Name: Czasowo kontrolowana translokacja jądrowa gości w żywych komórkach przy użyciu klatkowanych klejów molekularnych jako fotoaktywowanych znaczników (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę światłem indukowanej translokacji jądrowej cząsteczek w żywych komórkach przy użyciu klatkowanych klejów molekularnych. Technika ta umożliwia precyzyjne dostarczanie leków do jądra komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uznajemy Centrum Integracji Nanobiologicznej, Uniwersytet Tokijski. Praca ta była wspierana przez Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (26810046) dla K.O. i częściowo wspierana przez Grant-in-Aid for Specially Promote Research (25000005) dla T.A. R.M. dziękuje Research Fellowships of Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) dla Młodych Naukowców oraz Programowi dla Wiodących Szkół Podyplomowych (GPLLI).

1. Przygotowanie gości z Uwięziony (w klatce)Znaczniki Glue-R
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu CagedGlue-NBD.
	<ol>
		<li>Zsyntetyzować CagedGlue-NBD (Rysunek 1) zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami20.</li>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy CagedGlue-NBD (10 mM) w suchym dimetylosulfoksydzie (DMSO). 
		Uwaga: Roztwór zapasowy należy przechowywać w ciemności. Przed użyciem roztwór można rozcieńczyć buforami wodnymi lub pożywkami do hodowli komórkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu CagedGlue-QD.
	<ol>
		<li>Zsyntetyzować CagedGlue-dibenzocyklooktynowo (CagedGlue-DBCO) (Rysunek 1) zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami20.</li>
		<li>Przygotować roztwór zapasowy CagedGlue-DBCO (10 mM) w suchym DMSO.</li>
		<li>W celu przygotowania CagedGlue-QD najpierw przygotować kropki kwantowe z funkcjonalizacją azydową (Azide-QD; Rysunek 3). Dodać 10 µL roztworu estru azide-PEG4-NHS (Rysunek 3) w dimetylformamidzie (DMF, 125 µM) do 400 µL roztworu kropek kwantowych (QDs) powlekanych PEG z funkcjonalizacją aminową (Amine-QD; Rysunek 3) w DMF (500 nM). Mieszać mieszaninę przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dializować otrzymany roztwór przez 24 h przeciwko 80 mL DMF, używając membrany z regenerowanej celulozy o progu odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 3 50.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór zapasowy CagedGlue-DBCO do stężenia 50 µM za pomocą DMF. Dodać 20 µL roztworu do roztworu po dializie (Rysunek 3) i mieszać mieszaninę przez 3 h w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dializować otrzymany roztwór przez 24 h przeciwko 80 mL DMF, używając membrany z regenerowanej celulozy (25 0 MWCO).</li>
		<li>Rozcieńczyć otrzymany roztwór do stężenia 20 nM za pomocą DMF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Proces modyfikacji kropek kwantowych; schemat reakcji chemicznej; modyfikacja grupy aminowej do azotkowej; wiązanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie przygotowania Zamknięte w klatceGlue-QD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Przygotowanie próbki komórek Hep3B do obserwacji mikroskopowych
<ol>
	<li>Hodować ludzkie komórki raka wątrobowego Hep3B w minimalnym medium podstawowym Eagle'a (EMEM) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2.</li>
	<li>Wysiać komórki dzień przed eksperymentem. Wysiać 5,0 × 103 komórek Hep3B na studzienkę 8-komorowego podłoża szklanego w EMEM (10% FBS, 20 µL) i inkubować próbkę komórek w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 24 h.</li>
	<li>Usunąć medium hodowlane i dwukrotnie wypłukać próbkę komórek 10 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym Dulbecco (D-PBS).</li>
</ol>
3. Obserwacja translokacji jądrowej gości małocząsteczkowych wywołanej światłem UV
<ol>
	<li>Dodać do próbki komórek (przygotowanej w kroku 2.3) 200 µL pożywki EMEM bez dodatku FBS, zawierającej Uwięziony (w klatce molekularnej)Glue-NBD (10 µM) i inkubować otrzymaną próbkę komórek w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 3 h. 
	Uwaga: Inkubacja próbki komórkowej w EMEM bez FBS przez czas dłuższy niż 4 h powoduje poważne uszkodzenie komórek.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i wypłukać próbkę komórek za pomocą 100 µL dwukrotnie w D-PBS.</li>
	<li>W celu wizualizacji endosomów, do próbki komórkowej należy dodać 200 µL pożywki EMEM (10% FBS) zawierającej czerwony barwnik fluorescencyjny (np., LysoTracker Red, 10 nM), a następnie inkubować otrzymaną próbkę komórek w 37 °C poniżej 5% CO2 przez 20 min. Usunąć pożywkę i przepłukać próbkę komórek za pomocą 100 µL dwukrotnie w D-PBS. Przenieść próbkę komórek do 200 µL pożywki EMEM (10% FBS).</li>
	<li>W celu translokacji jądrowej KlatkoweGlue-NBD, naświetlaj próbkę komórek światłem UV przez 2 min poprzez światłowód z wykorzystaniem źródła światła ksenonowego o mocy 10 W, wyposażonego w filtr pasmowy 365 nm. W przypadku próbki w komórce referencyjnej, która nie była poddana działaniu promieniowania UV, należy przechowywać próbkę w ciemności. 
	Uwaga: Pokrywki podłoży szklanych można zdjąć w celu zapewnienia efektywnej ekspozycji na promieniowanie UV. Długotrwała ekspozycja na światło UV może wywołać cytotoksyczność w komórkach.</li>
	<li>W celu wizualizacji jąder komórkowych należy dodać 1 µL Hoechst 3342 (1 mg/mL) do pożywki hodowlanej, a następnie inkubować otrzymaną próbkę komórek w 37 °C poniżej 5% CO2 przez 10 min.</li>
	<li>Próbkę komórkową poddano konfokalnej mikroskopii laserowej i zarejestrowano mikrografie po wzbudzeniu przy 48 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm) oraz 710 nm (dwufotonowe; λobs = 390-465 nm) odpowiednio dla NBD, barwnika czerwono-fluorescencyjnego oraz Hoechst 342.</li>
</ol>
4. Obserwacja translokacji jądrowej małocząsteczkowych gości wywołanej dwufotonowym światłem NIR
<ol>
	<li>Do próbki komórek (przygotowanej w kroku 2.3) dodać 20 µL EMEM bez FBS zawierającego CagedGlue-NBD (10 µM) i inkubować otrzymaną próbkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 3 h.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć próbkę komórek 10 µL D-PBS. Następnie dodać do próbki 20 µL EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Poddać próbkę komórek badaniu za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej i zarejestrować mikrografie przy wzbudzeniu przy 48 nm (λobs = 50-530 nm).</li>
	<li>W celu wywołania translokacji jądrowej CagedGlue-NBD naświetlać obszar zawierający badaną komórkę laserem dwufotonowym (710 nm), zamontowanym w mikroskopie jako źródło światła, przez 2 min (30 s × 4). Obserwować translokację zgodnie z opisem w kroku 4.3.</li>
</ol>
5. Obserwacja translokacji jądrowej makromolekularnych gości wywołanej światłem UV
<ol>
	<li>Dopełnić próbkę komórkową (przygotowaną w kroku 2.3) za pomocą 200 µL pożywki EMEM bez FBS zawierającej UwięzioneGlue-QD (10 nM), a następnie inkubować otrzymaną próbkę komórek w 37 °C poniżej 5% CO2 przez 3 h.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i wypłukać próbkę komórek za pomocą 100 µL dwukrotnie w D-PBS. Dostarczyć do próbki komórek 200 µL z pożywki EMEM (10% FBS).</li>
	<li>do translokacji jądrowej UwięzionyGlue-QD, naświetlaj próbkę komórek światłem UV przez 2 min poprzez światłowód z wykorzystaniem 10-W źródła światła ksenonowego wyposażonego w filtr pasmowy 365 nm. W przypadku próbki w komórce referencyjnej, niewystawionej na działanie promieniowania UV, należy przechowywać próbkę w ciemności.</li>
	<li>W celu wizualizacji jąder komórkowych dodać 1 µL Hoechst 3342 (1 mg/ml) do pożywki hodowlanej, a następnie inkubować otrzymaną próbkę komórek w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 10 min.</li>
	<li>Próbkę komórkową poddać konfokalnej mikroskopii laserowej i zarejestrować mikrofotografie przy wzbudzeniu przy 405 nm (λobs = 430-520 nm) oraz 488 nm (λobs = 625-680 nm) odpowiednio dla Hoechst 342 i kropek kwantowych (QD).</li>
</ol>
6. Test żywotności komórek
<ol>
	<li>Kulturować ludzkie komórki raka wątrobowokomórkowego Hep3B w pożywce EMEM (10% FBS) w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2.</li>
	<li>Wysiać komórki dzień przed eksperymentem. Wysiać 5,0 × 103 komórki Hep3B na studnię 96-dołkowej płytki hodowlanej w pożywce EMEM (10% FBS, 200 µL), a następnie inkubować próbkę komórek w 37 °C poniżej 5% CO2 przez 24 h.</li>
	<li>Usuń pożywkę i wypłucz próbkę komórek za pomocą 100 µL dwukrotnie w D-PBS.</li>
	<li>Dodać do próbki komórek 200 µL pożywki EMEM bez FBS zawierającej Uwięzione w klatceGlue-NBD (0,1-100 µM) i inkubować otrzymaną próbkę komórkową w 37 °C poniżej 5% CO2 przez 3 h.</li>
	<li>Naświetlaj próbkę komórek światłem UV przez 2 min poprzez światłowód z wykorzystaniem ksenonowego źródła światła o mocy 10 W, wyposażonego w filtr pasmowy 365 nm. W przypadku analogicznej próbki komórkowej bez ekspozycji na promieniowanie UV należy przechowywać próbkę komórkową w ciemności.</li>
	<li>Dodaj 10 µL odczynnika Cell Counting Kit-8 (10 µL) do pożywki hodowlanej i inkubować otrzymaną próbkę komórek w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 przez 2 h.</li>
	<li>poddać próbkę komórek spektroskopii absorpcyjnej (λ = 450 nm) przy użyciu czytnika mikropłytek.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene+therapy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li>
<li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+for+Cancer%3A+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li>
<li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENE+THERAPY%3A+Twenty-First+Century+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li>
<li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).</li>
<li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li>
<li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Go+in%21+Go+out%21+Inducible+control+of+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li>
<li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li>
<li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidinium-based+%26%2334%3Bmolecular+glues%26%2334%3B+for+modulation+of+biomolecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Guanidinium-based &#34;molecular glues&#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li>
<li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer%3A+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li>
<li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+%26%2334%3BMolecular+Glue%26%2334%3B+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &#34;Molecular Glue&#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue%3A+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li>
<li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+glues+for+manipulating+enzymes%3A+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li>
<li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Photoswitch%3A+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li>
<li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li>
<li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+Bioorthogonal+1%2C3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li>
<li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li>
<li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue%3A+Activation+of+Ion+Permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li>
<li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets%3A+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li>
<li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Klán, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology%3A+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wcześniejsze badania nad wywołaną światłem translokacją białek do jądra komórkowego zostały przeprowadzone przy użyciu klatkowanego NLS 7,8,9. Jak wspomniano wcześniej, metody te wymagają dodatkowych technik w celu włączenia białek znakowanych NLS do cytoplazmy. W przeciwieństwie do tego, nasz przywieszka CagedGlue-R umożliwia nie tylko fotoindukowaną translokację jądrową, ale także absorpcję komórkową gości. Ta cecha...

Jądro komórkowe, zawierające informacje genetyczne, jest jednym z najważniejszych organelli jako wewnątrzkomórkowy cel dostarczania leków, ponieważ modulacja replikacji i ekspresji genów jest skuteczna w leczeniu różnych chorób, w tym nowotworów i zaburzeń genetycznych1,2,3. W celu dostarczania leków do jądra szeroko badano sprzęganie znaczników peptydowych, takich jak sygnały lokalizacji jądrowej (NLS)4,5,6. Jednakże, aby zminimalizować niepożądane skutki uboczne, niezbędna jest czasowo-przestrzenna kontrola translokacji jądrowej.
Wcześniej translokacja białek do jądra komórkowego wyzwalana światłem była osiągana przy użyciu klatkowanych NLS7,8,9. NLS migruje do jądra komórkowego poprzez wiązanie się z cytoplazmatycznymi białkami transportowymi6. W opisanych metodach białka gościnne zawierające klatkowane NLS są wprowadzane bezpośrednio do cytoplazmy poprzez mikroiniekcję8 lub ekspresjonowane w komórkach docelowych przy użyciu techniki rozszerzania kodu genetycznego9. Dlatego metoda umożliwiająca zarówno pobranie komórkowe, jak i fotoindukowaną translokację jądrową jest korzystna w zastosowaniach praktycznych.
W niniejszej pracy opisujemy wyzwalaną światłem translokację jądrową gości w żywych komórkach z wykorzystaniem dendrytycznego klatkowanego kleju molekularnego (KlatkoweGlue-R, Rysunek 1) tagi. Rozpuszczalne w wodzie kleje molekularne10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23 posiadający wiele Gu+ opracowano wcześniej zawiesiny, które ściśle przylegają do białek11,12,13,14,15,16,17, kwasy nukleinowe18,19,20, błony fosfolipidowe21, oraz nanoarkusze glinki22,23 poprzez tworzenie wielu mostków solnych pomiędzy ich Gu+ podstawniki i grupy oksyanionowe na celach. Gu+ zawieszek do Zamknięte w klatkachGlue-R są chronione anionową grupą fotolabilną, butyrylowanym nitroveratryloksykarbonylem (BANVOC). Goście oznaczeni za pomocą W klatceGlue-R są pobierane przez żywe komórki poprzez endocytoza i pozostawanie w endosomach (Rysunek 2). Po naświetleniu, BAgrupy NVOC w ramach Związane z klatką / w klatceGlue-R zostają odłączone, w wyniku czego powstaje uwolniony molekularny klej (Uwolniony z klatkiGlue-R) przenoszący wiele Gu+ zawieszek, co ułatwia migrację znakowanego gościa do cytoplazmy, a następnie do jądra komórkowego (Rysunek 2). The KlatkowaneZnacznik Glue-R może zostać odblokowany poprzez ekspozycję na światło UV lub dwufotonowe światło bliskiej podczerwieni (NIR) bez wywoływania poważnej fototoksyczności. Demonstrujemy spatiotemporalnie kontrolowane dostarczanie do jądra komórkowego gości makromolekularnych, a także gości małocząsteczkowych z Uwięziony (w klatce molekularnej)Znaczniki Glue-R, przyjmując odpowiednio kropki kwantowe (QDs) oraz barwnik fluorescencyjny (nitrobenzooksadiazol; NBD) jako przykłady.
<img alt="Schemat reakcji chemicznej Glue-R w klatce, uwalnianie za pomocą światła UV lub NIR, proces syntezy organicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Schematy struktur UwięzioneGlue-R. 9 jonów guanidyniowych (Gu+zawieszki z KlatkoweGlue-R są chronione grupą nitroveratryloksykarbonylową podstawioną maślanem (BAgrupa NVOC). Ta BAGrupy NVOC są odszczepiane poprzez naświetlanie promieniowaniem UV lub dwufotonowym światłem NIR. Rdzeń ogniskowy... Uwięziony (w klatce)Glue-R jest funkcjonalizowany za pomocą nitrobenzooksadiazolu (NBD) lub dibenzocyklooktynu (DBCO). Przedruk za zgodą autora z literatury20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Schemat endocytozy z znakowaniem molekularnym; obejmuje wyzwalanie fotochemiczne oraz translokację do jądra." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie wyzwalanej światłem translokacji jądrowej gości sprzężonych z a Związany (uwolniony światłem)znacznik Glue-R Gość/Uwięziony (w klatce)Konjugat Glue-R jest pobierany przez żywe komórki poprzez endocytoza. Po naświetleniu, Uwięzione (w klatce)Znacznik Glue-R zostaje odblokowany w celu uzyskania Uwolniony z klatkiznacznik Glue-R, który może ułatwiać ucieczkę z endosomów znakowanego gościa. Następnie znakowany gość migruje do jądra komórkowego. Przedruk za zgodą źródła20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Azide-PEG4-NHS ester</td><td>Click Narzędzia chemiczne</td><td>AZ103</td><td></td></tr><tr><td>Q-dot 655 ITK</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Regenerowana membrana celulozowa (MWCO 3,500)</td><td>NIPPON Genetics</td><td>TOR-3K</td><td></td></tr><tr><td>Regenerowana membrana celulozowa (MWCO 25,000)</td><td>Aparat Harvarda</td><td>7425-RC25K</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa Hep3B</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>8-komorowe podłoże szklane</td><td>Nunc</td><td>155411JP</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna pożywka egzogenna Eagle (EMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30406.02</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Dulbecco sól fizjologiczna (D-PBS)</td><td>Wako Pure Chemical Branże</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Lonza Walkersville</td><td>PA-3015</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Dojindo</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl-Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Wyposażony w dwufotonowy laser wzbudzający (laser Mai Tai, Spectra-Physics)</td></tr><tr><td>Laser konfokalny mikroskop skaningowy</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Ksenoniowe źródło światła</td><td>Asahi Spectra</td><td>LAX-102</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Paradygmat</td><td></td> SpectraMax</tr></tbody></table>

czasowo kontrolowana translokacja jądrowa gości w żywych komórkach przy użyciu klatkowanych klejów molekularnych jako fotoaktywowanych znaczników

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Jądro komórkowe jest jednym z najważniejszych organelli jako subkomórkowy cel dostarczania leków, ponieważ modulacja replikacji i ekspresji genów jest skuteczna w leczeniu różnych chorób. Tutaj demonstrujemy wyzwalaną światłem translokację jądrową gości za pomocą znaczników kleju molekularnego w klatce (CagedGlue-R), których wisiorki z wieloma jonami guanidyny (Gu +) są chronione przez anionową grupę fotorozszczepialną (nitroweratryloksykarbonyl podstawiony maślanem; BaNVOC). Goście oznaczeni klejem CagedGlue-R są wchłaniani do żywych komórek przez endocytozę i pozostają w endosomach. Jednak po napromieniowaniu fotoelektrycznym klej w klatcejest przekształcany w klej molekularny bez klatki (UncagedGlue-R) zawierający wiele wisiorków Gu +, co ułatwia ucieczkę endosomalną i późniejszą translokację jądrową gości. Metoda ta jest obiecująca w przypadku selektywnego dostarczania leków ukierunkowanych na jądro, ponieważ oznaczeni goście mogą migrować do cytoplazmy, a następnie do jądra komórkowego tylko wtedy, gdy zostaną napromieniowani. KlatceZnaczniki Glue-R mogą dostarczać gości makromolekularnych, takich jak kropki kwantowe (QD), a także gości małocząsteczkowych. KlatceZnaczniki Glue-R można rozpakować nie tylko za pomocą światła UV, ale także dwufotonowego światła bliskiej podczerwieni (NIR), które może głęboko wnikać w tkankę.

Przed fotoirradiacją komórki Hep3B inkubowane z CagedGlue-NBD wykazywały punktową emisję fluorescencji z wnętrza komórek (λext = 488 nm; Rysunki 4A i 4C, kolor zielony). Analogowy mikrograf uzyskano po wzbudzeniu przy 543 nm dla barwnika fluorescencyjnego o czerwonej emisji (Rysunki 4B i 4C, kolor czerwony), co wskazuje, że CagedGlue-NBD zlokalizował się w endosom...

Ten protokół opisuje wywołaną światłem translokację jądrową gości w żywych komórkach za pomocą klatkowanych znaczników kleju molekularnego. Metoda ta jest obiecująca w przypadku selektywnego dostarczania leków ukierunkowanych na cele jądrowe.

Czasowo kontrolowana translokacja jądrowa gości w żywych komórkach przy użyciu klatkowanych klejów molekularnych jako fotoaktywowanych znaczników

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w obszarze dostarczania leków, takie jak sposób dostarczania leku do określonego granulatu komórkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że translokacja jądrowa gazu może być indukowana przez światło. Procedurę zademonstrują Rina Mogaki i Akio Arisaka, absolwenci z mojej grupy.Aby rozpocząć, należy przygotować klej molekularny w klatce połączonej z kropkami kwantowymi, syntetyzując dibenzocyklooktynę połączoną z klejem molekularnym w klatce, jak opisano bardziej szczegółowo w innym miejscu. Przygotować 10-milimolowy roztwór podstawowy dibenzocykloktyny połączonej z klejem molekularnym w suchym DMSO. Następnie przygotuj klej molekularny połączony z kropkami kwantowymi, najpierw tworząc funkcjonalizowane kropki kwantowe aseye.Aby to osiągnąć, dodaj 100 mikrolitrów 125 mikromolowego estru aseye PEG4 NHS w DMF do 400 mikrolitrów roztworu DMF zawierającego 500 nanomolowych kropek kwantowych, które są pokryte peg funkcjonalizowany aminami. Mieszaj mieszaninę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Otrzymany roztwór należy umieścić w membranie z regenerowanej celulozy i dializować przez 24 godziny w 800 ml DMF.Następnie rozcieńczyć

spatiotemporally-controlled-nuclear-translocation-guests-living-cells

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Systemy znakowania białek SNAP-tag i CLIP-tag umożliwiają specyficzne, kowalencyjne przyłączanie cząsteczek, w tym barwników fluorescencyjnych, do białka docelowego w żywych komórkach. Po sklonowaniu i ekspresji białko z tagiem może być stosowane z różnymi substratami w wielu dalszych zastosowaniach bez konieczności ponownego klonowania.

Fluorescencyjne znakowanie linii COS-7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych SNAP-tag w celu obrazowania żywych komórek

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Ten protokół pokazuje, jak śledzić translokację jądra białka pod wpływem stresu cieplnego, używając białka fuzyjnego białka zielonej fluorescencji (GFP) jako markera i barwienia 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Protokół barwienia DAPI jest szybki i zachowuje sygnały lokalizacji subkomórkowej GFP i białka.

Wykrywanie lokalizacji subkomórkowej białka poprzez znakowanie białek zielonej fluorescencji i barwienie 4',6-diamidino-2-fenyloindolem w Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia nowy protokół bezpośredniego przykładania siły mechanicznej do jądra komórkowego za pomocą mikrokulek magnetycznych dostarczanych do cytoplazmy i jednoczesnego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.

Połączenie siłownika siły magnetycznej 3D i wielofunkcyjnego obrazowania fluorescencyjnego w celu badania mechanobiologii jądra

Protokół ten opisuje, jak efektywnie konfigurować i wykonywać zautomatyzowane analizy danych obrazowania żywych komórek uzyskanych ze śledzenia transportu nukleocytoplazmatycznego za pomocą narzędzi optogenetycznych.

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

Poznaj metodę światłem indukowanej translokacji jądrowej cząsteczek w żywych komórkach przy użyciu klatkowanych klejów molekularnych. Technika ta umożliwia precyzyjne dostarczanie leków do jądra komórkowego.

Czasowo kontrolowana translokacja jądrowa gości w żywych komórkach przy użyciu klatkowanych klejów molekularnych jako fotoaktywowanych znaczników (Wideo) | JoVE Journal

Czasowo kontrolowana translokacja jądrowa gości w żywych komórkach przy użyciu klatkowanych klejów molekularnych jako fotoaktywowanych znaczników

Przeglądaj więcej filmów