Name: Struktura krystaliczna domeny N-końcowej receptora Ryanodine z Plutella xylostella (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj krystalizację białka i rentgenografię strukturalną w celu określenia struktury domeny N-końcowej receptora ryanodynowego z Plutella xylostella. Ta metoda umożliwia projektowanie nowych insektycydów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tych badań zostało zapewnione przez: Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), Narodową Fundację Nauk o Przyrodzie Chin (31320103922, 31230061) oraz Projekt Narodowego Programu Badań Podstawowych (973) Chin (2015CB856500, 2015CB856504). Jesteśmy wdzięczni personelowi linii badawczej BL17U1 w Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF).

1. Klonowanie genów, ekspresja białek i oczyszczanie
<ol>
	<li>PCR amplifikuje DNA odpowiadające białku będącemu przedmiotem zainteresowania (reszty 1-205 DBM RyR, Genbank wg. nr. AFW97408) i sklonować do wektora pET-28a-HMT przez klonowanie niezależne od ligacji (LIC)25. Ten wektor zawiera znacznik histydyny, znacznik MBP i miejsce rozszczepienia proteazy TEV na N-końcu15.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery LIC do amplifikacji docelowego genu z rozszerzeniami 5' kompatybilnymi z LIC: 
		Podkład do przodu LIC: 
		5' TACTTCCAATCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGG 3' 
		Odwrócony podkład LIC: 
		5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'</li>
		<li>Połączyć składniki reakcji (50 μL): 1 μL matryc DNA (100 ng/μL), 1 μL startera forward (10 μM), 1 μL startera reverse (10 μM), 0,5 μL polimerazy DNA (NEB), 5 μL 10x buforu reakcyjnego, 1 μL dNTP (25 mM), 40,5 μl DDH2O, wolnego od RNaz.
		<ol>
			<li>Umieść mieszaninę reakcyjną w maszynie do PCR i uruchom następujący program.</li>
			<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie uruchomić 30 cykli (95 °C przez 30 s, 58 °C przez 15 s, 72 °C przez 1 min). Inkubować w temperaturze 72 °C przez 5 minut, a następnie utrzymywać w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Uruchom całą mieszaninę reakcyjną (50 μl) na 2% żelu agarozowym i ekstrahuj za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Klonowanie niezależne od ligacji (LIC)
		<ol>
			<li>Przeprowadzić wytrawianie SspI (60 μL): 20 μL wektora DNA (50 ng/μL), 6 μL 10x buforu reakcyjnego, 4 μL SspI i 30 μL ddH2O. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Uruchomić całą mieszaninę reakcyjną na 1% żelu agarozowym i ekstrahować za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
			<li>Wykonaj obróbkę wektora polimerazą DNA T4 i wstaw DNA. Połącz następujące elementy: 5 μl wektora lub insercji DNA (50 ng/μL), 2 μL 10x buforu polimerazy DNA T4, 1 μL dGTP (25 mM) dla wektora lub 1 μL dCTP (25 mM) dla insercji DNA, 1 μL DTT (100 mM), 0,4 μL polimerazy DNA T4 (kwalifikowanej LIC), i 9,6 μl ddH2O. Inkubować reakcje w temperaturze pokojowej przez 40 min. Enzym inaktywowany termicznie w temperaturze 75 °C przez 20 min. 
			Uwaga: Wektor LIC i wstawiony DNA muszą być traktowane oddzielnie w reakcjach.</li>
			<li>Przeprowadź reakcję wyżarzania LIC. Połącz następujące elementy: 2 μl DNA z insercją potraktowaną T4, 2 μl DNA wektora LIC poddanego działaniu T4. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć BL21 (DE3) komórki E. coli za pomocą tego rekombinowanego plazmidu.
	<ol>
		<li>Rozmrozić właściwe komórki (50 μl w probówce do mikrowirówki) na lodzie.</li>
		<li>Dodać około 1 μl (50 ng) plazmidu do probówki. Wymieszaj komórki i DNA, delikatnie przesuwając probówkę 2-3 razy. Umieść probówkę na lodzie na 20 minut.</li>
		<li>Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 40 s. Ponownie umieść probówkę na lodzie na 2 minuty. Dodaj 1 ml pożywki LB o temperaturze pokojowej do probówki.</li>
		<li>Umieścić probówkę z mieszaniną w wytrząsarce o prędkości 250 obr./min w temperaturze 37 °C na 45 minut. Rozprowadzić 150–200 μl mieszaniny na płytkach selekcyjnych. Odwrócić płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię i posaz komórki w 100 ml pożywki 2YT zawierającej 50 μg/ml kanamycyny w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego ranka zaszczepić 1 l pożywki 2YT zawierającej 50 μg/ml kanamycyny 10 ml nocnej hodowli i inkubować w inkubatorze z wytrząsarką o temperaturze 37 °C przy 250 obr./min, aż OD600 osiągnie ~0,6. Następnie indukować kulturę za pomocą IPTG do końcowego stężenia 0,4 mM i rosnąć przez kolejne 5 godzin w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, zebrać komórki i ponownie zawiesić co 10 g komórek w 40 ml buforu do lizy (10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl, 10 mM β-merkaptoetanolu, 25 μg/ml lizozymu, 25 μg/ml DNazy, 1 mM PMSF).
	<ol>
		<li>Zakłócić go przez sonikację przy amplitudzie 65% przez 8 minut z 1 s włączonym i 1 s wyłączonym. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 40 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Przefiltrować supernatant przepuszczając przez filtr 0,22 μm i załadować go do pętli próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść białko fuzyjne, rozetnij znacznik i ponownie oczyść białko docelowe.
	<ol>
		<li>Oczyść białko fuzyjne za pomocą kolumny Ni-NTA (bufor wiążący: 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl; bufor elucyjny: 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl, 500 mM imidazol) i oczyść za pomocą systemu oczyszczania, z gradientem liniowym 20–250 mM imidazolu.</li>
		<li>Rozszczepić eluowane białko docelowe proteazą TEV (w stosunku 1:50) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Oczyść mieszaninę reakcji rozszczepienia za pomocą kolumny z żywicą amylozową (bufor wiążący: 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl; bufor elucyjny: 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl, 10 mM maltozy) i kolumny Ni-NTA do usunięcia znacznika i proteazy TEV. Białko docelowe będzie znajdować się we frakcji przepływowej tych dwóch kolumn.</li>
		<li>Próbkę należy dializować w stosunku do buforu dializacyjnego (10 mM Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 10 mM β-merkaptoetanolu w celu zmniejszenia stężenia soli. Oczyścić próbkę na kolumnie wymieniacza anionowego (bufor wiążący: 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM β-merkaptoenol; bufor elucyjny: 10 mM Tris-HCl pH 8,8, 1 M KCl, 10 mM β-merkaptoetanol) przez gradient liniowy 20–500 mM KCl w buforze elucji.</li>
		<li>Ostatnim etapem procesu oczyszczania jest zagęszczenie białka za pomocą koncentratora odśrodkowego (10 kDa MWCO) i wstrzyknięcie do żelowej kolumny filtracyjnej Superdex 200 26/600 w celu sprawdzenia jednorodności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź czystość białka, uruchamiając je na 15% SDS PAGE. 
	nuta: Wszystkie kolumny pracują w systemie oczyszczania białek o natężeniu przepływu wiązania 2 ml / min i natężeniu przepływu elucji 4 ml / min, z wyjątkiem filtracji żelowej przy 1 ml / min.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i krystalizacja białek
<ol>
	<li>Zagęścić oczyszczoną próbkę białka do 10 mg/ml za pomocą koncentratora odśrodkowego (10 kDa MWCO) i wymiany buforu do buforu krystalizacyjnego przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić badanie przesiewowe krystalizacji (stosunek 1:1, 200 nl białka i 200 nl bufora zbiornika) metodą dyfuzji par w pozycji siedzącej w temperaturze 295 K z kilkoma zestawami do krystalizacji przy użyciu zautomatyzowanego systemu robotycznego do obsługi cieczy w formacie 96-dołkowym. 
	nuta: Użyliśmy zestawów firm Molecular Dimensions i Hampton Research oraz zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy Gryphon.</li>
	<li>Uszczelnij 96-dołkową płytkę krystalizacyjną, aby zapobiec parowaniu i umożliwić zrównoważenie kropli białka z buforem zbiornika. Następnie umieścić płytki w inkubatorze kryształowym w temperaturze 18 °C.</li>
	<li>Okresowo sprawdzaj 96-dołkowe płytki za pomocą mikroskopu świetlnego w celu monitorowania tworzenia się i wzrostu kryształów.</li>
	<li>Aby odróżnić kryształy białka od kryształów soli, użyj barwnika białkowego. Dodaj 1 μl barwnika do kropli docelowej. Odczekaj około 1 godziny i obserwuj pod mikroskopem. Kryształy białka zmienią kolor na niebieski.</li>
	<li>Wykorzystać warunki dodatniej krystalizacji (1,5 M siarczanu amonu, 0,1 M Tris pH 8,0) w celu dalszej optymalizacji kryształów za pomocą metody dyfuzji parowej w wiszących kroplach na płytkach 24-dołkowych.
	<ol>
		<li>Zoptymalizuj pH od 7,0 do 8,5 z odstępem 0,5 jednostki pH na każdym kroku. Zoptymalizuj stężenie siarczanu amonu od 1,2 M do 1,7 M w odstępie 0,1 M na każdym kroku. (W naszym przypadku najlepszym warunkiem wytworzenia dużych kryształów w kształcie płytek było 0,1 M HEPES, pH 7,0 i 1,6 M siarczan amonu)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Montaż kryształów, zbieranie danych rentgenowskich i określanie struktury
<ol>
	<li>Zamontuj kryształy w kriopętli i schładzaj w ciekłym azocie, używając roztworu zbiornikowego zawierającego 20% glicerolu jako krioprotektoru. Umieść kryształy w unipuck do przechowywania i transportu.</li>
	<li>Wstępne badanie przesiewowe kryształów białkowych za pomocą wewnętrznego dyfragenta rentgenowskiego firmy Rigaku. Wybierz najlepsze z najwyższymi rozdzielczościami do zbierania danych w obiektach synchrotronowych (nasz zestaw danych został zebrany z BL17U1 w Shanghai Synchrotron Radiation Facility).
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania sterującego linią BluIce26, aby zamontować i wyśrodkować kryształy za pomocą funkcji automatycznego lub ręcznego centrowania. Wykonaj ekspozycje testowe, aby określić strategię zbierania danych, w tym kąt początkowy, czas ekspozycji, odległość detektora, szerokość klatki i liczby.</li>
		<li>Zbierz odpowiedni zestaw danych (zebraliśmy 180 klatek z czasem naświetlania 1 s, szerokością klatki 1° i odległością detektora 350 mm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indeksuj, integruj i skaluj zestaw danych za pomocą HKL2000 suite27. Najpierw wykonaj funkcję wyszukiwania pików, aby znaleźć punkty dyfrakcyjne, a następnie zindeksuj plamy i wybierz odpowiednią grupę przestrzeni. Po szczytowej integracji przeskaluj zestaw danych przy użyciu odpowiedniego modelu błędów i zapisz wyjściowy plik .sca.</li>
	<li>Rozwiąż problem fazowy poprzez zastąpienie molekularne za pomocą Phaser28 w PHENIX29.
	<ol>
		<li>Oblicz możliwą liczbę kopii cząsteczek białka w jednostce asymetrycznej za pomocą Xtriage30.</li>
		<li>Poszukaj odpowiednich szablonów struktur o wysokiej identyczności sekwencji i podobieństwie strukturalnym jako białko docelowe, korzystając ze znanych struktur z literatury lub modeli generowanych przez serwer przewidywania struktury, takich jak Phyre231 (użyliśmy królika RyR1 NTD jako modelu wyszukiwania, PDB ID 2XOA).</li>
		<li>Uruchom Phaser, używając pliku danych dyfrakcyjnych, pliku struktury szablonu i pliku sekwencji białka, aby znaleźć rozwiązanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj AutoBuild32 w PHENIX29, aby wygenerować początkowy model przy użyciu pliku wyjściowego z Phaser i pliku sekwencji z docelowego białka.</li>
	<li>Ręcznie zbuduj strukturę do zmodyfikowanej eksperymentalnej gęstości elektronów za pomocą Coot33 i udoskonal za pomocą phenix.refine34 w cyklach iteracyjnych.</li>
	<li>Zweryfikuj ostateczny model za pomocą narzędzi walidacyjnych w PHENIX18.</li>
</ol>

<ol><li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li>
<li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor%2Fcalcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li>
<li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+ryanodine+receptors%3A+molecular+targets+for+novel+pest+control+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals.</a> Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).</li>
<li>Steinbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+spread%2C+genetics+and+functional+characteristics+of+ryanodine+receptor+based+target-site+resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).</li>
<li>Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%2C+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li>
<li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+%28L.%29+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li>
<li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li>
<li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer%2C+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li>
<li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li>
<li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li>
<li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+mutations+in+the+ryanodine+receptor+N-terminal+region+couple+to+a+mobile+intersubunit+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface.</a> Nature Communications. 4, 1506(2013).</li>
<li>Lau, K., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+wild+type+and+disease+mutant+forms+of+the+ryanodine+receptor+SPRY2+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain.</a> Nature Communications. 5, 5397(2014).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors%3A+insights+into+disease+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>des Georges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+Gating+and+Activation+of+RyR1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for Gating and Activation of RyR1.</a> Cell. 167 (1), 145-157 (2016).</li>
<li>Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+conformational+switch+mechanism+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+gating+mechanism+of+the+type+2+ryanodine+receptor+RyR2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.</a> Science. 354 (6310), (2016).</li>
<li>Wei, R. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/cr201699">Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.</a> Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+rabbit+ryanodine+receptor+RyR1+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.</a> Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamondback+moth+ecology+and+management%3A+problems%2C+progress%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors%3A+Insights+into+Disease+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li>
<li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li>
<li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HKL-3000%3A+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.378.2281&rep=rep1&type=pdf">Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation.</a> CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+model+building%2C+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li>
<li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coot%3A+model-building+tools+for+molecular+graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li>
<li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano procedurę rekombinacyjnej ekspresji, oczyszczania, krystalizacji i określania struktury DBM RyR NTD. Do krystalizacji kluczowym wymogiem jest uzyskanie białek o wysokiej rozpuszczalności, czystości i jednorodności. W naszym protokole zdecydowaliśmy się użyć wektora pET-28a-HMT, ponieważ zawiera on znacznik heksahistydyny i znacznik MBP, z których oba można wykorzystać do oczyszczania w celu uzyskania wyższej czystości fałdowania. Dodatkowo znacznik MBP pomaga w rozpuszczalności białka docelowego. O...

Receptory Ryanodine (RyR) to specyficzne kanały jonowe, które pośredniczą w przenikaniu jonów Ca2+ przez błony retikulum sarkoplazmatycznego (SR) w komórkach mięśniowych. Dlatego odgrywają ważną rolę w procesie sprzężenia skurczu wzbudzenia. W swojej funkcjonalnej postaci RyR składa się jako homo-tetramer o masie cząsteczkowej >2 MDa, przy czym każda podjednostka składa się z ~ 5000 reszt aminokwasowych. U ssaków występują trzy izoformy: RyR1 - typ mięśni szkieletowych, RyR2 - typ mięśnia sercowego i RyR3 - wszechobecne w różnych tkankach1.
U owadów występuje tylko jeden rodzaj RyR, który wyraża się w tkance mięśniowej i nerwowej2. Owad RyR jest bardziej podobny do ssaka RyR2 z identycznością sekwencji około 47%3. Insektycydy diamidowe ukierunkowane na RyR Lepidoptera i Coleoptera zostały opracowane i wprowadzone na rynek przez główne firmy, takie jak Bayer (flubendiamid), DuPont (chlorantraniliprol) i Syngenta (cyantraniliprol). Od czasu stosunkowo niedawnego wprowadzenia na rynek, insektycydy diamidowe stały się jedną z najszybciej rozwijających się klas insektycydów. Obecnie sprzedaż tych trzech insektycydów rocznie przekroczyła 2 miliardy dolarów amerykańskich, przy stopie wzrostu wynoszącej ponad 50% od 2009 roku (Agranova).
Ostatnie badania wykazały rozwój odporności u owadów po kilku pokoleniach stosowania tych środków owadobójczych4,5,6,7,8. Mutacje oporności w domenie transbłonowej RyR z diamentowej (DBM), Plutella xylostella (G4946E, I4790M) i odpowiadające im pozycje u górnika pomidorowego, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) pokazują, że region ten może być zaangażowany w wiązanie insektycydów diamidowych, ponieważ wiadomo, że region ten ma kluczowe znaczenie dla bramkowania kanału4,8,9. Pomimo szeroko zakrojonych badań w tej dziedzinie, dokładne mechanizmy molekularne insektycydów diamidowych pozostają nieuchwytne. Co więcej, nie jest jasne, czy mutacje oporności wpływają na interakcje z diamidami bezpośrednio, czy allosterycznie.
Wcześniejsze badania opisywały strukturę kilku domen RyR gatunków ssaków oraz strukturę pełnowymiarowych ssaków RyR1 i RyR2 odpowiednio za pomocą krystalografii rentgenowskiej i mikroskopii krioelektronowej10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Jednak do tej pory nie opisano żadnej struktury RyR owadów, co uniemożliwiałoby nam zrozumienie molekularnych zawiłości funkcji receptora, a także molekularnych mechanizmów działania insektycydów i rozwoju odporności na insektycydy.
W tym manuskrypcie prezentujemy uogólniony protokół strukturalnej charakterystyki N-końcowej domeny β-koniczynowej receptora ryanodyny z diamentowej, niszczycielskiego szkodnika infekującego rośliny krzyżowe na całym świecie22. Konstrukcja została zaprojektowana zgodnie z opublikowanymi strukturami krystalicznymi królika RyR1 NTD23,24oraz modelami strukturalnymi cryo-EM16,17,18,19,20,21. Jest to pierwsza struktura o wysokiej rozdzielczości opisana dla owada RyR, która ujawnia mechanizm bramkowania kanałów i stanowi ważny szablon do rozwoju insektycydów specyficznych dla gatunku przy użyciu projektowania leków opartych na strukturze. Do wyjaśnienia struktury zastosowaliśmy krystalografię rentgenowską, która jest uważana za "złoty standard" w określaniu struktury białek w rozdzielczości bliskiej atomowej. Chociaż proces krystalizacji jest nieprzewidywalny i pracochłonny, ten protokół krok po kroku pomoże naukowcom w ekspresji, oczyszczeniu i scharakteryzowaniu innych domen RyR owadów lub ogólnie innych białek.

<table><tbody><tr>Wektor <td></td><td></td><td>pET-28a-HMT</td><td>Ten zmodyfikowany wektor pET zawiera znacznik heksahistydyny, białko fuzyjne MBP i miejsce rozszczepienia proteazy TEV na N-końcu (Lobo i Van Petegem, 2009)</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3) szczep</td><td>Novagen</td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>HisTrapKolumna HP (5 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna z żywicy amylozowej</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021S Q Kolumna</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose o wysokiej wydajności&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>Koncentratory Amicon (10 kDa MWCO)</td>Kolumna filtracyjna żelowa <td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 26/600&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany system robotyczny do obsługi cieczy&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>Gryphon</td><td></td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>Zamontowany CryoLoop - 20 mikronów</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>Wymiary molekularne</td><td>CryoWand</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do ładowania Puck Dewar</td><td>Molekularne Wymiary</td><td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop</td> Inkubator kryształowy <td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wymiary molekularne</td><td>Dyfraktor rentgenowski MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td>Rigaku</td><td>FRX</td> Eppendorf Nexus GX2 <td></td></tr><tr><td>Zestaw mini-przygotowania plazmidu</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Ekstrakcja żelu <td></td></tr><tr><td> zestaw</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna SspI</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4</td><td>Novagen</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Scientific Chemical</td><td>25389940</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview</td><td>367931</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall LYNX 6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonnicator</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>System oczyszczania białek</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta Mikroskop Pure</td><td></td></tr><tr><td>Light</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik krystaliczny IzIt</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator wytrząsarki</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>Indeksowy ekran kryształowy</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Struktura ekranu krystalicznego</td><td>Wymiary molekularne</td> Ekran krystaliczny <td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>ProPlex</td><td>Wymiary molekularne Ekran</td> kryształowy <td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>PACT premier</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>Ekran kryształowy JCSG-plus</td><td>Molekularny Wymiary</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

struktura krystaliczna domeny n-końcowej receptora ryanodine z plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Rozwój silnych i skutecznych insektycydów ukierunkowanych na receptory ryanodine (RyRs) owadów wzbudził duże zainteresowanie w dziedzinie zwalczania szkodników w rolnictwie. Do tej pory skomercjalizowano kilka insektycydów diamidowych zwalczających szkodniki RyR, które generują roczne przychody w wysokości 2 miliardów dolarów amerykańskich. Jednak zrozumienie sposobu działania insektycydów ukierunkowanych na RyR jest ograniczone przez brak informacji strukturalnych dotyczących owada RyR. To z kolei ogranicza wiedzę na temat rozwoju odporności szkodników na insektycydy. diamentowa (DBM) jest niszczycielskim szkodnikiem niszczącym uprawy krzyżowe na całym świecie, który według doniesień wykazuje również odporność na insektycydy diamidowe. W związku z tym ogromne znaczenie praktyczne ma opracowanie nowych środków owadobójczych ukierunkowanych na DBM RyR, w szczególności ukierunkowanych na region inny niż tradycyjne miejsce wiązania diamidów. Tutaj przedstawiamy protokół do strukturalnego scharakteryzowania N-końcowej domeny RyR z DBM. Rentgenowska struktura krystaliczna została rozwiązana przez zastąpienie molekularne w rozdzielczości 2,84 A, co pokazuje motyw fałdowania koniczyny beta i flankującą helisę alfa. Protokół ten można dostosować do ekspresji, oczyszczania i charakterystyki strukturalnej innych domen lub białek w ogóle.

Oczyszczanie
Domena N-końcowa RyR z DBM została wyeksponowana jako białko fuzyjne z tagiem heksahistydynowym, tagiem MBP oraz miejscem cięcia dla proteazy TEV. Zastosowano pięcioetapową strategię oczyszczania w celu uzyskania białka o wysokiej czystości, odpowiedniego do krystalizacji. W pierwszej kolejności białko fuzyjne oczyszczono z frakcji rozpuszczalnej lizatu komórkowego za pomocą kolumny Ni-NTA (HisTrap HP). Następnie białk...

W tym artykule opisujemy protokoły ekspresji, oczyszczania, krystalizacji i określania struktury N-końcowej domeny receptora ryanodine z diamentowej (Plutella xylostella).

Struktura krystaliczna domeny N-końcowej receptora Ryanodine z Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Rozwiązanie struktury domeny receptora ryanodine może pomóc w zrozumieniu molekularnego mechanizmu funkcji białka, działania insektycydów i rozwoju odporności na insektycydy. Miara ta implikuje wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej do zilustrowania struktury, która jest uważana za złoty standard w określaniu struktury białek w rozdzielczości bliskiej atomowi. Ta wysokorozdzielcza struktura domeny receptora ryanodine owadów ujawnia mechanizm bramkowania kanałów i stanowi ważny szablon do opracowywania insektycydów specyficznych dla gatunku przy użyciu podejść do projektowania leków opartych na strukturze.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ przyszli krystalografowie białek muszą być biegli w biochemii, biofizyce, informatyce i matematyce. Zacznij od amplifikacji DNA odpowiadającego białku będącemu przedmiotem zainteresowania w reakcji łańcuchowej polimerazy. Pod koniec reakcji uruchom całe 50 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej na 2% żelu agarozowym i wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie ze standardowymi protokołami.Następnie zlinearyzuj DNA wektora LIC, mieszając 20 mikrolitrów DNA wektora z 6 mikrolitrami buforu reakcyjnego 10X i 4 mikrolitrami enzymu restrykcyjnego SspI w 30 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Inkubować tę mieszaninę reakcyjną przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji uruchomić całą mieszaninę reakcyjną na 1% żelu agarozowym, a następnie przeprowadzić ekstrakcję zlinearyzowanego DNA wektora za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie wykonaj oddzielne zabiegi polimerazy DNA T4 na 5 mikrolitrach zlinearyzowanego wektorowego DNA i amplifikowanego DNA z amplifikacją PCR, zgodnie ze standardowymi protokołami. Inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 20 minut inaktywować enzym termiczny w temperaturze 75 stopni Celsjusza. Przeprowadzić niezależną od ligacji reakcję wyżarzania klonowania, łącząc 2 mikrolitry DNA z insercją poddaną działaniu T4 z 2 mikrolitrami DNA wektora LIC poddanego działaniu T4 przez 10 minut inkubacji w temperaturze pokojowej.Aby przekształcić komórki BL21(DE3)E. Coli za pomocą rekombinowanego plazmidu, rozmrozić 50 mikrolitrów kompetentnych komórek na lodzie i dodać około 1 mikrolitra wyżarzonego plazmidu do probówki. Delikatnie przesuń probówkę dwa do trzech razy, aby wymieszać komórki i DNA, a następnie umieść probówkę z powrotem na lodzie na 20 minut.Pod koniec inkubacji poddaj komórki szokowi termicznemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 40 sekund, a następnie dwie minuty z powrotem na lodzie. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki LB o temperaturze pokojowej do probówki i umieść komórki na wytrząsarce o prędkości 250 obr./min na 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji z wytrząsaniem rozsypać 150 do 200 mikrolitrów tej mieszaniny na płytki selekcyjne i odwrócić płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia posadź pojedynczą kolonię w 100 mililitrach pożywki 2-YT, uzupełnionej kanamycyną, w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka zaszczepić jeden litr pożywki 2-YT, uzupełnionej kanamycyną, 10 mililitrami nocnej kultury i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wstrząsaniem, aż odczyt OD600 osiągnie około 0,6. Następnie indukuj hodowlę za pomocą IPTG do końcowego stężenia 0,4 milimola i hoduj komórki przez pięć godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Pod koniec inkubacji zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad na 10 gramów bakterii na 40 mililitrów stężenia buforu do lizy. Rozbijaj ściany komórkowe za pomocą sonikacji przy amplitudzie 65% i jedna sekunda po sekundzie przerwy, przez osiem minut. Usuń resztki komórek przez odwirowanie.Następnie przefiltruj supernatant przez filtr o średnicy 22 mikrometrów i załaduj roztwór do pętli próbki. Aby oczyścić białko fuzyjne, wstrzyknąć przefiltrowany supernatant z pętli próbki do pięciomililitrowej kolumny niklowo-nitrolotrioctowej w systemie oczyszczania o liniowym gradieniu od 20 do 250 milimolowych imidazolu. Rozszczepić wymyte białko docelowe proteazą wirusa wytrawiania tytoniu w stosunku 1 do 50 przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza i oczyścić mieszaninę reakcji rozszczepienia na kolumnie żywicy amylozowej i kolumnie niklowo-nitrolotrioctowej, aby usunąć znacznik i proteazę wirusa wytrawiania tytoniu.Przeprowadzić dializę przepływu z kolumny niklowo-nitrolotrioctowej w stosunku do buforu dializacyjnego w celu zmniejszenia stężenia soli i oczyścić próbkę na kolumnie anionowymiennej przez gradient liniowy od 20 do 500 milimolowego chlorku potasu w buforze elucyjnym. Następnie należy zagęścić białko w koncentratorze odśrodkowym. Wstrzyknąć skoncentrowane białko do żelowej kolumny filtracyjnej Superdex 200 26/600, aby sprawdzić jednorodność i ocenić czystość białka za pomocą 15% SDS-PAGE.Aby przygotować białko do krystalizacji, należy skoncentrować oczyszczoną próbkę białka do 10 miligramów na mililitr w koncentratorze odśrodkowym i wymienić bufor na bufor krystalizacyjny przed przechowywaniem w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić badanie przesiewowe krystalizacji, należy użyć metody dyfuzji pary w pozycji siedzącej o temperaturze 295 kelwinów, z kilkoma zestawami do krystalizacji i zautomatyzowanym systemem obsługi cieczy w formacie 96-dołkowym. Pod koniec ustawiania kropli uszczelnij 96-dołkową płytkę krystalizacyjną, aby zapobiec parowaniu i umożliwić zrównoważenie kropli białka w buforze zbiornika.Umieść płytki w inkubatorze kryształkowym w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Okresowo sprawdzaj płytki pod mikroskopem świetlnym, aby monitorować tworzenie się i wzrost kryształów. Aby odróżnić kryształy białka od kryształów soli, dodaj jeden mikrolitr barwnika krystalicznego białka do kropli docelowej i obserwuj kryształy pod mikroskopem po godzinie.Kryształy białka będą niebieskie. Aby jeszcze bardziej zoptymalizować kryształy, należy zastosować dodatnie warunki krystalizacji i metodę dyfuzji parowej w wiszących kroplach na płytkach 24-dołkowych, a następnie inkubację w inkubatorze kryształowym w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Aby określić strukturę białka, zamontuj kryształy na kriopętli pod mikroskopem świetlnym w celu błyskawicznego chłodzenia w ciekłym azocie i umieść kryształy w unibucku do przechowywania i transportu.Wstępnie przesiewaj kryształy w wewnętrznym dyfraktorze rentgenowskim, korzystając z funkcji ręcznego centrowania do montażu i centrowania kryształów. Następnie użyj oprogramowania do dyfrakcji rentgenowskiej, aby zebrać dane. Aby zindeksować, zintegrować i skalować zestaw danych za pomocą pakietu HKL-2000, najpierw wybierz detektor i załaduj zestaw danych.Następnie wykonaj funkcję wyszukiwania pików, aby znaleźć punkty dyfrakcyjne. Indeksuj miejsca, wybierz odpowiednią grupę przestrzeni i przeprowadź integrację szczytową. Następnie przeskaluj zestaw danych.Dostosuj model błędu i ponownie przeskaluj. Zapisz wyjściowy plik sca. Aby określić strukturę za pomocą pakietu oprogramowania Phenix, utwórz nowy projekt.Najpierw uruchom Extriage z plikiem sca, aby obliczyć możliwą liczbę kopii cząsteczek białka w jednostce asymetrycznej. Następnie, aby rozwiązać problem fazowy przez zastąpienie molekularne, uruchom Phaser, używając pliku danych dyfrakcyjnych, pliku struktury szablonu z tożsamością o wysokiej sekwencji i podobieństwem strukturalnym jako białko docelowe oraz pliku sekwencji białka, aby znaleźć rozwiązanie. Wykonaj automatyczne kompilowanie w Phenix, aby wygenerować początkowy model, używając pliku wyjściowego z Phaser i pliku sekwencji z białka docelowego.Ręcznie zbuduj strukturę w zmodyfikowanej eksperymentalnej gęstości elektronów za pomocą COOT i udoskonal za pomocą Phenix refine w cyklach iteracyjnych. Zweryfikuj ostateczny model za pomocą narzędzi do walidacji w Phenix. W tym reprezentatywnym eksperymencie oczyszczenie domeny końcowo-końcowej białka receptora ryanodine diamentowej, jak wykazano, dało pojedyncze prążki o mocy około 21 kilodaltonów za pomocą analizy STS-PAGE.Objętość elucji z żelowej kolumny filtracyjnej potwierdziła, że oczyszczona domena końcowo-końcowa receptora ryanodyny jest monomerem. Do krystalizacji najbardziej optymalnymi warunkami, w których powstały wysokiej jakości kryształy w kształcie płytek, była obecność 1 molowego HEPES-u o pH 7 i 1,6 molowego siarczanu amonu. Określenie struktury białka na podstawie zestawu danych dyfrakcyjnych przy użyciu oprogramowania, jak pokazano, ujawniło domenę końcowo-końcową receptora ryanodine diamentowej obejmującą reszty od 1 do 205.Białka z dużym nieporządkiem, elastycznymi regionami lub o słabym powinowactwie są trudne do krystalizacji. W tych scenariuszach strategie inżynierii białek, takie jak redukcja entropii powierzchniowej, skracanie pętli i sieciowanie, mogą zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania lepszych kryształów białkowych. Oprócz ujawniania struktur białkowych o wysokiej rozdzielczości, krystalografia rentgenowska może być również wykorzystywana do badania interakcji białko-pestycyd, co może pomóc w projektowaniu pestycydów opartych na strukturze.

crystal-structure-n-terminal-domain-ryanodine-receptor-from-plutella

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Tutaj opisujemy metodę ekspresji i oczyszczania wysokiej jakości domen wystających (P) norowirusa (P) w E. coli do wykorzystania w badaniach krystalografii rentgenowskiej. Metoda ta może być stosowana do innych domen kaliciwirusa P, a także białek niestrukturalnych, tj. białka wirusa sprzężonego z genomem (VPg), proteazy i polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp).

Wytwarzanie wystających domen ludzkiego norowirusa w E. coli do krystalografii rentgenowskiej

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Opisujemy protokoły określania struktury domeny wiążącej IKK NEMO za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Metody te obejmują ekspresję, oczyszczanie i charakterystykę białek, a także strategie skutecznej optymalizacji kryształów i określania struktury białka w jego niezwiązanej formie.

Wytwarzanie, krystalizacja i określanie struktury domeny wiążącej IKK NEMO

Ten protokół został opracowany do badania przejścia dimery-dodekameru TmPep1050, aminopeptydazy M42, na poziomie strukturalnym. Jest to prosty proces obejmujący proces od oczyszczania białek po przetwarzanie danych rentgenowskich. Krystalogeneza, indeksacja zbioru danych i wymiana molekularna zostały podkreślone na przykładzie wariantu TmPep1050H60A H307A.

Krystalografia rentgenowska w celu zbadania przejścia w stan oligomeryczny aminopeptydazy Thermotoga maritima M42 TmPep1050

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.

Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Poznaj krystalizację białka i rentgenografię strukturalną w celu określenia struktury domeny N-końcowej receptora ryanodynowego z Plutella xylostella. Ta metoda umożliwia projektowanie nowych insektycydów.

Struktura krystaliczna domeny N-końcowej receptora Ryanodine z Plutella xylostella

Przeglądaj więcej filmów