Name: Nowatorskie rozpoznawanie obiektów i testy behawioralne lokalizacji obiektów u myszy przy ograniczonym budżecie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj protokół testowania pamięci u myszy metodami OLT i NORT. Naucz się budowy aren z akrylu i analizy behawioralnej w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez R00 NS089938 z NIH oraz fundusze zalążkowe z Chronic Brain Injury and Discovery Themes na Uniwersytecie Stanowym Ohio dla EDK.

Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie stanowym Ohio (OSU).
1. Budowa aren
<ol>
	<li>Zamów materiały wymienione w Tabeli 1: pięć arkuszy akrylu, cement akrylowy oraz aplikator hipodermiczny 16 G.</li>
	<li>Stosuj odpowiedni sprzęt ochronny zgodnie z instrukcjami producenta, co może obejmować ochronę oczu, skóry oraz inne rodzaje zabezpieczeń.</li>
	<li>Usuń ochronną papierową powłokę z arkuszy akrylowych.</li>
	<li>Wykonaj próbne dopasowanie wszystkich elementów, aby potwierdzić poprawność wymiarów (Rysunek 1A).</li>
	<li>Zmontuj strzykawkę i napełnij ją cementem akrylowym.</li>
	<li>Wyrównaj długą krawędź zewnętrznej ścianki (część B) z górną krawędzią podstawy (część C) i upewnij się, że są one względem siebie prostopadłe, używając kątownika warsztatowego.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki nanieś małą, równomierną warstwę cementu bezpośrednio w narożnik dwóch łączonych elementów.</li>
	<li>Przytrzymaj oba elementy (części B i C) na miejscu, aż wstępnie stężeją (około 5 min). 
	UWAGA: Zazwyczaj utwardzają się w 80% w ciągu 24 h, jednak montaż można kontynuować po 5 min.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.5–1.7 z drugą zewnętrzną ścianką (część B) i tą samą podstawą.</li>
	<li>Przymocuj dwie wewnętrzne ścianki (część A), jedną po drugiej, do podstawy, stosując kroki 1.5–1.7.</li>
	<li>Dodatkowo użyj strzykawki, aby nanieść małą, równomierną warstwę cementu bezpośrednio w narożniku tworzonym obecnie przez ściankę zewnętrzną (część B) i ściankę wewnętrzną (część A).</li>
	<li>Przytrzymaj te elementy na miejscu przez 5 min.</li>
	<li>Po 24–48 h przystąp do przygotowania środowiska do testów behawioralnych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie środowiska i sprzętu do testów behawioralnych
<ol>
	<li>Umieść wskazówki środowiskowe (opisane w sekcji dyskusji) naprzeciwko siebie, skierowane w stronę aren w obszarze testowym (Rysunek 1B).</li>
	<li>Ustaw cztery areny testowe w układzie 2x2 na podłodze lub stabilnym stole, w odpowiednich odległościach od wskazówek i kamery, aby zmaksymalizować bodźce wizualne dla myszy (Rysunek 1B).</li>
	<li>Zweryfikuj linię widoczności, opierając przymiar od dna każdej areny o jej ścianę w stronę wskazówek, aby potwierdzić, że odległości między arenami a wskazówkami są odpowiednie.</li>
	<li>Wyznacz optymalną długość drogi optycznej, która umożliwi dokumentację wideo wszystkich czterech aren, regulując wysokość kamery lub wysokość stołu (Rysunek 1B).</li>
	<li>Podłącz kamerę do przedłużacza USB.</li>
	<li>Za pomocą korytek kablowych poprowadź kabel wzdłuż sufitu i w dół ściany do komputera z uruchomionym oprogramowaniem do przechwytywania wideo.</li>
	<li>Ukryj komputer za zasłoną, która oddzieli myszy w obszarze testowym od badacza (Rysunek 1C).</li>
	<li>Przygotuj po 4 egzemplarze co najmniej 3 różnych obiektów o długości i szerokości około 2–5 cm oraz wysokości do 10 cm do wykorzystania w testach (Rysunek 1D).</li>
</ol>
<img alt="Schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, ustawienie eksperymentu, wymiary, kalibracja ekranu, marionetka z linijką." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie do testów behawioralnych. (A) Montaż areny do testu otwartego pola (open-field test), gdzie część A odpowiada ścianie wewnętrznej, część B ścianie zewnętrznej, a część C podstawie. Gotowa arena będzie posiadać dwie ściany zewnętrzne (części B), które biegną wzdłuż całej krawędzi podstawy, oraz dwie ściany wewnętrzne (części A), które mieszczą się między ścianami zewnętrznymi na sąsiednich krawędziach podstawy (część C). Wszystkie ściany opierają się na podstawie. (B) Reprezentatywny układ aren na stole o wysokości 0,62 m, sygnały środowiskowe o wymiarach 60 x 90 cm, oświetlenie oraz kamera dla obszaru testowego, co pozwala na jednoczesną rejestrację wszystkich czterech aren. (C) Kurtyna oddzielająca eksperymentatora i system komputerowy od myszy podczas prób. Oświetlenie górne jest włączone na potrzeby wykonania tej fotografii, jednak podczas testów zapalone są jedynie lampy podłogowe. Ponadto, na potrzeby zdjęcia obszaru testowego usunięto jeden z sygnałów środowiskowych, lecz podczas testów przed arenami znajduje się czwarty sygnał, naprzeciwko całkowicie czarnego sygnału za stołem. (D) Reprezentatywny obiekt (oraz linijka dla skali) odpowiedni do testów OLT lub NORT z udziałem myszy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="9">
	<li>Przeprowadź walidację tych obiektów.
	<ol>
		<li>Pozyskaj minimum 8 myszy typu dzikiego w płci, szczepie i grupie wiekowej reprezentatywnej dla myszy eksperymentalnych, które będą użyte (np. samice i samce myszy C57Bl/6 w wieku od 6 do 9 tygodni).</li>
		<li>Przez okres od 3 do 5 dni przed testowaniem codziennie manipuluj myszami przez 1 min.</li>
		<li>Podziel myszy na grupy po 4 i, jeśli nie są jeszcze kwaterowane pojedynczo, przenieś je do indywidualnych, czystych klatek utrzymaniowych.</li>
		<li>Przenieś je do pomieszczenia testowego i pozwól im na aklimatyzację przez co najmniej 30 min. 
		UWAGA: Obecność eksperymentatora w pomieszczeniu przez te 30 min zredukuje stres u myszy podczas zadania, szczególnie jeśli eksperymentator jest mężczyzną20.</li>
		<li>Po zakończeniu aklimatyzacji i przygotowaniu eksperymentatora do rozpoczęcia pracy, zacznij nagrywać wideo.</li>
		<li>Umieść każdą mysz przodem do ścian w jednym z narożników areny (zwanym narożnikiem startowym) (Rycina 2A).</li>
		<li>Pozwól myszom swobodnie eksplorować areny przez 10 min.</li>
		<li>Zatrzymaj nagrywanie wideo.</li>
		<li>Zwróć myszy do ich czystych klatek utrzymaniowych na okres 20 min.</li>
		<li>Oczyść wszystkie areny metodami rekomendowanymi przez zespół ds. zwierząt, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować wskazówki olfaktoryczne przed kolejnym użyciem.</li>
		<li>Używając dwustronnej taśmy, przymocuj 2 różne obiekty w pobliżu 2 narożników niebędących narożnikami startowymi w taki sposób, aby obiekty w arenie były zrównoważone, w odległości 6 x 6 cm2 od każdej ze ścian danego narożnika (Rycina 2B).</li>
		<li>Zacznij nagrywać wideo.</li>
		<li>Umieść każdą mysz przodem do ścian w narożniku startowym.</li>
		<li>Pozwól myszom swobodnie badać arenę i obiekty przez 10 min.</li>
		<li>Zatrzymaj nagrywanie wideo.</li>
		<li>Umieść myszy z powrotem w ich czystych klatkach utrzymaniowych na okres 20 min.</li>
		<li>Oczyść wszystkie areny i obiekty metodami rekomendowanymi przez zespół ds. zwierząt, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować wskazówki olfaktoryczne.</li>
		<li>Powtarzaj próby treningowe z 2 nowymi obiektami przymocowanymi w tych samych lokalizacjach, aż wszystkie obiekty (co najmniej trzy różne obiekty w przypadku przeprowadzania zarówno OLT, jak i NORT) zostaną przetestowane u każdej myszy.</li>
		<li>Wyklucz obiekty, na których myszy mogą usiąść.</li>
		<li>Przeanalizuj czas badania każdego obiektu przez każdą mysz zgodnie z krokiem 4.</li>
		<li>Wyklucz obiekty o ujemnej lub dodatniej wartości wewnętrznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przeprowadzenie testu behawioralnego
<ol>
	<li>Tydzień przed testowaniem: zapoznanie osób przeprowadzających testy behawioralne
	<ol>
		<li>Codziennie przez 1 min w ciągu 3–5 dni przed testowaniem należy obchodzić się z dorosłymi samicami i samcami myszy C57Bl/6 w wieku od 6 do 9 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 1: sesje habituacji
	<ol>
		<li>Podzielić myszy na grupy po 4 osobniki i, jeśli nie są one jeszcze utrzymywane pojedynczo, przenieść je do indywidualnych, czystych klatek tymczasowych.</li>
		<li>Przenieść je do pomieszczenia testowego i pozwolić im na aklimatyzację w tym pomieszczeniu przez co najmniej 30 min. 
		UWAGA: Obecność eksperymentatora w pomieszczeniu przez te 30 min zredukuje stres u myszy podczas zadania, zwłaszcza jeśli eksperymentator jest mężczyzną20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu aklimatyzacji i gdy eksperymentator będzie gotowy do rozpoczęcia, należy włączyć nagrywanie wideo.</li>
	<li>Umieścić każdą mysz w arenie (jedna mysz na arenę) twarzą do ścian w narożniku wypuszczania (Rycina 2A).</li>
	<li>Pozwolić myszom na swobodną eksplorację aren przez 6 min.</li>
	<li>Zatrzymać nagrywanie wideo.</li>
	<li>Przenieść myszy z powrotem do czystych klatek tymczasowych w odstępie między próbami (ITI).</li>
	<li>Wyczyścić wszystkie areny zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.3–3.9 jeszcze dwa razy, aby przeprowadzić łącznie 3 sesje habituacji dla każdej myszy.</li>
	<li>Przenieść wszystkie myszy z powrotem do ich klatek macierzystych.</li>
	<li>Wyczyścić wszystkie areny zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe przed użyciem następnego dnia.</li>
	<li>Dzień 2: próba treningowa, OLT, NORT 
	UWAGA: NORT jest testem opcjonalnym.
	<ol>
		<li>Po 24 h przenieść tę samą grupę myszy do pomieszczenia testowego i pozwolić im na aklimatyzację w tym pomieszczeniu przez co najmniej 30 min, analogicznie do procedury przed sesjami habituacji w dniu poprzednim.</li>
		<li>Przeprowadzić próbę treningową z wykorzystaniem 2 obiektów umieszczonych w arenie (Rycina 2B).
		<ol>
			<li>Używając dwustronnej taśmy, przymocować obiekty w odległości 6 x 6 cm2 od 2 narożników innych niż narożnik wypuszczania, tak aby były one rozmieszczone w arenie w sposób zrównoważony.</li>
			<li>Włączyć nagrywanie wideo.</li>
			<li>Umieścić każdą mysz twarzą do ścian w narożniku wypuszczania, tak jak podczas sesji habituacji.</li>
			<li>Pozwolić myszom na swobodną eksplorację areny i obiektów przez 10 min.</li>
			<li>Zatrzymać nagrywanie wideo.</li>
			<li>Umieścić myszy z powrotem w czystych klatkach tymczasowych na ITI trwający 20 min.</li>
			<li>Wyczyścić wszystkie areny i obiekty zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadzić OLT.
		<ol>
			<li>Przenieść jeden z obiektów użytych w próbie treningowej do nowego narożnika innego niż narożnik wypuszczania i przymocować obiekt dwustronną taśmą w odległości 6 cm od każdej ze ścian tego narożnika (Rycina 2C). 
			UWAGA: Drugi obiekt powinien pozostać w miejscu, w którym znajdował się podczas próby treningowej.</li>
			<li>Włączyć nagrywanie wideo.</li>
			<li>Umieścić każdą mysz twarzą do ścian w narożniku wypuszczania.</li>
			<li>Pozwolić myszom na badanie obiektów przez 10 min.</li>
			<li>Zatrzymać nagrywanie wideo.</li>
			<li>Umieścić myszy z powrotem w czystych klatkach tymczasowych na ITI trwający 20 min.</li>
			<li>Wyczyścić wszystkie areny i obiekty zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadzić NORT.
		<ol>
			<li>Zastąpić obiekt, który nie został przesunięty podczas OLT, nowym obiektem i przymocować nowy obiekt dwustronną taśmą w odległości 6 cm od dwóch ścian narożnika (Rycina 2D).</li>
			<li>Włączyć nagrywanie wideo.</li>
			<li>Umieścić każdą mysz twarzą do ścian w narożniku wypuszczania.</li>
			<li>Pozwolić myszom na badanie obiektów przez 10 min.</li>
			<li>Zatrzymać nagrywanie wideo.</li>
			<li>Przenieść myszy z powrotem do ich klatek macierzystych.</li>
			<li>Wyczyścić wszystkie areny i obiekty zalecanymi w jednostce doświadczalnej metodami czyszczenia, np. przecierając 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały zapachowe przed kolejnym użyciem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Analiza zachowania myszy w boksie; układ eksperymentalny z kolorowymi obiektami, cztery etapy schematu A-D." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Konfiguracja areny dla prób. (A) Arena do testu otwartego pola bez obiektów do sesji habituacji. Czarna strzałka wskazuje róg wypuszczenia. Róg ten powinien znajdować się w tej samej lokalizacji względnej w każdej arenie i być spójny dla każdej badanej myszy oraz dla każdej próby. (B) W próbie treningowej dwa różne obiekty są przymocowane do otwartego pola w odległości 6 x 6 cm od odpowiadających im ścian. (C) W teście OLT jeden obiekt zostaje przeniesiony w nowe miejsce, również w odległości 6 x 6 cm od ścian i z dala od rogu wypuszczenia. (D) W teście NORT obiekt, który był stacjonarny w OLT, zostaje zastąpiony nowym obiektem, podczas gdy obiekt przeniesiony w OLT staje się teraz obiektem znanym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
4. Analiza danych z testów behawioralnych
UWAGA: Analiza wideo powinna zostać w idealnym przypadku przeprowadzona przez co najmniej dwóch niezależnych, zaślepionych eksperymentatorów.
<ol>
	<li>Otwórz plik wideo.</li>
	<li>Na ekranie nałóż przezroczyste koła zapewniające obramowanie o szerokości 2 cm wokół każdego obiektu, aby ułatwić określenie aktywnej eksploracji. W celu kalibracji tej siatki należy użyć klatki z pliku wideo, na której w arenie umieszczono linijkę.</li>
	<li>Obserwuj zachowanie myszy i rejestruj czas, w którym mysz aktywnie eksploruje obiekt; uznaje się to za eksplorację, gdy nos myszy jest skierowany w stronę obiektu w odległości nieprzekraczającej 2 cm od tego obiektu.
	<ol>
		<li>Zapisz znacznik czasu rozpoczęcia eksploracji obiektu przez mysz oraz znacznik czasu zakończenia tej eksploracji.</li>
		<li>Powtórz tę procedurę dla obu obiektów w arenie przez cały czas trwania próby.</li>
		<li>Oblicz skumulowany czas eksploracji każdego obiektu przez mysz, odejmując czas rozpoczęcia od czasu zakończenia dla każdego przypadku eksploracji obiektu, a następnie sumując wszystkie te wartości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz procent całkowitego czasu eksploracji lub indeks dyskryminacji za pomocą następujących wzorów:
	<ol>
		<li>Oblicz procent całkowitego czasu eksploracji = 
		<img alt="Wzór indeksu preferencji nowości; równanie ilustrujące stosunek interakcji z obiektem nowym i znanym." src="/files/ftp_upload/58593/58593eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		UWAGA: Wartość powyżej 50% wskazuje na intensywniejszą eksplorację nowej lokalizacji lub obiektu.</li>
		<li>Oblicz indeks dyskryminacji = 
		<img alt="Wzór indeksu neofobii; schemat statystyczny; mierzy czas trwania odpowiedzi na nowość." src="/files/ftp_upload/58593/58593eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
		UWAGA: Wartość dodatnia wskazuje na dłuższy czas eksploracji nowego obiektu. Indeks dyskryminacji równy zero oznacza poświęcenie równego amountu czasu obydwu obiektom.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przedstaw wyniki graficznie i przeprowadź analizy statystyczne przy użyciu testu t lub analizy ANOVA, w zależności od liczby porównywanych grup.</li>
</ol>

<ol><li>Krakauer, J. W., Ghazanfar, A. A., Gomez-Marin, A., Maclver, M. A., Poeppel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience+Needs+Behavior%3A+Correcting+a+Reductionist+Bias%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuroscience Needs Behavior: Correcting a Reductionist Bias.</a> Neuron. 93 (3), 480-490 (2017).</li>
<li>Lange, F., Seer, C., Kopp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+flexibility+in+neurological+disorders%3A+Cognitive+components+and+event-related+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cognitive flexibility in neurological disorders: Cognitive components and event-related potentials.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 83, 496-507 (2017).</li>
<li>Barnett, J. H., Blackwell, A. D., Sahakian, B. J., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Paired+Associates+Learning+%28PAL%29+Test%3A+30+Years+of+CANTAB+Translational+Neuroscience+from+Laboratory+to+Bedside+in+Dementia+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Paired Associates Learning (PAL) Test: 30 Years of CANTAB Translational Neuroscience from Laboratory to Bedside in Dementia Research.</a> Current Topics in Behavioral Neuroscience. 28, 449-474 (2016).</li>
<li>Eichenbaum, H., Otto, T., Cohen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocampus-what+does+it+do%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+and+Neural+Biology%22%5BJournal%5D)">The hippocampus-what does it do?</a> Behavioral and Neural Biology. 57 (1), 2-36 (1992).</li>
<li>Bartsch, T., Wulff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocampus+in+aging+and+disease%3A+From+plasticity+to+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The hippocampus in aging and disease: From plasticity to vulnerability.</a> Neuroscience. 19 (309), 1-16 (2015).</li>
<li>Smith, B. M., Yao, X., Chen, K. S., Kirby, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Larger+Social+Network+Enhances+Novel+Object+Location+Memory+and+Reduces+Hippocampal+Microgliosis+in+Aged+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Larger Social Network Enhances Novel Object Location Memory and Reduces Hippocampal Microgliosis in Aged Mice.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10 (142), 1-16 (2018).</li>
<li>Chieffi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+Influence+on+Hippocampal+Function%3A+Possible+Involvement+of+Orexin-A%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exercise Influence on Hippocampal Function: Possible Involvement of Orexin-A.</a> Frontiers in Physiology. 14 (8), 85(2017).</li>
<li>Garth, A., Roeder, I., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+in+an+enriched+environment+learn+more+flexibly+because+of+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Mice in an enriched environment learn more flexibly because of adult hippocampal neurogenesis.</a> Hippocampus. 26 (2), 261-271 (2016).</li>
<li>Brown, R. E., Stanford, L., Schellinck, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+standardized+behavioral+tests+for+knockout+and+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Developing standardized behavioral tests for knockout and mutant mice.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (3), 163-174 (2000).</li>
<li>Barker, G. R., Warburton, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+the+hippocampus+involved+in+recognition+memory%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">When is the hippocampus involved in recognition memory?</a> Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).</li>
<li>Savage, S., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+behavior+testing%3A+memory%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Animal behavior testing: memory.</a> British Journal of Anaesthesia. 113 (1), 6-9 (2015).</li>
<li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures?</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li>
<li>Vogel-Ciernia, A., Wood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+object+location+and+object+recognition+memory+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Examining object location and object recognition memory in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 69, 1-17 (2014).</li>
<li>Ammassari-Teule, M., Passino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+hippocampus+is+selectively+involved+in+the+processing+of+spatial+information+even+in+mice+with+a+genetic+hippocampal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Psychobiology%22%5BJournal%5D)">The dorsal hippocampus is selectively involved in the processing of spatial information even in mice with a genetic hippocampal dysfunction.</a> Psychobiology. 25 (2), 118-125 (1997).</li>
<li>Le Merrer, J., Rezai, X., Scherrer, G., Becker, J. A., Kieffer, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hippocampus-dependent+and+facilitated+striatum-dependent+behaviors+in+mice+lacking+the+delta+opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Impaired hippocampus-dependent and facilitated striatum-dependent behaviors in mice lacking the delta opioid receptor.</a> Neuropsychopharmacology. 38 (6), 1050-1059 (2013).</li>
<li>Hattiangady, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Object+location+and+object+recognition+memory+impairments%2C+motivation+deficits+and+depression+in+a+model+of+Gulf+War+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Object location and object recognition memory impairments, motivation deficits and depression in a model of Gulf War illness.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 78(2014).</li>
<li>Oliveira, A. M., Hawk, J. D., Abel, T., Havekes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-training+reversible+inactivation+of+the+hippocampus+enhances+novel+object+recognition+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Post-training reversible inactivation of the hippocampus enhances novel object recognition memory.</a> Learning and Memory. 17 (3), 155-160 (2010).</li>
<li>Cohen, S. J., Stackman, R. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+rodent+hippocampal+involvement+in+the+novel+object+recognition+task%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Assessing rodent hippocampal involvement in the novel object recognition task.</a> Behavioral Brain Research. 285, 105-117 (2014).</li>
<li>Cohen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rodent+Hippocampus+Is+Essential+for+Nonspatial+Object+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Rodent Hippocampus Is Essential for Nonspatial Object Memory.</a> Current Biology. 23 (17), 1685-1690 (2013).</li>
<li>Sorge, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+exposure+to+males%2C+including+men%2C+causes+stress+and+related+analgesia+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents.</a> Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).</li>
<li>Ennaceur, A., Delacour, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+one-trial+test+for+neurobiological+studies+of+memory+in+rats.+1%3A+Behavioral+data%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data.</a> Behavioral Brain Research. 31 (1), 47-49 (1988).</li>
<li>Leger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Object+recognition+test+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Object recognition test in mice.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2531-2537 (2013).</li>
<li>Wolf, A., Bauer, B., Abner, E. L., Ashkenazy-Frolinger, T., Hartz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Behavioral+Test+Battery+to+Assess+Learning+and+Memory+in+129S6%2FTg2576+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+ONE%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Behavioral Test Battery to Assess Learning and Memory in 129S6/Tg2576 Mice.</a> Public Library of Science ONE. 11 (1), e0147733(2016).</li>
<li>Ennaceur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-trial+object+recognition+in+rats+and+mice%3A+methodological+and+theoretical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">One-trial object recognition in rats and mice: methodological and theoretical issues.</a> Behavioural Brain Research. 215, 244-254 (2010).</li>
<li>Lueptow, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Object+Recognition+Test+for+the+Investigation+of+Learning+and+Memory+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel Object Recognition Test for the Investigation of Learning and Memory in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e55718(2017).</li>
<li>Wasserstein, R. L., Lazar, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ASA%27s+Statement+on+p-Values%3A+Context%2C+Process%2C+and+Purpose%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Statistician%22%5BJournal%5D)">The ASA's Statement on p-Values: Context, Process, and Purpose.</a> The American Statistician. 70 (2), 129-133 (2016).</li>
<li>Ranstam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+the+P-value+culture+is+bad+and+confidence+intervals+a+better+alternative%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Why the P-value culture is bad and confidence intervals a better alternative.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (8), 805-808 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Skuteczne testy kognitywne izolują i oceniają funkcje neuronalne określonych obszarów mózgu, badając zachowanie w kontrolowanym środowisku1. U ludzi zaprojektowano specjalne zadania mające na celu ocenę wydajności docelowych regionów mózgu, takie jak zadanie sortowania kart w Wisconsin pod kątem funkcji przedczołowej lub test uczenia się sparowanych współpracowników w Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB) dla funkcji hipokampa2,3. Testy te mają na celu badanie funkcji określonych regionów mózgu u ludzi poprzez ocenę zachowań, które wynikają z aktywności neuronalnej tych regionów. Ostatecznym celem większości badań biomedycznych jest poprawa zdrowia ludzkiego; Jednak wiele badań nad funkcjonowaniem mózgu w zdrowiu lub chorobie nie może być etycznie przeprowadzonych z udziałem ludzi. W przypadku badań, w których nie można uczestniczyć w ludziach, często wybieranym modelem są małe gryzonie, takie jak myszy. Wykorzystanie modeli mysich pozwala na bezpośrednią kontrolę nad eksperymentalnymi manipulacjami, w tym zmianą ekspresji genów, indukcją urazu, a nawet modulacją aktywności obwodu za pomocą technik optogenetycznych. Testy behawioralne myszy, podobne do testów na ludziach, mają na celu ocenę wpływu zmiennych eksperymentalnych na funkcjonowanie mózgu poprzez pomiar zachowań, które opierają się na określonych regionach.
Hipokamp jest niezbędną strukturą do tworzenia pamięci u ludzi i gryzoni4. Mówiąc dokładniej, hipokamp odgrywa kluczową rolę w pamięci deklaratywnej obejmującej reprezentacje relacyjne, ale nie pamięć proceduralną, która opiera się na ośrodkach motorycznych mózgu4. Funkcja pamięci hipokampa jest przedmiotem badań w wielu dziedzinach neurobiologii, ponieważ jest wyjątkowo wrażliwa na zakłócenia. Negatywne zaburzenia, począwszy od długotrwałego stresu i starzenia się, a skończywszy na drgawkach i udarze, są związane z uszkodzeniem hipokampa5. Natomiast pozytywne interwencje, takie jak interakcje społeczne, fizyczne wzbogacanie środowiska lub ćwiczenia, poprawiają funkcję hipokampa6,7,8. Badania na gryzoniach z odpowiednim testowaniem pamięci hipokampa mogą ujawnić wgląd w komórkowe i molekularne mediatory pamięci, a także wpływ różnych interwencji środowiskowych na funkcję hipokampa.
U gryzoni opracowano kilka testów do badania uczenia się i pamięci zależnej od hipokampa9,10,11. Można je ogólnie podzielić na zadania, które wymagają bodźca o wartości emocjonalnej, aby wywołać zmianę w zachowaniu, oraz zadania, które czerpią z preferencji gryzoni do badania nowych bodźców11. Na przykład kontekstowe warunkowanie strachu łączy nieprzyjemny bodziec (wstrząs stopą) z kontekstem środowiskowym, a następnie testuje pamięć pod kątem tego kontekstu, mierząc zachowanie związane z zamrożeniem wywołane strachem9,11. Labirynt wodny Morris i jego suchy odpowiednik, labirynt Barnesa, wykorzystują ujemne wzmocnienie zewnętrzne, aby promować uczenie się przestrzenne4,11. W każdym przypadku gryzonie szukają ucieczki z awersyjnej sytuacji, zanurzając się odpowiednio w zimnej wodzie lub wystawiając na działanie na jasno oświetlonej platformie. Z kolei labirynt z ramieniem promieniowym opiera się na pozytywnym wzmocnieniu, ponieważ zwierzęta wykorzystują naturalne zachowania związane z żerowaniem w połączeniu z pamięcią przestrzenną, aby odzyskać małe nagrody w postaci jedzenia4,11. Zadania te są szeroko stosowane i przyniosły podstawową wiedzę na temat pamięci hipokampa. Jednak negatywne i pozytywne wzmocnienia zewnętrzne lub bodźce wywołujące strach, takie jak szok, dodają komponent emocjonalny do tych testów behawioralnych, co w niektórych przypadkach może być niepożądane. Na przykład hipokamp grzbietowy i brzuszny są związane z różnymi funkcjami, odpowiednio pamięcią przestrzenną i regulacją emocjonalną12. Testy, które opierają się na emocjonalnej reakcji na bodźce, mogą nie odzwierciedlać dokładnie upośledzonej pamięci przestrzennej, jeśli wpływa to również na funkcje regulacji emocjonalnej brzusznego hipokampa.
OLT to prosty i skuteczny test, który dostarcza miary pamięci przestrzennej zależnej od hipokampa13. Zadanie opiera się na wewnętrznej preferencji zwierzęcia do nowości bez dodatkowego zewnętrznego wzmocnienia i dlatego zazwyczaj pozwala uniknąć komplikacji związanych z różnymi reakcjami emocjonalnymi13. Obecny protokół OLT jest przedstawiony dla myszy, ale jest również skuteczny u szczurów, jeśli wymiary sprzętu są odpowiednio skalowane. Protokół polega na aklimatyzacji myszy do areny testowej na otwartym polu, a następnie umożliwieniu jej zbadania 2 obiektów w odniesieniu do przestrzennych wskazówek środowiskowych. Mysz jest następnie usuwana z areny, a podczas opóźnienia (interwału między próbami lub ITI) jeden z obiektów jest przesuwany. Po ITI mysz zostaje ponownie wprowadzona na arenę i może swobodnie eksplorować. Ogólnie rzecz biorąc, myszy preferują nowości, a jeśli pamiętają lokalizację obiektów z ich początkowej ekspozycji, spędzą więcej czasu na badaniu poruszanego obiektu. Zwierzęta z uszkodzeniami w hipokampie mają upośledzone przestrzenne uczenie się kontekstowe i w związku z tym nie wykazują preferencji dla obiektów w nowej lokalizacji14,15.
OLT może być używany niezależnie lub w połączeniu z dodatkowym testem pamięci, który wykorzystuje aktywność neuronalną z wielu obszarów mózgu, nowym zadaniem rozpoznawania obiektów (NORT). NORT jest identyczny z OLT do fazy testowej, kiedy jeden z obiektów jest zastępowany nowym obiektem, zamiast być przenoszony w nowe miejsce. Podobnie jak w przypadku OLT, myszy z dobrą pamięcią do obiektów spontanicznie wolą badać nowy obiekt. W przeciwieństwie do pamięci lokalizacji obiektów, która w dużej mierze opiera się na substratach hipokampa, pamięć rozpoznawania obiektów wydaje się polegać na różnych regionach mózgu, a zaangażowanie hipokampa jest niepewne. Wiele badań donosi, że uszkodzenia lub inaktywacja hipokampa nie wpływają na preferencję nowego obiektu10,13,16,17, podczas gdy inni uważają, że jest odwrotnie18,19. Jednak nadal jest to powszechnie stosowane zadanie do oceny funkcji pamięci ogólnej u gryzoni.
Protokół przedstawiony tutaj określa kroki związane z inicjacją i realizacją OLT i NORT, które korzystają z areny testowania na otwartym polu. Dostępny na rynku sprzęt do testów behawioralnych może być zbyt kosztowny, szczególnie dla mniejszych laboratoriów. Protokół ten obejmuje projekt i proste kroki do budowy aren we własnym zakresie przy minimalnych kosztach i bez specjalistycznych narzędzi. Co więcej, protokół ten szczegółowo opisuje idealny obszar testów behawioralnych, w tym rozmieszczenie aren, wskazówki kontekstowe i system nagrywania wideo, który przygotowuje grunt pod wdrożenie protokołów OLT i NORT. Przedstawiono reprezentatywne wyniki zarówno dla udanych, jak i wadliwych badań, podkreślając znaczenie optymalizacji wszystkich materiałów i procedur dla każdego badania.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>opis</td>
			<td>opcja</td>
			<td>ilość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Część A: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 40 cm x 40,64 cm)</td>
			<td>Trasowane krawędzie</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Część B: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 40 cm x 41,91 cm)</td>
			<td>Trasowane krawędzie</td>
			<td>cyfra arabska</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Część C: Arkusz akrylowy - nieprzezroczysty biały (0,635 cm x 41,91 cm x 41,91 cm)</td>
			<td>Trasowane krawędzie</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cement akrylowy (1 pkt.)</td>
			<td>nie</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-stopniowy aplikator hipo</td>
			<td>nie</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwadrat kombinowany</td>
			<td>nie</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kamera internetowa HD</td>
			<td>nie</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oprogramowanie do przechwytywania wideo</td>
			<td>nie</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przedłużacz USB 2.0</td>
			<td>nie</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanał kablowy</td>
			<td>nie</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Szczegółowa lista materiałów i sprzętu wymaganych do testów behawioralnych.

<table><tbody><tr><td>Znak Biały - 9% Półprzezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)</td><td>TAP Plastics</td><td>NA</td><td>1/4 "x 15.75" x 15,75 " z frezowanymi krawędziami</td></tr><tr><td>Znak Biały - 9% Półprzezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)</td><td>TAP Plastics</td><td>NA</td><td>1/4 "x 15,75" x 16,5 " z frezowanymi krawędziami</td></tr><tr><td>Znak biały - 9% Przezroczysty i nieprzezroczysty kolorowy odlew akrylowy (Chemcast)</td><td>TAP Plastics</td><td>NA</td><td>1/4" x 16,5" x 16,5" z frezowanymi krawędziami</td></tr><tr><td>TAP Cement akrylowy (1 pkt.)</td><td>TAP Plastics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>16 G Aplikator hipo</td><td>TAP Plastics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Debiutanckie oprogramowanie do przechwytywania wideo Pro Edition</td><td>Oprogramowanie NCH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stanely SAE/metryczny grzebień kwadratowy</td><td>Grainger</td><td>6R171</td><td></td></tr><tr><td>Logitech Pro Stream Webcam C922x</td><td>CDW</td><td>4429927</td><td></td></tr><tr><td>Belkin 16' Aktywny przedłużacz USB 2.0</td><td>CDW</td><td></td><td></td>570691</tr><tr><td>Panduit Pan-Way LD Bieżnia powierzchniowa (8')</td><td></td><td>CDW 300902</td><td></td></tr><tr><td>Wskazówki przestrzenne/środowiskowe</td><td>Zmienna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Obiekty do testowania</td><td>Zmienna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>70%</td><td>etanolu Zmienna</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Zmienna</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorskie rozpoznawanie obiektów i testy behawioralne lokalizacji obiektów u myszy przy ograniczonym budżecie

Novel Object Recognition and Object Location Behavioral Testing in Mice on a Budget

Etologicznie istotne testy behawioralne są kluczowym elementem każdego badania, które wykorzystuje modele mysie do badania poznawczych skutków różnych zmian fizjologicznych lub patologicznych. Zadanie lokalizacji obiektu (OLT) i zadanie rozpoznawania nowych obiektów (NORT) to dwa skuteczne zadania behawioralne powszechnie używane do ujawnienia funkcji i względnego zdrowia określonych regionów mózgu zaangażowanych w pamięć. Podczas gdy oba te testy wykorzystują wrodzoną preferencję myszy do nowości, aby ujawnić pamięć dla wcześniej napotkanych obiektów, OLT przede wszystkim ocenia uczenie się przestrzenne, które w dużej mierze opiera się na aktywności hipokampa. Z kolei NORT ocenia nieprzestrzenne uczenie się tożsamości obiektu, które opiera się na wielu regionach mózgu. Oba zadania wymagają areny testowej na otwartym polu, obiektów o wartości wewnętrznej równoważnej myszom, odpowiednich wskazówek środowiskowych oraz sprzętu do nagrywania wideo i oprogramowania. Dostępne na rynku systemy, choć wygodne, mogą być kosztowne. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prostą, opłacalną metodę budowy aren i ustawiania sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia OLT i NORT. Ponadto manuskrypt opisuje skuteczny protokół testowy, który obejmuje zarówno OLT, jak i NORT i zapewnia typowe metody pozyskiwania i analizy danych, a także reprezentatywne wyniki. Pomyślne zakończenie tych testów może dostarczyć cennych informacji na temat funkcji pamięci różnych systemów modeli myszy i ocenić podstawowe regiony neuronalne, które wspierają te funkcje.

Rysunek 3 przedstawia przykłady typowych wyników pozytywnych i negatywnych uzyskanych u dorosłych samców i samic myszy C57Bl/6 z zastosowaniem tego protokołu6. Interpretacja danych z testów OLT i NORT zawsze odnosi się do zagregowanych danych grupy (patrz dyskusja poniżej). Czas eksploracji pojedynczej myszy nie może być interpretowany jako obecność lub brak pamięci. Jednakże wyniki grupy myszy (t.j. wielu osobników) można porównać z innymi grupami lub z ustalonym poziomem przypadku, stosując testy statystyczne. Podczas typowej próby treningowej grupy myszy nie wykazują średnio istotnej preferencji do któregoś z obiektów, ponieważ oba są w równym stopniu nowe i nie posiadają żadnej wewnętrznie negatywnej ani pozytywnej wartości dla myszy (Rysunek 3A i 3B). Jeśli zagregowane dane grupy myszy wykazują istotną preferencję jednego obiektu nad drugim podczas treningu, obiekty te nie powinny być stosowane, ponieważ taka wrodzona preferencja/awersja zakłóci wyniki w kolejnych próbach. Ponadto całkowity czas eksploracji wszystkich myszy musi spełniać minimalny standard (tradycyjnie ustalony na 20 sekund21) i powinien zostać porównany, aby upewnić się, że nie występują różnice bazowe w eksploracji, które mogłyby wpłynąć na późniejsze testy pamięci.
Podczas OLT pamięć dotyczącą lokalizacji obiektu przejawia się tym, że myszy spędzają średnio znacznie więcej niż 50% całkowitego czasu eksploracji z obiektem przesuniętym (Rycina 3A). Jeśli całkowity czas eksploracji u poszczególnych myszy znacznie się różni, wyniki lepiej przedstawić w formie indeksu dyskryminacji obiektów (Rycina 3B). Znaczący wzrost średniego indeksu dyskryminacji na Rycynie 3B wskazuje, że myszy spędziły więcej czasu z obiektem po jego przesunięciu. Niezależnie od tego, czy mierzy się to wzrostem procentowego czasu, czy indeksem dyskryminacji, zwiększona eksploracja obiektu po jego przesunięciu sugeruje, że myszy pamiętają miejsce, w którym obiekt znajdował się podczas treningu.
Ostatnia próba w tym protokole ocenia pamięć rozpoznawania obiektów. Reprezentatywny przykład z jedną grupą myszy wykazuje wyższy średni procent czasu eksploracji (Rycina 3C), a także dodatni indeks dyskryminacji (Rycina 3D) w porównaniu do stałych wartości kontrolnych wynoszących odpowiednio 50% i 0. Podobnie jak w przypadku danych OLT, jeśli między poszczególnymi myszami występuje znacząca zmienność całkowitego czasu eksploracji, indeks dyskryminacji jest prawdopodobnie lepszą metodą wizualizacji tych danych. Rycina 3E przedstawia przykład porównania dwóch grup w teście NORT oraz niektóre komplikacje statystyczne, które mogą wystąpić w tych badaniach (patrz sekcja dyskusja). Choć test t dla jednej próby dla grupy B wykazuje eksplorację istotnie powyżej 50%, ten sam test dla grupy A tego nie potwierdza. Wynik ten nie oznacza, że grupa A i B różnią się od siebie. Aby określić różnice między grupami, należy przeprowadzić oddzielny nieparametryczny test Manna-Whitneya dla dwóch prób, porównujący grupę B z grupą A. Nieparametryczny test Manna-Whitneya dla dwóch prób przeprowadzony na tych reprezentatywnych danych grupowych nie wykazuje istotnej różnicy (p = 0,66) między dwiema grupami w procencie czasu eksploracji nowego obiektu.
Zarówno test OLT, jak i NORT są bardzo wrażliwe na wartość immanentną obiektów, dlatego niezbędne jest dokładne przetestowanie równoważności obiektów, aby upewnić się, że nie występuje wrodzona preferencja, która mogłaby zakłócić wyniki. Rysunek 3F i 3G przedstawiają przykład niewłaściwego doboru obiektów. W teście pilotażowym na grupie 4 myszy zaobserwowano tendencję do spędzania mniej niż 50% czasu eksploracji z obiektem A w parze z obiektem B (Rysunek 3F). Gdy obiekty te zostały następnie wykorzystane w teście NORT, w którym obiekt A był obiektem nowym, a wielkość próby wynosiła 16, myszy spędzały istotnie mniej niż 50% czasu eksploracji z obiektem A (Rysunek 3G). Taka awersja do nowego obiektu jest tutaj łatwo rozpoznawalna jako błąd techniczny w eksperymencie i obrazuje, dlaczego testy pilotażowe obiektów pod kątem wrodzonej preferencji lub awersji są niezbędne.
<img alt="Wykresy analizy behawioralnej; % czasu badania vs indeks dyskryminacji; test rozpoznawania obiektów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58593/58593fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Dane z testów behawioralnych przeprowadzonych na dorosłych myszach szczepu C57Bl/6 typu dzikiego. (A) Porównanie procentowego całkowitego czasu badania przesuniętego obiektu podczas próby treningowej w stosunku do OLT wykazuje istotny wzrost badania po przesunięciu obiektu. ****p &lt; 0.0001, test t dla prób zależnych. (B) Reprezentatywne wyniki badania przesuniętego obiektu podczas prób treningowych i OLT, przedstawione jako indeks dyskryminacji, analogicznie wykazują istotny wzrost badania obiektu po jego przesunięciu. ****p &lt; 0.0001, test t dla prób zależnych. (C) Procent całkowitego czasu badania nowego obiektu w NORT wykazuje istotną preferencję badania nowego obiektu. **p = 0.0024, test t dla jednej próby vs. 50%. (D) Reprezentatywne wyniki badania nowego obiektu w NORT, przedstawione jako indeks dyskryminacji, analogicznie wykazują preferencję badania nowego obiektu. **p = 0.0024, test t dla jednej próby vs 0. (E) Reprezentatywne wyniki analizy NORT z udziałem dwóch różnych grup myszy. Grupa B różni się istotnie od 50% w teście t dla jednej próby (**p = 0.0024), ale grupa A nie wykazuje takiej różnicy (p = 0.5837). W oddzielnej analizie, w celu porównania grup, zastosowano test U Manna-Whitneya ze względu na nierówną liczebność grup; nie stwierdzono istotnej różnicy w badaniu (p = 0.66, ns). (F) Procent czasu spędzonego z obiektem podczas prób walidacyjnych przy małej liczebności próby wskazuje na tendencję do unikania obiektu. p = 0.2159, test t dla jednej próby. (G) Przy większej liczebności próby i wykorzystaniu obiektu z (F) jako nowego obiektu w NORT, stwierdzono istotne unikanie obiektu, mimo że był on obiektem nowym. *p = 0.0270, test t dla jednej próby. Jest to przykład błędu technicznego przy wyborze obiektu. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Dane z paneli C-E zostały zaadaptowane z wcześniejszej publikacji6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58593/58593fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Tutaj udostępniamy protokół, który zawiera obszerne instrukcje dotyczące ekonomicznego ustanawiania lokalizacji obiektów mysich i nowatorskich testów behawioralnych rozpoznawania obiektów, w tym projektowania, kosztu i budowy wymaganego sprzętu, a także wykonywania testów behawioralnych, zbierania danych i analizy.

Nowatorskie rozpoznawanie obiektów i testy behawioralne lokalizacji obiektów u myszy przy ograniczonym budżecie

Ethologically relevant behavioral testing is a critical component of any study that uses mouse models to study the cognitive effects of various ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji pamięci. Na przykład określamy rolę określonych białek w pamięci, testując transgeniczne myszy z nokautem w tych zadaniach. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybki i opłacalny sposób przeprowadzania testów pamięci w dowolnym laboratorium.Demonstracja konstrukcji areny ma kluczowe znaczenie, ponieważ spawanie rozpuszczalnikiem przyniesie dobre wyniki tylko wtedy, gdy zostanie wykonane z należytą starannością. Zacznij od zdobycia pięciu arkuszy akrylu, cementu akrylowego i aplikatora hipo o rozmiarze 16. Usuń papierową powłokę ochronną z arkuszy akrylowych.Następnie dopasuj wszystkie materiały na sucho, aby potwierdzić, że rozmiary są prawidłowe. Następnie zmontuj i załaduj strzykawkę cementem akrylowym. Wyrównaj długą krawędź ściany zewnętrznej z górną krawędzią podstawy i upewnij się, że są one prostopadłe do siebie za pomocą kwadratu kombinowanego lub kwadratu operatora.Następnie za pomocą strzykawki nałóż małą i stabilną warstwę cementu bezpośrednio na róg dwóch łączonych elementów. Przytrzymaj dwa elementy na miejscu przez pięć minut, aż wstępnie się zestalą. Powtórz te same kroki, aby przymocować drugą ścianę zewnętrzną do podstawy.Następnie przymocuj dwie ściany wewnętrzne, pojedynczo, podstawę za pomocą cementu akrylowego. Na koniec za pomocą strzykawki nałóż małą i stabilną kroplę cementu bezpośrednio na narożnik tworzony teraz przez ścianę zewnętrzną i ścianę wewnętrzną. Rozpocznij sesję habituacyjną od podzielenia myszy na grupy po cztery i umieść je w osobnych, czystych klatkach.Następnie przyprowadź jedną grupę myszy do pokoju testowego i pozwól im zaaklimatyzować się przez co najmniej 30 minut. Po aklimatyzacji rozpocznij nagrywanie wideo. Umieść każdą mysz na arenie przodem do ścian rogu zwalniania i pozwól myszom swobodnie eksplorować areny przez sześć minut.Następnie przestań nagrywać wideo i przywróć myszy do ich czystych klatek podczas przerwy między próbami. Wyczyść wszystkie areny za pomocą metod czyszczenia zalecanych przez zwierzęta, takich jak przecieranie 70% etanolem, aby zminimalizować sygnały węchowe. Na koniec, po wykonaniu łącznie trzech sesji habituacji, przywróć wszystkie myszy do ich domowych klatek.Po 24 godzinach przynieś tę samą grupę myszy do pokoju testowego i pozwól im zaaklimatyzować się w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut, tak jak to miało miejsce przed sesjami przyzwyczajenia poprzedniego dnia. Przeprowadź próbę treningową przy użyciu dwóch obiektów umieszczonych na arenie. Przymocuj przedmioty taśmą dwustronną w odległości sześć na sześć centymetrów od dwóch niezwalniających narożników, tak aby były przeciwwagi na arenie.Pozwól myszom swobodnie badać arenę i obiekty przez 10 minut. Następnie zatrzymaj nagrywanie wideo. Umieść myszy z powrotem w czystych klatkach na 20 minut i oczyść obszary etanolem.Następnie, aby wykonać zadanie lokalizacji obiektu OLT, przenieś jeden z obiektów używanych w próbie szkoleniowej do nowego narożnika bez zwalniania i przymocuj obiekt sześć centymetrów od każdej ściany tego narożnika za pomocą taśmy dwustronnej. Powtórz to samo nagranie wideo myszy w okolicy przez 10 minut, jak opisano wcześniej. Na koniec, aby wykonać zadanie rozpoznawania nowego obiektu NORT, zastąp obiekt, który nie został przeniesiony podczas OLT, nowym obiektem i przymocuj nowy obiekt sześć centymetrów od dwóch ścian rogu za pomocą taśmy dwustronnej.Powtórz to samo nagranie wideo myszy w okolicy przez 10 minut, jak opisano wcześniej. Podczas OLT pamięć o lokalizacji obiektu jest odzwierciedlana przez grupę myszy spędzających średnio znacznie więcej czasu z obiektem po jego przemieszczeniu. Można to również przedstawić jako wzrost wskaźnika dyskryminacji.W NORT pamięć o lokalizacji obiektu jest odzwierciedlona przez grupę myszy spędzających średnio znacznie ponad 50% czasu badawczego z nowym obiektem lub wykazujących wskaźnik dyskryminacji znacznie większy od zera. Wybieranie obiektów, do których myszy nie mają wrodzonych preferencji, jest kluczowe. Na przykład w teście pilotażowym z próbą o wielkości czterech myszy wykazywały tendencję do spędzania mniej niż 50% czasu badania z obiektem A, gdy zostały sparowane z obiektem B. Kiedy obiekt A został następnie użyty jako nowy obiekt w NORT, przy większej wielkości próby wynoszącej 16, myszy spędziły znacznie mniej niż 50% czasu badania z obiektem A. Dane te sugerują wrodzoną awersję do obiektu A. Podczas tej procedury, Ważne jest, aby pamiętać o dokładnym czyszczeniu wszystkich przedmiotów i aren między użyciem.W tej metodzie badanie obiektów może być oceniane ręcznie przez badaczy lub za pomocą komercyjnego oprogramowania. Oprogramowanie wiąże się z wyższymi kosztami początkowymi, ale po skalibrowaniu może zaoszczędzić czas i zasoby finansowe w dłuższej perspektywie.

novel-object-recognition-object-location-behavioral-testing-mice-on

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

W pełni zautomatyzowany system do pomiaru fizjologicznie istotnych właściwości mechanizmów pośredniczących w lokalizacji przestrzennej, lokalizacji czasowej, czasie trwania, szacowaniu szybkości i prawdopodobieństwa, ocenie ryzyka, impulsywności oraz dokładności i precyzji pamięci, w celu oceny wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na podstawowe mechanizmy poznawcze u myszy.

Zautomatyzowane, ilościowe badania poznawczo-behawioralne myszy: do genetyki, farmakologii, poznania zwierząt i nauczania na studiach licencjackich

Długotrwałe i kompleksowe monitorowanie myszy w środowisku domowym pozwala na głębsze zrozumienie nieprawidłowych zachowań w mysich modelach chorób mózgu. W artykule opisano Zintegrowaną Stację Behawioralną (INBEST) jako kluczowy komponent współczesnej analizy behawioralnej.

Fenotypowanie behawioralne modeli chorób myszy za pomocą Zintegrowanej Stacji Behawioralnej (INBEST)

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania towarzyskości myszy. Myszy są filmowane, gdy poruszają się i wchodzą w interakcje w specjalnej klatce. Przetwarzanie filmów pozwala na zautomatyzowaną kwantyfikację towarzyskości z doskonałą dokładnością i niezawodnością.

Eksperymentalna ocena towarzyskości myszy przy użyciu podejścia do zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Bardziej ograniczone, powtarzające się zachowania (RRB) zakłócają życie osób dotkniętych tym problemem.  Zachowania te są trudne do modelowania u gryzoni, co utrudnia podstawowe badania biomedyczne nad potencjalnymi terapiami lub interwencjami w przypadku RRB.  W tym miejscu opisujemy eksplorację nowych obiektów jako potencjalny test dla RRB wyższego rzędu u myszy.

Eksploracja nowych obiektów jako potencjalny test dla powtarzających się zachowań wyższego rzędu u myszy

Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.

Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau

Test rozpoznawania obiektów (ORT) to prosty i skuteczny test do oceny uczenia się i pamięci u myszy. Metodologia została opisana poniżej.

Nowatorski test rozpoznawania obiektów do badania uczenia się i pamięci u myszy

Ten protokół opisuje test behawioralny, oparty na teście labiryntu Barnesa, w celu zbadania, jak instynktowne działania obronne są modyfikowane przez wiedzę o środowisku przestrzennym.

Test behawioralny do badania roli pamięci przestrzennej podczas instynktownej obrony u myszy

Kompleksowy test behawioralny obejmujący umiejętności motoryczne, nastrój - w tym interakcje społeczne, depresję i lęk - oraz funkcje poznawcze jest przeznaczony do wielokrotnej oceny zmian behawioralnych związanych z neurodegeneracją u myszy.

Bateria testów behawioralnych do wielokrotnej oceny zdolności motorycznych, nastroju i funkcji poznawczych u myszy

Ten protokół zawiera szczegółowe kroki dla zadania lokalizacji obiektu z czterema powtórzeniami przy użyciu tej samej kohorty szczurów. Słabe i silne kodowanie może wytwarzać wspomnienia krótko- i długotrwałe. Elastyczność protokołu z powtarzaniem może być korzystna w badaniach obejmujących operacje chirurgiczne, oszczędzając czas i pracę.

Wewnątrzprzedmiotowy projekt eksperymentalny wykorzystujący zadanie lokalizacji obiektu w szczurach

Opracowaliśmy pojedynczą platformę do śledzenia zachowań zwierząt podczas dwóch zadań związanych z nauką asocjacyjną zależnych od włókien wspinaczkowych. Niedroga konstrukcja umożliwia integrację z eksperymentami optogenetycznymi lub obrazowymi ukierunkowanymi na aktywność móżdżku związaną ze wspinaniem się włókien.

Elastyczna platforma do monitorowania sensorycznego uczenia się asocjacyjnego zależnego od móżdżku

Tutaj prezentujemy uproszczoną konfigurację sprzętu i oprogramowania open-source do badania uczenia przestrzennego myszy za pomocą wirtualnej rzeczywistości (VR). System ten wyświetla wirtualną ścieżkę liniową do myszy z ograniczeniem głowy działającej na kole, wykorzystując sieć mikrokontrolerów i komputer jednopłytkowy z łatwym w użyciu pakietem oprogramowania graficznego Python.

System rzeczywistości wirtualnej typu open source do pomiaru uczenia się przestrzennego u myszy z unieruchomioną głową

Poznaj protokół testowania pamięci u myszy metodami OLT i NORT. Naucz się budowy aren z akrylu i analizy behawioralnej w badaniach neurobiologicznych.

Nowatorskie rozpoznawanie obiektów i testy behawioralne lokalizacji obiektów u myszy przy ograniczonym budżecie

Przeglądaj więcej filmów