Name: Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj model hodowli rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran przy użyciu oczu świni. Ta metoda pozwala oceniać toksyczność leków i regenerację tkanek w kontrolowanym środowisku 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH-NEI R01 EY024942, Research to Prevent Blindness, Upstate Medical University Unrestricted Research Funds, oraz Lions District 20-Y. Mikroskopia i analiza obrazu skrawków parafiny zostały przeprowadzone w Microscopy CORE, a przygotowanie preparatu histologicznego zostało wykonane w Biorepository and Pathology CORE w Icahn School of Medicine w Mount Sinai.

1. Hodowla organów
<ol>
	<li>Preparaty
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór agarowy w następujący sposób. W małej kolbie przygotować 1% agaru i 1 mg/ml kolagenu bydlęcego w DMEM-F12 do 20 ml. Doprowadź do wrzenia na gorącym talerzu. Umieścić roztwór w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Umieść probówkę w łaźni wodnej na płycie grzejnej, aby zapobiec zastygnięciu roztworu.</li>
		<li>Przygotować uzupełnioną pożywkę bezsurowicową (SSFM) zgodnie ze składem podanym w Tabeli Materiałów. 
		nuta: Niezbędna ilość SSFM do przygotowania zależy od liczby rogówek, które mają być przetworzone. Zwykle 30 ml wystarcza na 4 rogówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie 
	nuta: Wykonaj ten krok w okapie presektoryjnym lub okapie chemicznym. Oczy są wysyłane z pokrywkami nadal przymocowanymi w oddzielnych torebkach w celu ochrony kul.
	<ol>
		<li>Usuń kule z pokrywek za pomocą ostrza chirurgicznego o prostej krawędzi na desce do krojenia oczyszczonej etanolem. Usuń nadmiar tkanki tłuszczowej z oka za pomocą ostrza lub małych nożyczek (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A, 3B).</li>
		<li>Po zdjęciu kuli z pokrywy przytrzymaj kulę z tyłu za pomocą kleszczy i natychmiast zanurz oko w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Szybko zanurz 3x w 10% jodu (w zlewce o pojemności 100 ml). Szybko zanurz 2x w PBS (~100 ml w zlewce, często zmieniaj PBS).</li>
		<li>Za pomocą czystego ręcznika lub chusteczki owiń oko obwodowo z wystarczającym naciskiem, aby uzyskać napiętą powierzchnię rogówki do przecięcia trepaną. 
		UWAGA: Uważaj, aby ręcznik lub chusteczka nie stykały się z rogówką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postrzelaj
	<ol>
		<li>Użyj trepanacji 6 mm, aby owinąć środek rogówki. Penetrować nabłonek i zrąb przedni bez wykonywania rany o pełnej grubości przez całą rogówkę. 
		nuta: Jeśli śródbłonek zostanie przeniknięty, nastąpi utrata ciśnienia i wyciek płynu. W takim przypadku oko należy wyrzucić.</li>
		<li>Umieść trepanację na środku rogówki, obróć ją o 180° zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara 5x (każda zmiana kierunku będzie liczona jako jeden raz), jednocześnie lekko uciskając, aby pogłębić ranę. 
		nuta: Rana powinna być teraz na tyle głęboka, aby umożliwić uniesienie płata tkanki za pomocą kleszczy. Jeśli tak nie jest, powtórz krok 1.3.2.</li>
		<li>Podnieś klapkę z krawędzi. W tym samym czasie, drugą ręką lub drugą osobą, użyj ostrza, tnąc równolegle do gałki ziemskiej, aby odciąć tkankę, podczas gdy kleszcze nadal unoszą się z przedniej rogówki w obrębie brzegu rany. Na końcu tego kroku powinna znajdować się okrągła rana znajdująca się w środku rogówki (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3C, 3D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wycinanie i usuwanie rogówki z kuli ziemskiej
	<ol>
		<li>Trzymając oko tkanką, wykonaj małe nacięcie w odległości 1 mm od krawędzi rogówki za pomocą ostrza, tak aby rąbek został włączony do hodowli narządu.</li>
		<li>Za pomocą małych, ostrych nożyczek uzyskaj dostęp do nacięcia utworzonego w poprzednim kroku, aby przeciąć wokół kuli ziemskiej, zachowując milimetrowy margines w całej rogówce, aby rąbek pozostał nienaruszony.</li>
		<li>Umieść rogówkę w naczyniu o średnicy 60 mm z 1 ml PBS, nawiniętą stroną do dołu, aż do zamontowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Upewnij się, że agar osiągnął wysoką temperaturę (około 25 °C).</li>
		<li>Za pomocą dwóch par kleszczy utwórz miseczkę, trzymając dwie strony rogówki śródbłonkiem do góry. Dodaj podgrzany roztwór agaru do rogówki za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia, aż będzie pełna.</li>
		<li>Po stwardnieniu agaru (zwykle około 30-45 s) ostrożnie odwróć rogówkę z agarem na płytkę o średnicy 60 mm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3E). Przykryj pokrywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja
	<ol>
		<li>Dodać 4 ml SSFM do płytki, utrzymując rogówkę na granicy powietrzno-płynnej na granicy rąbka w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Odświeżać pożywkę po 24 godzinach, a następnie co drugi dzień. 
		nuta: W przypadku wykonywania transfekcji do rany należy pominąć antybiotyki do czasu transfekcji.</li>
		<li>Zwilż powierzchnię rogówki raz dziennie, dodając 1 kroplę SSFM z kondycjonowanego podłoża w naczyniu, aby utrzymać wilgoć. W tym celu wyjmij naczynie z inkubatora, umieść je pod maską, zdejmij pokrywkę naczynia, zwilż powierzchnię pożywką z naczynia za pomocą sterylnej pipety, ponownie przykryj i włóż z powrotem do inkubatora.</li>
		<li>W przypadku knockdownu genu należy potraktować ranę siRNA ukierunkowanym na gen lub kontrolnym, które jest skompleksowane do nośnika za pośrednictwem lipidów zgodnie z instrukcjami dostawcy (patrz poniżej).</li>
		<li>Wymieszać 5 μl (50 pmol) siRNA z 50 μl minimalnej ilości niezbędnej pożywki o obniżonej surowicy (np. Opti-MEM). Zmieszać 2 μl odczynnika do transfekcji z 50 μl pożywki o zredukowanej surowicy. Pozostaw na 5 minut, a następnie wymieszaj.</li>
		<li>Dodać 200 μl pożywki o obniżonej surowicy do mieszaniny odczynnik/siRNA.</li>
		<li>Pipetę należy wnosić kroplami na ranę i inkubować przez 3 godziny.</li>
		<li>Wypłucz siRNA z powierzchni rogówki za pomocą pożywki w naczyniu. Zmień pożywkę inkubacyjną na SSFM + antybiotyki (patrz Tabela Materiałów). Kontynuuj inkubację, jak wspomniano wcześniej (kroki 1.6.1-1.6.2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Histologia: Skrawki parafinowe i barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Przygotowanie tkanki
	<ol>
		<li>Po dwutygodniowej inkubacji, jeśli używasz części tkanki do ilościowej analizy łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), przed utrwaleniem przetnij rogówkę na pół przez ranę. Umieść tę połowę lub tylko 1/4 (albo jest to wystarczająca tkanka) w stabilizującym odczynniku chroniącym RNA.</li>
		<li>Za pomocą standardowego zestawu do izolacji wyizoluj RNA i wykonaj qRT-PCR. 
		nuta: Alternatywnie, tylko zraniona część może być izolowana i testowana pod kątem ekspresji genów.</li>
		<li>Umieść drugą połowę rogówki w kasetach patologii tkanek i zanurz w utrwalaczu (10% formalina) na 2-4 dni w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Parafina osadza tę połowę zranionej rogówki przy użyciu standardowych technik. 
		nuta: Ustaw zranioną rogówkę tak, aby upewnić się, że przekrój tkanki wytworzy przekrój rogówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne przy użyciu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)
	<ol>
		<li>Dzień 1
		<ol>
			<li>Prawidłowo oznacz slajdy za pomocą ołówka. Odparafinować tkankę, umieszczając szkiełka w słoiku ze środkiem czyszczącym (2 zmiany po 10 minut).</li>
			<li>Ponownie nawodnić tkankę, przenosząc szkiełka do etanolu w zmniejszających się stężeniach (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20,5 min na każdą zmianę).</li>
			<li>Pobrać antygen poprzez podgrzewanie szkiełek w kuchence mikrofalowej w plastikowym słoiku z buforem cytrynianowym (10 mM, pH 6,4) przez 5 minut. Pierwszy cykl 5 min przy 50% mocy. Napełnij słoik buforem cytrynianowym i powtórz. Schładzać przez 10 min.</li>
			<li>Umyć 3x PBS po 2 min. Przepuszczalność tkanek za pomocą 1% Triton X-100 w PBS 10 min w RT. Blokuj skrawki 3% normalną surowicą kozią (NGS) przez 1 godzinę w RT w wilgotnej komorze.</li>
			<li>Inkubować tkankę z przeciwciałem pierwszorzędowym (1:100 lub zgodnie z sugestią dostawcy) w 3% NGS przez noc w temperaturze 4 °C (300 μl na szkiełko).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dzień 2
		<ol>
			<li>Przepłucz szkiełka 3x PBST (PBS plus 1% Tween 20), po 2 minuty każda. Umieść szkiełka w 3% H2O2 na 10 minut, aby zablokować endogenną peroksydazę. Umyć 3x PBST po 2 min. Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym HRP (1:250) w 3% NGS przez 1 godzinę w RT (300 μl na szkiełko).</li>
			<li>Szkiełka myjące 3x PBST po 2 min każda. Traktuj slajdy za pomocą zestawu DAB. Dodawać 300 μl/szkiełko przez 3 min. Umyj szkiełka za pomocą dH2O 2x (szybkie zanurzenia).</li>
			<li>Przeciwbarwienie hematoksyliną przez 20 s. Umyj szkiełko za pomocą dH2O 2x (szybkie zanurzenia). Bejcować środkiem niebieszczącym przez 20 s. Płukać w dH2O przez 20 s. Odwodnić tkankę, umieszczając szkiełka w rosnących stężeniach etanolu (50%, 70%, 100%, 100%, wszystkie szybkie zanurzenia).</li>
			<li>Suche ślizgi na ręczniku papierowym pod maską przez 10-20 min.</li>
			<li>Zamontuj szkiełka za pomocą 1 kropli nośnika montażowego, pokrywa z szkiełkiem nakrywkowym. Etykietuj i przechowuj w RT.</li>
			<li>Zobrazuj szkiełka pod mikroskopem i określ ilościowo sygnał DAB za pomocą ImageJ7 (patrz sekcja 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne: Fluorescencja
	<ol>
		<li>W dniu 1 wykonaj czynności opisane w kroku 2.2.1. Wykonaj następujące czynności w dniu 2.</li>
		<li>Płucz szkiełka 3x w PBST przez 2 minuty każda. Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluoroforem w 3% NGS (1:200) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Prać 3x w PBST po 2 min. Zamontuj szkiełka za pomocą 1 kropli 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Suszyć na ręczniku papierowym pod maską przez 30 min. Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja za pomocą obrazu J
	<ol>
		<li>Pobierz wersję "Fiji" ImageJ, która zawiera niezbędne wtyczki do ilościowego oznaczania barwienia DAB.</li>
		<li>Otwórz obraz na Fidżi i wybierz Obraz → Kolor → Dekonwolucja kolorów.</li>
		<li>Wybierz "H DAB" jako plamę, a następnie kliknij OK. Pojawią się trzy nowe obrazy. Wybierz obraz, który zawiera tylko barwienie DAB.</li>
		<li>Aby określić ilościowo tylko barwienie zrębu, użyj funkcji gumki ImageJ, aby usunąć nabłonek z obrazu DAB.</li>
		<li>Wybierz pozycję Analizuj → Mierz (lub Ctrl + M) i zarejestruj wartość.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten opisuje model do badania gojenia się ran w naturalnym warstwowym środowisku 3D. Zastosowanie hodowli narządowej jako produktu pośredniego między hodowlą komórkową a badaniami in vivo znacznie obniża koszty, a także zmniejsza liczbę procedur na żywych zwierzętach. Inne modele 3D przyniosły ogromne korzyści w tej dziedzinie, w tym samosyntetyzujące się żele kolagenowe wykonane z pierwotnych ludzkich fibroblastów rogówki2 lub te same komórki osadzone w żelach wykonanych z kolagenów pocho...

Blizny na rogówce wynikające z urazu, urazu lub infekcji mogą prowadzić do osłabiającego zmętnienia i trwałej utraty wzroku. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania ścieżek, które mogą być ukierunkowane na interwencję terapeutyczną. Obecne możliwości leczenia są ograniczone i polegają głównie na przeszczepach rogówki, które nie są dostępne dla pacjentów na całym świecie. Zarówno ludzkie (ryc. 1), jak i zwierzęce rogówki mogą być wykorzystywane do badań 2D i 3D nad hodowlami komórkowymi1,2. Rogówki ze zwłok ludzkich, które nie nadają się do przeszczepu, można uzyskać z banków oczu lub scentralizowanych banków tkanek (National Disease Research Interchange (NDRI)), a oczy zwierząt można uzyskać z rzeźni. Pierwotne komórki nabłonka rogówki, fibroblasty zrębu, a ostatnio komórki śródbłonka, mogą być izolowane i hodowane z tych tkanek w celu gojenia ran i badań toksykologicznych3,4,5. Oprócz znaczenia zrozumienia molekularnych podstaw choroby oczu powodującej ślepotę, dostępność tkanek i zdolność do hodowli komórek pierwotnych sprawiły, że rogówka stała się ważnym systemem modelowym do badań. Rogówka jest idealna do testowania wpływu środków na blizny, ponieważ normalna rogówka jest przezroczysta, a niektóre rodzaje ran tworzą zmętnienia lub blizny zwłóknieniowe (recenzja w6). Kilka modeli gojenia ran rogówki in vivo zostało również szeroko wykorzystanych w badaniach nad bliznami1. Rzadziej wykorzystywany jest model gojenia ran rogówki ex vivo7,8, który jest szczegółowo opisany tutaj. Celem tej metody jest ilościowe określenie wyników bliznowacenia charakteryzujących się zwłóknieniami w systemie 3D wielokomórkowego modelu rogówki ex vivo.
Ranienie nabłonka rogówki, które nie narusza błony podstawnej nabłonka, zwykle zamyka się w ciągu 24-72 godzin9. Wkrótce po zranieniu komórki na krawędzi nabłonka zaczynają się rozprzestrzeniać i migrować na wolną powierzchnię nabłonka, aby przywrócić funkcję bariery nabłonkowej. Po tej aktywności następuje sekwencyjnie aktywacja proliferacji komórek podstawnych rogówki, a w późniejszym etapie komórek prekursorowych zlokalizowanych w zewnętrznej strefie rąbka w celu odzyskania masy komórek nabłonka10,11. Rany te często goją się bez blizn. Jednak rana, która przenika przez błonę podstawną do zrębu, często powoduje powstawanie blizn1. Po zranieniu zrębu rogówki, zrąb jest wypełniony komórkami różnego pochodzenia, w tym zróżnicowanymi rezydentnymi komórkami zrębu, a także fibrocytami pochodzącymi ze szpiku kostnego12,13,14. Bliznowacenie zwłóknieniowe charakteryzuje się utrzymywaniem się miofibroblastów w gojącej się ranie. Te patologiczne miofibroblasty wykazują zwiększoną adhezję poprzez akumulację integryn w zrostach ogniskowych, włóknach stresowych aktyny mięśni α gładkich (α-SMA) oraz miejscową aktywację macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) sekwestrowanego utajonego czynnika wzrostu transformującego beta (TGFβ). Różnicowanie komórek pochodzących z nabłonka, znane jako przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT), może również przyczyniać się do powstawania blizn6.
Istnieje delikatna równowaga między różnicowaniem komórek a apoptozą po zranieniu. Z powodu pęknięcia błony podstawnej, czynniki wzrostu, takie jak płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) i TGFβ z łez i nabłonka, obmywają zrąb, indukując różnicowanie miofibroblastów, utrzymującą się autokrynną pętlę aktywacji TGFβ i wydzielanie zdezorganizowanego zwłóknienia ECM15,16. Utrzymywanie się miofibroblastów w zagojonej ranie sprzyja zamgleniu i bliznowaceniu rogówki (ryc. 2). Jednak w zagojonej regeneracyjnie ranie, mimo że rozwijają się miofibroblasty, ulegają one apoptozie, a zatem ich liczba jest nieobecna lub znacznie zmniejszona w zagojonej tkance (przegląd w referencji6,10). W związku z tym badania nad bliznowaceniem zwłóknieniowym skupiły się przynajmniej częściowo na celowaniu w cząsteczki, które zapobiegają nadmiernemu rozwojowi miofibroblastów lub utrzymywaniu się miofibroblastów17,18. Ponieważ trwałość miofibroblastów charakteryzuje zarówno bliznowacenie, jak i chorobę zwłóknieniową we wszystkich tkankach19, rogówka może być przydatna jako system modelowy do badania ogólnych komórkowych mechanizmów zwłóknienia.
W naszym systemie modelowym, rogówka jest raniona cylindrycznym ostrzem zwanym trepanacją, będąc jeszcze w kuli ziemskiej. Rogówki ludzkie i świńskie można zranić za pomocą trepanacji o średnicy 6 lub 7 mm; W przypadku rogówek króliczych preferowana jest trepanacja o średnicy 6 mm. Rogówka świni jest podobna pod względem wielkości do rogówki ludzkiej. Ponieważ są one opłacalne i łatwo dostępne w dużych ilościach, rogówki świń są rutynowo używane do hodowli narządów. Co więcej, przeciwciała i siRNA zdolne do reagowania z człowiekiem konsekwentnie reagowały krzyżowo ze świnią7. Po zranieniu rogówki są wycinane z kuli ziemskiej z nienaruszonym rąbkiem i montowane na podstawie agaru/kolagenu. Rogówki są hodowane w pożywkach bez surowicy oraz stabilizowanej witaminie C, aby symulować proliferację fibroblastów i osadzanie ECM20. Ani dodanie surowicy, ani czynników wzrostu nie jest potrzebne do indukowania tworzenia miofibroblastów7. Rogówki są rutynowo naprawiane i przetwarzane do badania histologicznego po dwóch tygodniach hodowli. W przypadku knockdownu genu lub w celu przetestowania wpływu czynnika na gojenie się ran, rana może być leczona za pomocą siRNA w ranie po zranieniu7 lub można dodać do podłoża odpowiednio środek rozpuszczalny8.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>Paciorkowiec do długopisu&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670049</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen bydlęcy Solution</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Oczy świni z dołączonymi powiekami&nbsp;</td><td>Pel-freeze, Arkansas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6,0 mm trepanacja&nbsp;</td>Ostrze chirurgiczne <td>Katena</td><td>K28014</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Personna</td><td>0.009</td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Fisher</td><td>895110</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fisher</td><td>08953-F</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes&nbsp;</td><td>Kimberly-Clark&trade; 34120</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych 60 mm&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Uzupełnione podłoże wolne od surowicy (SSFM)</td><td></td><td></td><td>Dodaj wszystkie następujące składniki do DMEM/F-12:&nbsp; ITS, RPMI, Glutation, L-glutamina, MEM Aminokwasy endogenne, MEM Pirogronian sodu, ABAM, gentamycyna, witamina C.&nbsp; </td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>ITS Suplement do płynnych pożywek&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>100X</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Roztwór witamin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7256</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>Stosować przy 1 &mikro; g/ml. Zamrażanie podwielokrotności; Nie używać ponownie po rozmrożeniu.</td></tr><tr><td>1% roztwór L-glutaminy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100x</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>100x</td></tr><tr><td>MEM Roztwór pirogronianu sodu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td>1 M Zapasy (1,000x) i zamrozić w jednorazowych aliquits. Używaj z zamrażarki za każdym razem, gdy przygotowywane są nośniki.</td></tr><tr><td>ABAM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7292</td><td>100x</td></tr><tr><td>gentamycyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>30-005-CR</td><td>200x</td></tr><tr><td>Witamina C&nbsp;</td><td>Wako</td><td>070-0483</td><td>2-0-aD Kwas glukopiranozylo-askorbinowy. 1 mM zapasy (1000x)</td></tr><tr><td>10% jodu&nbsp;</td><td>Kasety Fisher Chemical</td><td>SI86-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Path&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia (NGS)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>Używamy 3%</td></tr><tr><td>pożywki montażowej NGS&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczny Przezroczysty&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>314-629</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Ultra Pure</td><td>200CSGP</td><td>200 Proof, rozcieńczony w 100%, 70%, 50%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP327</td><td>10 mM, pH 6,4</td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>EMD Milipore</td><td>M10742500</td><td></td></tr><tr><td>Środek niebieszczący&nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>220-106</td><td></td></tr><tr><td>1% Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td>Rozcieńczony w PBS</td></tr><tr><td>0,1% Tween 20&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP337</td><td>Rozcieńczony w PBS</td></tr><tr><td>3% nadtlenku wodoru&nbsp;</td><td>Zestaw Fisher</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>DAB&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>BP1423-500</td><td>Roztwór agaru: przygotuj 1% agar i 1 mg / ml kolagenu bydlęcego w DMEM-F12 do 20 ml</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bermis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> Wilgotna <td>Użyj dowolnej komory, przykryj ją mokrą chusteczką do wycierania, a następnie nałóż na nią warstwę Parafilmu.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNAprotect Odczynnik komórkowy</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp; 76104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>12183018A Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>anty-fibronektynowo-EDA</td><td>Sigma</td><td>F6140</td><td>1:200 Rozcieńczony w&nbsp; 3% normalna surowica kozia</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-alfa aktyny mięśni gładkich</td><td>Sigma</td><td>A2547 lub C6198 (sprzężone cy3)</td><td>1:200 Rozcieńczone w 3% normalnej surowicy koziej</td></tr><tr><td>Permafluor&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Gt anty -MS IgG (H+L) Przeciwciało wtórne, HRP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>62-6520</td><td>1:100 rozcieńczony w 3% normalnej surowicy koziej (do barwienia a-SMA, DAB)</td></tr><tr><td>Gt przeciwciało wtórne anty -MS IgM (H+L), HRP&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA1-85999</td><td>1:100 rozcieńczony w 3% normalnej surowicy koziej (do barwienia FN-EDA, DAB)</td></tr><tr><td>Gt anty -MS IgG (H+L) Przeciwciało wtórne, Cy3&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-146</td><td>1:200 Rozcieńczony w&nbsp; 3% normalna surowica kozia (dla a-SMA, barwienie fluorescencyjne)</td></tr><tr><td>&nbsp; Zeiss Axioplan2&nbsp;</td><td>Przyrządy diagnostyczne Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope SPOT-2</td><td>, Sterling Heights, kamera</td><td></td><td></td> CCD Michigan</tr></tbody></table>

model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Rogówka była szeroko wykorzystywana jako system modelowy do badania gojenia się ran. Możliwość generowania i wykorzystywania pierwotnych komórek ssaków w dwuwymiarowej (2D) i trójwymiarowej (3D) hodowli wygenerowała bogactwo informacji nie tylko na temat biologii rogówki, ale także na temat gojenia się ran, biologii miofibroblastów i blizn w ogóle. Celem protokołu jest system testowy do ilościowego określania rozwoju miofibroblastów, który charakteryzuje bliznowacenie. Demonstrujemy model hodowli narządów rogówki ex vivo na oczach świni. W tej ranie po keratektomii przedniej rogówki znajdujące się jeszcze w kuli ziemskiej są ranione okrągłym ostrzem zwanym trepanacją. Usuwa się czop składający się z około 1/3 przedniej rogówki, w tym nabłonka, błony podstawnej i przedniej części zrębu. Po zranieniu rogówki są wycinane z kuli, montowane na bazie kolagenu/agaru i hodowane przez dwa tygodnie w pożywce wolnej od surowicy z dodatkiem stabilizowanej witaminy C w celu zwiększenia proliferacji komórek i wydzielania macierzy zewnątrzkomórkowej przez rezydujące fibroblasty. Aktywacja miofibroblastów w przednim zrębie jest widoczna w zagojonej rogówce. Model ten może być wykorzystany do oznaczania zamykania ran, rozwoju miofibroblastów i markerów zwłóknienia oraz do badań toksykologicznych. Ponadto w tym systemie można przetestować wpływ inhibitorów małocząsteczkowych, a także transfekcji siRNA za pośrednictwem lipidów w celu knockdownu genów.

Immunohistochemia jest głównym testem wykorzystywanym do analizy powodzenia eksperymentu gojenia ran ex vivo. Rysunek 4 przedstawia nabłonek i stromę przednią w tkance kontrolnej (Rysunek 4A, 4B). Sześć godzin po zranieniu nabłonek był nieobecny (Rysunek 4C, 4D). Sześć dni po zranieniu, zgodnie z oczekiwaniami, nabłonek odrósł (Rysunek 4E</strong...

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

W niniejszej pracy opisano prostą metodę oceny procesu gojenia ran w trójwymiarowym, wielokomórkowym modelu hodowli organów. Do przeprowadzenia tej analizy wykorzystaliśmy oczy świń, jednak metoda ta jest możliwa do zastosowania nawet przez osoby nieznające budowy oka. W ramach przeglądu procedury: otrzymaliśmy oczy świń, wycięliśmy gałki oczne, a następnie wykonaliśmy okrągły otwór w rogówce, przechodzący przez nabłonek oraz około jednej trzeciej grubości rąbka.Wycinamy rogówkę, montujemy ją na podłożu z agaru, a następnie umieszczamy tak przygotowany preparat w inkubatorze. Tkanka zacznie wypełniać ubytek, tworząc bliznę w rogówce. Nie ma potrzeby dodawania czynników wzrostu ani nawet surowicy.Procedurę tę przeprowadza się w pośrodku bezsurowiczym. Chociaż proces ten odbywa się w rogówce, może on służyć jako system modelowy dla włóknistego gojenia ran w ujęciu ogólnym, ponieważ wiele szlaków komórkowych aktywowanych podczas bliznowacenia jest podobnych w różnych układach.W komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając chirurgicznego skalpela, oddziel gałkę oczną od powieki na oczyszczonej etanolem desce do krojenia, a następnie usuń nadmiar tkanki tłuszczowej z każdego oka.

ex-vivo-corneal-organ-culture-model-for-wound-healing-studies

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół przygotowania i uprawy rozszczepionych guzików rogówki u świń. Ponieważ ten typowy dla organoorganizacji model hodowli narządów wykazuje wskaźnik umieralności komórek w ciągu 15 dni, porównywalny z ludzkimi rogówkami dawców, stanowi on pierwszy model umożliwiający długotrwałą hodowlę rogówek innych niż ludzkie bez dodawania toksycznego dekstranu.

Model hodowli śródbłonka śródbłonka rogówki świni przy użyciu podzielonych guzików rogówki

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę tworzenia modelu ex vivo świńskiego zapalenia bakteryjnego rogówki. Pseudomonas aeruginosa jest używany jako organizm prototypowy. Ten innowacyjny model naśladuje infekcję in vivo, ponieważ namnażanie się bakterii zależy od zdolności bakterii do uszkadzania tkanki rogówki.

Ustanowienie modelu rogówki ex vivo świni do badania leczenia farmakologicznego przeciwko bakteryjnemu zapaleniu rogówki

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Stripping Only Descemeta to eksperymentalna procedura, w której pacjenci z centralnym gutem rogówki wynikającym z dystrofii śródbłonka Fuchsa mają usuniętą błonę Descemeta na potrzeby komórek obwodowych w celu regeneracji warstwy śródbłonka. Przedstawiono nowatorską metodologię symulującą DSO w dystroficznych rogówkach ludzkich ex vivo z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez eFGF1 (NM141).

Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Obecny protokół pokazuje różne etapy związane z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Regenerujące się lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Poznaj model hodowli rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran przy użyciu oczu świni. Ta metoda pozwala oceniać toksyczność leków i regenerację tkanek w kontrolowanym środowisku 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Przeglądaj więcej filmów