Name: Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę analizy dynamiki sieci aktomyozynowej w pojedynczych komórkach nabłonkowych i zakrzywionych tkankach nabłonkowych z wykorzystaniem oprogramowania Fiji. Protokół nie wymaga umiejętności programowania i jest dostępny dla początkujących użytkowników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są bardzo wdzięczni Miriam Osterfield za podzielenie się swoimi radami na temat obrazowania in vitro komór jajowych przy użyciu podejścia przyjętego z laboratorium Celeste Berg4. Dziękujemy również Sebastianowi Tosi za skrypt Fidżi, który umożliwia segmentację komórek.

<ol><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).</li>
<li>Hudson, A. M., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying oogenesis.</a> Methods. 68, 207-217 (2014).</li>
<li>Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries.</a> Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).</li>
<li>Peters, N. C., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Culturing+and+Live+Imaging+of+Drosophila+Egg+Chambers%3A+A+History+and+Adaptable+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method.</a> Methods of Molecular Biology. , 35-68 (2016).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%2C+Volume+1%22">The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1</a>. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).</li>
<li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331, 1071-1074 (2011).</li>
<li>Andersen, D., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+ovarian+muscle+contraction+and+oocyte+growth+on+egg+chamber+elongation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila.</a> Development. 143, 1375-1387 (2016).</li>
<li>Pokrywka, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+GFP-labeled+proteins+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50044(2013).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bullwinkle+is+required+for+epithelial+morphogenesis+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).</li>
<li>Cetera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+promotes+the+global+alignment+of+contractile+actin+bundles+during+Drosophila+egg+chamber+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation.</a> Nature Communications. 5, 5511(2014).</li>
<li>Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+rotation+is+preceded+by+planar+symmetry+breaking+of+actomyosin+and+protects+epithelial+tissue+from+cell+deformations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations.</a> PLOS Genetics. 13, e1007107(2017).</li>
<li>Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+polarized+actomyosin+contractile+flows+control+epithelial+junction+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling.</a> Nature. 468, 1110-1114 (2010).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).</li>
<li>Haase, R. Surface manager. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager">https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager</a> (2018).</li>
<li>Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins">https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins</a> (2018).</li>
<li>Pietzsch, T. BigDataViewer. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/BigDataViewer">https://imagej.net/BigDataViewer</a> (2017).</li>
<li>Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigDataViewer%3A+visualization+and+processing+for+large+image+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets.</a> Nature Methods. 12, 481-483 (2015).</li>
<li>Turner, C. M., Adler, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons+in+the+morphogenesis+of+epidermal+hairs+during+wing+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila.</a> Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).</li>
<li>Heemskerk, I., Streichan, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cartography%3A+compressing+bio-image+data+by+dimensional+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction.</a> Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).</li>
<li>Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+Breaking+in+an+Edgeless+Epithelium+by+Fat2-Regulated+Microtubule+Polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity.</a> Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).</li>
<li>Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+light-sheet+microscopy+for+adventurous+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists.</a> Nature Methods. 12, 30-34 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów związanych z sekcją i hodowlą komór jajowych
Jeśli zbyt wiele much zostanie umieszczonych w małej fiolce, pokarm dla much może stać się błotnisty po 2-3 dniach z powodu dużej ilości żerujących larw i dorosłych much uwięzionych w pokarmie much. W takim przypadku przerzuć resztę tych much do nowej fiolki ze świeżym pokarmem i zmniejsz ich liczbę. W szczególności wyklucz samice, które utknęły w jedzeniu.
Miesza...

Ciągły rozwój nowatorskich technologii obrazowania i oprogramowania mających zastosowanie w naukach przyrodniczych miał ogromny wpływ na zrozumienie podstawowych zasad życia. Jednym z głównych wyzwań jest wiarygodna wizualizacja procesów rozwojowych w połączeniu z ich obrazowaniem na żywo w różnych tkankach. Tkanki są częściami narządów i ciał i jako takie większość z nich nie jest łatwo dostępna do obrazowania. Dlatego opracowano protokoły, które umożliwiają ich sekcję i hodowlę in vitro, w celu wizualizacji zdarzeń biologicznych, które w wystarczającym stopniu odzwierciedlają sytuację in vivo w żywym organizmie.
W ciągu ostatnich dziesięcioleci, hodowla i obrazowanie na żywo komór jajowych Drosophila, struktur podobnych do acinarów przypominających prymitywne organy, przyczyniło się ogromnie do zrozumienia podstawowych zasad rozwoju prymitywnych organów1,2,3. Obecnie dostępnych jest kilka protokołów hodowli, a ich użycie zależy od czasu akwizycji, typu komórki, która ma być zobrazowana, oraz ich dostępności (np. wewnętrzna linia zarodkowa vs. zewnętrzna linia somatyczna)4.
Wspólną cechą wszystkich tych protokołów hodowlanych jest konieczność unieruchomienia analizowanych komór jajowych, które wykazują wysoką aktywność kurczliwą w płynnych podłożach. Aktywność skurczowa komór jajowych jest spowodowana głównie przez arkusz mięśniowy, który pokrywa długi ciąg połączonych komór jajowych5,6,7. Dlatego, aby osiągnąć prawidłowe unieruchomienie komór młodych jaj, opracowano różne podejścia, polegające na pokryciu komór jajowych szkiełkami nakrywkowymi6,8,9 lub elastycznych4,10 lub osadzaniu ich w agarozie o niskiej temperaturze topnienia3,11. Podejścia te są popularne, ponieważ pozwalają również na obrazowanie większej płaszczyzny wizualnej ze względu na subtelne spłaszczenie powierzchni obwodowej komór jajowych.
Jednak ostatnio wykazano, że komory młodych jaj (etap 1-8) obracają się wokół swojej osi przednio-tylnej6 i że ten ruch tkanki jest napędzany przez delikatną sieć aktomiozyny blisko obwodowej powierzchni tych młodych komór jajowych12. Dlatego sztuczna zmiana powierzchni komórkowej spowodowana subtelnym spłaszczeniem tej tkanki może mieć negatywny wpływ na zachowanie maszynerii aktomiozyny generującej siłę. Przeciwieństwem jest to, że jeśli tkanka komory jajowej nie jest spłaszczona, mikroskopowe obrazowanie białek na obwodowej powierzchni komór jajowych staje się jeszcze bardziej ograniczone przez zmniejszony rozmiar płaszczyzny akwizycji.
Dlatego połączyliśmy protokoły z Prasad et al.9 i laboratorium Celeste Berg4,10 i dalej je zmodyfikowaliśmy, aby w opracowanej metodzie nie stosowano szkiełek nakrywkowych/elastycznych/agarozy. Komory jajowe Drosophila są swobodnie hodowane w pożywkach, a przedstawiony tutaj protokół dotyczy tylko mikroskopii odwróconej. Protokół składa się z dwóch części. Pierwsza część skupia się na analizie sygnałów aktomiozyny w lokalnej skali komórkowej (do 15 komórek) w komorach jajowych. W drugiej części skupimy się na pokonaniu ograniczeń związanych z małą płaszczyzną akwizycji spowodowaną swobodną hodowlą komór jajowych. W związku z tym opracowaliśmy nowatorską metodę obliczeniową opartą na Fidżi z półinteraktywnym graficznym interfejsem użytkownika, który selektywnie wyodrębnia i rozwija określone warstwy obwodowej powierzchni tkanki. Następnie stosuje się protokół, który opisuje, jak analizować aktomiozynę w skali tkankowej (tj. >50 komórek). Ponieważ selektywna ekstrakcja zdefiniowanej cienkiej warstwy zakrzywionych tkanek nabłonkowych nie była łatwa do zrealizowania przy użyciu klasycznej projekcji z-stack (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1), ta łatwa w użyciu metoda służy jako ważny warunek wstępny do kompleksowego zrozumienia zachowania cienkiej (<1 μm) sieci aktomiozyny w skali tkankowej w komorach jajowych Drosophila.
Ponadto, aby ułatwić protokół, udostępniamy przykładowe filmy poklatkowe (TLM) oraz przykładowe pliki fluorescencyjnie oznaczonego konwencjonalnego zachowania Myosin II bez mięśni (zobacz Plik uzupełniający 3). Miozyna II jest białkiem motorycznym i reprezentuje aktywną kurczliwą część maszynerii aktomiozyny. Aby zobrazować Miozynę II, używamy linii transgenicznych Drosophila, które zawierają zmodyfikowany regulatorowy łańcuch świetlny Myosin II o nazwie MRLC::GFP (szczegóły w Tabeli Materiałów)12,13. W celu wizualizacji błon komórkowych protokół opiera się na dostępnych w handlu barwnikach (patrz tabela materiałów). Protokół ten jest odpowiedni nie tylko do analizy małych subkomórkowych sygnałów MRLC::GFP12, ale także do wszelkich cząstek subkomórkowych o podobnej wielkości około ±300 μM, takich jak te obserwowane za pomocą Life-Act::GFP12,14.
Chociaż oba te protokoły są prezentowane za pomocą komór jajowych Drosophila hodowanych in vitro, akwizycja sygnałów aktomiozyny może być również przeprowadzana przy użyciu innych tkanek po optymalizacji pożywki hodowlanej i w zależności od dostępności albo fluorescencyjnie znakowanych białek z odpowiednimi barwnikami komercyjnymi, albo, na przykład, mikroiniekcji mRNA w celu uzyskania przejściowych profili ekspresji genów. Podobnie, oparty na Fidżi protokół ekstrakcji cienkiej warstwy z powierzchni obwodowej może być stosowany bardziej ogólnie do tkanek elipsoidalnych i narządowych.

<table><tbody><tr><td>Schneider Medium</td><td>Gibco</td><td>21720-024</td><td>[+]-Glutamina</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;[ +] 10.000 jednostek/ml penicyliny [+] 10.000 &mikro; g/mL Streptomycyna</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; F135</td><td>Inaktywowany termicznie</td></tr><tr><td>roztwór insuliny Human</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; I9278</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki Falcon</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>sterylny</td></tr><tr><td>filtr Millex-GV</td><td>Millipore</td><td>SLGV033NS</td><td>33 mm</td></tr><tr><td>Naczynia Microwell ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>35 mm szalka Petriego, 14 mm Microwell, nr 1,5 szklana osłona</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>A. Dumont & Fils</td><td></td><td>&nbsp;#55</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red (barwnik błony komórkowej)</td><td>Invitrogen</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64 (barwnik błony komórkowej)</td><td>ThermoFisher/Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko preparacyjne depresji</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-560B</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Aparatura mikroskopowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steromikroskop</td><td>np. Zeiss</td><td></td><td>Stemi SV 6</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny</td>, <td>np. Zeiss/Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z wirującym dyskiem</td>, <td>np. Zeiss/Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkło mikroskopowe/szkło nakrywkowe</td>, <td>np. Thermo Scientific/Menzel Glas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cactus tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wironit uchwyt</td> <td>na igłęHammacher</td><td>9160020</td><td></td></tr><tr><td>Grzbiet kaktusa</td><td>Echinocactus grusonii/beczkowy kaktus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila użyte w manuskrypcie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP</td><td></td><td></td><td>Aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Rauzi i wsp.: Planarna spolaryzowana aktomiozyna kurczliwa przepływy kontrolujące przebudowę połączenia nabłonkowego. Nature 2010, tom 468, str. 1110-1115.</td></tr><tr><td>AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C</td><td></td><td></td><td>Aby uzyskać szczegółowe informacje, patrz Viktorinova et al.: Rotacja nabłonka jest poprzedzona złamaniem symetrii płaskiej aktomiozyny i chroni tkankę nabłonkową przed deformacjami komórek. PLoS Genetics 2017, tom 13, wydanie 11, str. e1007107.</td></tr></tbody></table>

analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych drosophila

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Niedojrzałe jaja Drosophila nazywane są komorami jajowymi, a ich struktura przypomina prymitywne organy, które podczas rozwoju przechodzą zmiany morfologiczne z okrągłego na elipsoidalny. Ten proces rozwojowy nazywa się oogenezą i ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia funkcjonalnych dojrzałych jaj, aby zabezpieczyć następne pokolenie much. Z tych powodów komory jajowe posłużyły jako idealny i odpowiedni model do zrozumienia rozwoju narządów zwierzęcych.
Opracowano kilka protokołów hodowli in vitro, ale te protokoły mają kilka wad. Jedna z nich polega na zastosowaniu różnych pokryw, które wywierają sztuczny nacisk na obrazowane komory jajowe w celu ich unieruchomienia i zwiększenia obrazowanej płaszczyzny akwizycji powierzchni obwodowej analizowanych komór jajowych. Takie podejście może negatywnie wpłynąć na zachowanie cienkiej maszynerii aktomiozyny, która generuje moc do obracania komór jajowych wokół ich dłuższej osi.
Dlatego, aby przezwyciężyć to ograniczenie, hodujemy komory jajowe Drosophila swobodnie w pożywce, aby niezawodnie analizować maszynerię aktomiozyny wzdłuż obwodu komór jajowych. W pierwszej części protokołu udostępniamy podręcznik szczegółowo opisujący, jak analizować maszynerię aktomiozyny w ograniczonej płaszczyźnie akwizycji w lokalnej skali komórkowej (do 15 komórek). W drugiej części protokołu udostępniamy użytkownikom nową wtyczkę opartą na Fidżi, która umożliwia proste wydobycie zdefiniowanej cienkiej warstwy obwodowej powierzchni komór jajowych. Poniższy protokół opisuje następnie, jak analizować sygnały aktomiozyny w skali tkankowej (>50 komórek). Na koniec wskazujemy ograniczenia tych podejść zarówno w lokalnej skali komórkowej, jak i tkankowej oraz omawiamy ich potencjalny przyszły rozwój i możliwe zastosowania.

Niniejszy protokół umożliwia naukowcom badanie zachowania sieci akto-miozyny w tkankach nabłonkowych. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy szczegółowa analiza zachowania akto-miozyny w lokalnej skali komórkowej (kilka komórek) zostanie połączona z podobną analizą w skali tkankowej (wiele komórek). Jednak tkanki nabłonkowe są często zakrzywione, a wydzielenie cienkiej warstwy tych tkanek nie było wcześniej łatwo możliwe, co pokazano na przykładzie komór jajowych Drosophila (<strong cl...

Ten protokół zapewnia opartą na Fidżi, przyjazną dla użytkownika metodologię wraz z prostymi instrukcjami wyjaśniającymi, jak niezawodnie analizować zachowanie aktomiozyny w pojedynczych komórkach i zakrzywionych tkankach nabłonkowych. Do korzystania z samouczka nie są wymagane żadne umiejętności programowania; wszystkie kroki są wykonywane w sposób półinteraktywny przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika Fiji i powiązanych wtyczek.

Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Nasz protokół pomaga naukowcom analizować subkomórkową sieć aktomiozyny w poszczególnych komórkach nabłonka, a także pozwala im przeprowadzić podobną analizę w skali wielokomórkowej w zakrzywionych tkankach nabłonkowych. Nasz protokół jest dobrym przykładem aplikacji na Fidżi. Posiada intuicyjny graficzny interfejs użytkownika i nie wymaga żadnej wiedzy na temat skryptów.Dlatego jest bardzo odpowiedni również dla początkujących użytkowników w tej dziedzinie. Chociaż nasza metoda została opracowana dla komór jajowych Drosophila, ma również zastosowanie poza Drosophila epithelia. Zachęcamy naukowców do przetestowania naszego protokołu w swoich systemach modelowych.Użyj dołączonych plików testowych, aby zapoznać się z tym protokołem. Pomoże Ci to zdecydować, która część tego protokołu jest odpowiednia dla Twojego indywidualnego pytania badawczego. Ta część protokołu umożliwia użytkownikom segmentację komórek nabłonka w filmach poklatkowych, a następnie analizowanie impulsów aktomiozyny w poszczególnych komórkach w czasie za pomocą Surface Manager.Aby rozpocząć, otwórz Fidżi i zaimportuj makro TissueCellSegmentMovie. ijm zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie otwórz plik TIFF z korektą wybielania i podziel kanały pliku z korektą wybielania, przechodząc do paska menu, wybierając Obraz, a następnie Kolor i wybierając Podziel kanały.Uruchom przesłany skrypt na aktywnym kanale błony komórkowej wybranego filmu poklatkowego, naciskając ikonę Uruchom w otwartym skrypcie. Aby uzyskać ładną maskę komórki, ustaw rozmycie gaussowskie na 2.500, a czułość wykrywania komórek na minus jeden, a następnie kliknij OK. Następnie ustaw szacowaną tolerancję szumów w zakresie od 10 do 20 dla filmów poklatkowych zarejestrowanych obiektywem 63x i kliknij przycisk OK. W analizowanym filmie poklatkowym pojawia się wygenerowana maska komórki, pojawia się nowe okno o nazwie ParticleStack, a także pojawia się małe okno o nazwie Wymagane działanie. W masce komórki na filmie poklatkowym ustaw ostrość tylko na komórkach w środku i zaznacz te, które mogą zapewnić pełne i dobrze zdefiniowane kontury w całym filmie poklatkowym.Gdy wybrane komórki w środku ładnie odpowiadają prawdziwym błonom komórkowym, zapisz ParticleStack jako plik TIFF. Otwórz odpowiedni plik TIFF ParticleStack na Fidżi. Po zainstalowaniu wtyczki Surface Manager na Fidżi otwórz wtyczkę.W programie Surface Manager kliknij przycisk Przeczytaj obraz konspektu i ustaw indeks Jaccarda na 60%Wczytywanie konturów może potrwać kilka minut w zależności od liczby komórek. Po załadowaniu każda komórka zostanie przypisana do numeru S i pojawi się w lewej części okna Menedżera powierzchni. Kliknij na wybraną liczbę S, aby zaimportować kontur komórki z ParticleStack1.TIFF pojawia się na filmie poklatkowym. Sprawdź każdą zaimportowaną liczbę S pod kątem jakości konturów komórek w całym filmie i usuń niechciane komórki, które wyświetlają nieprawidłowe kontury komórek. Aby usunąć niechcianą komórkę, podświetl kontur komórki i kliknij przycisk Usuń.Użyj narzędzia Pędzel, aby skorygować kontury komórek. Po zakończeniu zapisz poprawione komórki jako RoiSet. plik zip.Aby określić, czy impulsy aktomiozyny są obecne w analizowanej tkance i zrozumieć szczegółowe zachowanie, a także kierunkowość sygnałów aktomiozyny, zacznij od otwarcia Fidżi. Otwórz film poklatkowy, załaduj zapisany ParticleStack1. tiff i film poklatkowy z korekcją wybielacza, a następnie załaduj wtyczkę Surface Manager i odpowiedni obszar zainteresowania z RoiSet.plik zip. Następnie w programie Surface Manager aktywuj kanał z sygnałami zainteresowania. Kliknij przycisk Statystyki, aby wyświetlić okno o nazwie Średnia wartość szarości plasterek po wycinku.Średnie i średnie natężenia sygnałów aktomiozyny będą wyświetlane w czasie w dowolnych jednostkach, podobnie jak inne parametry związane z obszarem i kształtem komórki. Zapisz wartości jako plik arkusza kalkulacyjnego, przechodząc do okna Statystyki, klikając Plik i wybierając Zapisz jako.Podobnie wygeneruj maskę komórki i załaduj ją do Menedżera powierzchni w celu analizy impulsów aktomiozyny w skali tkankowej. Ta część protokołu pozwala użytkownikom na selektywne wyodrębnianie cienkiej warstwy aktomiozyny w zakrzywionej tkance nabłonka w czasie.Kroki te są przyjazne dla użytkownika i oparte na intuicyjnym interfejsie graficznym. Otwórz Fidżi i upewnij się, że jest zainstalowana wtyczka Ellipsoid Surface Projection. Następnie otwórz film poklatkowy i wyeksportuj go jako plik XML/HDF5, klikając Wtyczki, przechodząc do BigDataViewer i wybierając Eksportuj bieżący obraz jako plik XML/HDF5.Następnie otwórz wyeksportowany plik w Ellipsoid Surface Projection, przechodząc do Plugins, klikając BigDataViewer, a następnie Ellipsoid Surface Projection i wybierając plik XML. Spowoduje to otwarcie nowego okna z strzałkowymi widokami komory jajowej i pojawi się okno dialogowe prowadzące użytkownika przez proces przetwarzania. Okno dialogowe o nazwie Projekcja jajników ma kilka zakładek.W pierwszej karcie dialogowej, zwanej obwiednią, zdefiniuj obramowania x i y komory jajowej w filmie poklatkowym wraz z szerokością z obwiedni, a następnie naciśnij ustaw. Wybrane części komory na jajka są podświetlone na różowo. Następnie zdefiniuj rozmiar blobów sygnału w zakładce okna dialogowego o nazwie znajdź blobs w oknie Projekcja jajników.Zdefiniuj sigma i minimalną wartość szczytową. Następnie naciśnij przycisk compute, aby zidentyfikować sygnały aktomiozyny, które pojawią się jako zielone plamy. Ponów ten krok z różnymi parametrami, aż zostanie znalezionych około 100 miejsc.Identyfikacja sygnałów aktomiozyny jest kluczowym krokiem. Zależy to od jakości sygnału i prawidłowego rozmiaru wykrytych blobów. Jeśli na obrazie nie ma widocznych zielonych plam, następny krok nie zadziała.Aby zaprojektować elipsoidę, przejdź do zakładki o nazwie dopasuj elipsoidę. Ustaw losowe próbki na 10 000, odległość graniczną zewnętrzną/wewnętrzną na 1 do 10, a następnie kliknij przycisk Oblicz. Następnie automatycznie otworzy się zakładka o nazwie projekcja, która pozwoli na zdefiniowanie ekstrakcji powierzchni.Na karcie rzutowania ustaw minimalną i maksymalną odległość rzutowania jako szerokość żądanej elipsoidy. Minimalna i maksymalna odległość projekcji musi pasować tak, aby różowy zdefiniowany obszar elipsoidalny obejmował całą zewnętrzną warstwę komory jajowej. Następnie zdefiniuj odległość przekroju jako jeden.Upewnij się, że różowy obszar elipsoidy ze zdefiniowanym za pomocą w komorze jaja jest widoczny przed naciśnięciem przycisku obliczeń. Pomaga ocenić jakość nowego dopasowania elipsoidalnego. Następnie ustaw szerokość wyjściową elipsoidy na większą lub równą 800 oraz wysokość większą lub równą 400.Następnie ustaw czas trwania ekstrakcji powierzchni i wybierz rzut sferyczny lub cylindryczny. W razie potrzeby odwróć Z i wyrównaj Y.Press compute, aby uzyskać ekstrakcję powierzchni dla obu kanałów w nowych oknach o nazwie image. Dostosuj jasność i kontrast uzyskanych okien obrazu, aby móc zobaczyć wyświetlane sygnały aktomiozyny, klikając Obraz, przechodząc do Dostosuj i wybierając Jasność/Kontrast.Jeśli wyodrębnianie powierzchni wygląda dobrze, zapisz oba kanały oddzielnie jako pliki TIFF. Dodatkowo zapisz plik okna dziennika, aby w przyszłości móc dowiedzieć się, w jaki sposób powierzchnia tej konkretnej komory na jajka została wydobyta. Następnie połącz kanały z preferowanym kodem koloru na Fidżi i zapisz wyniki jako pliki TIFF.Protokół ten umożliwia naukowcom zbadanie zachowania sieci aktomiozyny w tkankach nabłonkowych. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy szczegółowa analiza zachowania aktomiozyny w lokalnej skali komórkowej zostanie połączona z podobną analizą w skali tkankowej. Pokazano tutaj reprezentatywne przykłady dynamicznego zachowania miozyny II w lokalnej skali komórkowej oraz w skali tkankowej dla kontroli i komór jajowych Drosophila z mutacją tłuszczu2.Na podstawowej pojedynczej płaszczyźnie zielony zmodyfikowany regulatorowy łańcuch świetlny sygnałów miozyny II porusza się prostopadle do osi przednio-tylnej komór jajowych kontrolnych. Ta polaryzacja jest tracona w komorach jajowych z mutacją tłuszczu 2 i prowadzi do anizotropowych impulsów miozyny II, oscylacji Na poziomie tkanki zielony zmodyfikowany regulatorowy łańcuch świetlny miozyny II w próbce kontrolnej generuje zsynchronizowaną siłę wymaganą do promowania rotacji nabłonka. W przeciwieństwie do tego, nabłonek pęcherzykowy komory jajowej z mutacją tłuszczu2 pulsuje silnie po stronie podstawy i nie generuje zsynchronizowanej siły wymaganej do promowania rotacji nabłonka.W cienkim obszarze wierzchołkowym komory jajowej Drosophila, mutant fat2 wykazuje również zmienione dynamiczne zachowanie zielonego zmodyfikowanego regulatorowego łańcucha świetlnego miozyny II.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak analizować sieć aktomiozyny w skali lokalnej i tkankowej w komorach jajowych Drosophila przy użyciu Fidżi. Aby uzyskać dalsze praktyczne wskazówki i sposoby rozwiązywania problemów, zapoznaj się z częścią dyskusji po protokole. Jeśli masz jakiekolwiek pytania związane z Fidżi lub naszymi wtyczkami, odwiedź odpowiednie strony internetowe lub skontaktuj się z nami.

analysis-actomyosin-dynamics-at-local-cellular-tissue-scales-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj prezentujemy metodę rejestrowania skurczów mięśni embrionalnych w zarodkach Drosophila w sposób nieinwazyjny i zorientowany na szczegóły.

Obrazowanie i analiza na żywo skurczów mięśni w zarodku Drosophila

Celem tego protokołu jest wstrzyknięcie globularnej aktyny sprzężonej z rodaminą do zarodków Drosophila i zobrazowanie wewnątrzjądrowego montażu pręcików aktyny po stresie cieplnym.

Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu

U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Migracja jądrowa w oocycie Drosophila

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

W tej pracy zastosowano podejście do rekonstytucji in vitro do badania poroselastyczności żeli z aktomiozyną w kontrolowanych warunkach. Określa się ilościowo dynamikę żelu aktomiozyny i wbudowanego rozpuszczalnika, za pomocą której wykazano porosprężystość sieci. Omawiamy również wyzwania eksperymentalne, typowe pułapki i znaczenie dla mechaniki cytoszkieletu komórkowego.

Mechanika (poro-)elastycznych kurczliwych sieci aktomyozyny jako modelowy układ cytoszkieletu komórkowego

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Poznaj metodę analizy dynamiki sieci aktomyozynowej w pojedynczych komórkach nabłonkowych i zakrzywionych tkankach nabłonkowych z wykorzystaniem oprogramowania Fiji. Protokół nie wymaga umiejętności programowania i jest dostępny dla początkujących użytkowników.

Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów