Name: Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj metodę optogenetycznej manipulacji obwodami nerwowymi podczas monitorowania stanów snu i czuwania u myszy. Technika ta umożliwia badanie przyczynowych związków między aktywnością neuronów BNST a regulacją snu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Merck Investigator Studies Program (#54843), grant KAKENHI Grant-in-Aid na badania naukowe nad innowacyjnymi obszarami, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.) oraz KAKENHI Grant-in-Aid for Exploratory Research on Innovative Areas (T.S.) (18H02595).

Wszystkie eksperymenty tutaj zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Eksperymentów i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Tsukuba, zgodnie z wytycznymi NIH.
1. Chirurgia zwierząt, wstrzykiwanie wirusów, elektroda do EEG/EMG i implantacja światłowodów
UWAGA: Odpowiednie techniki ochrony i postępowania powinny być wybrane w oparciu o poziom bezpieczeństwa biologicznego wirusa, który ma być użyty. AAV powinien być używany w izolowanym pomieszczeniu klasy P1A do wstrzykiwań, a probówka z AAV musi być sterylizowana w autoklawie po zużyciu całej objętości. Pole operacyjne i cały wszczepiony materiał powinny być czyste i sterylne podczas użytkowania. 
nuta: Zobacz Rysunek 1.
<ol>
	<li>Zdezynfekuj sprzęt chirurgiczny za pomocą autoklawu.</li>
	<li>Znieczulij myszy izofluranem za pomocą waporyzatora znieczulającego. Obserwuj, aż mysz osiągnie pożądaną głębokość znieczulenia, określoną przez utratę reakcji na szczypanie ogona kleszczami. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
	<li>Zdezynfekować pole operacyjne roztworem jodu lub 70% EtOH (3x) i wystarczająco wysuszyć. Pozwól wirusowi rozmrozić się na lodzie podczas wykonywania operacji. Przykryj obszar operacyjny chłonnym papierem laboratoryjnym.</li>
	<li>Zamocuj głowę myszy w aparacie stereotaktycznym za pomocą pasków dousznych i szczypania nosa. Po upewnieniu się, że głowa jest stabilnie trzymana, wykonaj nacięcie śródstrzałkowe na skórze głowy, aby upewnić się, że pozycje bregmy i lambdy znajdują się na tym samym poziomie na linii poziomej.</li>
	<li>Aby uniknąć luki w pozycjonowaniu, odpowiednio wyreguluj poziomy szczypania nosa i nauszników w górę iw dół. Bregma i lambda odnoszą się odpowiednio do przecięcia się sutura saggitalis i sutura coronalis lub sutura lambdoidal (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Użyj klamer Serafin, aby przytrzymać skórę, aby utrzymać dostęp do czaszki. Po odsłonięciu czaszki należy zdezynfekować powierzchnię czaszki jodem lub 5%H2O2, aby umożliwić wyraźniejsze uwidocznienie szwów czaszkowych, w tym bregmy i lambdy.</li>
	<li>Przygotuj wstrzyknięcie wektora AAV:
	<ol>
		<li>Umyj wnętrze strzykawki o pojemności 10 ml (patrz Tabela materiałów) kolejno 70% EtOH, 100% EtOH i wysterylizowaną wodą, 5 razy każdy. Zabezpieczyć strzykawkę w zacisku ramienia pompy do mikroiniekcji i upewnić się, że cały roztwór ze strzykawki został opróżniony.</li>
		<li>Ostrożnie odessać 2 μl oleju mineralnego bez pęcherzyków powietrza, a następnie odessać wyznaczoną objętość roztworu wirusa. Po aspiracji należy obcisnąć tłok i upewnić się, że na końcu igły pojawił się roztwór wirusa. 
		nuta: Objętość wstrzykniętego roztworu wirusa określono w eksperymentach pilotażowych z użyciem tego samego szczepu myszy i tego samego produktu wirusowego. Zależność między objętością roztworu wirusa a zasięgiem obszaru zakażenia powinna być oszacowana z wyprzedzeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknij wektor AAV:
	<ol>
		<li>Wyreguluj końcówkę igły do mikroiniekcji na bregmie i zanotuj współrzędne jako oryginalny punkt. Przesunąć końcówkę do wyznaczonego miejsca wstrzyknięcia (dla BNST: przednio-tylna + 0,2 mm, przyśrodkowo-boczna ± 1,0 mm, grzbietowo-brzuszna - 4,2 mm) i umieścić końcówkę igły w tym miejscu. Umieść znak na czaszce i wywierć otwory o średnicy około 2 mm za pomocą wiertła dentystycznego z frezem z węglika spiekanego 0,7 mm. Uważaj, aby nie uszkodzić opony twardej lub tkanki mózgowej.</li>
		<li>Po usunięciu krwi z okolic otworów za pomocą bawełnianego wacika, powoli przesuń igłę do pozycji BNST. Powoli wstrzyknąć wyznaczoną ilość roztworu wirusa (0,07 μl/min) za pomocą mechanicznego mikroiniektora. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy pozostawić igłę na 5 minut, aby roztwór wystarczająco naciekł do tkanki BNST. Ostrożnie wyjmij igłę.</li>
		<li>W przypadku wstrzyknięcia obustronnego powtórzyć czynności 1.8.1-1.8.2 po drugiej stronie. Przez cały czas trwania zabiegu utrzymuj czaszkę w wilgoci za pomocą sterylnego roztworu soli fizjologicznej. 
		nuta: Użyliśmy niestandardowych implantów EEG/EMG (szer.: 5 mm, gł.: 7 mm, wys.: 1 mm) z czterema elektrodami EEG (4 mm), dwiema elektrodami EMG (2 mm; przyciąć elektrodę 4 mm do 2 mm za pomocą szczypiec) i 6 elektrodami (4,5 mm) (<klasa silna="xfig">ryc. 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>dwa druty ze stali nierdzewnej (patrz Tabela materiałów), z których 1 mm izolacji jest zdjęty z obu końców do elektrod EMG. Dopasuj środek elektrod do bregmy i zaznacz położenie każdej elektrody EEG (przednio-tylna ± 1,5 mm, przyśrodkowo-boczna ± 1,0 mm) i określ pozycję implantu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Implanty światłowodowe:
	<ol>
		<li>Przymocuj tulejkę światłowodową do manipulatora i obróć ramię manipulatora tak, aby miało kąt ±30° względem linii poziomej (proces ten jest potrzebny tylko w celu uniknięcia zakłóceń między elektrodami a światłowodami, tak jak w przypadku stymulacji BNST). Połóż końcówkę światłowodu na bregmie i zapisz współrzędne.</li>
		<li>Przesuń końcówkę do docelowej linii wprowadzania i zaznacz pozycję na czaszce. Umieść również dodatkowe znaki w pobliżu miejsca wstawienia kotwiących. Wywierć czaszkę w każdym miejscu wiertłem dentystycznym, aby wprowadzić światłowód i przykręcić. Przykręć do czaszki. Uważaj, aby nie złamać opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki śrubą.</li>
		<li>Delikatnie włóż światłowód, aż sięgniesz powyżej BNST za pomocą manipulatora. Skuwka powinna spoczywać na pozostałej czaszce (<klasa mocna = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
		<li>Nałożyć fotoutwardzalny cement dentystyczny (patrz Tabela materiałów), aby pokryć włókno i. Czas reakcji do zestalenia kleju powinien być określony w instrukcji producenta (Nasz materiał wymaga ekspozycji na światło przez co najmniej 10 s z fotogeneratorem o określonej długości fali. Po tym nie ma potrzeby suszenia kleju).</li>
		<li>Na tym etapie upewnij się, że żadne materiały (śruba lub klej) nie zajmują miejsca montażowego elektrod. Ponadto należy unikać przerywania cementu dla tulejki łączącej się ze światłowodem i. Powtórz kroki 1.10.1-1.10.4 po przeciwnej stronie dla stymulacji obustronnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wywierć otwory na elektrody EEG/EMG. Włóż końcówki elektrod do otworów. Przytrzymaj implant i nałóż klej cyjanoakrylowy na przestrzeń między czaszką a elektrodami. Włóż ponownie, uważając, aby nie kolidować z żadnymi materiałami.</li>
	<li>Pokryj obwód elektrod i światłowodów klejem cyjanoakrylowym, a następnie nałóż na klej akcelerator cyjanoakrylowy. Ten krok pozwala uniknąć przerw w łączeniu tulejka-optyk i przewodu elektroda-przewód (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	nuta: Klej cyjanoakrylowy i jego przyspieszacz są szkodliwe dla oka myszy. Uważaj, aby nie spowodować rozlania tych substancji chemicznych. Należy również uważać, aby nie dotykać mocno elektrod i włókien, aby uniknąć nieoczekiwanego odchylenia bezpośrednio po zestaleniu kleju.</li>
	<li>Odsłoń mięśnie szyi myszy i włóż przewody elektrody EMG pod mięsień. Dostosuj długość elektrody EMG tak, aby znajdowała się tuż pod mięśniami karkowymi. Lekkie połączenie między końcówką elektrody a powięzią mięśniową wystarczy, aby złapać sygnał EMG.</li>
	<li>Nałożyć klej cyjanoakrylowy, aby wypełnić implanty i zestalić klej płynem przyspieszającym. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej w celu regeneracji, aż pojawi się odruch posturalny. Dostosuj temperaturę poduszki grzewczej do temperatury ciała spoczynkowego zwierzęcia (36.0 °C w ZT 0-12 w przypadku myszy C57BL6; nie przekraczaj 38.0 °C). 
	nuta: Antybiotyk nie jest wymagany do sterylnej operacji.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi analgezji pooperacyjnej. Trzymaj myszy w klatce domowej przez okres rekonwalescencji wynoszący co najmniej 7 dni.</li>
</ol>
2. Monitorowanie EEG/EMG z fotopobudzeniem docelowych neuronów w określonych stanach snu
UWAGA: Ten protokół obejmuje korzystanie z urządzeń laserowych klasy 3B lub urządzeń LED. Eksperymentatorzy powinni być świadomi informacji dotyczących bezpieczeństwa. Wymagane są okulary ochronne.
<ol>
	<li>Przed podłączeniem laserowego do światłowodu wyreguluj intensywność lasera za pomocą skalera. Przymocuj końcówkę laserowego do nieużywanego światłowodu za pomocą tulejki i upewnij się, że na styku światłowodu z nie ma miejsca.</li>
	<li>Włącz główny wyłącznik lasera i odczekaj 20 minut, aż się rozgrzeje.</li>
	<li>Wyślij laser do kontrolera intensywności i dostosuj intensywność lasera do 10 mW/mm2. Zmień tryb lasera na logikę tranzystorową i potwierdź, że impulsy świetlne są emitowane ze światłowodu sterowanego przez regulator wzoru, który jest ustawiony na 10 ms dla czasu trwania, 40 ms dla spoczynku, 20 razy dla cyklu i 20 razy powtórz (czyli 20 Hz z 10 ms impulsy świetlne przez 20 s).</li>
	<li>Po okresie rekonwalescencji przenieś myszy do komory eksperymentalnej w celu rejestracji EEG/EMG. Myszy domowe w stałej temperaturze 23 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności z pokarmem i wodą dostępnymi ad libitum.</li>
	<li>Podłącz wszczepioną elektrodę i adapter, które są przywiązane do pierścienia ślizgowego, aby uniknąć splątania. Zaleca się pokrycie złącza materiałem nieprzepuszczalnym dla światła, takim jak folia aluminiowa, aby zapobiec wyciekowi lasera. Jeśli wymagany jest eksperyment dwustronny, użyj pierścienia ślizgowego z rozwidlonym mocowaniem do.</li>
	<li>W tym protokole oceniamy opóźnienie do czuwania ze snu NREM lub snu REM, więc czas nagrywania powinien być ograniczony w zoptymalizowanym czasie zeitgeber (ZT0 definiuje się jako czas, w którym światło jest włączone). Protokół ten został przeprowadzony pomiędzy ZT4 - ZT10. Pozwól myszom swobodnie przebywać w komorze doświadczalnej przez co najmniej 1 godzinę w ramach aklimatyzacji.</li>
	<li>W okresie eksperymentalnym monitoruj sygnały EEG i EMG na tym samym monitorze i oceń stan myszy jako czuwanie, sen NREM lub sen REM. Użyj kontroli wzmocnienia dla każdej fali, aby ułatwić rozróżnienie każdego stanu.</li>
	<li>W celu pomiaru opóźnienia snu do czuwania NREM obserwuj stabilny sen NREM przez 40 s lub stabilny sen REM przez 30 s, a następnie włącz przełącznik generatora wzorców do fotostymulacji (protokół ten generuje 20 Hz z 10 ms impulsów świetlnych przez 20 s). Potwierdź emisję lasera do wszczepionych światłowodów.</li>
	<li>Rejestruj sygnały EEG/EMG, dopóki stan snu nie zmieni się w stan czuwania. Jeśli potrzebne są dwa lub więcej badań eksperymentalnych, ogranicz manipulację optogenetyczną do jednego dziennie, ponieważ fotostymulacja jest sztuczną interwencją, która może wpływać na architekturę snu / czuwania.</li>
	<li>Po eksperymencie należy przeprowadzić głębokie znieczulenie i perfuzję sterylną solą fizjologiczną i paraformaldehydem (PFA) w celu pobrania próbki całego mózgu do analizy immunohistochemicznej26.</li>
</ol>
3. Analiza czasu opóźnienia od snu NREM do czuwania
<ol>
	<li>Po zarejestrowaniu sygnałów EEG/EMG prześlij dane sygnału do komputera w celu oceny stanów snu/czuwania. Protokół ten opisuje metodę analizy EEG za pomocą oprogramowania rejestrującego (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Uruchom aplikację do podpisywania uśpienia i kliknij kartę Plik i wybierz opcję Otwórz, aby wybrać zarejestrowane dane (plik .kcd). Kliknij kartę Uśpienie, aby wybrać Czas epoki, aby dostosować okno czasowe dla każdej epoki (używamy 1 epoki/4 sekundy).</li>
	<li>Ręczna ocena stanów snu/czuwania na podstawie sygnałów EEG/EMG, według następujących kryteriów: czuwanie, wysokie napięcie EMG i niskie napięcie EEG o wysokiej częstotliwości; NREM, niski ton EMG i wysokie napięcie EEG o wysokiej częstotliwości δ (0,5-4 Hz); i REM, EMG wskazuje na atonię mięśniową i niskie napięcie EEG o wysokiej częstotliwości θ (6-9 Hz). Stan, który nie trwa nieprzerwanie przez 16 s (tj. 4 epoki), nie jest definiowany jako zmiana stanu, ponieważ nie jest stanem stabilnym.</li>
	<li>Kliknij i przytrzymaj lewy przycisk myszy na pierwszej epoce i przeciągnij kursor, aż określony trend dłuższy niż 16 s (4 epoki) zostanie zakończony. Następnie zwolnij lewy przycisk myszy i wybierz odpowiedni stan (czuwanie lub sen NREM lub sen REM) w wyskakującym okienku. Powtórz tę procedurę, aby ocenić wszystkie sygnały EEG/EMG zarejestrowane w pliku.</li>
	<li>Znajdź dokładny czas stymulacji w epoce, w której EEG pokazuje sen NREM lub REM, oraz epokę pokazującą przejście stanu po punkcie stymulacji. Policz liczbę epok między okresami tuż po stymulacji i tuż przed przejściem stanu.</li>
	<li>Potem pomnóż policzoną liczbę epok przez 4 s (A). W epoce stymulacji zrób zrzut ekranu i zmierz szerokość między punktem stymulacji a końcem epoki. Następnie podziel zmierzoną długość przez całą długość epoki i pomnóż przez 4 s (B). Podobnie oblicz czas trwania snu NREM w epoce zmiany stanu, co oznacza czas między początkiem epoki a punktem zmiany stanu (C).</li>
	<li>Suma A, B i C, aby uzyskać opóźnienie od snu NREM do czuwania. Ta sama procedura jest stosowana do analizy przejścia stanu ze snu REM do czuwania.</li>
</ol>

<ol><li>Spoormaker, V. I., Montgomery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+sleep+in+post-traumatic+stress+disorder%3A+Secondary+symptom+or+core+feature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?</a> Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).</li>
<li>Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+slow+wave+sleep+and+reduced+stage+2+sleep+in+children+depending+on+exercise+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity.</a> Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).</li>
<li>Mellman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+and+anxiety+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Sleep and anxiety disorders.</a> Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).</li>
<li>Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+of+wakefulness+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry of wakefulness and sleep.</a> Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).</li>
<li>Chemelli, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narcolepsy+in+orexin+knockout+mice%3A+Molecular+genetics+of+sleep+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation.</a> Cell. 98 (4), 437-451 (1999).</li>
<li>Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-process+model+of+sleep+regulation%3A+A+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sleep+Research%22%5BJournal%5D)">The two-process model of sleep regulation: A reappraisal.</a> Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).</li>
<li>Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+human+sleep%3A+recovery+process+gated+by+a+circadian+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).</li>
<li>Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic%2C+circadian%2C+and+emotional+regulation+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep.</a> Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).</li>
<li>Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+state+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sleep state switching.</a> Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuits+for+fear+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuits for fear and anxiety.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).</li>
<li>Lebow, M. A., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overshadowed+by+the+amygdala%3A+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+emerges+as+key+to+psychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders.</a> Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+migration+and+proliferation+of+intermediate+progenitors+of+GABAergic+neurons+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon.</a> Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+wakefulness+and+arousal%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Shining light on wakefulness and arousal.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).</li>
<li>Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+hypocretin-mediated+sleep-to-wake+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).</li>
<li>Weber, F., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit-based+interrogation+of+sleep+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Circuit-based interrogation of sleep control.</a> Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).</li>
<li>Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+REM+sleep+by+ventral+medulla+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons.</a> Nature. 526, 435-438 (2015).</li>
<li>Oishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-wave+sleep+is+controlled+by+a+subset+of+nucleus+accumbens+core+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer%3A+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).</li>
<li>Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+optogenetics+with+complementary+methodologies+in+systems+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).</li>
<li>Saito, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+the+preoptic+area+send+direct+inhibitory+projections+to+orexin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).</li>
<li>Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).</li>
<li>Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+of+GABAergic+neurons+in+the+bed+nucleus+of+the+stria+terminalis+triggers+immediate+transition+from+non-rapid+eye+movement+sleep+to+wakefulness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice.</a> Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).</li>
<li>Lin, F., Pichard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLin%2C+F+%22Handbook+of+practical+immunohistochemistry%3A+frequently+asked+questions%22">Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+neurons%3A+tools%2C+applications%2C+and+experimental+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints.</a> Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).</li>
</ol>

Projekt ten był częściowo wspierany finansowo przez firmę Merck & Co.

Przedstawiono metodę oceny wpływu optogenetycznej stymulacji neuronów o określonych tożsamościach chemicznych na przejścia stanów snu i czuwania oraz podaliśmy przykład manipulacji neuronamiGABA BNST . Nasze dane wykazały, że optogenetyczne pobudzenie neuronów GABABNST powoduje natychmiastowe przejście ze snu NREM do czuwania.
Dostępne są różne projekty eksperymentalne ze względu na rozwój wielu rodzajów narzędzi optogenetycznych. Możliwe jest aktywowanie lub hamowanie ak...

Sen jest niezbędny dla optymalnych funkcji poznawczych. Ostatnie odkrycia sugerują również, że zaburzenia snu są związane z szerokim zakresem chorób1,2,3. Chociaż funkcje snu są jeszcze w dużej mierze nierozwiązane, ostatnio poczyniono znaczne postępy w zrozumieniu obwodów i mechanizmów neuronalnych, które kontrolują stany snu/czuwania4. U ssaków występują trzy stany czujności: czuwanie, sen bez szybkich ruchów gałek ocznych (NREM) i sen z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM). Czuwanie charakteryzuje się szybkimi oscylacjami EEG (5-12 Hz) o niskiej amplitudzie z celową i utrzymującą się aktywnością motoryczną. Sen NREM definiowany jest przez powolne oscylacje (1-4 Hz) o dużej amplitudzie (fale delta), z brakiem świadomości i celową aktywnością motoryczną. Sen REM charakteryzuje się stosunkowo szybkimi oscylacjami (6-12 Hz) o niskiej amplitudzie i prawie całkowitą obustronną atonią mięśniową5.
Borbely zaproponował teorię regulacji snu i czuwania, znaną jako model dwóch procesów6,7. Proces homeostatyczny, określany również jako proces S, reprezentuje ciśnienie snu, które gromadzi się podczas czuwania i rozprasza się podczas snu. Inny proces, określany jako proces C, jest procesem okołodobowym, co wyjaśnia, dlaczego poziom czujności zmienia się w cyklu 24-godzinnym. Oprócz tych dwóch procesów, czynniki allostatyczne są również ważne dla regulacji snu/czuwania8,9. Czynniki allostatyczne obejmują stany odżywcze i emocje. Strachowi i lękowi zwykle towarzyszy wzrost pobudzenia wraz z reakcjami autonomicznymi i neuroendokrynnymi10,11,12. Uważa się, że układ limbiczny odgrywa rolę w regulacji strachu i lęku, a mechanizmy leżące u podstaw reakcji autonomicznych i neuroendokrynnych zostały szeroko zbadane, ale ścieżka, za pomocą której układ limbiczny wpływa na stany snu / czuwania, nie została jeszcze ujawniona. Wiele ostatnich badań z wykorzystaniem optogenetyki i farmakogenetyki sugeruje, że neurony i obwody neuronalne, które regulują stany snu / czuwania, są rozmieszczone w całym mózgu, w tym w korze mózgowia, podstawie przodomózgowia, wzgórzu, podwzgórzu i pniu mózgu. W szczególności ostatnie postępy w optogenetyce pozwoliły nam stymulować lub hamować określone obwody neuronalne invivo z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technika ta pozwoli na postęp w naszym zrozumieniu neuronalnych substratów snu i czuwania oraz tego, jak stany snu/czuwania są regulowane przez procesy okołodobowe, ciśnienie snu i czynniki allostatyczne, w tym emocje. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie, w jaki sposób można wykorzystać manipulację optogenetyczną w połączeniu z rejestracją snu i czuwania, co może potencjalnie zaktualizować naszą wiedzę na temat konektomów i mechanizmów w mózgu, które odgrywają rolę w regulacji snu NREM, snu REM i czuwania. Zrozumienie tego mechanizmu, za pomocą którego układ limbiczny reguluje stany snu/czuwania, ma ogromne znaczenie dla zdrowia, ponieważ bezsenność zwykle wiąże się z lękiem lub strachem przed niemożnością zaśnięcia (somnifobia).
Uważa się, że BNST odgrywa istotną rolę w stanach lęku i strachu. Neurony GABA-ergiczne wykazujące ekspresję 67 są główną populacją klasy BNST12,13. Zbadaliśmy wpływ manipulacji optogenetycznej tych neuronów (GABABNST) na stany snu / czuwania. Jednym z największych postępów w neurobiologii w ostatnich latach są metody, które umożliwiają manipulowanie neuronami o określonych tożsamościach chemicznych in vivo, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Optogenetyka jest bardzo przydatna do wykazywania związków przyczynowo-skutkowych między aktywnością neuronalną a określonymi reakcjami behawioralnymi14. Opisujemy optogenetykę jako metodę badania funkcjonalnej łączności zdefiniowanych obwodów neuronalnych w regulacji stanów snu / czuwania. Dzięki zastosowaniu tej techniki osiągnięto ogromny postęp w zrozumieniu obwodów neuronalnych, które regulują stany snu/czuwania15,16,17,18,19. W wielu przypadkach opsyny są specyficznie wprowadzane do neuronów o określonej tożsamości chemicznej w selektywnych regionach mózgu przez kombinację myszy z czynnikiem Cre i indukowanego przez Cre transferu genów za pośrednictwem AAV. Ponadto ogniskowa ekspresja światłoczułych opsyn, takich jak rodopsyna kanałowa 2 (ChR2)20 lub archaerodopsyna (ArchT)21 w połączeniu z systemem Cre-loxP lub Flp-FRT pozwala nam manipulować selektywną populacją neuronów i specyficzną ścieżką neuronalną22.
Opisujemy tutaj eksperymenty na neuronach GABA-ergicznych w BNST jako przykład. Do ekspresji opsyn w wyznaczonej populacji neuronalnej najczęściej stosuje się odpowiednie myszy kierujące Cre i wektory wirusa zależne od Cre. Przydatne są również linie transgeniczne lub knock-in, w których opsyny ulegają ekspresji w określonych populacjach neuronów. W poniższych eksperymentach użyliśmy GAD67-Cre knock-in myszy23, w których tylko neurony GABAergiczne wyrażają rekombinazę Cre z tłem genetycznym C57BL / 6J oraz wektora AAV, który zawiera ChR2 (hChR2 H134R) połączonego z EYFP lub EYFP jako kontrolę z przełącznikiem "FLEx (Flip-excision)" 24. Procedura szczegółowo opisuje optogenetyczne pobudzenie neuronów GABA-ergicznych w BNST podczas monitorowania stanów snu/czuwania25.

<table><tbody><tr><td>Światłowodowe złącza obrotowe 1x1</td><td>Doric</td><td>FRJ 1x1 FC-FC</td><td>dla optogenetyki</td></tr><tr><td>6-pinowe złącze</td><td>header KEL corporation</td><td>DSP02-006-431G</td><td></td></tr><tr><td>Gniazdo 6-pin</td><td>Hirose</td><td>21602X3GSE</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP</td><td></td><td></td><td>3,70 razy; 1013(kopie genomowe/ml)</td></tr><tr><td>AAV10-EF1a-DIO-EYFP</td><td></td><td></td><td>5,82&razy; 1013(kopie genomowe/ml)</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Fuji film</td><td>014-23302</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Nippon koden</td><td>N/A</td><td>do zapisu EEG/EMG</td></tr><tr><td>Parownik anestezjologiczny</td><td>Muromachi</td><td>MK-AT-210D</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny wtryskiwacz</td><td>KD scientific</td><td>780311</td><td></td></tr><tr><td>Frez z węglika spiekanego</td><td>Minitor</td><td>B1055</td><td>&phi; 0,7 mm. Określany jako wiertło dentystyczne, używane z mikrosilnikiem obrotowym o dużej prędkości&nbsp;</td></tr><tr><td>Przyczepność cyjanoakrylowa&nbsp; (Aron alpha A) i przyspieszenie</td><td>Konishi</td><td>#30533</td><td></td></tr><tr><td>Lampa do utwardzania zębów</td><td>3M</td><td>Elipar S10</td><td></td></tr><tr><td>Klej epoksydowy</td><td>Konishi</td><td>#04888</td><td>izolacja wokół lutu 6-pinowego i ekranowanego</td></tr><tr><td>Patchcord światłowodowy (rozgałęziony)</td><td>Doric</td><td>BFP(#)_50/125/900-0.22</td><td></td></tr><tr><td>Gad67-Cre myszy</td><td>dostarczone przez dr Kenji Sakimura</td><td></td><td>Gen rekombinazy Cre jest wbity w allel Gad67</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamiltona</td><td>Hamilton</td><td>65461-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw mikrosilnika obrotowego o dużej prędkości</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Używany z frezem z węglika spiekanego</td></tr><tr><td>Tuleja łącząca</td><td>Thorlab</td><td>ADAF1</td><td>&phi; Ceramika 2,5 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td>871119</td><td></td></tr><tr><td>Laser&nbsp; &nbsp;</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>N/A Długość</td><td>fali 473 nm</td></tr><tr><td>Laserowy kontroler intensywności</td><td>COHERENT</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator laserowy</td> Bio <td>centrum badawcze</td><td>STO2</td><td>określany jako generator impulsów w tekście</td></tr><tr><td>Światłowód z tulejką&nbsp;</td><td>Thorlab</td><td>FP200URT-CANNULA-SP-JP</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2-rh10</td><td>dostarczony przez PennVector Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>Addgene</td><td>plasimid # 20296</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA</td><td>dostarczony przez Dr. Karla Deisserotha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>krosowy</td><td>Doric</td><td>D202-9089-0,4</td><td>Długość 0,4 m, przewodnik laserowy między laserem i złącze obrotowe</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotoutwardzalny cement dentystyczny</td><td>3M</td><td>56846</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk Serafin</td><td>Stoelting</td><td>52120-43P</td><td></td></tr><tr><td>ekranowany</td><td>mogami</td><td>W2780</td><td>do gniazda 6-pin do zapisu EEG/EMG</td></tr><tr><td>Komora do nagrywania snu</td><td>Nie</td><td></td> <td>dotyczy Nie dotyczyWykonany na zamówienie (21 cm i razy 29 cm i razy 19 cm) z uchwytem na zbiornik na wodę</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do znaków snu</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/</td><td>A do analizy EEG/EMG</td></tr><tr><td>Pierścień ślizgowy</td><td>neuroscience, inc</td><td>N/A</td><td>do analizy EEG/EMG</td></tr><tr><td>Śruba ze stali nierdzewnej</td><td>Yamazaki</td><td>N/A</td><td>&phi; 1,0 x 2,0</td></tr><tr><td>Drut ze stali nierdzewnej</td><td>Drut Cooner</td><td>AS633</td><td>&nbsp; Ramka stereotaktyczna o średnicy 0,0130</td></tr><tr><td>cala z konsolą cyfrową</td><td>Koph</td><td>N/A</td><td>Model 940</td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie rejestratora Vital</td><td>KISSEI COMTEC</td><td>N/A</td><td>do zapisu EEG/EMG</td></tr></tbody></table>

manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

W ostatnich latach optogenetyka była szeroko stosowana w wielu dziedzinach badań neuronaukowych. W wielu przypadkach opsyna, taka jak rodopsyna kanałowa 2 (ChR2), ulega ekspresji przez wektor wirusowy w określonym typie komórek neuronalnych u różnych myszy z napędem Cre. Aktywacja tych opsyn jest wyzwalana przez zastosowanie impulsów świetlnych, które są dostarczane przez laser lub diodę LED przez optyczne, a efekt aktywacji jest obserwowany z bardzo wysoką rozdzielczością czasową. Eksperymentatorzy są w stanie ostro stymulować neurony podczas monitorowania zachowania lub innego wyniku fizjologicznego u myszy. Optogenetyka może umożliwić użyteczne strategie oceny funkcji obwodów neuronalnych w regulacji stanów snu/czuwania u myszy. Tutaj opisujemy technikę badania wpływu manipulacji optogenetycznej neuronów o określonej tożsamości chemicznej podczas monitorowania elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG) w celu oceny fazy snu myszy. Jako przykład opisujemy manipulację neuronami GABA-ergicznymi w jądrze łożyska prążka końcowego (BNST). Ostre pobudzenie optogenetyczne tych neuronów powoduje szybkie przejście do czuwania, gdy jest stosowane podczas snu NREM. Manipulacje optogenetyczne wraz z zapisem EEG/EMG mogą być stosowane do rozszyfrowania obwodów neuronalnych, które regulują stany snu/czuwania.

Niniejsze badanie wykazało wpływ optogenetycznej stymulacji neuronów GABABNST na przejścia między stanami snu. ChR2-EYFP wykazano ogniskowo w neuronach GABA w BNST. Histochemiczne badanie hybrydyzacji in situ wykazało kolokalizację ChR2-EYFP w neuronach wykazujących sygnały mRNA GAD 67, co wskazuje, że są to neurony GABAergiczne. Immunohistochemiczne próbki skrawków potwierdziły położenie włókna optycznego, którego końcówka znajdowała się bezpośrednio nad BNST...

Tutaj opisujemy metody optogenetycznej manipulacji poszczególnych typów neuronów podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy, przedstawiając jako przykład naszą niedawną pracę nad jądrem łożyska prążka końcowego.

Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Ta procedura może pomóc nam zidentyfikować funkcję określonych obwodów nerwowych, które są zaangażowane w regulację snu i czuwania, przy mniej inwazyjnej manipulacji i wysokiej rozdzielczości czasowej. Metoda ta pozwala nam monitorować powierzchnię EEG w czasie rzeczywistym w połączeniu z manipulacją określonym obwodem nerwowym w celu zbadania związku przyczynowego między obwodami a stanami czuwania podczas snu. Shota Kodani zamierza zademonstrować tę procedurę.Po potwierdzeniu braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi nałóż maść na oczy zwierzęcia i użyj pasków do uszu i szpilki do nosa do aparatu stereotaktycznego, aby ustabilizować głowę znieczulonej myszy na podkładce chłonnej. Gdy głowa jest unieruchomiona na miejscu, wykonaj nacięcie w połowie strzałki na skórze głowy, aby potwierdzić, że przecięcie między szwem strzałkowym a szwem koronalnym lub szwem lambdoidea znajduje się w linii poziomej na tym samym poziomie. Aby uniknąć luki pozycjonującej, w razie potrzeby wyreguluj zacisk nosa i nauszniki.Następnie, za pomocą klamer serafinowych, aby utrzymać skórę otwartą, zdezynfekuj odsłoniętą powierzchnię czaszki, aby umożliwić wyraźniejsze uwidocznienie szwów czaszkowych. Aby wstrzyknąć wektor wirusa związanego z adenowirusem, załaduj 10-mililitrową strzykawkę sterylizowaną etanolem z dwoma mikrolitrami oleju mineralnego, a następnie eksperymentalną objętość wirusa do wstrzyknięcia. Za pomocą pompki do mikroiniekcji wyregulować końcówkę igły do mikroiniekcji na bregmie i zanotować współrzędne jako punkt początkowy.Następnie przesunąć końcówkę do wyznaczonego miejsca wstrzyknięcia i umieścić końcówkę igły w tym miejscu. Zaznacz czaszkę w miejscu wstrzyknięcia i użyj wiertła dentystycznego wyposażonego w frez z węglika spiekanego o średnicy 0,7 milimetra, aby wywiercić otwór o średnicy około dwóch milimetrów w czaszce. Po usunięciu krwi z okolic otworu za pomocą wacika, powoli przesuwaj igłę do jądra łożyska prążka końcowego lub BSNT i powoli wstrzykuj wyznaczoną objętość roztworu wirusa.Następnie pozostaw igłę na miejscu na pięć minut, aby roztwór wystarczająco nacieknął tkankę BNST przed ostrożnym wycofaniem igły. W przypadku elektroencefalogramu lub EEG i elektromiogramu lub EMG, implantacji elektrod, najpierw dwa druty ze stali nierdzewnej, z których usunięto jeden milimetr izolacji z obu końców, do elektrod EMG i umieść środek elektrod na bregmie. Następnie zaznacz położenie każdej elektrody EEG.Aby określić położenie implantu światłowodowego, przymocuj tuleję światłowodową do manipulatora i obróć ramię manipulatora pod kątem plus minus 30 stopni względem linii poziomej. Połóż końcówkę światłowodu na bregmie i zapisz współrzędne. Przesuń końcówkę do docelowej linii wprowadzania i zaznacz pozycję na czaszce oraz pozycję kotwiącej obok miejsca włożenia.Użyj wiertła dentystycznego, aby wywiercić czaszkę w każdym miejscu i użyj manipulatora, aby delikatnie wprowadzić światłowód, aż sięgnie powyżej BNST. Skuwka powinna spoczywać na pozostałej czaszce. Przymocuj włókno do czaszki za pomocą kotwiącej, uważając, aby nie złamać opony twardej ani nie uszkodzić żadnej tkanki.Następnie przykryj włókno i przykręć fotoutwardzalnym cementem dentystycznym. Następnie wywierć otwory na elektrody EEG/EMG i włóż końcówkę pierwszej elektrody do jednego otworu. Trzymając implant jedną ręką, nałóż klej cyjanoakrylowy na przestrzeń między czaszką a elektrodą i włóż elektrodę do końca, uważając, aby nie uszkodzić żadnej tkanki.Po umieszczeniu wszystkich elektrod należy pokryć obwód elektrod i światłowodów dodatkowym klejem cyjanoakrylowym i przyspieszaczem cyjanoakrylanu, aby uniknąć powodowania przerw w strefach łączenia tulejki z optycznym i elektrody z przewodem ołowianym. Teraz odsłoń mięśnie szyi i włóż przewody elektrody EMG pod mięsień. Dostosuj długość elektrody EMG tak, aby zmieściła się tuż pod mięśniami karkowymi i wypełnij implanty większą ilością kleju cyjanoakrylowego i przyspieszacza.Następnie umieść mysz na podkładce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnej rekompensaty. Do monitorowania EEG/EMG podczas fotowzbudzenia docelowych neuronów, najpierw użyj skalara do regulacji intensywności lasera i użyj skuwki, aby przywiązać końcówkę laserowego do nieużywanego światłowodu. Upewnij się, że na styku między światłowodem a nie ma miejsca.Po 20 minutach wyemituj rozgrzany laser do kontrolera intensywności i dostosuj intensywność do 10 miliwatów na milimetr kwadratowy. Ustaw czas trwania impulsu świetlnego na 10 milisekund, okres odpoczynku na 40 milisekund, cykl na 20, a powtarzanie na 20. Zmień tryb lasera na logikę tranzystorową i potwierdź, że impulsy świetlne są emitowane ze światłowodu sterowanego przez regulator wzoru.Podłącz wszczepioną elektrodę i adapter, a następnie zakryj złącze materiałem nieprzepuszczalnym dla światła, aby zapobiec wyciekowi lasera. A kiedy laser będzie gotowy, przenieś myszy do komory eksperymentalnej w celu rejestracji EEG/EMG. Aby ocenić opóźnienie do czuwania spowodowane nieszybkimi ruchami gałek ocznych lub snem z szybkimi ruchami gałek ocznych, ogranicz czas nagrywania i zoptymalizuj czas przyrostu miejsca i pozwól myszom swobodnie poruszać się w komorze eksperymentalnej przez co najmniej godzinę.W okresie eksperymentalnym monitoruj sygnały EEG i EMG na tym samym ekranie rejestracji. Oceń stan myszy jako stan czuwania, sen bez szybkich ruchów gałek ocznych lub sen z szybkimi ruchami gałek ocznych, używając regulatora wzmocnienia dla każdej fali, aby ułatwić rozróżnienie każdego stanu. Aby zmierzyć opóźnienie snu bez szybkich ruchów gałek ocznych do czuwania, obserwuj stabilny sen bez szybkich ruchów gałek ocznych przez 40 sekund, a następnie włącz generator wzorców do stymulacji fotograficznej i potwierdź emisję lasera do wszczepionych światłowodów.Następnie rejestruj sygnały EEG/EMG do momentu, gdy stan snu zmieni się w stan czuwania. Poniżej przedstawiono ślady EEG/EMG przed i po fotostymulacji podczas snu bez szybkich ruchów gałek ocznych. EEG o wysokim napięciu i niskiej częstotliwości bez sygnałów EMG reprezentuje sen bez szybkich ruchów gałek ocznych.Stymulacja fotograficzna wywołała ostre przejście do stanu czuwania około dwie sekundy po stymulacji u myszy z ekspresją rodopsyny-2, podczas gdy myszy kontrolne nie wykazywały tego przejścia, co sugeruje, że pobudzenie neuronów BNST GABA podczas snu bez szybkich ruchów gałek ocznych wyzwala szybką indukcję czuwania. I odwrotnie, stymulacja fotograficzna podczas snu z szybkimi ruchami gałek ocznych nie miała żadnego wpływu, więc efekt przejścia pojawił się tylko w śnie bez szybkich ruchów gałek ocznych. Ważne jest, aby zadbać o precyzyjną koordynację etapów iniekcji wirusa i implantacji światłowodu.Ślady EEG/EMG uchwycone podczas analizy snu mogą być wykorzystane do oceny konsekwencji manipulacji zdjęciami na różne stany czujności u myszy. Technika ta pomoże nam również zidentyfikować inne komponenty i obwody zaangażowane w regulację stanów snu i czuwania. Używaj okularów ochronnych, aby uniknąć uszkodzenia oka przez laser i pamiętaj, aby po użyciu zawsze sterylizować w autoklawie pojemnik z wektorem wirusa związanego z adeno.

optogenetic-manipulation-neural-circuits-during-monitoring

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Źródło: Kodani, S., et.al. Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronalnych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje optogenetyczną manipulację obwodami neuronalnymi zaangażowanymi w przejście ze snu do czuwania u myszy. Zabieg polega na chirurgicznym wszczepieniu światłowodu i elektrod do mózgu i mięśni, aby umożliwić stymulację światłem i zapis elektrofizjologiczny. Dostarczając światło w celu aktywacji światłoczułych kanałów kationowych w...

Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronowych w celu przejścia ze snu do czuwania u myszy

Ten film demonstruje protokół modulacji oscylacji theta w genetycznie zmodyfikowanym modelu myszy z światłoczułymi kanałami jonowymi w neuronach przegrody przyśrodkowej GABA-ergiczne. Dostarczając impulsy świetlne do hipokampa, protokół ma na celu synchronizację aktywności neuronalnej i generowanie oscylacji theta, które są rejestrowane jako lokalne potencjały pola.

Selektywna manipulacja oscylacjami theta w modelu mysim

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Zapis elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG) u swobodnie zachowujących się myszy jest kluczowym krokiem do skorelowania zachowania i fizjologii ze snem i czuwaniem. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny zapewnia przewodowy system do pozyskiwania zapisów EEG i EMG u myszy.

Procedura rejestracji poligraficznej do pomiaru snu u myszy

Tutaj prezentujemy eksperymentalne i analityczne procedury opisujące dynamikę czasową zmiennych neuronalnych i sercowych snu nie-REM u myszy, które modulują reakcję snu na bodźce akustyczne.

Kwantyfikacja dynamiki mocy widmowej i tętna w podczerwieni u śpiących myszy

Opisujemy użycie optogenetyki i zapisów elektrofizjologicznych do selektywnych manipulacji oscylacjami theta hipokampa (5-10 Hz) u zachowujących się myszy. Skuteczność porywania rytmu jest monitorowana za pomocą lokalnego potencjału pola. Połączenie inhibicji opto- i farmakogenetycznej rozwiązuje eferentny odczyt synchronizacji hipokampa.

Optogenetyczne porywanie oscylacji theta hipokampa u zachowujących się myszy

Opisujemy wysokoprzepustową metodę pomiaru snu za pomocą monitorowania w domowej klatce opartej na aktywności. Ta metoda ma przewagę nad tradycyjnymi metodami opartymi na EEG. Jest dobrze zwalidowany do określania całkowitego czasu trwania snu i może być potężnym narzędziem do monitorowania snu w modelach chorób ludzkich u gryzoni.

Nieinwazyjne, wysokoprzepustowe określanie czasu trwania snu u gryzoni

Ta praca wprowadza metodę niezawodnego wykonywania optogenetycznego zapisu pojedynczej jednostki z obudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody.

Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Ten artykuł opisuje protokół do manipulowania celami molekularnymi w korze mózgowej za pomocą wirusów związanych z adenowirusami oraz do monitorowania efektów tej manipulacji podczas czuwania i snu za pomocą zapisów elektrokortykograficznych.

Zapis elektrokortykograficzny obszarów kory mózgowej manipulowanych za pomocą wirusa związanego z adenowirusem skierowanym przeciwko kofilinie u myszy

Poznaj metodę optogenetycznej manipulacji obwodami nerwowymi podczas monitorowania stanów snu i czuwania u myszy. Technika ta umożliwia badanie przyczynowych związków między aktywnością neuronów BNST a regulacją snu.

Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

Przeglądaj więcej filmów