szok cieplny bakterii.Następnie umieść probówki z powrotem na lodzie. Dodaj 250 mikrolitrów pożywki SOC do bakterii i pozwól im dojść do siebie w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze wstrząsającym przez 30 do 45 minut. Po wyzdrowieniu bakterii połóż je na płytkach agarowych o stężeniu 1,5% LB, które zawierają 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Na początek przygotuj co najmniej dwa zestawy 200 mikrolitrowych probówek reakcyjnych PCR dla każdego konstruktu. Napełnij jeden z zestawów probówek reakcyjnych pożywką o pojemności 100 mikrolitrów LB, zawierającą 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.Za pomocą sterylnej końcówki pipety zdrap materiał biologiczny z jednej kolonii bakteryjnej i rozprowadź go na dnie pustej probówki reakcyjnej PCR o pojemności 200 mikrolitrów. Natychmiast przenieść końcówkę pipety do drugiej odpowiedniej probówki reakcyjnej, która zawiera pożywkę LB. Zakręć końcówką, aby upewnić się, że część bakterii została przeniesiona na podłoże LB.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Następnie przygotuj 10 mikrolitrów PCR Master Mix na probówkę reakcyjną, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać 10 mikrolitrów PCR Master Mix do oznakowanych probówek reakcyjnych PCR, bez pożywki LB.Za pomocą termocyklera inkubuj reakcje zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj barwnik ładujący do amplifikowanych fragmentów i załaduj je na 1% żel agarozowy. Załaduj odpowiednią drabinkę DNA do wymiarowania i uruchom żel w odpowiednim buforze do pracy z żelem o napięciu 120 woltów przez 30 minut.Oblicz teoretyczną wielkość amplikonu, sumując poszczególne rozmiary użytych promotorów, rusztowania gRNA i liczbę sekwencji N20. Na podstawie wyników PCR kolonii zidentyfikuj klony bakterii na podstawie prawidłowego rozmiaru pasma i czy istnieje prawdopodobieństwo, że zawierają one prawidłowe wektory. Używając odpowiedniej kultury o pojemności 100 mikrolitrów, zaszczepij 2,5 mililitrową kulturę LB na noc zawierającą 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Następnie użyj komercyjnego mini-zestawu plazmidowego, aby wyekstrahować DNA plazmidu, zgodnie z instrukcjami producenta. W tej procedurze klonowanie gRNA ze składaniem ciągów służy do szybkiego generowania plazmidów ekspresji gRNA.Typowy wynik PCR używanych do otrzymywania fragmentów STAgR jest widoczny tutaj. Sześć amplikonów reprezentuje liniowe fragmenty DNA, z których każdy zawiera indywidualne sekwencje gRNA N20 na swoich końcach. Szkielet plazmidowy jest rozszerzony o sekwencje celujące gRNA1 i gRNA6, a zatem posiada wymagane nakładanie się na dwa inne PCR do składania Gibsona.Po oczyszczeniu można osiągnąć wydajność DNA wynoszącą co najmniej jeden mikrogram dla wektorów i insertów. Po montażu Gibsona transformacja bakteryjna prowadzi do powstania od 100 do 700 kolonii bakteryjnych. Reprezentatywna analiza 22 kolonii bakteryjnych za pomocą PCR kolonii zgodnie z protokołem STAgR z sześcioma kasetami gRNA wskazuje, że siedem klonów wykazuje oczekiwany rozmiar amplikonu do pełnego złożenia.Pozostałe klony prawdopodobnie otrzymały wektory STAgR, zawierające od jednej do pięciu kaset gRNA, podczas gdy jeden klon jest całkowicie pusty. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin. Prawidłowo wykonana pozwala na wygenerowanie wielu multipleksowych wektorów ekspresji gRNA w czasie krótszym niż tydzień roboczy.Podczas wykonywania tej procedury należy zwrócić uwagę na prawidłowe przypisanie i kombinację podkładów wysięgowych N20. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć własne wektory ekspresji RNA przewodnika multipleksu.

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Białko związane z CRISPR, Cpf1, może być prowadzone przez specjalnie zaprojektowane RNA CRISPR (crRNA) do rozszczepiania dwuniciowego DNA w pożądanych miejscach, generując lepkie końce. Na podstawie tej cechy ustalono standard składania DNA (C-Brick), a protokół szczegółowo opisujący jego użycie opisano tutaj.

Protokoły standardowego montażu DNA C-Brick przy użyciu Cpf1

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Tutaj przedstawiono prostą, efektywną i opłacalną metodę klonowania sgRNA.

Przewodnik CRISPR Klonowanie RNA dla systemów ssaków

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Adaptowalny moduł klonowania molekularnego Gibson Assembly został wykorzystany w formacie kursu opartego na kursie licencjackim (CURE) dla studentów kursów laboratoryjnych biologii molekularnej. Ocena efektów uczenia się studentów wykazała lepsze zrozumienie i pewność siebie w klonowaniu molekularnym po ukończeniu CURE, a nowe plazmidy sklonowano do badań nad biosyntezą produktów naturalnych.

Poprawa wyników studentów dzięki adaptacyjnemu doświadczeniu badawczemu na studiach licencjackich opartym na kursie klonowania molekularnego

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Naucz się metody STAgR do klonowania gRNA w aplikacjach CRISPR/Cas9. Ten protokół upraszcza multipleksowanie wektorów gRNA, czyniąc je efektywnym i dostosowywalnym narzędziem dla badaczy.

Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR)

Przeglądaj więcej filmów