Name: In vitro Test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj niezawodny test agregacji białka tau do badania procesów patogennych w chorobie Alzheimera. Ta metoda umożliwia przesiewanie leków z wysoką powtarzalnością wykorzystując czyste białko rekombinowane.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Hectorowi Quirante za wyrażenie i oczyszczenie huTau441, Hannie Inganäs i Margot van Winsen za doskonałe wsparcie techniczne oraz Martinowi Koldijkowi za analizę danych.

1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Bufor reakcyjny
	<ol>
		<li>Przygotować bufor reakcyjny: 0,5 mM TCEP w PBS, pH 6,7 rozpuszczając suchy proszek TCEP (MW = 286,65 g/mol) w roztworze PBSstock, pH 7,4, 
		UWAGA: Obecność TCEP wynika z badań agregacji pomostowej z użyciem białka tau typu dzikiego, które zawiera cysteiny. W obecnym protokole TCEP jest używany tylko do regulacji pH PBS z 7,4 do 6,7 i nie odgrywa żadnej roli w regulacji jakichkolwiek reakcji redoks.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj i przefiltruj roztwór przez sterylny filtr membranowy PES o porach 0,22 μm.</li>
		<li>Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Rozmrozić na ławce i ustabilizować w temperaturze pokojowej przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>huTau441 powiedział:
	<ol>
		<li>Usuń huTau441 (w celu ekspresji i oczyszczania białek patrz Apetri i wsp.24) od -80 °C zamrażarki.</li>
		<li>Rozmrozić na ławce i zrównoważyć do temperatury pokojowej (RT).</li>
		<li>Wiruj probówkę z białkiem przez 5 minut w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 20-25 °C, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Zmierz stężenie huTau441 przez absorpcję przy 280 nm przy użyciu współczynnika ekstynkcji 0,31 ml mg-1 cm-1</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tioflawina T
	<ol>
		<li>Przygotować 500 μM roztwór podstawowy tioflawiny T (ThT), rozpuszczając 10 mg suchego proszku ThT (MW = 318,86 g/mol) w 35 ml buforze reakcyjnym.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj, wiruj 3 razy przez 20 sekund z maksymalną prędkością i przefiltruj roztwór przez sterylny filtr membranowy PES o wielkości porów 0,22 μm.</li>
		<li>Określić stężenie na podstawie pomiarów absorpcji przy 411 nm przy współczynniku ekstynkcji 22 000 M-1 cm-1 i dostosować stężenie ThT do 500 μM. Przechowywać w temperaturze pokojowej w temperaturze pokojowej z dala od światła. Przygotowuj świeże co 2 miesiące.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>heparyna
	<ol>
		<li>Przygotować świeży roztwór heparyny o stężeniu 55 μM, rozpuszczając 1 mg suchego proszku heparyny HMW (MW = 17-19 kDa) w 1 ml buforze reakcyjnym w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wstrząśnij energicznie i wiruj 2 razy przez 5 sekund.</li>
		<li>Przefiltruj roztwór przez sterylny filtr membranowy PES o wielkości porów 0,20 μm (strzykawka).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test agregacji ThT w trybie ciągłym na wielomodowym czytniku mikropłytek
UWAGA: Barwnik ThT jest dodawany do reakcji w celu monitorowania kinetyki agregacji huTau441 w trybie ciągłym (pomiary automatyczne). Chociaż reakcję można śledzić za pomocą zwykłego fluorometru przy użyciu konwencjonalnej kuwety, ręczny charakter operacji ogranicza częstotliwość pomiarów i pogarsza dokładność rejestrowanych krzywych kinetycznych. Z tego powodu stosowany jest automatyczny wielomodowy czytnik mikropłytek.
<ol>
	<li>Konfiguracja instrumentu
	<ol>
		<li>Włącz komputer i wielomodowy czytnik mikropłytek. Pozwól sprzętowi ustabilizować się przez 10 minut.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie i przygotuj protokół.
		<ol>
			<li>Wybierz typ protokołu: protokół standardowy (redukcja danych jest wykonywana niezależnie dla każdej płyty).</li>
			<li>Ustaw temperaturę na 37 °C i wybierz podgrzewanie wstępne przed kontynuowaniem protokołu.</li>
			<li>Ustaw bieg kinetyczny: Czas pracy 50 h / Interwał pomiaru: 15 min.</li>
			<li>Ustaw wytrząsanie orbitalne na 425 cpm (3 mm) w trybie ciągłym.</li>
			<li>Wybierz metodę odczytu: Intensywność fluorescencji - Punkt końcowy/Kinetyka - Monochromatory Długości fal: Wzbudzenie 440 nm (pasmo 20 nm)/ Emisja 485 nm (pasmo 20 nm) - Pozycja optyki: Góra - Normalna prędkość odczytu - Wysokość odczytu: 4,50 mm</li>
			<li>Uruchom przebieg przy użyciu utworzonego protokołu. Nazwij eksperyment, wybierz miejsce docelowe nowo utworzonego pliku i pozwól instrumentowi na wstępne wyrównanie do żądanej temperatury.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spontaniczna konwersja huTau441
	<ol>
		<li>Przygotować próbkę reakcyjną w probówce o pojemności 1,5 ml. Użyć 200 μl mieszaniny na reakcję i co najmniej 4 kontrpróby (objętość reakcji na 4 kontrpróby = 800 μl).</li>
		<li>Przygotować 800 μl próbki reakcyjnej (w przypadku 4 kontrprób) zawierającej 15 μM huTau441, 8 μM heparyny i 50 μM ThT. Rozpocząć od wymieszania białka z buforem reakcyjnym, dodać heparynę i ThT i dobrze wymieszać, pipetując 5 razy w górę i w dół. Przestrzegaj wskazanej kolejności dodawania odczynnika.</li>
		<li>Wiruj próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 25 °C przez 5 minut, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Dozować 200 μl próbki reakcyjnej na studzienkę do 96-dołkowych mikropłytek (96-dołkowa stała mikropłytka, objętość studzienki 360 μl, płaskie dno). Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Uszczelnij mikropłytkę, aby uniknąć parowania.</li>
		<li>Umieść mikropłytkę w wielomodowym czytniku mikropłytek i rozpocznij pomiary.</li>
		<li>Po zakończeniu eksperymentu wyjmij płytkę ze sprzętu i wyeksportuj dane do oprogramowania do przetwarzania danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola jakości konwersji, zbioru i przechowywania nasion.
	<ol>
		<li>Usunąć uszczelniacz z płytki i zebrać różne kontrpróby w probówkach o pojemności 1,5 ml. Dobrze wymieszać zagregowaną próbkę w studzienkach, pipetując 2 razy w górę i w dół przed jej pobraniem. Kruszywa mają tendencję do osadzania się na dnie studni.</li>
		<li>Dokładnie wymieszać w probówce o pojemności 1,5 ml, pipetując 5 razy w górę i w dół, a następnie dozować 10-20 μl na powierzchnię miki w celu analizy agregatów za pomocą AFM (więcej informacji można znaleźć w Apetri i wsp.<klasa sup="odnośnik">24).</li>
		<li>Zbierz kruszywa, obracając probówkę o pojemności 1,5 ml w temperaturze 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Agregaty tworzą granulkę.</li>
		<li>Oddzielić i przeanalizować supernatant za pomocą S-MALS w celu potwierdzenia braku monomerycznego tau w próbce, co wskazuje na udaną konwersję na agregaty (więcej szczegółów patrz Apetri i wsp.<klasa sup="odnośnik">24).</li>
		<li>Oznaczyć probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą pozostałe agregaty (osady), wskazując początkowe stężenie białka huTau441 i objętość próbki. Kruszywa należy zamrozić błyskawicznie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja z nasionami
	<ol>
		<li>Usuń agregaty huTau441 z zamrażarki -80 °C. Dodać objętość buforu reakcyjnego wskazaną na etykiecie (początkowa objętość próbki) i pozwolić probówce ustabilizować się do temperatury pokojowej. Zawiesić kruszywa, pipetując w górę i w dół 5 do 8 razy.</li>
		<li>Poddać sonifikację zagregowanej próbki. W przypadku próbki o objętości 200 μL (15 μM huTau441), sonikować na lodzie za pomocą mikrokońcówki 1/8" (od 100 μL do 10 ml) przez łączny okres 15 s, używając impulsów 1 s i przerw 2 s przy amplitudzie 30% (sonikator 250 watów). Ponownie zrównoważ próbkę do RT. 
		UWAGA: Zastosowane warunki sonikacji prowadzą do jednorodnej populacji włókienek tau o długości 20-50 nm24.</li>
		<li>Przygotować próbkę reakcyjną w probówkach o pojemności 1,5 ml. Użyć 200 μl mieszaniny na reakcję i co najmniej 4 kontrpróby (objętość reakcji na 4 kontrpróby = 800 μl).</li>
		<li>Przygotować 800 μl próbki reakcyjnej zawierającej 15 μM huTau441, 8 μM heparyny i 50 μM ThT. Rozpocząć od wymieszania białka z buforem reakcyjnym, dodać heparynę i ThT i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół 5 razy. Przestrzegaj wskazanej kolejności dodawania odczynnika.</li>
		<li>Wiruj próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 25 °C przez 5 minut, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Dozować 200 μl próbki reakcyjnej na studzienkę do 96-dołkowej (96-dołkowa stała mikropłytka, objętość 360 μl, płaskie dno). Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Dokładnie homogenizować wstępnie uformowaną próbkę włókienki poprzez powtarzalne pipetowanie w górę i w dół (5 razy) i dodać do każdej studzienki ilość odpowiadającą pożądanemu procentowi nasion. Dla całkowitej objętości studzienki 200 μl, 2 μl dodatku wstępnie uformowanych nasion to 1% (v/v). Mieszać, pipetując w górę i w dół 3 razy podczas dodawania do dołka i unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Uszczelnij mikropłytkę, aby uniknąć parowania.</li>
		<li>Umieść mikropłytkę w wielomodowym czytniku mikropłytek i rozpocznij pomiary.</li>
		<li>Usuń płytę z urządzenia i wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative tauopathies.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).</li>
<li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease%3A+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li>
<li>Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+consists+of+a+set+of+proteins+with+repeated+C-terminal+microtubule-binding+domains+and+variable+N-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).</li>
<li>Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+principles+of+tau+and+the+paired+helical+filaments+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).</li>
<li>Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A68%3A+a+major+subunit+of+paired+helical+filaments+and+derivatized+forms+of+normal+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau.</a> Science. 251 (4994), 675-678 (1991).</li>
<li>Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-aggregation+inhibitor+therapy+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).</li>
<li>Pickhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Small+Molecule+Inhibitors+of+Tau+Aggregation+by+Targeting+Monomeric+Tau+As+a+Potential+Therapeutic+Approach+for+Tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies.</a> Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).</li>
<li>Paranjape, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azaphilones+inhibit+tau+aggregation+and+dissolve+tau+aggregates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).</li>
<li>Seidler, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+inhibitors+of+tau+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-based inhibitors of tau aggregation.</a> Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).</li>
<li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li>
<li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), USA. E4376-E4385 (2014).</li>
<li>Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+principles+of+mammalian+prion+propagation+and+transmissibility+barriers%3A+Insight+from+studies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro.</a> Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).</li>
<li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li>
<li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li>
<li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li>
<li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li>
<li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li>
<li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li>
<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+features+of+tau+fibrils+from+Alzheimer%27s+disease+brain+are+faithfully+propagated+by+unmodified+recombinant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein.</a> Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).</li>
<li>Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+unravel+the+complexity+inherent+in+tau+aggregation+leading+to+Alzheimer%27s+disease+and+the+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies.</a> Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e51537(2015).</li>
<li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51%2FVL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43(2018).</li>
<li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).</li>
<li>Zhu, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+heparin+binding+to+Tau+protein%3A+implication+for+inducer-mediated+Tau+filament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).</li>
<li>Buee, L., Delacourte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biochemistry+of+tau+in+progressive+supranuclear+palsy%2C+corticobasal+degeneration%2C+FTDP-17+and+Pick%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease.</a> Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomimo licznych wysiłków, kinetyka agregacji tau opisana do tej pory w literaturze nie ma pożądanego poziomu odtwarzalności i/lub niektórych cech polimeryzacji zależnej od zarodkowania 19,20,21,22,23,25. Jest to często podkreślane przez brak fazy opóźnionej, nieefektywne wysiew i niefibrylarny charakter agregatów tau. Przyczyna tych niedociągnięć może być różna i obejmuje nieoptymalną jakość białka tau (fragmentacja, obecność agregatów, niska czystość itp.), wybór białka i odczynników indukujących i/lub warunki eksperymentalne. Innym czynnikiem komplikującym są dwie reszty cysteiny znajdujące się wokół granicy faz agregacji tau, które mogą tworzyć wewnątrz- lub międzycząsteczkowe mostki dwusiarczkowe w zależności od środowiska redoks i wpływać na efektywność agregacji tau. W większości podejść odczynniki redukujące, takie jak DTT lub TCEP, są stosowane w celu utrzymania reszt cysteiny w zredukowanych formach, a tym samym zwiększenia poziomu odtwarzalności25. Ponadto współczynnik ekstynkcji tau jest bardzo niski, co prowadzi do trudności w dokładnych pomiarach stężenia białka.
Skupiliśmy się w szczególności na kilku parametrach i atrybutach jakościowych, które uznaliśmy za kluczowe dla solidnego, powtarzalnego i reprezentatywnego profilu agregacji białka tau: wyeliminowanie możliwości tworzenia się dwusiarczku wewnątrz- i międzycząsteczkowego, generowanie monomeru tau o wysokiej czystości i poprawa dokładności oznaczania stężenia. Wszystkie te pytania związane z odczynnikami są potencjalnymi punktami uwagi, które uznaliśmy za kluczowe dla optymalnego opracowania testu. Aby rozwiązać te problemy, pełnej długości huTau441 poddano ekspresji z dwiema mutacjami, C291A i C322A, oraz ze znacznikami końcowymi N i C. Mutacja reszt cysteiny ma minimalny wpływ na białko tau, jednocześnie eliminując bardzo trudne do kontrolowania mostkowanie dwusiarczków. Ekspresja białka za pomocą stosunkowo krótkich znaczników końcowych N i C pozwoliła nam na zastosowanie dwuetapowego protokołu oczyszczania powinowactwa, który doprowadził do uzyskania bardzo wysokiej czystości, integralności i zawartości monomerów. Ponadto wprowadziliśmy mutację F8W, która zwiększyła współczynnik ekstynkcji białka i pozwoliła na znacznie dokładniejsze pomiary stężenia24.
Oprócz zastosowania wysokiej jakości odczynników białkowych zoptymalizowano również inne parametry testu. Stwierdzono, że optymalny stosunek tau do heparyny wynosi około 0,5 (M/M), co jest zgodne z wcześniej opublikowanymi badaniami26. Ponadto mechaniczne i optyczne ustawienia przyrządów mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia odtwarzalności, a optymalne parametry mogą się w pewnym stopniu różnić w zależności od producenta.
Agregacja tau opisana w tym teście wykazuje cechy, które są związane z patogenezą tau w AD i pokrewnymi tauopatiami. Proces rozpoczyna się początkową fazą opóźnienia odpowiadającą tworzeniu jąder o wysokiej energii, po której następuje faza szybkiego wzrostu, która odpowiada wzrostowi włókienek. Czas opóźnienia jest wystarczająco długi, aby otworzyć szerokie okno do szczegółowego zbadania procesu wysiewu obejmującego szeroki zakres stężeń nasion (rysunek 5), a jednocześnie nie jest zbyt długi, aby uniknąć degradacji białka i/lub niespecyficznej agregacji (rysunek 2). Te wtórne zdarzenia mogą wystąpić szczególnie wtedy, gdy wewnętrznie nieuporządkowane białko, takie jak huTau441, jest wystawione przez długi czas na warunki fizjologiczne. Uzyskane agregaty tau wykazują morfologię PHF wyizolowanych z mózgów pacjentów z chorobą Alzheimera i są bardzo skuteczne w rekrutacji monomerycznego tau i przekształcaniu go w agregaty generowane de novo , w procesie zwanym wysiewem. Test jest wysoce powtarzalny, a krzywe kinetyczne są praktycznie nie do odróżnienia między odwiertami, seriami doświadczalnymi i partiami białek. Chociaż obecny test koncentruje się tylko na najdłuższej izoformie tau, huTau441, zastosowanie można dostosować do badania konwersji innych form tau (Ameijde i wsp., Acta Neuropathologica Communications, w druku) Ponadto umożliwia badania mechanistyczne skoncentrowane na wzajemnym oddziaływaniu izoform tau i być może rzucają światło na różnice między patogenezą tau w AD, gdzie zarówno izoformy 3R, jak i 4R są obecne w PHF i chorobie PICK'a lub czołowo-skroniowej otępienie, w którym patologia tau zawiera głównie izoformy tau 3R i 4R, odpowiednio27.
Bardzo wysoka odtwarzalność testu powinna pozwolić czytelnikom na jego względne wdrożenie w konkretnych warunkach laboratoryjnych. Test naśladuje to, co uważa się za nieprawidłowe fałdowanie i agregację tau in vivo , umożliwiając badania mechanistyczne, które rzucą światło na patogenezę tau i stanowią cenne narzędzie do badań przesiewowych kandydatów na leki i oceny ich interferencji z różnymi etapami procesu patogenezy.

Choroba Alzheimera jest wyniszczającym zaburzeniem neurodegeneracyjnym, które jest histopatologicznie definiowane przez nagromadzenie zewnątrzkomórkowych blaszek starczych zagregowanego beta-amyloidu 1 i wewnątrzkomórkowych splątków neurofibrylarnych zawierających zagregowane hiperfosforylowane białko tau2. Fizjologiczne tau jest monomeryczne i prezentowane jako sześć unikalnych izoform zawierających 0-2 N końcowe inserty i 3 lub 4 domeny wiążące mikrotubule3,4 powstające w wyniku alternatywnego splicingu i średnio 2-3 fosforylacji. Uważa się, że hiperfosforylacja, nieprawidłowe fałdowanie i samoagregacja w struktury fibrylarne stanowią kluczowe elementy patogenezy tau, co patologicznie ocenia się u osób z demencją5,6.
Zagregowane neurofibrylarne sploty tau są znakiem rozpoznawczym nie tylko AD, ale także innych tauopatii, w tym zwyrodnienia płata czołowo-skroniowego (FTLD), choroby Picka, postępującego porażenia nadjądrowego (PSP), otępienia czołowo-skroniowego (FTD) i pierwotnej tauopatii związanej z wiekiem (PART)2. Z biochemicznego punktu widzenia zrozumienie mechanizmu nieprawidłowego fałdowania i agregacji tau może rzucić światło na patologiczne procesy związane z AD i innymi tauopatiami. Oprócz aspektu naukowego, solidne testy agregacji in vitro są cennymi narzędziami do badań przesiewowych kandydatów na leki7,8,9,10. Uważa się, że agregacja tau następuje w procesie polimeryzacji zależnej od zarodkowania (NDP)11,12,13,14. Kinetyka NDP jest sigmoidalna i rozpoczyna się od niekorzystnego energetycznie etapu zarodkowania, po którym następuje szybki energetycznie proces agregacji.
W przeciwieństwie do innych białek amyloidogennych, w tym białka prionowego, beta amyloidu i α-synukleiny, tau nie agreguje się spontanicznie w warunkach fizjologicznych i nawet ekstremalne pH lub wysokie temperatury nie sprzyjają agregacji15. Jest to najprawdopodobniej spowodowane oddziaływaniami hydrofilowymi obecnymi w granicy faz agregacji tau. Jednak tau agreguje efektywnie w stężeniach fizjologicznych, gdy używane są induktory, takie jak heparyna16 lub inne polianiony17,18.
Poprzednie próby stworzenia testów agregacji tau in vitro rzuciły nieco światła na szczegóły nieprawidłowego fałdowania i agregacji tau, ale nie udało im się naśladować tego, co uważa się za kinetykę agregacji tau in vivo. W większości przypadków kinetyka agregacji tau nie miała początkowej fazy opóźnienia związanej z zarodkowaniem tau. Mogło to być konsekwencją stosowania bardzo wysokich stężeń białka tau, obecności agregatów w wyjściowych preparatach białka tau i/lub stosowania fragmentów tau o znacznie wyższej skłonności do agregacji niż bardziej fizjologiczne białko tau o pełnej długości19,20,21,22,23. Ponadto wcześniejsze badania nie zajmowały się aspektem odtwarzalności i odporności kinetyki agregacji tau.
Tutaj opisujemy solidny test agregacji tau in vitro, który naśladuje główne cechy polimeryzacji zależnej od zarodkowania, z początkową fazą opóźnienia odpowiadającą zarodkowi tau, po której następuje faza wzrostu wykładniczego. Co więcej, wytworzone rekombinowane agregaty tau mają charakter fibrylarny i niezwykle wysoką siłę wysiewu. Test jest wysoce powtarzalny również między partiami tau i stanowi cenne narzędzie do badań przesiewowych pod kątem inhibitorów agregacji.

<table><tbody><tr><td>Tioflawina T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516-5G</td><td>suchy proszek (Mw = 318,86 g/mol)</td></tr><tr><td>Heparyna&nbsp;</td><td>Suchy proszek Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>(Mw = 17-19 kDa)</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259-1G</td><td>suchy proszek (MW= 286,65 g/mol)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Sterylny, pH 7,4 (1X)</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m sterylny filtr</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>membrana PES&nbsp;</td></tr><tr><td>0,20 &mu; m sterylny filtr serynge</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>membrana PES&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropłytki 96-dołkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502867</td><td>Czarne, płaskie dolne</td></tr><tr><td>zgrzewarki do mikropłytek&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>DY992</td><td>Paski samoprzylepne&nbsp;</td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek Synergy Neo2&nbsp;</td>Technologia hybrydowa <td>Biotek</td><td>Synergy Neo2</td><td>, oprogramowanie Gen5</td></tr><tr><td>Lampy Eppendorf</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>0030 120.086</td><td>Probówki 1,5 ml</td></tr><tr><td>Ultrasonics-Branson SFX250</td><td>Branson</td><td>101-063-966R</td><td>1/2" Solid Horn i 1/8" Microtip&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Agregacja białka tau i tworzenie par spiralnych włókien jest cechą charakterystyczną choroby Alzheimera i innych tauopatii. W porównaniu z innymi białkami związanymi z chorobami neurodegeneracyjnymi, kinetyka agregacji in vitro białka tau jest mniej spójna, co daje stosunkowo dużą zmienność. W tym miejscu opisujemy rozwój testu agregacji in vitro, który naśladuje oczekiwane etapy związane z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją tau in vivo. W teście wykorzystuje się najdłuższą izoformę tau (huTau441), która zawiera zarówno N-końcowe wstawki kwasowe, jak i cztery domeny wiążące mikrotubule (MBD). Agregacja in vitro jest wywoływana przez dodanie heparyny, a następnie w sposób ciągły następuje fluorescencja tioflawiny T w 96-dołkowym formacie mikropłytki. Test agregacji tau jest wysoce powtarzalny między różnymi studzienkami, seriami doświadczalnymi i partiami białka. Agregacja prowadzi do morfologii podobnej do tau PHF, która jest bardzo skuteczna w zasiewaniu tworzenia struktur fibrylarnych de novo. Oprócz zastosowania w badaniu mechanizmu nieprawidłowego fałdowania i agregacji tau, obecny test jest solidnym narzędziem do badań przesiewowych leków, które mogą zakłócać patogenezę tau.

Rekombinowane białko huTau441 zawierające mutacje C291A i C322A oraz N-końcowy znacznik His i C-końcowy znacznik C zostało wyekspresowane i oczyszczone zgodnie z wcześniejszym opisem24. Partie huTau441 są wysoko czyste, co potwierdzono w analizie SDS-PAGE, oraz wirtualnie w 100% monomeryczne w ocenie S-MALS (Rycina 1). Agregację 15 µM huTau441 indukowano poprzez dodanie 8 µM heparyny HMW, a reakcję monitorowano w sposób ciągły za pomocą fluorescencji ThT przy użyciu wielofunkcyjnego czytnika mikropłytek. Długość fali wzbudzenia wynosiła 440 nm (szerokość pasma 20 nm), natomiast emisję mierzono przy 485 nm (szerokość pasma 20 nm). Test jest wysoko powtarzalny, a wyniki z 10 poszczególnych dołków są praktycznie nieodróżnialne (Rycina 2A). Morfologię agregatów huTau441 wykazujących dodatni wynik z ThT oceniono po 50 h za pomocą AFM. Zagregowane huTau441 stanowi homogeniczną mieszaninę struktur włóknistych o różnej długości, podobnych do opisanych morfologii ex vivo (Rycina 2B). Ponadto końcowa mieszanina reakcyjna nie zawiera monomeru, co sugeruje pełną konwersję w agregaty, jak wykazano w pomiarach S-MALS (Rycina 2C). Kinetyka agregacji huTau441 w niezależnych seriach eksperymentalnych jest bardzo podobna, co podkreślają zbliżone krzywe sigmoidalne oraz nieodróżnialne fazy lag i wzrostu (Rycina 3). Wysoki poziom powtarzalności jest zachowany przy użyciu różnych partii białka (Rycina 4). Co więcej, uprzednio utworzone agregaty huTau441 są bardzo wydajne w rekrutowaniu monomerów tau i indukowaniu tworzenia agregatów tau de novo. Ilości tak niskie jak 0,0025% (v/v) uprzednio utworzonych agregatów tau są w stanie pominąć etap nukleacji i wywołać generowanie włókien de novo (Rycina 5).
<img alt="Wyniki oczyszczania białka; żel SDS-PAGE i wykres chromatografii wykluczania molekularnego; analiza molekularna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Rekombinowany huTau441 jest monomeryczny i wysoce czysty. A) Ocena czystości w warunkach denaturujących na żelu SDS-PAGE 4-12%, obejmująca marker masy cząsteczkowej białek (w kDA) (ścieżka 1); przelew z końcowego etapu oczyszczania powinowactwem do znacznika C (ścieżka 2); frakcja płukania kolumny (ścieżka 3), eluowany pik białka huTau441, odpowiednio przed (ścieżka 4) i po wymianie buforu (ścieżka 5). B) Analiza S-MALS białka huTau441. Białko wykazuje &gt; 99,9% formy monomerycznej o masie molowej 51 kDa i nie zawiera agregatów ani fragmentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Kinetyka fluorescencji, włókna amyloidowe i chromatografia UV; wykres, obraz mikroskopowy i wykres kropkowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Agregacja rekombinowanego huTau441 jest wysoce powtarzalna i prowadzi ilościowo do powstania struktur włóknistych. A) Kinetyka agregacji huTau441 indukowanej heparyną, monitorowana w sposób ciągły w formacie mikropłytek 96-dołkowych za pomocą fluorescencji ThT. Stężenia huTau441 i heparyny wynoszą odpowiednio 15 µM i 8 µM. 10 poszczególnych krzywych odpowiada konwersji tej samej partii białka w dziesięciu dołkach tej samej mikropłytki i charakteryzują się średnią (z SD) fazą lag wynoszącą 14,2 ± 0,38 h oraz t50 wynoszącym 18,8 ± 0,40 h. Dane kinetyczne dopasowano do 5-parametrowej krzywej logistycznej z liniowym spadkiem górnej asymptoty. Fazę lag i t50 obliczono poprzez interpolację między wartościami przewidywanymi za pomocą regresji liniowej. Fazę lag obliczono na podstawie 3% wzrostu sygnału fluorescencji ThT. Dopasowanie krzywych i statystyki podsumowujące zostały uzyskane przy użyciu oprogramowania IBM SPSS statistics wersja 20.0.0.2. B). Agregaty tau wykazują morfologię typu PHF, co wskazują obrazy AFM po 50 h; C). Analiza S-MALS monomerów huTau441 (t = 0 h) oraz nadosadu mieszaniny reakcyjnej po zakończeniu reakcji (t = 50 h). W punkcie czasowym 50 h mieszaninę reakcyjną wirowano przez 1 h przy 20,000 X g i 4 ˚C, a otrzymany nadosad wstrzyknięto do S-MALS. Zanik piku monomeru potwierdza całkowitą agregację białka tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy intensywności fluorescencji; Próba 1 i Próba 2; czas vs intensywność; analiza fałdowania białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Test agregacji tau wykazuje wysoką powtarzalność między niezależnymi seriami eksperymentalnymi. Dwa panele przedstawiają cztery poszczególne krzywe kinetyczne dla spontanicznej agregacji huTau441 zebranych w dwóch niezależnych eksperymentach z wykorzystaniem tej samej partii białka huTau441. Stężenia huTau441 i heparyny wynoszą odpowiednio 15 µM oraz 8 µM. Kinetyka charakteryzuje się średnią (z SD) fazą lag wynoszącą 12,2 ± 0,18 h i t50 wynoszącym 17,8 ± 0,8 h (Próba 1) oraz odpowiednio 11,6 ± 0,52 h i t50 wynoszącym 17,8 ± 0,23 h (Próba 2). Dane kinetyczne dopasowano do 5-parametrycznej krzywej logistycznej z liniowym spadkiem górnej asymptoty. Wartości T50 obliczono poprzez interpolację między wartościami przewidzianymi przez regresję liniową. Fazę lag obliczono na podstawie 3% wzrostu sygnału fluorescencji ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy intensywności fluorescencji partii w czasie, przedstawiające wyniki powtórzeń eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Test agregacji tau wykazuje wysoką odtwarzalność pomiędzy różnymi partiami białka huTau441. Każdy panel przedstawia cztery powtórzenia odpowiadające konkretnej partii huTau441. Agregacja każdej partii była monitorowana w niezależnych eksperymentach. Stężenia huTau441 i heparyny wynoszą odpowiednio 15 µM i 8 µM. Kinetyka agregacji odpowiadająca czterem poszczególnym partiom tau charakteryzuje się odpowiednio: średnią (z SD) fazą lag wynoszącą 15,3 ± 0,38 h i t50 wynoszącym 21,1 ± 0,46 h (Partia 1); fazą lag 12,5 ± 0,07 h i t50 19,8 ± 0,34 h (Partia 2); fazą lag 15,1 ± 0,34 h i t50 21,9 ± 0,86 h (Partia 3) oraz fazą lag 11,5 ± 0,29 h i t50 17,8 ± 0,29 h (Partia 4). Dane kinetyczne dopasowano do 5-parametrycznej krzywej logistycznej z liniowym spadkiem w górnej asymptocie. Fazę lag oraz t50 obliczono poprzez interpolację między wartościami przewidywanymi za pomocą regresji liniowej. Fazę lag obliczono na podstawie 3% wzrostu sygnału fluorescencji ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres intensywności fluorescencji w funkcji czasu; wykresy amplifikacji PCR; analiza danych w eksperymencie qPCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wstępnie utworzone agregaty hutau441 wykazują wysoką aktywność inicjującą (seeding). Aby zainicjować proces seedingu, do monomeru hutau441 dodano sonikowane agregaty tau. Od koloru czerwonego do niebieskiego, każdy kolor różnych krzywych kinetycznych reprezentuje inną ilość dodanych zarodków: odpowiednio 1,25%, 0,63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% i 0,0025% (v/v). Spontaniczną konwersję hutau441 przedstawiono kolorem czarnym. Wszystkie warunki przetestowano w czterech powtórzeniach. Cztery powtórzenia kinetyczne powiązane z określoną koncentracją zarodków są wysoce powtarzalne i w większości przypadków nieodróżnialne. Koncentracje hutau441 i heparyny wynoszą odpowiednio 15 µM i 8 µM. Dodatek niewielkich ilości wstępnie utworzonych, sonikowanych struktur włóknistych eliminuje początkową fazę lag obserwowaną podczas spontanicznej konwersji, a efekt ten jest proporcjonalny do ilości zarodków. Od koloru czerwonego do niebieskiego, obserwowana różnica w t50 (t50 spont.conv-t50 seeding) wynosi odpowiednio 18,9, 18,40, 17,8, 17,3, 16,6, 16,1, 15,4, 14,7, 14,2 i 13,7 godziny. Spontaniczna konwersja hutau441 charakteryzuje się średnim t50 (z SD) wynoszącym 19,85 ± 0,54 h. Dane kinetyczne dopasowano do 5-parametrowej krzywej logistycznej z liniowym spadkiem górnej asymptoty. Wartości t50 obliczono poprzez interpolację między wartościami przewidywanymi za pomocą regresji liniowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Test agregacji tau opisany w tym manuskrypcie naśladuje przewidywane cechy błędnego fałdowania i agregacji tau in vivo.

In vitro Test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Nieprawidłowe fałdowanie białka Tau w jego samoorganizacji w sparowane spiralne włókna jest patologiczną cechą charakterystyczną choroby Alzheimera i innych tauopatii. Tutaj przedstawiamy solidny test agregacji Tau, który może pomóc w wyjaśnieniu procesu patogenezy Tau. Konwersja przebiega zgodnie ze wszystkimi etapami procesu polimeryzacji zależnej od zarodkowania i jest wysoce odtwarzalna, co pozwala na badania przesiewowe leków w bardziej rygorystycznym formacie, który do tej pory spełniał poziom OBSI.Jakość odczynników ma kluczowe znaczenie. Rekombinowane Tau musi być wysoce czyste i pozbawione skupisk i fragmentów. Najpierw włącz komputer i wielomodowy czytnik mikropłytek.Po ustabilizowaniu się sprzętu uruchom oprogramowanie i wybierz Protokół standardowy jako typ protokołu. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza i wybierz Podgrzewanie wstępne przed kontynuowaniem protokołu. Następnie ustaw czas pracy kinetycznej na 50 godzin, a interwał pomiaru na 15 minut.Ustaw wytrząsanie orbitalne na 425 cykli na minutę w trybie ciągłym. Następnie wybierz metodę odczytu jako momochromatory kinetyczne punktu końcowego intensywności fluorescencji. Ustaw długość fali wzbudzenia na 440 nanometrów, a długość fali emisji na 485 nanometrów, pozycję optyki na górę, a wzmocnienie na 80.Wybierz normalną prędkość odczytu i ustaw wysokość odczytu na 4,50 milimetra. Następnie zweryfikuj i zapisz protokół. Uruchom przebieg przy użyciu utworzonego protokołu.Nazwij eksperyment, wybierz miejsce docelowe nowo utworzonego pliku i pozwól instrumentowi wstępnie zrównoważyć się do żądanej temperatury. Do eksperymentu spontanicznej rekombinowanej konwersji Tau należy przygotować próbkę reakcyjną o objętości 1 000 mikrolitrów z 800 mikrolitrami do fluorescencji tioflawiny-T i 130 mikrolitrami do analizy SEC-MALS, najpierw mieszając białko z buforem reakcyjnym w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj heparynę i tioflawinę-T i dobrze wymieszaj, pipetując pięć razy w górę i w dół.Ważne jest, aby precyzyjnie wykonywać protokół, aby zapewnić wysoką odtwarzalność, mieszać odczynniki w tej samej kolejności i dotrzymywać terminów. Wirować próbkę w temperaturze 12 000 x g i 25 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Po odwirowaniu należy dozować 200 mikrolitrów próbki reakcyjnej na studzienkę do 96-dołkowej mikropłytki, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.Następnie uszczelnij mikropłytkę, aby uniknąć parowania. Umieścić mikropłytkę w wielomodowym czytniku mikropłytek. Wybierz pełną płytkę lub, jeśli płyta nie jest pełna, wybierz dołki do odczytania i rozpocznij pomiar.Eksport danych do oprogramowania do przetwarzania danych. Następnie wyjmij mikropłytkę z urządzenia. Następnie usuń uszczelniacz z mikropłytki.Wymieszać zagregowaną próbkę w studzienkach, pipetując dwa razy w górę i w dół, a następnie zebrać różne kontrpróby w probówkach o pojemności 1,5 mililitra. Dokładnie wymieszaj każdą próbkę, pipetując pięć razy w górę i w dół, a następnie dozuj od 10 do 20 mikrolitrów na powierzchnię miki w celu analizy agregatów za pomocą mikroskopii sił atomowych. Następnie zbierz agregaty, obracając każdą rurkę o pojemności 1,5 mililitra przy 20 000 x g i 4 stopniach Celsjusza przez jedną godzinę.Przeanalizować supernatant za pomocą SEC-MALS w celu potwierdzenia braku monomerycznego Tau w próbce, co wskazuje na pomyślną konwersję na agregaty. Następnie usuń cały pozostały supernatant i oznacz 1,5-mililitrową probówkę zawierającą pozostałe agregaty początkowym stężeniem rekombinowanego białka Tau i objętością próbki. Zamroź kruszywa i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza.W przypadku eksperymentu z nasionami należy wyjąć rekombinowane agregaty Tau z zamrażarki, dodać objętość buforu reakcyjnego wskazaną na etykiecie i pozostawić probówkę do ustabilizowania się do temperatury pokojowej. Następnie ponownie zawiesić kruszywo, pipetując w górę i w dół od pięciu do ośmiu razy. Sonikować zagregowaną próbkę o objętości 200 mikrolitrów na lodzie za pomocą mikrokońcówki 1/8 cala przez łączny okres 15 sekund z impulsami trwającymi jedną sekundę i dwie sekundy przerwy przy amplitudzie 30 procent.Następnie przygotuj próbkę reakcyjną o pojemności 800 mikrolitrów, najpierw mieszając białko z buforem reakcyjnym w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj heparynę i tioflawinę-T i dobrze wymieszaj, pipetując pięć razy w górę i w dół. Wiruj próbki w temperaturze 12 000 x g i 25 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza.Po odwirowaniu należy dozować 198 mikrolitrów próbki reakcyjnej na studzienkę do 96-dołkowej mikropłytki, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Homogenizować wstępnie uformowaną próbkę włóknistą, pipetując trzykrotnie w górę i w dół. Dodaj ilość odpowiadającą żądanemu procentowi nasion do każdego dołka i wymieszaj, pipetując trzy razy w górę i w dół.Następnie uszczelnij mikropłytkę, aby uniknąć parowania. Umieścić mikropłytkę w wielomodowym czytniku mikropłytek i rozpocząć pomiar. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij mikropłytkę z urządzenia.Następnie wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego. Rekombinowany Tau zawierający mutacje C291A i C322A oraz końcowe c-znaczniki n his i c są wysoce czyste, jak pokazano na stronie SDS i praktycznie w 100 procentach monomeryczne, zgodnie z oceną SEC-MALS. Po indukowanej heparyną rekombinowanej agregacji Tau nastąpiła fluorescencja tioflawiny-T przy użyciu długości fali wzbudzenia 440 nanometrów i długości fali emisji 485 nanometrów.Test jest wysoce powtarzalny, a wyniki z 10 pojedynczych dołków są praktycznie nie do odróżnienia. Rekombinowane agregaty Tau są jednorodną mieszaniną struktur strzałkowych o różnej długości, podobną do morfologii zgłoszonych ex vivo. Końcowa mieszanina reakcyjna nie zawiera monomeru, co sugeruje pełną konwersję na agregaty, jak wykazano pomiarami SEC-MALS.Kinetyka rekombinowanej agregacji Tau w niezależnych seriach eksperymentalnych jest podobna, co podkreślają podobne krzywe sigmoidalne oraz nierozróżnialne fazy opóźnienia i wzrostu. Wysoki poziom odtwarzalności jest utrzymywany, gdy stosowane są różne partie białka. Wstępnie uformowane rekombinowane agregaty Tau są skuteczne w rekrutacji monomeru Tau i indukowaniu tworzenia de novo agregatów Tau, a wydajność procesu jest wprost proporcjonalna do procentu nasion.Ilości tak niskie, jak 0,0025 procent wstępnie uformowanych agregatów Tau wyrażonych objętościowo, są w stanie ominąć zarodkowanie rekombinowanego Tau i wywołać wytwarzanie włókien de novo. Obecny test naśladuje to, co uważa się za nieprawidłowe fałdowanie i agregację Tau in vivo i umożliwia badania mechanistyczne, które mogą rzucić światło na proces patogenezy i stanowią cenne narzędzie do badań przesiewowych leków i badania interferencji kandydatów na leki na różnych etapach procesu. Wysoka powtarzalność testu pozwoli naukowcom na jego stosunkowo łatwe wdrożenie w laboratorium.Chociaż obecny test koncentruje się tylko na najdłuższej izoformie Tau, ludzkiej Tau-441, zastosowanie można dostosować do badania różnych wariantów Tau. I nie zapominaj, że wybór odpowiednich odczynników białkowych i produkcja ich zgodnie z wysokimi standardami jakości są niezbędne do stworzenia solidnego i wysoce powtarzalnego testu.

in-vitro-assay-for-studying-aggregation-tau-protein-drug

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wideo demonstruje test cytometrii przepływowej rezonansu fluorescencji (FRET) w celu wykrycia aktywności wysiewu agregatów białkowych wyizolowanych z próbek biologicznych. Komórki ssaków wykazujące ekspresję białek reporterowych tau są inkubowane z kompleksami transdukcji liposomów zawierającymi nasiona tau. Nasiona te pośredniczą w agregacji białek reporterowych, prowadząc do generowania dodatniego sygnału FRET w cytometrze przepływowym.

Technika cytometrii przepływowej FRET do wykrywania agregacji białek reporterowych indukowanej nasionami Tau

Ten film prezentuje test komórkowy określający ilościowo wychwyt Tau przez mysi mikroglej przy użyciu wrażliwych na pH, fluorescencyjnie znakowanych agregatów Tau, analizowanych za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu oceny ilościowej.

Test komórkowy do oceny wychwytu białka tau przez mikroglej

Ten film pokazuje ocenę in vitro zapadania się stożka wzrostu neuronów przez agregaty amyloid-β (Aβ). Traktowanie neuronów agregatami Aβ powoduje destabilizację cytoszkieletu, prowadzącą do zapadnięcia się stożków wzrostu na końcach aksonów. Leczone komórki porównuje się z komórkami kontrolnymi w celu oceny stopnia zapadania się stożka wzrostu.

Ocena in vitro zagregowanego β amyloidu na zapadanie się stożka wzrostu neuronów

Ten film pokazuje proces transdukcji ludzkich komórek nerwowych za pomocą lentiwirusa kodującego zmutowane ludzkie białko tau oznaczone żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP) w celu zbadania agregacji białek. Przedstawia etapy od wniknięcia wirusa do ekspresji zmutowanego tau, których kulminacją jest tworzenie widocznych cytoplazmatycznych agregatów tau w neuronach.

Transdukcja ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa do analizy agregacji białka Tau

Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.

Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Ten manuskrypt opisuje standardowe protokoły pomiaru hiperfosforylacji tau, pomiaru wiązania tau z mikrotubulami oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowego tau po leczeniu farmakologicznym. Protokoły te mogą być stosowane wielokrotnie do badań przesiewowych leków lub innych związków, które są ukierunkowane na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul.

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Mikrodializa in vivo umożliwiła pobranie cząsteczek obecnych w płynie śródmiąższowym mózgu (ISF) od obudzonych, swobodnie zachowujących się zwierząt. W celu analizy stosunkowo dużych cząsteczek w ISF, niniejszy artykuł koncentruje się w szczególności na protokole mikrodializy przy użyciu sond z membranami odcinającymi o dużej masie cząsteczkowej.

In vivo (in vivo) Metoda mikrodializy do zbierania dużych białek zewnątrzkomórkowych z płynu śródmiąższowego mózgu za pomocą sond odcinających o dużej masie cząsteczkowej

Tutaj opisujemy test komórkowy do ilościowej oceny wychwytu tau przez mikroglej w celu stworzenia narzędzia badawczego do lepszego scharakteryzowania mechanizmów działania przeciwciał anty-tau.

Test komórkowy do badania klirensu Tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, w której ludzkie kultury neuronalne są transdukowane za pomocą lentiwirusowych konstruktów kodujących zmutowane ludzkie tau. Transdukowane kultury wykazują agregaty tau i związane z nimi patologie.

Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

Poznaj niezawodny test agregacji białka tau do badania procesów patogennych w chorobie Alzheimera. Ta metoda umożliwia przesiewanie leków z wysoką powtarzalnością wykorzystując czyste białko rekombinowane.

In vitro Test do badania agregacji białka tau i badań przesiewowych leków

Przeglądaj więcej filmów