Name: Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj techniki fluorymetryczne do oceny integralności błon plemników przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Te metody umożliwiają precyzyjną analizę potencjału zapłodnienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować izraelskiej firmie "SION" zajmującej się sztucznym zapłodnieniem i hodowlą (Hafetz-Haim, Izrael) za pomoc i współpracę, a także Pani Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Francja) za pomoc w konfiguracji i szkoleniu instrumentu.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z izraelskimi wytycznymi z 1994 roku dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Nasienie bydlęce zostało dostarczone przez komercyjną firmę izraelską do sztucznego zapłodnienia i hodowli. W tym badaniu oceniano wytryski 11 buhajów.
1. Przygotowanie próbki nasienia
UWAGA: Procedura jest oparta na protokole laboratorium Roth1,3.
<ol>
	<li>Uzyskaj około 1–6 ml nasienia buhaja w probówce o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do każdego 1 ml nasienia dodać 6 ml wstępnie podgrzanego (w temperaturze 37 °C) buforu NKM (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MOPS [kwas 3-N-morfilino-propanosulfonowy; pH 7,4]) i wirować przez 8 minut przy 600 x g, 1–2 razy, aż supernatant będzie klarowny. 
	UWAGA: Jeśli stężenie plemników lub objętość początkowa są bardzo wysokie, podziel je na dwie rurki przy pierwszym praniu.</li>
	<li>Natychmiast usunąć i wyrzucić klarowny supernatant oraz pozostawić około 1 cm supernatantu nad osadem.</li>
	<li>Ostrożnie pochyl rurki pod kątem 30°, aby zwiększyć powierzchnię, na której plemniki mogą podpłynąć i odczekaj 20–30 minut, aby plemniki mogły podpłynąć w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Widać zmętnienie.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety ostrożnie usunąć górny 1 ml supernatantu zawierającego ruchliwe plemniki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Utrzymuj plemniki w temperaturze 37 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Oszacuj liczbę plemników za pomocą hemocytometru Neubauera. 
	UWAGA: Zamiast tego można użyć innej komory liczącej, ale liczenie jest inne.
	<ol>
		<li>Aby zapobiec przemieszczaniu się plemników, rozcieńczyć 100 μl ruchliwych plemników w 10 ml podwójnie destylowanej wody (DDW) (rozcieńczenie 1:100) w probówce o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszać.</li>
		<li>Załadować po 10 μl próbki z każdej strony hemocytometru i szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że nie tworzysz się pęcherzyków wewnątrz komory, ponieważ może to spowodować niedokładną liczbę plemników.</li>
		<li>Obserwuj pod mikroskopem złożonym z obiektywem 20x. 
		UWAGA: Pełna siatka na hemocytometrze zawiera 9 dużych kwadratów, każdy o wielkości 1 mm2, a szkło nakrywkowe spoczywa 0,1 mm nad podłogą komory. W ten sposób objętość w centralnym obszarze zliczania wynosi 0,1 mm3 lub 0,1 μl. Centralny obszar hemocytometru zawiera 25 średnich kwadratów, a każdy średni kwadrat ma 16 mniejszych kwadratów z pojedynczymi liniami.</li>
		<li>Policz całkowitą liczbę komórek znajdujących się w 4 średnich kwadratach narożnych i kwadracie środkowym. Aby uzyskać większą precyzję, policz dwie komory (obie strony hemocytometru Neubauera) i użyj średniej do obliczenia stężenia komórek.</li>
		<li>Obliczyć liczbę plemników, mnożąc otrzymaną średnią liczbę przez 5 (aby uzyskać liczbę komórek na obszarze zliczania) i przez 10 000 (aby uzyskać liczbę komórek na 1 ml rozcieńczonej próbki). Następnie pomnóż otrzymaną liczbę przez współczynnik rozcieńczenia (1:100). 
		UWAGA: Na przykład średnia liczba plemników zliczonych w 5 z 25 średnich kwadratów w centralnym obszarze zliczania dwóch komór wynosi 150 ([152+148]/2). Zatem średnia liczba plemników w komorze (lub na 0,1 μl) wynosi 150 x 5 = 750. Pomnóż liczbę 750 przez 10 000, aby uzyskać liczbę komórek na 1 ml rozcieńczonej próbki (7 500 000), a następnie pomnóż przez 100 (współczynnik rozcieńczenia), aby uzyskać 75 x 107 komórek na ml oryginalnej próbki nasienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Technika #1: Jednoczesna ocena błon plemników za pomocą wielu sond fluorescencyjnych
UWAGA: Błony plemników (plazma, akrosomalne i mitochondrialne) zostały ocenione zgodnie z wcześniejszym opisem Celeghini et al.10, z pewnymi modyfikacjami. Zastosowano mikroskopię epifluorescencyjną, połączoną z kamerą cyfrową o wzbudzeniu przy 450-490 nm i emisji przy 515-565 nm przy użyciu potrójnego filtra.
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,1 mg/ml roztworu podstawowego DAPI, rozpuszczając 5 mg DAPI w 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przygotować 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy PBS w stosunku 1:10 (roztwór roboczy; 10 μg/ml).</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml FITC-PSA, rozpuszczając 1 mg FITC-PSA w 1 ml PBS. Przygotować 50 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy PBS w stosunku 1:10 (roztwór roboczy; 100 μg/ml).</li>
		<li>Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego JC-1, rozpuszczając 1 mg JC-1 w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Przygotować 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy DMSO w stosunku 1:10 (roztwór roboczy; 0,1 mg/ml).</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy PI, rozpuszczając 10 mg PI w 400 μl PBS (co daje 2,5 mg/ml). Przechowywać w temperaturze +4 °C. Rozcieńczyć bulion 1 PBS w stosunku 1:20 (roztwór roboczy; 0,125 mg/ml). Przechowywać w temperaturze +4 °C w postaci roztworu podstawowego. 
		Uwaga: PI jest potencjalnym mutagenem i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Barwnik należy zutylizować w sposób bezpieczny i zgodny z obowiązującymi lokalnymi przepisami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś 133 μl ruchliwych plemników (krok 1.5) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml (25 x 106 plemników/ml). 
	UWAGA: Jeżeli stężenie próbki jest wyższe, rozcieńczyć ją w buforze NKM, aby osiągnąć wymagane stężenie; Jeżeli stężenie próbki typu swim up jest niższe, odwirować otrzymany supernatant po wypłynięciu w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut, usunąć 0,5 ml supernatantu i ponownie policzyć plemniki.</li>
	<li>Dodać 17 μl DAPI (roztworu roboczego) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Do osadu dodać 100 μL buforu NKM.</li>
	<li>Dodać 50 μl FITC-PSA, 2 μl JC-1 i 3 μl PI (roztworów roboczych) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Do osadu dodać 40 μl buforu NKM i ponownie zawiesić przez pipetowanie.</li>
	<li>Przenieść 10 μl próbki na szkiełko podstawowe, rozmazać i nakryć szkiełko.</li>
	<li>Natychmiastowa wizualizacja za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (użyj obiektywu 40x) z potrójnym filtrem, wyposażonym w kamerę cyfrową i uchwyć obraz osobno dla każdego filtra. 
	UWAGA: Nie ma znaczenia kolejność wizualizowanych filtrów.
	<ol>
		<li>Wizualizacja pod kanałem DAPI ze wzbudzeniem przy 358 nm i emisją przy 461 nm.</li>
		<li>Wizualizacja w kanale FITC dla zielonych monomerów o wzbudzeniu przy 450–490 nm i emisji przy 515–565 nm.</li>
		<li>Wizualizacja pod kanałem PI dla czerwonych agregatów o wzbudzeniu przy 488 nm i emisji przy 590 nm.</li>
		<li>Wizualizacja pod JC-1 czerwonych agregatów o wzbudzeniu przy 559 nm i emisji w zakresie 574–627 nm; Zielone monomery JC-1 o wzbudzeniu przy 488 nm i emisji w zakresie 500–535 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Scal trzy obrazy otrzymane z filtrów w formacie JPG/JPEG, korzystając z opcji "scal" w oprogramowaniu aparatu.</li>
	<li>Otwórz scalony obraz za pomocą narzędzia "Paint" i użyj opcji pędzla, aby oznaczyć zliczone plemniki.</li>
	<li>Klasyfikuj plemniki na podstawie fluorescencji emitowanej przez każdą sondę:
	<ol>
		<li>Ogólnie rzecz biorąc, oceniaj co najmniej 200 plemników na szkiełku - wszystkie komórki są niebieskie (DAPI).</li>
		<li>Oceń żywotność, licząc martwe komórki, które wydają się fioletowe (PI [czerwony] + DAPI [niebieski]) i oblicz procent martwych komórek (martwe komórki/całkowita liczba zliczonych komórek x 100).</li>
		<li>Oceń status akrosomów za pomocą wzorców barwienia fluorescencyjnego (FITC-PSA). Oblicz procenty różnych wzorców (nienaruszone, uszkodzone lub przereagowane komórki akrosomowe/całkowita liczba komórek x 100). 
		UWAGA: Uszkodzona błona akrosomalna wygląda jak w pełni wybarwiona, zielona czapeczka akrosomowa; przereagowana błona akrosomalna wykazuje szczątkowe zielone zabarwienie równikowe lub górne; Komórki zawierające nienaruszoną błonę akrosomalną nie będą wykazywać żadnego zielonego zabarwienia obszaru akrosomalnego.</li>
		<li>Oceń ΔΨm, rozróżniając plemniki o wysokim ΔΨm, które mają zabarwioną na czerwono część środkową, i plemniki o niskim ΔΨm, które wykazują zabarwioną na zielono część środkową. Policz osobno czerwone i zielone części środkowe i oblicz ich stosunek (czerwony/zielony).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Technika #2: Ocena błon plemników za pomocą gotowych do użycia zestawów i cytometrii przepływowej
UWAGA: Ocena integralności błony plazmatycznej, potencjału błony mitochondrialnej i integralności błony akrosomalnej została przeprowadzona za pomocą gotowych do użycia zestawów do cytometrii przepływowej zawierających liofilizowane fluorochromy w każdym dołku. Zabieg został wykonany zgodnie z zaleceniami producentów z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Ocena integralności błony plazmatycznej
	<ol>
		<li>Weź żądaną liczbę studzienek z opakowania zestawu żywotności i koncentracji (PI i SYbr14), przenieś je do podstawy roboczej i przykryj elastyczną pokrywką (chronić przed światłem).</li>
		<li>Dodać 199 μl buforowanego roztworu do cytometrii na studzienkę.</li>
		<li>Dodać 1 μl jednorodnego nasienia o wymiarach 57 x 106/ml (57 000 komórek na studzienkę) i homogenizować przez pipetowanie.</li>
		<li>Przykryj talerz czarną pokrywką.</li>
		<li>Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, chronić przed światłem.</li>
		<li>Przepuścić próbkę przez cytometr przepływowy z ustawieniem "żywotność".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potencjał błony mitochondrialnej
	<ol>
		<li>Weź żądaną liczbę studzienek z opakowania zestawu do aktywności mitochondrialnej (JC-1), przenieś je do podstawy roboczej i przykryj elastyczną pokrywką (chronić przed światłem).</li>
		<li>Dodać 10 μl absolutnego etanolu do studzienki i odpipetować w celu ponownego zawieszenia proszku znajdującego się w studzience.</li>
		<li>Dodać 190 μl PBS do dołka i homogenizować przez pipetowanie.</li>
		<li>Dodać 0,75 μl jednorodnego nasienia o wymiarach 57 x 106/ml (50 000 komórek na studzienkę) i homogenizować przez pipetowanie.</li>
		<li>Przykryj talerz czarną pokrywką.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Przepuścić próbkę przez cytometr przepływowy z ustawieniem "aktywność mitochondriów".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Integralność membrany akrosomalnej 
	UWAGA: Barwienie FITC-PSA (patrz Technika #1) umożliwia ocenę 3 kategorii akrosomów (nienaruszony akrosom, akrosom przereagowany i akrosom uszkodzony). Korzystając z cytometru przepływowego i zestawu żywotności i integralności akrosomów (PI i FITC-PNA), plemniki są rozdzielane na te 3 kategorie.
	<ol>
		<li>Weź żądaną liczbę studzienek z opakowania zestawu żywotności i integralności akrosomów, przenieś je do podstawy roboczej i przykryj elastyczną pokrywką (chronić przed światłem).</li>
		<li>Dodać 200 μl buforowanego roztworu do cytometrii na studzienkę.</li>
		<li>Dodać 0,7 μl jednorodnego nasienia o wymiarach 57 x 106/ml (40 000 komórek na studzienkę) i homogenizować przez pipetowanie.</li>
		<li>Przykryj talerz czarną pokrywką.</li>
		<li>Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C, chronić przed światłem.</li>
		<li>Przepuścić próbkę przez cytometr przepływowy z ustawieniem "InCyte".</li>
		<li>Przeanalizuj wynikowy histogram, bramkując trzy obszary markerów zgodnie z intensywnością fluorescencji, reprezentujące znikome, niskofluorescencyjne komórki z nienaruszonym, niebarwionym akrosomem (R1), komórki o niskiej fluorescencji z resztkową barwioną częścią akrosomu (R2) i wysoce fluorescencyjne komórki z zakłóconym akrosomem (R3). 
		UWAGA: Skorzystaj z sekcji "Analizowanie plików uzyskanych za pomocą innych modułów" w podręczniku użytkownika instrumentu, aby utworzyć trzy regiony (R1, R2, R3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Technika #3: Ocena błon plemników za pomocą sond fluorescencyjnych i cytometrii przepływowej
UWAGA: Użycie aneksyny V w połączeniu z fluorochromami PI umożliwia ocenę apoptozy i obliczenie proporcji apoptotycznych plemników (indeks apoptozy).
<ol>
	<li>Przygotować 1x bufor wiążący anektynę V z 20x roztworu podstawowego (rozcieńczyć 500 μl buforu wiążącego anekynę V, 20x roztwór podstawowy 9,5 ml sterylnej wody destylowanej).</li>
	<li>Oszacować liczbę plemników za pomocą hemocytometru Neubauera, jak opisano w punkcie 1.7.</li>
	<li>Przemyć 106 plemników w 1 ml 1x buforu wiążącego anektynę V i odwirować przy 300 x g przez 10 min.</li>
	<li>Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 100 μL 1x bufora wiążącego aneksynę V.</li>
	<li>Dodać 10 μl aneksyny V sprzężonej z FITC.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć plemniki, dodając 1 ml 1x buforu wiążącego anektynę V na 106 komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 min.</li>
	<li>Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl 1x bufora wiążącego anektynę V na 106 komórek ogółem.</li>
	<li>Dodać 1 μg/ml PI bezpośrednio przed analizą za pomocą cytometru przepływowego.</li>
	<li>Przepuścić próbkę przez cytometr przepływowy ustawiony na "InCyte".</li>
</ol>

<ol><li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li>
<li>Gürler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability%2C+synthesis+of+reactive+oxygen+species%2C+and+DNA+damage+of+bovine+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li>
<li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li>
<li>Beltrán, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Anat+Embryol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li>
<li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li>
<li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Reprod+Sci%22%5BJournal%5D)">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li>
<li>Jankovicová, J., Simon, M., Antalíková, J., Horovská, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Hung%22%5BJournal%5D)">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
<li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li>
<li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma%2C+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Domest+Anim%22%5BJournal%5D)">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li>
<li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functionality+in+reproduction%3A+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li>
<li>Eddy, E. M., O’Brien, A. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=6j-mOAcNnPUC&pgis=1">The spermatozoon</a>. , Raven Press. New York, USA. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction; Volume 1 (1994).</li>
<li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li>
<li>Espinoza, J. a, Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li>
<li>Hüttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oxidative+phosphorylation%2C+the+mitochondrial+membrane+potential%2C+and+their+role+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li>
<li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li>
<li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li>
<li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen%2C+including+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Potencjał zapłodnienia plemników zależy od wielu czynników wpływających na ich jakość. Wysokie stężenie plemników i wysoki odsetek plemników o bardzo ruchliwej ruchliwości można uznać za nasienie wysokiej jakości. Niemniej jednak taka ocena nie uwzględnia innych parametrów komórkowych i funkcjonalnych. Zastosowanie "stacjonarnego" mikrokapilarnego cytometru przepływowego można łatwo dostosować do oceny różnych struktur plemników za pomocą sond fluorescencyjnych, jak to wcześniej wykazano przez innych17<...

Integralność i funkcjonalność błon plemników to tylko niektóre z czynników wskazujących na żywotność plemników i potencjał zapłodnienia. Błona plazmatyczna działa jak bariera między przedziałami wewnątrzkomórkowymi i zewnątrzkomórkowymi, utrzymując w ten sposób komórkową równowagę osmotyczną1. Każdy stres, który powoduje uszkodzenie integralności błony komórkowej, może upośledzać homeostazę, zmniejszać żywotność i zdolność zapłodnienia oraz zwiększać śmierć komórek. Na przykład kriokonserwacja zmniejsza żywotność plemników z powodu uszkodzenia ich błony plazmatycznej w wyniku zmian temperatury i stresu osmotycznego2. Wcześniej informowaliśmy, że wystawienie nasienia buhaja na działanie niskich stężeń zanieczyszczeń przenoszonych przez żywność, takich jak pestycyd atrazyna, jej główny metabolit diaminochlorotriazyna lub mikotoksyna aflatoksyna B1, zmniejsza żywotność plemników1,3. Ustalono to poprzez znakowanie dwuniciowego DNA DAPI w połączeniu z PI, który wiąże się z DNA komórek z uszkodzoną błoną plazmatyczną.
Reakcja akrosomów (AR) polega na fuzji zewnętrznej błony akrosomowej i leżącej nad nią błony plazmatycznej, co prowadzi do uwolnienia enzymów akrosomalnych4,5. Są to zdarzenia niezbędne do penetracji osłony przejrzystej i dalszego łączenia plemnika z oocytem6. Dlatego ocena integralności błony akrosomalnej stanowi użyteczny parametr do oceny jakości nasienia i płodności samców7,8,9. Do weryfikacji integralności akrosomów nadaje się kilka technik fluorescencyjnych, FITC-PNA lub FITC-PSA8,10. W naszych poprzednich badaniach, korzystając z wzorców barwienia FITC-PSA1,3, przedstawiliśmy dokładne definicje (i) nienaruszonego akrosomu, (ii) uszkodzonej błony akrosomu i (iii) przereagowanego akrosomu. W bieżącym raporcie oceniamy stan akrosomów za pomocą cytometrii przepływowej dedykowanej plemnikom i porównujemy wyniki z wynikami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Mitochondria to wielofunkcyjne organelle zaangażowane między innymi w syntezę ATP, produkcję reaktywnych form tlenu, sygnalizację wapnia i apoptozę. Dysfunkcje fizjologiczne, w tym niepłodność męska i żeńska, są związane ze zmienioną funkcją mitochondriów11. Mitochondria plemników są rozmieszczone w części środkowej i odgrywają kluczową rolę w ruchliwości plemników12. Powszechnie przyjmuje się, że wysoki potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm) wiąże się z normalną ruchliwością i wysoką zdolnością do nawożenia13. Natomiast niski ΔΨm wiąże się z podwyższonym poziomem reaktywnych form tlenu i zmniejszoną szybkością nawożenia14. Niemniej jednak różne związki środowiskowe, na przykład substancje zaburzające gospodarkę hormonalną, mogą wywoływać stres komórkowy i prowadzić do przejściowego wzrostu ΔΨm, hiperpolaryzacji1,3, zwiększona produkcja wolnych rodników i ostatecznie apoptoza15. Sonda fluorescencyjna 5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraetylobenzimidazolylo-jodku karbocyjaniny (JC-1) umożliwia badanie m.in. wpływu toksyn przenoszonych przez żywność na plemniki ΔΨm1,3.
Standardowe spermiogramy, oparte na parametrach fizjologicznych i morfologicznych, nie są wystarczająco dobre, aby przewidzieć jakość nasienia. Aby zapewnić jakość nasienia, potrzebne są dokładniejsze metody. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwe metody określania jakości nasienia na podstawie oceny błon plemników: jednoczesne poczwórne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych i mikroskopię fluorescencyjną, opisane w naszych badaniach1,3 oraz zaawansowana cytometria przepływowa dedykowana plemnikom, niedawno wykorzystana w naszym laboratorium i już używana przez innych16,17,Rozdział 18.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MOPS [kwas 3-N-morfilinopropanosulfonowy]</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hemocytometr Neubauer Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol)</td><td>Sonda fluorescencyjna</td> <td>Sigma</td><td>D9542</td></tr><tr><td>PI (jodek propidyny)</td> <td>Sonda fluorescencyjna</td> <td>Sigma</td><td>P4170</td></tr><tr><td>FITC-PSA (aglutynina Pisum sativum sprzężona z izotiocyjanianem fluoresceiny)</td> <td>Sonda</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>fluorescencyjna Sigma L0770JC-1 (jodek karbocyjaniny 5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraetylobenzimidazolilu)</td><td>ENZOBiochem, Nowy Jork, NY, USA</td><td>ENZ52304</td><td>sonda fluorescencyjna</td></tr><tr><td>Aneksyna V sprzężona z FITC</td> MACS, sonda <td>fluorescencyjna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-060</td></tr><tr><td>Bufor wiążący załącznika V 20x roztwór podstawowy</td><td>MACS, bufor Miltenyi Biotec</td><td>130-092-820</td><td>Nikon</td></tr><tr><td>Eclipse, TE-2000-u</td><td>Nikon, Tokio, Japonia</td><td></td><td>odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Nis Elements</td><td>Nikon, Tokio, Japonia</td><td></td><td>oprogramowanie</td></tr><tr><td>Nikon DXM1200F</td><td>Nikon, Tokio, Japonia</td><td></td><td>aparat cyfrowy</td></tr><tr><td>Guava EasyCyte Plus</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francja</td><td></td><td>mikrokapilarny cytometr przepływu plemników</td></tr><tr><td>CytoSoft</td><td>Guava Technologies Inc., Hayward, Kalifornia, Stany Zjednoczone; dystrybuowane przez oprogramowanie IMV Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buforowany roztwór do cytometrii</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francja</td><td></td><td>Zestaw do 023862 bufora</td></tr><tr><td>Żywotność i stężenie</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francja</td><td>024708</td><td>zestaw do oceny żywotności</td></tr> Zestaw do aktywności <tr><td>mitochondrialnej</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francja</td><td>024864</td><td>zestaw do aktywności mitochondrialnej zestaw do oceny</td></tr><tr><td>żywotności i integralności akrosomów</td><td>IMV Technologies, L'Aigle, Francja</td><td>025293</td><td>zestaw do oceny integralności akrosomów</td></tr><tr><td>JMP-13</td><td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td><td></td><td>oprogramowanie</td></tr><tr><td>Nasienie bydlęce</td> <td>"SION", izraelska firma do sztucznego zapłodnienia i odmrażania, Hafetz-Haim, Izrael</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standardowe spermiogramy opisujące jakość plemników opierają się głównie na parametrach fizjologicznych i wizualnych, takich jak objętość i stężenie ejakulatu, ruchliwość i ruchliwość progresywna oraz morfologia i żywotność plemników. Jednak żadna z tych ocen nie jest wystarczająco dobra, aby przewidzieć jakość nasienia. Biorąc pod uwagę, że utrzymanie żywotności plemników i potencjału zapłodnienia zależy od integralności błony i funkcjonalności wewnątrzkomórkowej, ocena tych parametrów może umożliwić lepsze przewidywanie kompetencji zapłodnienia plemników. W tym miejscu opisujemy trzy możliwe metody oceny jakości nasienia przy użyciu określonych sond fluorescencyjnych w połączeniu z analizami mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej. W analizach oceniano integralność błony plazmatycznej przy użyciu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i jodku propidyny (PI), integralność błony akrosomalnej przy użyciu aglutyniny Pisum sativum sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC-PSA) oraz integralność błony mitochondrialnej przy użyciu jodku karbocyjaniny 5,5',6,6'-tetraetylobenzimidazolylu (JC-1). Przedstawiono również kombinacje tych metod. Na przykład zastosowanie aneksyny V w połączeniu z fluorochromami PI umożliwia ocenę apoptozy i obliczenie proporcji apoptotycznych plemników (indeksu apoptotycznego). Uważamy, że te metodologie, które opierają się na badaniu błon plemników, są bardzo przydatne do oceny jakości nasienia.

Rysunek 1 przedstawia jednoczesną ocenę fluorometryczną błon plemników (plazmatycznej, akrosomalnej i mitochondrialnej) z użyciem PI, DAPI, FITC-PSA i JC-1. Ocena błon plemników z wykorzystaniem jednoczesnego barwienia czterema sondami fluorescencyjnymi pozwala na przykład na jednoczesną ocenę dla każdego plemnika proporcji komórek w każdej kategorii – żywych vs. martwych; o wysokim vs. niskim ΔΨm; z nienaruszonym vs. uszkodzonym ak...

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Celem tych procedur jest ocena integralności błon plemników za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną lub analizą cytometrii przepływowej. Techniki te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozrodu, takie jak przewidywanie potencjału zapłodnienia i jakości próbki nasienia. Główną zaletą tych technik jest to, że umożliwiają one precyzyjną ocenę wielu błon plemników, o których wiadomo, że wiążą się z potencjałem zapłodnienia plemników.Implikacje tych technik rozciągają się w kierunku diagnozy jakości ejakulatu, ponieważ umożliwiają one dokładniejszą ocenę integralności osocza plemników i błony akrosomów, a także potencjału błony mitochondrialnej. Aby rozpocząć tę procedurę, należy uzyskać około jednego do sześciu mililitrów nasienia byka w 15-mililitrowej probówce w temperaturze pokojowej. Na każdy mililitr nasienia dodać sześć mililitrów buforu NKM podgrzanego do temperatury 37 stopni Celsjusza.Wirować 600 razy g przez osiem minut. Powtórzyć wirowanie raz lub dwa razy, aż supernatant będzie klarowny. Następnie natychmiast wyrzuć większość supernatantu, pozostawiając około jednego centymetra supernatantu nad osadem.Ostrożnie pochyl rurki pod kątem 30 stopni w inkubatorze i odczekaj 20 do 30 minut, aby plemniki mogły podpłynąć do góry. Za pomocą mikropipety ostrożnie usuń pozostały jeden mililitr supernatantu, który zawiera teraz ruchliwe plemniki i przenieś go do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Trzymaj plemniki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia.Najpierw przygotuj wszystkie potrzebne roztwory podstawowe, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przenieś 133 mikrolitry ruchliwych plemników o stężeniu 25 milionów plemników na mililitr do nowej 1,5 mililitrowej probówki. Dodać 17 mikrolitrów roztworu roboczego DAPI i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Wirować przy 1 000 g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i dodać 100 mikrolitrów buforu NKM do osadu. Następnie dodaj 50 mikrolitrów FITC-PSA, dwa mikrolitry JC-1 i trzy mikrolitry PI. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Wirować przy 1 000 g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 40 mikrolitrach buforu NKM. Następnie przenieś 10 mikrolitrów próbki na szkiełko podstawowe.Rozsmarować próbkę i dodać szkiełko nakrywkowe. Następnie natychmiast rozpocznij wizualizację próbki za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej z obiektywem 40X i potrójnym filtrem, jak opisano w protokole tekstowym, używając kamery cyfrowej do uchwycenia oddzielnego obrazu dla każdego filtra. Użyj opcji scalania w oprogramowaniu aparatu, aby scalić trzy obrazy otrzymane z filtrów, zapisując nowy plik w formacie JPEG.Otwórz scalony obraz za pomocą narzędzia do malowania i użyj opcji pędzla, aby oznaczyć zliczone plemniki. Następnie sklasyfikuj plemniki na podstawie fluorescencji emitowanej z każdej sondy, upewniając się, że oceniasz co najmniej 200 plemników na szkiełku. Wszystkie komórki powinny być wyświetlane na niebiesko z DAPI.Policz martwe komórki, które wydają się fioletowe, aby ocenić żywotność. Następnie użyj wzorców barwienia fluorescencyjnego, aby ocenić stan akrosomów. Na koniec oceń potencjał błony mitochondrialnej, odróżniając plemniki o wysokim potencjale błony mitochondrialnej, które wykazują zabarwioną na czerwono część środkową, od plemników o niskim potencjale błony mitochondrialnej, które wykazują zabarwioną na zielono część środkową.Policz osobno czerwone i zielone części środkowe i oblicz ich stosunek. Aby rozpocząć ocenę integralności błony plazmatycznej, należy pobrać żądaną liczbę studzienek z zestawu żywotności i koncentracji. Przenieś studzienki do podstawy roboczej i przykryj je elastyczną pokrywą, aby chronić je przed światłem.Do każdej studzienki dodać 199 mikrolitrów buforowego roztworu do cytometrii. Następnie dodać jeden mikrolitr jednorodnego nasienia o stężeniu 57 milionów komórek na mililitr do każdej studzienki i homogenizować przez pipetowanie. Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Następnie przepuść próbkę przez cytometr przepływowy, korzystając z ustawienia żywotności. Aby rozpocząć ocenę potencjału błony mitochondrialnej, wyjmij żądaną liczbę studzienek z zestawu aktywności mitochondriów. Przenieś je do bazy roboczej.Dodaj 10 mikrolitrów absolutnego etanolu do każdej studzienki i użyj pipety, aby ponownie zawiesić proszek znajdujący się w studzience. Dodać 190 mikrolitrów PBS do dołka i homogenizować przez pipetowanie. Dodać 0,75 mikrolitra jednorodnego nasienia o stężeniu 57 milionów komórek na mililitr do każdej studzienki i homogenizować przez pipetowanie.Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie przepuść próbkę przez cytometr przepływowy, używając ustawienia aktywności mitochondrialnej. Aby rozpocząć ocenę integralności błony akrosomalnej, wyjmij żądaną liczbę studzienek z zestawu żywotności i integralności akrosomów.Przenieś studzienki do podstawy roboczej i przykryj je elastyczną pokrywą, aby chronić je przed światłem. Do każdej studzienki dodać 200 mikrolitrów buforowego roztworu do cytometrii. Następnie dodać 0,7 mikrolitra jednorodnego nasienia o stężeniu 57 milionów komórek na mililitr do każdej studzienki i homogenizować przez pipetowanie.Przykryj płytkę pokrywką i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Następnie przepuść próbkę przez cytometr przepływowy, korzystając z ustawienia wglądu. W tym badaniu jakość nasienia jest oceniana przy użyciu różnych technik, z których jedna oceniała błony plemników za pomocą sond fluorometrycznych.Możliwa jest ocena różnic w jakości próbki nasienia pod względem integralności błony. Na przykład ejakulat byka numer siedem miał stosunkowo niski odsetek martwych komórek, niski odsetek plemników z pseudo-reaktywnym akrosomem i wyższy potencjał błony mitochondrialnej w porównaniu z ejakulatem byka numer jeden. Próbki są następnie oceniane pod kątem żywotności i aktywności mitochondriów.Histogramy dla tych reprezentatywnych przykładów reprezentują nieumięśnione plemniki i szczątki oraz bramkowane plemniki. Histogramy te reprezentują również żywe i martwe komórki oraz rozmieszczenie plemników do spolaryzowanej i zdepolaryzowanej błony mitochondrialnej. Integralność akrosomu jest następnie oceniana za pomocą gotowego do użycia zestawu i odczytywana za pomocą cytometrii przepływowej, dzieląc obszar na trzy obszary markerowe, które reprezentują znikome komórki o niskiej fluoryzacji z nienaruszonym niewybarwionym akrosomem, komórki o niskiej fluoryzacji z resztkową wybarwioną częścią akrosomu i komórki o wysokiej fluorescencji z zakłóconym akrosomem.Podejmując się tych procedur, ważne jest, aby upewnić się, że odpowiednio przygotowałeś początkową próbkę nasienia. Techniki te mogą zapewnić wgląd w ocenę jakości nasienia i mogą być stosowane do różnych organizmów, takich jak bydło, drób i ludzie. Porównanie między dwiema technikami, poczwórnym barwieniem i cytometrią przepływową, nie wykazało istotnych różnic w żywotności, potencjale błony mitochondrialnej i integralności akrosomów, co pokazuje, że obie techniki dały pasujące wyniki.

fluorimetric-techniques-for-the-assessment-of-sperm-membranes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy artykuł wideo przedstawia krok po kroku sposób przetwarzania próbki nasienia w celu uzyskania wysokiej jakości hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ na ludzkich plemnikach. Otrzymane preparaty mogą być wykorzystywane do przesiewowego badania aneuploidii w ramach diagnostyki klinicznej.<br...

Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w ludzkich plemnikach

Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Komórki jajowe oraz otaczające je powłoki pozakomórkowe często uwalniają peptydy, białka i małe cząsteczki, które komunikują się z plemnikami, by prowadzić je do jaja, wspomagając tym samym zapłodnienie. Wykorzystując plemniki żaby, opisujemy i porównujemy dwie klasy testów służących do wykrywania chemotaksji plemników – testy akumulacji plemników oraz testy śledzenia trajektorii plemników.

Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii z wykrywaniem fluorescencji i wykluczenia wielkości w celu sprawdzenia stabilności białka błonowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w Escherichia coli po solubilizacji detergentu. Białka wykazujące symetryczny pik w profilu wykluczenia wielkości z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnej GFP wskazują na oczyszczone białka z minimalną degradacją i agregacją, które można następnie wybrać do analizy struktura-funkcja.

Chromatografia wykluczająca wielkość z detekcją fluorescencji: technika identyfikacji integralności fluorescencyjnych białek błonowych po rozpuszczaniu detergentu

Opisano nowy protokół mechanicznego przygotowania zawiesin komórek jąder z materiału gryzoni, unikając enzymów i detergentów. Metoda jest bardzo prosta, szybka, powtarzalna i pozwala uzyskać dobrej jakości zawiesiny komórek, które nadają się do sortowania przepływowego i ekstrakcji RNA.

Prosta i skuteczna technika przygotowania zawiesin komórek jąder

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Opisujemy metody manipulowania niedojrzałymi oocytami Xenopus laevis, dojrzewania in vitro oocytów do komórek jajowych oraz docytoplazmatycznego wstrzykiwania plemników. Protokół ten umożliwia degradację niektórych białek matczynych i nadekspresję genów będących przedmiotem zainteresowania podczas zapłodnienia, a zatem jest cenny dla badania ról określonych czynników we wczesnym rozwoju embrionalnym.

Manipulacja i dojrzewanie in vitro oocytów Xenopus laevis, a następnie docytoplazmatyczna iniekcja plemnika w celu zbadania rozwoju embrionalnego

Poznaj techniki fluorymetryczne do oceny integralności błon plemników przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Te metody umożliwiają precyzyjną analizę potencjału zapłodnienia.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Przeglądaj więcej filmów