Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek
17 listopada 2018
Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.
Przedstawiono metodę analizy obrazu na żywo wychwytu cholesterolu LDL do różnych typów komórek ludzkich. Pozwala to na badania przesiewowe w kierunku związków, które modyfikują transport cholesterolu LDL. Główną zaletą stosowania obrazowania żywych komórek do ilościowego oznaczania napływu LDL jest to, że umożliwia monitorowanie morfologii komórek przez cały czas trwania testu, dzięki czemu można potencjalnie wykryć toksyczne związki.
Na początek odessaj pożywkę z wcześniej przygotowanych komórek i umyj komórki 5 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco. Zassać DPDS. Następnie, aby odłączyć komórki od 100-milimetrowej naczynia, dodaj 1,5 mililitra 0,25% trypsyny-EDTA dla komórek HepG2 i dodaj 1,5 mililitra 0,05% roztworu trypsyny-EDTA dla komórek HK2 lub HCAEC.
Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery minuty. Następnie zneutralizuj trypsynę, dodając 3 mililitry kompletnej pożywki dla komórek HepG2 i HCAEC. Użyj 3 mililitrów roztworu neutralizującego trypsynę, narusz DPDS 5% płodową surowicą bydlęcą lub FBS dla komórek HK2.
Przenieś komórki do stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów, a następnie odwiruj probówki o masie 250 g przez pięć minut. Po wirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórek w kompletnym pożywce. Delikatnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o siatce 40 mikronów, aby rozbić grudki komórek.
Policz komórki i ułóż je w zoptymalizowanej gęstości na 24-dołkowej płytce. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić przyczepienie się komórek. Następnego dnia zmień pożywkę komórkową na pożywkę bazową bez FBS dla linii komórkowej plus 5% surowicy z niedoborem lipoprotein lub 2% pożywki FBS.
Użyj 500 mikrolitrów całkowitej pożywki na studzienkę w 24-dołkowej płytce. Następnie kontynuuj inkubację przez 24 godziny, aby zagłodzić komórki. Wraz z etapem głodzenia lub następnego dnia, komórki mogą być traktowane pożądanymi związkami i odpowiednimi kontrolami.
24 godziny po głodzeniu dodaj 5 mikrolitrów LDL znakowanego na czerwono pHrodo do każdej studzienki zawierającej 500 mikrolitrów pożywki, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikrogramów na mililitr. Ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki z dołków. Natychmiast po dodaniu znakowanego LDL umieścić płytkę w inkubatorze systemu analizy żywych komórek i pozostawić płytkę do wyrównania przez 15 minut, aby zmniejszyć kondensację na płytce.
Podczas inkubacji komórek otwórz oprogramowanie i zaplanuj skanowanie, dodając naczynie trzymające płytkę. Obraz 16 obrazów na studzienkę, dodawaj jednogodzinne odstępy przy 10-krotnym powiększeniu przez cztery godziny, korzystając z kanałów czerwonego i fazowego. Następnie utwórz mapę płyt do wykorzystania do przetwarzania danych, wybierz zakładkę właściwości i wybierz mapę płyt.
Wprowadź typ komórki w zakładce komórek i zabiegi w kranie złożonym. Następnie kliknij kartę regionów, wybierz każdy zestaw replik i przypisz regiony. Po zakończeniu przebiegu eksperymentalnego utwórz zestaw obrazów w oprogramowaniu, aby wytrenować komputer w zakresie ilościowego określania każdego parametru zawartego w zestawie zliczającym.
W oprogramowaniu otwórz widok blachy, a następnie w polu narzędzi zadania analizy wybierz opcję utwórz lub dodaj do kolekcji obrazów. Wybierz nową kolekcję obrazów, wpisz nazwę kolekcji obrazów, a następnie wybierz kanały czerwony i fazowy, zaznaczając pola obok kanałów. Wybierz pięć kolejnych obrazów z różnych źródeł i punktów czasowych, a następnie dodaj je do kolekcji obrazów, dodając je do bieżącej kolekcji obrazów.
W polu narzędzia zadania analizy wybierz nową definicję przetwarzania, wybierz kolekcję obrazów z menu rozwijanego, wprowadź parametry dla typu komórek. W polu podglądu użyj menu rozwijanego, aby wybrać opcję Podgląd wszystkiego. W polu maski analizy zaznacz pola maski przecięcia i czerwonej maski obiektu, aby wyświetlić obszar uwzględniony w analizie dla definicji przetwarzania.
Przewiń kolekcję obrazów, aby upewnić się, że komórki i LDL są zawarte w masce. Wybierz plik i zapisz definicję przetwarzania. Następnie otwórz widok płyty doświadczalnej, aby przeanalizować zestaw obrazów z przebiegu eksperymentalnego.
W polu Narzędzia zadania analizy wybierz opcję uruchom nowe zadanie analizy, a następnie wybierz zapisaną definicję przetwarzania. Nazwij zadanie analizy, wybierz zakres czasu do analizy i wyróżnij studnie eksperymentalne do analizy. Wybierz przycisk uruchamiania.
Po zakończeniu zadania analizy wyeksportuj dane, wybierz zakończoną analizę i naciśnij przycisk View. W menu narzędzi wybierz eksport wykresu metryki. W menu regionów wybierz wszystkie dołki, a w menu grupy, aby uzyskać średnią wartość dla każdego zestawu studni jako grupy, wybierz duplikaty.
Aby wyeksportować indywidualne wartości dla każdej studni, nie wybierz żadnej. Z menu metryki czerwonego obiektu wybierz całkowitą intensywność zintegrowanego czerwonego obiektu. Wybierz przycisk eksportu danych.
Sprawdź podział danych na poszczególne obrazy. Dane są automatycznie kopiowane do schowka i można je wkleić do nowego pliku arkusza kalkulacyjnego. W menu metryki obiektu fazy wybierz zbieg, a następnie kliknij przycisk eksportu danych.
Na karcie monitów zaznacz opcję Podziel dane na poszczególne obrazy. Dane są automatycznie kopiowane do schowka i można je wkleić do pliku arkusza kalkulacyjnego zawierającego dane o całkowitej intensywności zintegrowanego z czerwonym obiektem. Teraz wyeksportowane dane można znormalizować, zgodnie z krokami 4.1.7 i 4.1.8 protokołu, aby uzyskać końcowe wartości absorpcji LDL.
Po leczeniu preparatem Dynasore lub rekombinowanym PCSK9 wszystkie trzy badane ludzkie linie komórkowe wykazały znaczne zmniejszenie napływu LDL w ciągu czterech godzin. Napływ LDL zmniejszył się w ludzkich komórkach raka wątroby lub HepG2, po leczeniu Dynasore w czasie, w porównaniu z komórkami leczonymi DMSO jako kontrola. Obrazowanie na żywych komórkach napływu LDL do komórek HepG2 w różnych punktach czasowych wykazało wzrost wychwytu LDL na rynku po leczeniu symwastatyną, co potwierdza czułość tej metody w wykrywaniu istotnych zmian w napływie LDL.
Obrazy w czasie rzeczywistym badane w początkowym i końcowym punkcie czasowym potwierdzają normalną morfologię komórek po leczeniu Dynasore, wskazując na skuteczność i bezpieczeństwo tego związku. Po dodaniu do komórek dalszego oznaczonego na czerwono LDL w celu zachowania jego aktywności fluorescencyjnej, ważne jest, aby chronić płytkę przed światłem, dopóki nie zostanie umieszczona w inkubatorze systemu obrazowania żywych komórek. Komórki z różnych narządów mogą reagować różnie na leczenie, czyli w przeciwnych kierunkach, lub mogą reagować w tych samych kierunkach, ale wykazywać różne tempo zmian w wychwytywaniu cholesterolu.
Tylko dzięki obrazowaniu żywych komórek można wykryć takie różnice i dokładnie określić je ilościowo.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę obrazowania żywych komórek w celu analizy pobierania cholesterolu LDL w różnych typach ludzkich komórek. Technika ta umożliwia przesiewanie związków wpływających na transport LDL, pozwalając jednocześnie na monitorowanie morfologii komórek w celu wykrycia potencjalnej cytotoksyczności.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Metabolizm cholesterolu
- Przesiewy farmakologiczne
Wprowadzenie
- Rola cholesterolu LDL w procesach komórkowych
- Znaczenie monitorowania stanu zdrowia komórek podczas eksperymentów
- Zastosowanie obrazowania żywych komórek w badaniach biologicznych
Zastosowane metody
- System do obrazowania żywych komórek
- Ludzkie linie komórkowe, w tym HepG2, HK2 oraz HCAECs
- Kwantyfikacja napływu LDL
Główne wyniki
- Zaobserwowano znaczną redukcję napływu LDL po zastosowaniu Dynasore
- Zwiększony pobór LDL w komórkach HepG2 po zastosowaniu symwastatyny
- Potwierdzono prawidłową morfologię komórek pomimo zastosowania związków
Wnioski
- Metoda ta pozwala na skuteczne pomiary wychwytu LDL i monitorowanie cytotoksyczności
- Wspiera dalsze badania nad metabolizmem cholesterolu oraz opracowywanie leków
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia jednoczesną kwantyfikację napływu cholesterolu LDL oraz monitorowanie kondycji komórek w czasie rzeczywistym, wypełniając istotną lukę w badaniach przesiewowych farmakologicznych celów metabolicznych i sercowo-naczyniowych. Poprzez integrację odczytów cytotoksyczności z funkcjonalnymi testami wychwytu, zwiększa ona wiarygodność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących i ogranicza odrzuty na późnych etapach badań ze względu na toksyczność poza-celową. Platforma ta wspiera przesiewy o średniej i wysokiej przepustowości w odpowiednich typach ludzkich komórek, zwiększając relewancję translacyjną w procesach walidacji celów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie endocytozy zależnej od LDLR jako celu terapeutycznego w zaburzeniach metabolicznych, chorobach układu sercowo-naczyniowego oraz chorobach nerek.
- Wartość operacyjna: Pozwala na jednoczesną ocenę wpływu związków na pobieranie LDL oraz morfologię komórek, co ułatwia wczesne wykrycie potencjalnej cytotoksyczności.
- Wartość prognostyczna: Wspiera mechanistyczną minimalizację ryzyka poprzez powiązanie farmakologicznej modulacji napływu LDL z wynikami dotyczącymi kondycji komórek.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych pomiarów napływu LDL w czasie, przy użyciu LDL znakowanego pHrodo red oraz obrazowania żywych komórek.
- Wartość operacyjna: Kompatybilny ze standardowymi formatami płytek 24-dołkowych i możliwy do dostosowania do różnych systemów obrazowania, co umożliwia standaryzację i powtarzalność testu.
- Skalowalność: Umożliwia pomiary seryjne w ciągu czterogodzinnego okresu z odstępami godzinnymi, co pozwala na profilowanie kinetyczne efektów działania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Przetestowano w trzech ludzkich liniach komórkowych (wątroby, nabłonka cewkowego nerek, śródbłonka tętnicy wieńcowej), co odzwierciedla układy istotne dla choroby w analizie odpowiedzi międzytkankowej.
- Wgląd mechanistyczny: Wykrywa różnicowe odpowiedzi na związki takie jak Dynasore, PCSK9 i Simvastatin, co wspiera walidację celów specyficznych dla danej ścieżki.
- Podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia normalizację danych dotyczących wychwytu LDL do stopnia konfluencji komórek, co zwiększa dokładność danych i pewność w określaniu relacji struktura-aktywność.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając odczytów funkcjonalnych, które pomagają w optymalizacji związków hit-to-lead oraz w priorytetyzacji badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków regulacyjnych LDL oraz zaangażowania celu w fizjologicznie istotnych ludzkich komórkach.
- Przesiewanie: Umożliwia zastosowanie gotowego formatu testu ze zstandaryzowanymi protokołami barwienia, inkubacji i obrazowania do przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Generuje zintegrowane parametry intensywności i konfluencji, które mogą być normalizowane w celu uzyskania dokładnych wartości poboru LDL na studzienkę.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje linie komórkowe pochodzenia ludzkiego w celu zwiększenia wartości prognostycznej w modelowaniu przedklinicznym i dopasowaniu biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania modulatorów metabolizmu cholesterolu w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w modulacji szlaku LDL.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zautomatyzowanej analizie obrazu i ustandaryzowanym definicjom przetwarzania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez powiązanie odczytów skuteczności z przesiewowym badaniem cytotoksyczności w jednym teście.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka na podstawie zrównoważonych profili skuteczności LDL i bezpieczeństwa komórkowego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze systemów obrazowania żywych komórek, pracy z sondami fluorescencyjnymi oraz oprogramowania do analizy obrazu.
- Zależne od dostępu do inkubatorów z kontrolą warunków środowiskowych, obiektywów 10x oraz możliwości obrazowania dwukanałowego (czerwony/fazowy).
- Wymaga standaryzacji przygotowania komórek, gęstości wysiewu oraz protokołów głodzenia w ramach zespołów w celu uzyskania spójnych wyników.
- Należy uwzględnić warunki trypsynizacji i neutralizacji specyficzne dla danego typu komórek (np. HepG2 vs. HK2 vs. HCAECs).
- Ograniczone przez ryzyko fotoblaknięcia, jeśli płytki nie zostaną zabezpieczone przed światłem po znakowaniu pHrodo red LDL.
