Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Metoda ta może pomóc w zrozumieniu kluczowych pytań w dziedzinie interakcji międzykomórkowych, takich jak to, które receptory pośredniczą w adhezji lub rozpoznawaniu w kontaktach międzykomórkowych i czy określone ligandy wywołują ich interakcje. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie takich interakcji bezpośrednio w żywych komórkach bez potrzeby fiksacji lub rozrywania komórek. Chociaż metoda ta jest stosowana do badania interakcji między hodowanymi komórkami, można ją również zastosować do innych systemów: pęcherzyków jednobłonowych, a nawet małych organizmów modelowych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, powinny sprawdzić, czy ich próbka jest wystarczająco stabilna, aby umożliwić akwizycję w ciągu kilku minut, dokładnie sprawdzając ruch komórki i powolne zmiany sygnału. Po pierwsze, wysiewaj odpowiednią liczbę komórek w co najmniej czterech dołkach sześciodołkowej płytki dziennie przed transfekcją. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% L-glutaminą.

Aby przeprowadzić podstawowy eksperyment, transfekcyjne plazmidy dla białka będącego przedmiotem zainteresowania należy połączyć z zielonym lub żółtym białkiem fluorescencyjnym i czerwonym białkiem fluorescencyjnym w oddzielnych studzienkach. Po czterech godzinach usuń pożywkę wzrostową i delikatnie umyj każdą studzienkę jednym mililitrem PBS uzupełnionym magnezem i wapniem, upuszczając PBS na krawędź studzienki, aby zapobiec oderwaniu się komórek podczas mycia. Następnie wyjmij PBS.

Dodaj około 50 mikrolitrów roztworu EDTA kroplami do każdego dołka, aby ułatwić oderwanie komórek. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie minuty, powoli potrząśnij sześciodołkową płytką na boki, aby odłączyć komórki. Następnie dodaj 950 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki i ponownie zawieś komórki, pipetując kilka razy w górę iw dół, odrywając w ten sposób wszystkie komórki od dna studzienki.

Upewnij się, że komórki są prawidłowo zawieszone i odłączone od siebie, sprawdzając wzrokowo, czy po ponownym zawieszeniu nie ma dużych agregatów komórek. Przenieś roztwór komórkowy z jednej studzienki do odpowiedniego dołka. Delikatnie wymieszać, pipetując kilka razy w górę i w dół.

Następnie zasiej wymieszane komórki na 35-milimetrowym szklanym naczyniu i hoduj zasiane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez jeden dzień. W oprogramowaniu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego ustaw ścieżkę optyczną. Aby uniknąć przesłuchów spektralnych, wybierz dwie oddzielne ścieżki do wzbudzania i wykrywania sekwencyjnego mEGFP lub mEYFP i mCherry lub mCardinal, a następnie wybierz opcję Przełącz ścieżki co linię.

Do detekcji należy użyć odpowiednich filtrów dla obu kanałów. Umieścić naczynie zawierające wymieszane komórki na uchwycie na próbkę. Po odczekaniu 10 minut, aby zapewnić równowagę temperatury i zmniejszyć dryft ostrości, ustaw ostrość na komórkach za pomocą lampki transmisyjnej w menu Zlokalizuj.

Wyszukaj parę czerwonych i zielonych komórek, które stykają się ze sobą. Następnie wybierz ścieżkę skanowania prostopadłą do kontaktu komórka-komórka za pomocą przycisku Przytnij. Powiększ, aby uzyskać rozmiar piksela od 50 do 200 nanometrów, a następnie wybierz opcję Linia w trybie skanowania.

Ustaw rozmiar klatki na 128 na jeden piksel. Ustaw szybkość skanowania na maksymalną dozwoloną wartość. Następnie ustaw cykle na 100 000 do 500 000.

Następnie wybierz odpowiednie moce lasera. Ustaw detektory w trybie zliczania fotonów. Naciśnij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć pobieranie.

Eksportuj surowe pliki danych do obrazu TIF RGB w formacie danych raw. Ten plik będzie zawierał kimograf z danymi kanału zielonego i czerwonego w kanale oznaczonym odpowiednio G i R obrazu. Następnie należy zaimportować plik TIF z odpowiednim oprogramowaniem do analizy i przystąpić do wykonywania analizy.

Wyrównaj linie, wykonując średnią czasową dla segmentów z blokami od 500 do 1000 linii. Określ położenie membrany w każdym bloku. Następnie przesuń wszystkie klocki do tej samej pozycji bocznej.

Zsumuj wszystkie wyrównane linie wzdłuż osi czasu i dopasuj średni profil intensywności za pomocą funkcji Gaussa. Zdefiniuj piksele odpowiadające membranie jako wszystkie piksele w zakresie plus minus 2,5 sigma od położenia membrany i zsumuj intensywność tych pikseli w każdej linii, uzyskując pojedynczą wartość sygnału fluorescencyjnego dla każdego punktu czasowego. W przypadku zaobserwowania wybielania fotograficznego należy zastosować korektę wybielania, dopasowując szeregi czasowe fluorescencji błony z funkcją podwójnej wykładni i stosując odpowiednią formułę korekcyjną.

Oblicz funkcje auto i korelacji krzyżowej zgodnie z odpowiednimi równaniami. Aby zwiększyć wiarygodność analizy i uniknąć artefaktów, należy wykonać obliczenia dla 10 do 20 równych segmentów całkowitego pomiaru. Sprawdź szeregi czasowe fluorescencji i funkcje korelacji w każdym segmencie i usuń wyraźnie zniekształcone segmenty.

Na koniec należy uśrednić wszystkie niezniekształcone segmenty. Analizując dane, dokładnie sprawdź szeregi czasowe intensywności i funkcje korelacji z każdego segmentu, aby uniknąć zniekształceń, na przykład spowodowanych pęcherzykami wewnątrzkomórkowymi na obrzeżach błony. Pokazano tutaj obraz intensywności komórek HEK 293T eksprymujących mirystolijno-palmitoilowany-mEYFP lub mCardinal.

Zaobserwowano względną korelację krzyżową bliską zeru, podczas gdy funkcje autokorelacji wykazują charakterystyczne czasy rozpadu od 10 do 20 milisekund dla dyfuzji mirystoliowanego-palmitoilarylonego-mEYFP i mCardinal w błonie plazmatycznej. Funkcje korelacji krzyżowej pomiarów sFCCS komórek HEK 293T eksprymujących zakotwiczony w błonie heterodimer mirystoliowany-palmitoilowany-mCardinal-mEYFP miały dodatnie amplitudy i wykazywały podobne czasy rozpadu jak funkcja autokorelacji. Pomiary sFCCS dotyczące kontaktów międzykomórkowych między komórkami APLP1-mEYFP i APLP1-mCardinal wykazały dodatnią względną korelację krzyżową wynoszącą 0,45.

Funkcje korelacji sFCCS uzyskane z pomiarów w klastrach APLP1 na styku komórka-komórka wykazały silnie zmniejszoną dynamikę, co jest widoczne w dużych czasach zaniku oscylacji przy dużych czasach opóźnień. Po dodaniu jonów względna korelacja krzyżowa wzrosła do średniej wartości 0,8. Co więcej, jasność molekularna znacznie wzrosła od małych oligomerów do większych multimerów składających się z 10 do 50 monomerów na każdej komórce.

Niestabilności przejściowe mogą spowodować, że funkcja korelacji krzyżowej będzie miała wartości ujemne lub wysoką fałszywie dodatnią korelację krzyżową. Odpowiadające im funkcje korelacji zazwyczaj znacznie odbiegają od funkcji większości segmentów. Jako podejście uzupełniające do sFCCS, liczba korelacji krzyżowej i jasność mogą być stosowane do wykrywania interakcji białko-białko

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że mieszanie transfekowanych komórek jest krytycznym krokiem. Delikatnie wymieszaj komórki i zoptymalizuj wydajność transfekcji, aby zwiększyć szansę na znalezienie czerwonych i zielonych komórek w kontakcie. Po opracowaniu technika ta została wykorzystana przez naukowców w dziedzinie immunologii do zbadania interakcji cząsteczek sygnałowych w synapsach immunologicznych.