Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka
1 grudnia 2018
Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.
Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych pytań w dziedzinie interakcji międzykomórkowych, takich jak to, które receptory pośredniczą w adhezji lub rozpoznawaniu w kontaktach międzykomórkowych i czy określone ligandy wywołują ich interakcje. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie takich interakcji bezpośrednio w żywych komórkach bez potrzeby fiksacji lub rozrywania komórek. Chociaż metoda ta jest stosowana do badania interakcji między hodowanymi komórkami, można ją również zastosować do innych systemów: pęcherzyków jednobłonowych, a nawet małych organizmów modelowych.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, powinny sprawdzić, czy ich próbka jest wystarczająco stabilna, aby umożliwić akwizycję w ciągu kilku minut, dokładnie sprawdzając ruch komórki i powolne zmiany sygnału. Po pierwsze, wysiewaj odpowiednią liczbę komórek w co najmniej czterech dołkach sześciodołkowej płytki dziennie przed transfekcją. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% L-glutaminą.
Aby przeprowadzić podstawowy eksperyment, transfekcyjne plazmidy dla białka będącego przedmiotem zainteresowania należy połączyć z zielonym lub żółtym białkiem fluorescencyjnym i czerwonym białkiem fluorescencyjnym w oddzielnych studzienkach. Po czterech godzinach usuń pożywkę wzrostową i delikatnie umyj każdą studzienkę jednym mililitrem PBS uzupełnionym magnezem i wapniem, upuszczając PBS na krawędź studzienki, aby zapobiec oderwaniu się komórek podczas mycia. Następnie wyjmij PBS.
Dodaj około 50 mikrolitrów roztworu EDTA kroplami do każdego dołka, aby ułatwić oderwanie komórek. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, powoli potrząśnij sześciodołkową płytką na boki, aby odłączyć komórki. Następnie dodaj 950 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki i ponownie zawieś komórki, pipetując kilka razy w górę iw dół, odrywając w ten sposób wszystkie komórki od dna studzienki.
Upewnij się, że komórki są prawidłowo zawieszone i odłączone od siebie, sprawdzając wzrokowo, czy po ponownym zawieszeniu nie ma dużych agregatów komórek. Przenieś roztwór komórkowy z jednej studzienki do odpowiedniego dołka. Delikatnie wymieszać, pipetując kilka razy w górę i w dół.
Następnie zasiej wymieszane komórki na 35-milimetrowym szklanym naczyniu i hoduj zasiane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jeden dzień. W oprogramowaniu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego ustaw ścieżkę optyczną. Aby uniknąć przesłuchów spektralnych, wybierz dwie oddzielne ścieżki do wzbudzania i wykrywania sekwencyjnego mEGFP lub mEYFP i mCherry lub mCardinal, a następnie wybierz opcję Przełącz ścieżki co linię.
Do detekcji należy użyć odpowiednich filtrów dla obu kanałów. Umieścić naczynie zawierające wymieszane komórki na uchwycie na próbkę. Po odczekaniu 10 minut, aby zapewnić równowagę temperatury i zmniejszyć dryft ostrości, ustaw ostrość na komórkach za pomocą lampki transmisyjnej w menu Zlokalizuj.
Wyszukaj parę czerwonych i zielonych komórek, które stykają się ze sobą. Następnie wybierz ścieżkę skanowania prostopadłą do kontaktu komórka-komórka za pomocą przycisku Przytnij. Powiększ, aby uzyskać rozmiar piksela od 50 do 200 nanometrów, a następnie wybierz opcję Linia w trybie skanowania.
Ustaw rozmiar klatki na 128 na jeden piksel. Ustaw szybkość skanowania na maksymalną dozwoloną wartość. Następnie ustaw cykle na 100 000 do 500 000.
Następnie wybierz odpowiednie moce lasera. Ustaw detektory w trybie zliczania fotonów. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć pobieranie.
Eksportuj surowe pliki danych do obrazu TIF RGB w formacie danych raw. Ten plik będzie zawierał kimograf z danymi kanału zielonego i czerwonego w kanale oznaczonym odpowiednio G i R obrazu. Następnie należy zaimportować plik TIF z odpowiednim oprogramowaniem do analizy i przystąpić do wykonywania analizy.
Wyrównaj linie, wykonując średnią czasową dla segmentów z blokami od 500 do 1000 linii. Określ położenie membrany w każdym bloku. Następnie przesuń wszystkie klocki do tej samej pozycji bocznej.
Zsumuj wszystkie wyrównane linie wzdłuż osi czasu i dopasuj średni profil intensywności za pomocą funkcji Gaussa. Zdefiniuj piksele odpowiadające membranie jako wszystkie piksele w zakresie plus minus 2,5 sigma od położenia membrany i zsumuj intensywność tych pikseli w każdej linii, uzyskując pojedynczą wartość sygnału fluorescencyjnego dla każdego punktu czasowego. W przypadku zaobserwowania wybielania fotograficznego należy zastosować korektę wybielania, dopasowując szeregi czasowe fluorescencji błony z funkcją podwójnej wykładni i stosując odpowiednią formułę korekcyjną.
Oblicz funkcje auto i korelacji krzyżowej zgodnie z odpowiednimi równaniami. Aby zwiększyć wiarygodność analizy i uniknąć artefaktów, należy wykonać obliczenia dla 10 do 20 równych segmentów całkowitego pomiaru. Sprawdź szeregi czasowe fluorescencji i funkcje korelacji w każdym segmencie i usuń wyraźnie zniekształcone segmenty.
Na koniec należy uśrednić wszystkie niezniekształcone segmenty. Analizując dane, dokładnie sprawdź szeregi czasowe intensywności i funkcje korelacji z każdego segmentu, aby uniknąć zniekształceń, na przykład spowodowanych pęcherzykami wewnątrzkomórkowymi na obrzeżach błony. Pokazano tutaj obraz intensywności komórek HEK 293T eksprymujących mirystolijno-palmitoilowany-mEYFP lub mCardinal.
Zaobserwowano względną korelację krzyżową bliską zeru, podczas gdy funkcje autokorelacji wykazują charakterystyczne czasy rozpadu od 10 do 20 milisekund dla dyfuzji mirystoliowanego-palmitoilarylonego-mEYFP i mCardinal w błonie plazmatycznej. Funkcje korelacji krzyżowej pomiarów sFCCS komórek HEK 293T eksprymujących zakotwiczony w błonie heterodimer mirystoliowany-palmitoilowany-mCardinal-mEYFP miały dodatnie amplitudy i wykazywały podobne czasy rozpadu jak funkcja autokorelacji. Pomiary sFCCS dotyczące kontaktów międzykomórkowych między komórkami APLP1-mEYFP i APLP1-mCardinal wykazały dodatnią względną korelację krzyżową wynoszącą 0,45.
Funkcje korelacji sFCCS uzyskane z pomiarów w klastrach APLP1 na styku komórka-komórka wykazały silnie zmniejszoną dynamikę, co jest widoczne w dużych czasach zaniku oscylacji przy dużych czasach opóźnień. Po dodaniu jonów względna korelacja krzyżowa wzrosła do średniej wartości 0,8. Co więcej, jasność molekularna znacznie wzrosła od małych oligomerów do większych multimerów składających się z 10 do 50 monomerów na każdej komórce.
Niestabilności przejściowe mogą spowodować, że funkcja korelacji krzyżowej będzie miała wartości ujemne lub wysoką fałszywie dodatnią korelację krzyżową. Odpowiadające im funkcje korelacji zazwyczaj znacznie odbiegają od funkcji większości segmentów. Jako podejście uzupełniające do sFCCS, liczba korelacji krzyżowej i jasność mogą być stosowane do wykrywania interakcji białko-białko
.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że mieszanie transfekowanych komórek jest krytycznym krokiem. Delikatnie wymieszaj komórki i zoptymalizuj wydajność transfekcji, aby zwiększyć szansę na znalezienie czerwonych i zielonych komórek w kontakcie. Po opracowaniu technika ta została wykorzystana przez naukowców w dziedzinie immunologii do zbadania interakcji cząsteczek sygnałowych w synapsach immunologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji w celu zbadania oddziaływań między białkami pośredniczącymi w interakcjach międzykomórkowych bezpośrednio w żywych komórkach. Metoda ta pozwala na badanie tych oddziaływań bez konieczności fiksacji lub rozrywania komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Interakcje białkowe
- Spektroskopia fluorescencyjna
Wstęp
- Zrozumienie oddziaływań międzykomórkowych jest kluczowe dla wielu procesów biologicznych.
- Receptory pośredniczą w adhezji i rozpoznawaniu w kontaktach międzykomórkowych.
- Specyficzne ligandy mogą inicjować te oddziaływania.
- Technikę tę można zastosować do hodowli komórkowych, pęcherzyków monomembranowych oraz niewielkich organizmów modelowych.
Cel badania
- Badanie oddziaływań białkowych w połączeniach międzykomórkowych.
- Przedstawienie wytycznych dotyczących kalibracji instrumentów i analizy danych.
- Badanie dynamiki oddziaływań międzykomórkowych w czasie rzeczywistym.
Zastosowane metody
- Spektroskopia fluktuacji fluorescencji
- Obrazowanie żywych komórek
- Akwizycja i analiza danych
- Kalibracja instrumentów
Główne wyniki
- Skuteczna obserwacja oddziaływań białek w żywych komórkach.
- Identyfikacja kluczowych receptorów zaangażowanych w adhezję komórkową.
- Wykazanie możliwości zastosowania metody w różnych systemach biologicznych.
- Wnioski dotyczące stabilności próbek w celu efektywnego pozyskiwania danych.
Wnioski
- Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania oddziaływań międzykomórkowych.
- Umożliwia ona analizę w czasie rzeczywistym bez naruszania integralności komórek.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różnorodne konteksty biologiczne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Oddziaływania białko-białko w kontaktach międzykomórkowych mają kluczowe znaczenie dla walidacji celów w odkrywaniu leków, szczególnie w przypadku receptorów powierzchniowych komórek i cząsteczek adhezyjnych. Niniejszy test umożliwia bezpośrednią, bezetykietową kwantyfikację dynamiki wiązania w żywych komórkach, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w sygnalizację międzykomórkową. Poprzez dostarczanie ilościowych odczytów siły oddziaływań i stanów oligomeryzacji w czasie rzeczywistym, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną podczas wczesnego wyboru celu i walidacji szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar bezpośrednich oddziaływań białko-białko na fizjologicznych stykach międzykomórkowych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych danych dotyczących wiązania bez konieczności fiksacji komórek, co pozwala zachować natywne stany konformacyjne i ogranicza powstawanie artefaktów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję celów terapeutycznych poprzez ujawnianie siły oddziaływań oraz zmian w oligomeryzacji (np. APLP1 wykazujący wzrost korelacji krzyżowej z 0,45 do 0,8 po indukcji cynkiem).
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Generuje zestandaryzowane, powtarzalne odczyty fluktuacji fluorescencji (sFCCS, liczba i jasność) odpowiednie dla formatów wysokoprzepustowego screeningu (high-content screening).
- Skalowalność: Kompatybilność z komercyjnymi mikroskopami konfokalnymi umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla wielu klas celów molekularnych.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza czasy dyfuzji, amplitudy korelacji wzajemnej oraz wskaźniki jasności molekularnej w celu obiektywnego porównania fenotypów oddziaływań.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Bezpośrednie zastosowanie w modelowaniu szlaków adhezji międzykomórkowej zaangażowanych w procesy neurodegeneracji, immunologii i nowotworów.
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane o interakcjach in vitro z walidacją funkcjonalną w kontekstach wielokomórkowych, wspierając mechanistyczne badania ukierunkowane na biomarkery.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Identyfikuje stabilne, specyficzne interakcje (np. klastry APLP1 wykazujące ograniczoną dynamikę), co pozwala na priorytetyzację celów o niższym ryzyku wyników fałszywie dodatnich.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od przesiewowego badania wiązania z celem po optymalizację związku wiodącego, szczególnie w przypadku celów wymagających walidacji w natywnych środowiskach błonowych oraz w kontekstach wielokomórkowych.
- Biologia odkrywcza: Weryfikacja hipotez badawczych poprzez pomiar specyficznych oddziaływań białek w kontaktach międzykomórkowych, co pozwala na wyjaśnienie mechanizmów adhezji i rozpoznawania.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki analizie korelacji opartej na segmentacji oraz korekcji wybielania, zapewniając powtarzalne wyniki ilościowe.
- Analityka: Dostarcza czasów zaniku dyfuzji (10–20 ms), amplitud korelacji krzyżowej oraz przesunięć jasności jako gotowych do analizy parametrów określających siłę oddziaływania i oligomeryzację.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych poprzez modelowanie oddziaływań w fizjologicznie istotnych połączeniach międzykomórkowych, co ma zastosowanie w modelach synaps oraz synaps immunologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania platformy fluktuacji fluorescencji, którą można zastosować do oddziaływań homotypowych i heterotypowych w różnych typach komórek i gatunkach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w międzykomórkowych szlakach sygnalizacyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji akwizycji (100k–500k cykli) i analizie odpornej na artefakty (uśrednianie segmentów, filtrowanie zniekształceń).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie ilościowych danych o oddziaływaniach na wczesnym etapie procesu, co ogranicza biologiczną atrycję w późniejszych fazach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka na podstawie stabilności oddziaływań, specyficzności oraz zachowania zależnego od dawki (np. indukowane cynkiem klastrowanie APLP1).
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mikroskopii konfokalnej oraz obrazowania żywych komórek.
- Zależy od utrzymania stabilnych kontaktów międzykomórkowych przez kilka minut w celu wiarygodnego pomiaru dynamiki dyfuzyjnej.
- Wymaga optymalizacji transfekcji dwukolorowej oraz separacji spektralnej w celu zminimalizowania przesłuchów między fluoroforami (np. mEGFP/mEYFP i mCherry/mCardinal).
- Obejmuje korekcję po akwizycji w celu usunięcia efektów fotoblaknięcia i dryfu poprzez wyrównanie średniej czasowej oraz dopasowanie wykładnicze.
- Ograniczona do systemów, w których dyfuzja i oddziaływania białek mogą być rozdzielone w skali czasu od milisekund do sekund fluktuacji fluorescencji.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Sample Preparation: Cell-Cell Mixing Assay
2:37
Scanning Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy (sFCCS): Acquisition
4:07
Scanning Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy (sFCCS): Data Analysis
6:03
Results: Investigation of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts by sFCCS
8:09
Conclusion
