Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila

Nasz protokół pomaga naukowcom analizować subkomórkową sieć aktomiozyny w poszczególnych komórkach nabłonka, a także pozwala im przeprowadzić podobną analizę w skali wielokomórkowej w zakrzywionych tkankach nabłonkowych. Nasz protokół jest dobrym przykładem aplikacji na Fidżi. Posiada intuicyjny graficzny interfejs użytkownika i nie wymaga żadnej wiedzy na temat skryptów.

Dlatego jest bardzo odpowiedni również dla początkujących użytkowników w tej dziedzinie. Chociaż nasza metoda została opracowana dla komór jajowych Drosophila, ma również zastosowanie poza Drosophila epithelia. Zachęcamy naukowców do przetestowania naszego protokołu w swoich systemach modelowych.

Użyj dołączonych plików testowych, aby zapoznać się z tym protokołem. Pomoże Ci to zdecydować, która część tego protokołu jest odpowiednia dla Twojego indywidualnego pytania badawczego. Ta część protokołu umożliwia użytkownikom segmentację komórek nabłonka w filmach poklatkowych, a następnie analizowanie impulsów aktomiozyny w poszczególnych komórkach w czasie za pomocą Surface Manager.

Aby rozpocząć, otwórz Fidżi i zaimportuj makro TissueCellSegmentMovie. ijm zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie otwórz plik TIFF z korektą wybielania i podziel kanały pliku z korektą wybielania, przechodząc do paska menu, wybierając Obraz, a następnie Kolor i wybierając Podziel kanały.

Uruchom przesłany skrypt na aktywnym kanale błony komórkowej wybranego filmu poklatkowego, naciskając ikonę Uruchom w otwartym skrypcie. Aby uzyskać ładną maskę komórki, ustaw rozmycie gaussowskie na 2.500, a czułość wykrywania komórek na minus jeden, a następnie kliknij OK. Następnie ustaw szacowaną tolerancję szumów w zakresie od 10 do 20 dla filmów poklatkowych zarejestrowanych obiektywem 63x i kliknij przycisk OK. W analizowanym filmie poklatkowym pojawia się wygenerowana maska komórki, pojawia się nowe okno o nazwie ParticleStack, a także pojawia się małe okno o nazwie Wymagane działanie. W masce komórki na filmie poklatkowym ustaw ostrość tylko na komórkach w środku i zaznacz te, które mogą zapewnić pełne i dobrze zdefiniowane kontury w całym filmie poklatkowym.

Gdy wybrane komórki w środku ładnie odpowiadają prawdziwym błonom komórkowym, zapisz ParticleStack jako plik TIFF. Otwórz odpowiedni plik TIFF ParticleStack na Fidżi. Po zainstalowaniu wtyczki Surface Manager na Fidżi otwórz wtyczkę.

W programie Surface Manager kliknij przycisk Przeczytaj obraz konspektu i ustaw indeks Jaccarda na 60%Wczytywanie konturów może potrwać kilka minut w zależności od liczby komórek. Po załadowaniu każda komórka zostanie przypisana do numeru S i pojawi się w lewej części okna Menedżera powierzchni. Kliknij na wybraną liczbę S, aby zaimportować kontur komórki z ParticleStack1.

TIFF pojawia się na filmie poklatkowym. Sprawdź każdą zaimportowaną liczbę S pod kątem jakości konturów komórek w całym filmie i usuń niechciane komórki, które wyświetlają nieprawidłowe kontury komórek. Aby usunąć niechcianą komórkę, podświetl kontur komórki i kliknij przycisk Usuń.

Użyj narzędzia Pędzel, aby skorygować kontury komórek. Po zakończeniu zapisz poprawione komórki jako RoiSet. plik zip.

Aby określić, czy impulsy aktomiozyny są obecne w analizowanej tkance i zrozumieć szczegółowe zachowanie, a także kierunkowość sygnałów aktomiozyny, zacznij od otwarcia Fidżi. Otwórz film poklatkowy, załaduj zapisany ParticleStack1. tiff i film poklatkowy z korekcją wybielacza, a następnie załaduj wtyczkę Surface Manager i odpowiedni obszar zainteresowania z RoiSet.

plik zip. Następnie w programie Surface Manager aktywuj kanał z sygnałami zainteresowania. Kliknij przycisk Statystyki, aby wyświetlić okno o nazwie Średnia wartość szarości plasterek po wycinku.

Średnie i średnie natężenia sygnałów aktomiozyny będą wyświetlane w czasie w dowolnych jednostkach, podobnie jak inne parametry związane z obszarem i kształtem komórki. Zapisz wartości jako plik arkusza kalkulacyjnego, przechodząc do okna Statystyki, klikając Plik i wybierając Zapisz jako.Podobnie wygeneruj maskę komórki i załaduj ją do Menedżera powierzchni w celu analizy impulsów aktomiozyny w skali tkankowej. Ta część protokołu pozwala użytkownikom na selektywne wyodrębnianie cienkiej warstwy aktomiozyny w zakrzywionej tkance nabłonka w czasie.

Kroki te są przyjazne dla użytkownika i oparte na intuicyjnym interfejsie graficznym. Otwórz Fidżi i upewnij się, że jest zainstalowana wtyczka Ellipsoid Surface Projection. Następnie otwórz film poklatkowy i wyeksportuj go jako plik XML/HDF5, klikając Wtyczki, przechodząc do BigDataViewer i wybierając Eksportuj bieżący obraz jako plik XML/HDF5.

Następnie otwórz wyeksportowany plik w Ellipsoid Surface Projection, przechodząc do Plugins, klikając BigDataViewer, a następnie Ellipsoid Surface Projection i wybierając plik XML. Spowoduje to otwarcie nowego okna z strzałkowymi widokami komory jajowej i pojawi się okno dialogowe prowadzące użytkownika przez proces przetwarzania. Okno dialogowe o nazwie Projekcja jajników ma kilka zakładek.

W pierwszej karcie dialogowej, zwanej obwiednią, zdefiniuj obramowania x i y komory jajowej w filmie poklatkowym wraz z szerokością z obwiedni, a następnie naciśnij ustaw. Wybrane części komory na jajka są podświetlone na różowo. Następnie zdefiniuj rozmiar blobów sygnału w zakładce okna dialogowego o nazwie znajdź blobs w oknie Projekcja jajników.

Zdefiniuj sigma i minimalną wartość szczytową. Następnie naciśnij przycisk compute, aby zidentyfikować sygnały aktomiozyny, które pojawią się jako zielone plamy. Ponów ten krok z różnymi parametrami, aż zostanie znalezionych około 100 miejsc.

Identyfikacja sygnałów aktomiozyny jest kluczowym krokiem. Zależy to od jakości sygnału i prawidłowego rozmiaru wykrytych blobów. Jeśli na obrazie nie ma widocznych zielonych plam, następny krok nie zadziała.

Aby zaprojektować elipsoidę, przejdź do zakładki o nazwie dopasuj elipsoidę. Ustaw losowe próbki na 10 000, odległość graniczną zewnętrzną/wewnętrzną na 1 do 10, a następnie kliknij przycisk Oblicz. Następnie automatycznie otworzy się zakładka o nazwie projekcja, która pozwoli na zdefiniowanie ekstrakcji powierzchni.

Na karcie rzutowania ustaw minimalną i maksymalną odległość rzutowania jako szerokość żądanej elipsoidy. Minimalna i maksymalna odległość projekcji musi pasować tak, aby różowy zdefiniowany obszar elipsoidalny obejmował całą zewnętrzną warstwę komory jajowej. Następnie zdefiniuj odległość przekroju jako jeden.

Upewnij się, że różowy obszar elipsoidy ze zdefiniowanym za pomocą w komorze jaja jest widoczny przed naciśnięciem przycisku obliczeń. Pomaga ocenić jakość nowego dopasowania elipsoidalnego. Następnie ustaw szerokość wyjściową elipsoidy na większą lub równą 800 oraz wysokość większą lub równą 400.

Następnie ustaw czas trwania ekstrakcji powierzchni i wybierz rzut sferyczny lub cylindryczny. W razie potrzeby odwróć Z i wyrównaj Y.Press compute, aby uzyskać ekstrakcję powierzchni dla obu kanałów w nowych oknach o nazwie image. Dostosuj jasność i kontrast uzyskanych okien obrazu, aby móc zobaczyć wyświetlane sygnały aktomiozyny, klikając Obraz, przechodząc do Dostosuj i wybierając Jasność/Kontrast.

Jeśli wyodrębnianie powierzchni wygląda dobrze, zapisz oba kanały oddzielnie jako pliki TIFF. Dodatkowo zapisz plik okna dziennika, aby w przyszłości móc dowiedzieć się, w jaki sposób powierzchnia tej konkretnej komory na jajka została wydobyta. Następnie połącz kanały z preferowanym kodem koloru na Fidżi i zapisz wyniki jako pliki TIFF.

Protokół ten umożliwia naukowcom zbadanie zachowania sieci aktomiozyny w tkankach nabłonkowych. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy szczegółowa analiza zachowania aktomiozyny w lokalnej skali komórkowej zostanie połączona z podobną analizą w skali tkankowej. Pokazano tutaj reprezentatywne przykłady dynamicznego zachowania miozyny II w lokalnej skali komórkowej oraz w skali tkankowej dla kontroli i komór jajowych Drosophila z mutacją tłuszczu2.

Na podstawowej pojedynczej płaszczyźnie zielony zmodyfikowany regulatorowy łańcuch świetlny sygnałów miozyny II porusza się prostopadle do osi przednio-tylnej komór jajowych kontrolnych. Ta polaryzacja jest tracona w komorach jajowych z mutacją tłuszczu 2 i prowadzi do anizotropowych impulsów miozyny II, oscylacji Na poziomie tkanki zielony zmodyfikowany regulatorowy łańcuch świetlny miozyny II w próbce kontrolnej generuje zsynchronizowaną siłę wymaganą do promowania rotacji nabłonka. W przeciwieństwie do tego, nabłonek pęcherzykowy komory jajowej z mutacją tłuszczu2 pulsuje silnie po stronie podstawy i nie generuje zsynchronizowanej siły wymaganej do promowania rotacji nabłonka.

W cienkim obszarze wierzchołkowym komory jajowej Drosophila, mutant fat2 wykazuje również zmienione dynamiczne zachowanie zielonego zmodyfikowanego regulatorowego łańcucha świetlnego miozyny II.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak analizować sieć aktomiozyny w skali lokalnej i tkankowej w komorach jajowych Drosophila przy użyciu Fidżi. Aby uzyskać dalsze praktyczne wskazówki i sposoby rozwiązywania problemów, zapoznaj się z częścią dyskusji po protokole. Jeśli masz jakiekolwiek pytania związane z Fidżi lub naszymi wtyczkami, odwiedź odpowiednie strony internetowe lub skontaktuj się z nami.