Name: Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj spektroskopię fluktuacji fluorescencji do badania interakcji białko-białko na styku komórka-komórka w żywych komórkach. Ta metoda umożliwia analizę w czasie rzeczywistym bez konieczności utrwalania próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez 254850309 grantowe Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Autorzy dziękują Madlenowi Lucknerowi za krytyczną lekturę rękopisu.

<ol><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.goodreads.com/book/show/13400.Molecular_Biology_of_the_Cell">Molecular biology of the cell</a>. , Garland Science. (2002).</li>
<li>Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherins+in+embryonic+and+neural+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cadherins in embryonic and neural morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (2), 91-100 (2000).</li>
<li>Harris, T. J. C., Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherens+junctions%3A+from+molecules+to+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adherens junctions: from molecules to morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (7), 502-514 (2010).</li>
<li>Hernández, J. M., Podbilewicz, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29254991">The hallmarks of cell-cell fusion.</a> Development. 144 (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nature Reviews Immunology. 3 (12), 973-983 (2003).</li>
<li>Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+and+dimerization+of+APLP1+are+strikingly+different+from+APP+and+APLP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2.</a> Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).</li>
<li>Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+and+believing%3A+recent+advances+in+imaging+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions.</a> F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273(2015).</li>
<li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Developmental Biology. 401 (1), 165-174 (2015).</li>
<li>Soba, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-+and+heterodimerization+of+APP+family+members+promotes+intercellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion.</a> The EMBO Journal. 24 (20), 3624-3634 (2005).</li>
<li>Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+dynamics+of+cadherin+interactions+at+cell-cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (24), 9857-9862 (2011).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).</li>
<li>Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+amyloid+precursor-like+protein+1+trans+interactions+in+cell-cell+adhesion+platforms+investigated+via+fluorescence+fluctuation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy.</a> Molecular biology of the cell. 28 (25), 3609-3620 (2017).</li>
<li>Schneider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+lipids+and+GPI-anchored+proteins+in+actin-free+plasma+membrane+vesicles+measured+by+STED-FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1507-1518 (2017).</li>
<li>Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16432516">Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells.</a> Nature methods. 3 (2), 83-89 (2006).</li>
<li>Ries, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Slow+Membrane+Dynamics+with+Continuous+Wave+Scanning+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (5), 1915-1924 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Determination+of+Membrane+Dynamics+with+Line-Scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+membrane+structure+elucidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (1), 225-233 (2009).</li>
<li>Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+number+of+molecules+and+brightness+in+the+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope.</a> Biophysical journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).</li>
<li>Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+particle+number+and+brightness+using+a+laser+scanning+confocal+microscope+operating+in+the+analog+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+research+and+technique%22%5BJournal%5D)">Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode.</a> Microscopy research and technique. 71 (1), 69-81 (2008).</li>
<li>Unruh, J. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Molecular+Concentration+and+Brightness+from+Fluorescence+Fluctuation+Data+with+an+Electron+Multiplied+CCD+Camera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).</li>
<li>Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+molecular+complexes+at+adhesions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2170-2175 (2009).</li>
<li>Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+brightness+image+analysis+reveals+ATF-induced+dimerization+kinetics+of+uPAR+in+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+journal+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane.</a> The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25 (9), 2883-2897 (2011).</li>
<li>Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+fluorescent+protein+tags+for+quantifying+protein+oligomerization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10634(2018).</li>
<li>Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+Protein+Interactions+and+Their+Stoichiometry+in+Living+Cells+by+Brightness+Analysis+of+Fluorescence+Fluctuation+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments.</a> Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).</li>
<li>Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf">https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf</a> (2010).</li>
<li>Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+quantification+of+biomolecular+interactions+by+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Biophysical journal. 102 (5), 1174-1183 (2012).</li>
<li>Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieving+the+intracellular+topology+from+multi-scale+protein+mobility+mapping+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells.</a> Nature Communications. 5, 4494(2014).</li>
<li>Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11371471">The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophysical journal. 80 (6), 2987-2999 (2001).</li>
<li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Optics Express. 18 (11), 11073(2010).</li>
<li>Ries, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+concepts+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 10 (24), 3487(2008).</li>
<li>Mayer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor-like+protein+1+%28APLP1%29+exhibits+stronger+zinc-dependent+neuronal+adhesion+than+amyloid+precursor+protein+and+APLP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (2), 266-276 (2016).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+limits+and+data+correction+in+number+of+molecules+and+brightness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis.</a> Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nandb-number+and+brightness+in+R+with+a+novel+automatic+detrending+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm.</a> Bioinformatics. 33 (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).</li>
<li>Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+binding+and+rapid+diffusion+of+proteins+in+complex+with+inositol+lipids+serves+to+coordinate+free+movement+with+spatial+information%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information.</a> The Journal of cell biology. 184 (2), 297-308 (2009).</li>
<li>Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbitrary-Region+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical journal. 111 (8), 1785-1796 (2016).</li>
<li>Hendrix, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+observation+of+cytosolic+HIV-1+assembly+onset+reveals+RNA-interacting+Gag+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers.</a> The Journal of cell biology. 210 (4), 629-646 (2015).</li>
<li>Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Interleaved+Excitation+Fluctuation+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging.</a> Biophysical Journal. 105 (4), 848-861 (2013).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5 (1), 5412(2014).</li>
<li>Chojnacki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope+glycoprotein+mobility+on+HIV-1+particles+depends+on+the+virus+maturation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state.</a> Nature Communications. 8 (1), 545(2017).</li>
<li>Godin, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+protein+oligomerization+and+densities+in+situ+using+spatial+intensity+distribution+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).</li>
<li>Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+Heterogeneity+on+the+Single+Molecular+Level+with+the+Photon-Counting+Histogram%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram.</a> Biophysical Journal. 78 (1), 474-486 (2000).</li>
<li>Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Cross-Correlation+Analysis+of+Intracellular+Reactions+with+Variable+Stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry.</a> Biophysical Journal. 88 (6), 4319-4336 (2005).</li>
<li>Jenkins, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+immune+cell+interactions+in+free-standing+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes.</a> Journal of cell science. 132 (4), (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tu procedura doświadczalna pozwala na badanie oddziaływań białko-białko trans na styku komórka-komórka, z wykorzystaniem technik spektroskopii fluktuacji fluorescencji, a mianowicie sFCCS i ccN&B. Metody te obejmują analizę statystyczną fluktuacji fluorescencji emitowanych przez dwa spektralnie oddzielone FP połączone z białkiem (białkami) będącym przedmiotem zainteresowania na styku dwóch sąsiednich komórek, z których każda wykazuje ekspresję jednego lub drugiego białka fuzyjnego. Obecność kompleksó...

<table><tbody><tr><td>Pożywka DMEM</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-01548</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w: Ca2+ i Mg2+</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w: Ca2+ i Mg2+</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-35500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>PAN-Biotech</td><td>P10-023100</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TurboFect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>HEK Komórki 293T</td><td>DSMZ</td><td>ACC 635</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma-Alderich</td><td>83689-1G</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid DNA</td><td>Addgene</td><td>NA</td><td>Patrz odniesienie 12 (Dunsing i wsp., MBoC 2017), aby uzyskać szczegółowy opis wszystkich plazmidów</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>35- mm szklane płytki</td><td>dolne CellVis</td><td>D35-14-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM780 konfokalne</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB pakiet oprogramowania</td><td>MathWorks</td><td>&nbsp; 2015b&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek Neubauer</td><td>Marienfeld</td><td>640110</td><td></td></tr></tbody></table>

test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Różnorodność procesów biologicznych obejmuje interakcje komórka-komórka, zazwyczaj pośredniczone przez białka, które oddziałują na granicy między sąsiednimi komórkami. Co ciekawe, tylko nieliczne testy są w stanie dokładnie zbadać takie interakcje bezpośrednio w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiamy test do pomiaru wiązania białek ulegających ekspresji na powierzchniach sąsiednich komórek, na styku komórka-komórka. Test ten składa się z dwóch etapów: mieszania komórek wyrażających interesujące białka połączonych z różnymi białkami fluorescencyjnymi, a następnie pomiarów spektroskopii fluktuacji fluorescencji na styku komórka-komórka przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Pokazujemy wykonalność tego testu w biologicznie istotnym kontekście, mierząc interakcje białka podobnego do prekursora amyloidu 1 (APLP1) w połączeniach komórka-komórka. Zapewniamy szczegółowe protokoły pozyskiwania danych przy użyciu technik opartych na fluorescencji (spektroskopia fluorescencji skaningowej, spektroskopia korelacji krzyżowej, analiza liczby korelacji krzyżowych i jasności) oraz wymagane kalibracje przyrządów. Ponadto omawiamy krytyczne etapy analizy danych oraz sposoby identyfikowania i korygowania zewnętrznych, fałszywych zmian sygnału, takich jak te spowodowane fotowybielaniem lub ruchem komórek.
Ogólnie rzecz biorąc, prezentowany test ma zastosowanie do każdej homo- lub heterotypowej interakcji białko-białko na styku komórka-komórka, między komórkami tego samego lub różnych typów i może być zaimplementowany na komercyjnym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Ważnym wymogiem jest stabilność systemu, która musi być wystarczająca do zbadania dynamiki dyfuzyjnej badanych białek w ciągu kilku minut.

Pierwszy test analizy oddziaływań białko-białko, t.j. mieszanie komórek wykazujących ekspresję spektralnie odmiennych białek fluorescencyjnych, a następnie pomiary sFCCS/ccN&amp;B (Rysunek 1), należy przeprowadzić na białkach, których nie spodziewamy się, że będą oddziaływać w punkcie kontaktu międzykomórkowego (t.j. kontrola negatywna). W związku z tym zmieszano komórki HEK 293T wykazujące ekspresję myristoylowano-palmitylowanego-mEYFP (myr...

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych pytań w dziedzinie interakcji międzykomórkowych, takich jak to, które receptory pośredniczą w adhezji lub rozpoznawaniu w kontaktach międzykomórkowych i czy określone ligandy wywołują ich interakcje. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie takich interakcji bezpośrednio w żywych komórkach bez potrzeby fiksacji lub rozrywania komórek. Chociaż metoda ta jest stosowana do badania interakcji między hodowanymi komórkami, można ją również zastosować do innych systemów: pęcherzyków jednobłonowych, a nawet małych organizmów modelowych.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, powinny sprawdzić, czy ich próbka jest wystarczająco stabilna, aby umożliwić akwizycję w ciągu kilku minut, dokładnie sprawdzając ruch komórki i powolne zmiany sygnału. Po pierwsze, wysiewaj odpowiednią liczbę komórek w co najmniej czterech dołkach sześciodołkowej płytki dziennie przed transfekcją. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% L-glutaminą.Aby przeprowadzić podstawowy eksperyment, transfekcyjne plazmidy dla białka będącego przedmiotem zainteresowania należy połączyć z zielonym lub żółtym białkiem fluorescencyjnym i czerwonym białkiem fluorescencyjnym w oddzielnych studzienkach. Po czterech godzinach usuń pożywkę wzrostową i delikatnie umyj każdą studzienkę jednym mililitrem PBS uzupełnionym magnezem i wapniem, upuszczając PBS na krawędź studzienki, aby zapobiec oderwaniu się komórek podczas mycia. Następnie wyjmij PBS.Dodaj około 50 mikrolitrów roztworu EDTA kroplami do każdego dołka, aby ułatwić oderwanie komórek. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, powoli potrząśnij sześciodołkową płytką na boki, aby odłączyć komórki. Następnie dodaj 950 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki i ponownie zawieś komórki, pipetując kilka razy w górę iw dół, odrywając w ten sposób wszystkie komórki od dna studzienki.Upewnij się, że komórki są prawidłowo zawieszone i odłączone od siebie, sprawdzając wzrokowo, czy po ponownym zawieszeniu nie ma dużych agregatów komórek. Przenieś roztwór komórkowy z jednej studzienki do odpowiedniego dołka. Delikatnie wymieszać, pipetując kilka razy w górę i w dół.Następnie zasiej wymieszane komórki na 35-milimetrowym szklanym naczyniu i hoduj zasiane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jeden dzień. W oprogramowaniu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego ustaw ścieżkę optyczną. Aby uniknąć przesłuchów spektralnych, wybierz dwie oddzielne ścieżki do wzbudzania i wykrywania sekwencyjnego mEGFP lub mEYFP i mCherry lub mCardinal, a następnie wybierz opcję Przełącz ścieżki co linię.Do detekcji należy użyć odpowiednich filtrów dla obu kanałów. Umieścić naczynie zawierające wymieszane komórki na uchwycie na próbkę. Po odczekaniu 10 minut, aby zapewnić równowagę temperatury i zmniejszyć dryft ostrości, ustaw ostrość na komórkach za pomocą lampki transmisyjnej w menu Zlokalizuj.Wyszukaj parę czerwonych i zielonych komórek, które stykają się ze sobą. Następnie wybierz ścieżkę skanowania prostopadłą do kontaktu komórka-komórka za pomocą przycisku Przytnij. Powiększ, aby uzyskać rozmiar piksela od 50 do 200 nanometrów, a następnie wybierz opcję Linia w trybie skanowania.Ustaw rozmiar klatki na 128 na jeden piksel. Ustaw szybkość skanowania na maksymalną dozwoloną wartość. Następnie ustaw cykle na 100 000 do 500 000.Następnie wybierz odpowiednie moce lasera. Ustaw detektory w trybie zliczania fotonów. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć pobieranie.Eksportuj surowe pliki danych do obrazu TIF RGB w formacie danych raw. Ten plik będzie zawierał kimograf z danymi kanału zielonego i czerwonego w kanale oznaczonym odpowiednio G i R obrazu. Następnie należy zaimportować plik TIF z odpowiednim oprogramowaniem do analizy i przystąpić do wykonywania analizy.Wyrównaj linie, wykonując średnią czasową dla segmentów z blokami od 500 do 1000 linii. Określ położenie membrany w każdym bloku. Następnie przesuń wszystkie klocki do tej samej pozycji bocznej.Zsumuj wszystkie wyrównane linie wzdłuż osi czasu i dopasuj średni profil intensywności za pomocą funkcji Gaussa. Zdefiniuj piksele odpowiadające membranie jako wszystkie piksele w zakresie plus minus 2,5 sigma od położenia membrany i zsumuj intensywność tych pikseli w każdej linii, uzyskując pojedynczą wartość sygnału fluorescencyjnego dla każdego punktu czasowego. W przypadku zaobserwowania wybielania fotograficznego należy zastosować korektę wybielania, dopasowując szeregi czasowe fluorescencji błony z funkcją podwójnej wykładni i stosując odpowiednią formułę korekcyjną.Oblicz funkcje auto i korelacji krzyżowej zgodnie z odpowiednimi równaniami. Aby zwiększyć wiarygodność analizy i uniknąć artefaktów, należy wykonać obliczenia dla 10 do 20 równych segmentów całkowitego pomiaru. Sprawdź szeregi czasowe fluorescencji i funkcje korelacji w każdym segmencie i usuń wyraźnie zniekształcone segmenty.Na koniec należy uśrednić wszystkie niezniekształcone segmenty. Analizując dane, dokładnie sprawdź szeregi czasowe intensywności i funkcje korelacji z każdego segmentu, aby uniknąć zniekształceń, na przykład spowodowanych pęcherzykami wewnątrzkomórkowymi na obrzeżach błony. Pokazano tutaj obraz intensywności komórek HEK 293T eksprymujących mirystolijno-palmitoilowany-mEYFP lub mCardinal.Zaobserwowano względną korelację krzyżową bliską zeru, podczas gdy funkcje autokorelacji wykazują charakterystyczne czasy rozpadu od 10 do 20 milisekund dla dyfuzji mirystoliowanego-palmitoilarylonego-mEYFP i mCardinal w błonie plazmatycznej. Funkcje korelacji krzyżowej pomiarów sFCCS komórek HEK 293T eksprymujących zakotwiczony w błonie heterodimer mirystoliowany-palmitoilowany-mCardinal-mEYFP miały dodatnie amplitudy i wykazywały podobne czasy rozpadu jak funkcja autokorelacji. Pomiary sFCCS dotyczące kontaktów międzykomórkowych między komórkami APLP1-mEYFP i APLP1-mCardinal wykazały dodatnią względną korelację krzyżową wynoszącą 0,45.Funkcje korelacji sFCCS uzyskane z pomiarów w klastrach APLP1 na styku komórka-komórka wykazały silnie zmniejszoną dynamikę, co jest widoczne w dużych czasach zaniku oscylacji przy dużych czasach opóźnień. Po dodaniu jonów względna korelacja krzyżowa wzrosła do średniej wartości 0,8. Co więcej, jasność molekularna znacznie wzrosła od małych oligomerów do większych multimerów składających się z 10 do 50 monomerów na każdej komórce.Niestabilności przejściowe mogą spowodować, że funkcja korelacji krzyżowej będzie miała wartości ujemne lub wysoką fałszywie dodatnią korelację krzyżową. Odpowiadające im funkcje korelacji zazwyczaj znacznie odbiegają od funkcji większości segmentów. Jako podejście uzupełniające do sFCCS, liczba korelacji krzyżowej i jasność mogą być stosowane do wykrywania interakcji białko-białko.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że mieszanie transfekowanych komórek jest krytycznym krokiem. Delikatnie wymieszaj komórki i zoptymalizuj wydajność transfekcji, aby zwiększyć szansę na znalezienie czerwonych i zielonych komórek w kontakcie. Po opracowaniu technika ta została wykorzystana przez naukowców w dziedzinie immunologii do zbadania interakcji cząsteczek sygnałowych w synapsach immunologicznych.

a-fluorescence-fluctuation-spectroscopy-assay-protein-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

W tym filmie opisujemy technikę anizotropii fluorescencji do badania interakcji między białkiem zespołu Shwachmana-Diamonda (SBDS) oznaczonym fluoroforem a czynnikiem wydłużenia 1 GTPazą (EFL1). Podczas inkubacji białek SBDS ze stopniowo rosnącymi stężeniami EFL1 obserwuje się stały wzrost anizotropii, co wskazuje na udaną interakcję między tymi dwoma białkami.

Wykrywanie interakcji białko-białko oparte na anizotropii fluorescencyjnej

Interakcje między białkami są fundamentalne dla wszystkich procesów komórkowych. Korzystając z transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego, można monitorować interakcję między parą białek w żywych komórkach i w czasie rzeczywistym. Ponadto można ocenić skutki potencjalnie patogennych mutacji.

Badanie interakcji białko-białko w żywych komórkach za pomocą transferu energii rezonansu bioluminescencyjnego

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Poznaj spektroskopię fluktuacji fluorescencji do badania interakcji białko-białko na styku komórka-komórka w żywych komórkach. Ta metoda umożliwia analizę w czasie rzeczywistym bez konieczności utrwalania próbek.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Przeglądaj więcej filmów