Opracowanie podwójnego humanizowanego modelu myszy TK-NOG dla patogenezy wątroby związanej z HIV
September 11th, 2019
Ten protokół zapewnia niezawodną metodę tworzenia humanizowanych myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Podwójnie odtworzone myszy z niedoborem odporności uzyskane przez wstrzyknięcie dośledzionowe ludzkich hepatocytów i hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + są podatne na zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 i rekapitulują uszkodzenie wątroby, jak obserwowano u pacjentów zakażonych wirusem HIV.
Ogólnym celem protokołu jest wygenerowanie humanizowanego modelu myszy z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym i wątrobą przy użyciu ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i wątroby. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania u genetycznych humanizowanych myszy wątroby. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania immunopatologii wywołanej przez HIV obserwowanej u ludzi.
Proces ten zostanie zademonstrowany przez Yimin Suna, kierownika z wydziału patologii i mikrobiologii, wraz z Weiminem Wangiem i Edwrdem Makarovem, technologiem badawczym. Na początek przenieś krew pępowinową zebraną w heparynizowanych probówkach do sterylnej komory laminarnej. Dodawaj PBS, aż objętość zostanie zwiększona do 35 mililitrów.
Ułóż próbkę na pożywce do separacji limfocytów i odwiruj ją 400 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 35 minut bez przerw. Następnie ostrożnie usuń górną warstwę osocza i użyj pipety transferowej, aby przenieść interfejs białego kożucha do nowej probówki. Ponownie zawieś kożuszek w 30 do 40 mililitrach lodowatego buforu.
Za pomocą pipety połącz 20 mikrolitrów zawiesiny komórek z 20 mikrolitrami 0,4% błękitu trypanowego. Odpipetować 10 mikrolitrów tej mieszaniny do zewnętrznego otworu jednej z dwóch komór szkiełka liczącego i włożyć szkiełko do automatycznego licznika komórek w celu policzenia komórek. Odwiruj komórki w temperaturze 300 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.
Ostrożnie odessać supernatant i dodać 300 mikrolitrów lodowatego buforu. Dodaj 100 mikrolitrów ludzkiego odczynnika blokującego receptor FC i 100 mikrolitrów monoklonalnych mysich mikrokulek sprzężonych z przeciwciałami anty-ludzkimi CD34 dla maksymalnie 100 milionów komórek. Inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Dodaj 10 mililitrów lodowatego buforu, aby umyć komórki i odwirować go 300 razy G i cztery stopnie Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach lodowatego buforu. Następnie umieść kolumnę LS o pozytywnej selekcji w polu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie i przepuść ją za pomocą trzech mililitrów lodowatego buforu.
Załaduj próbkę do kolumny LS, która może uwięzić mikrokulki związane z ludzkimi komórkami dodatnimi CD34 w próbkach i pozwolić im przepływać pod wpływem grawitacji do probówki zbiorczej. Przemyć kolumnę trzykrotnie lodowatym buforem i zebrać eluent do tej samej probówki zbiorczej. Następnie zanurz kolumnę z pięcioma mililitrami lodowatego buforu, aby nawiązywać do dodatnich komórek CD34 w nowej probówce zbiorczej.
Powtórz procedurę, aby osiągnąć czystość ponad 90%Następnie użyj barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru, aby policzyć wymykane komórki CD34-dodatnie. Po odliczeniu odwirować komórki w temperaturze 300 razy G przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 125 mikrolitrach PBS w celu wstrzyknięcia, które należy zastosować natychmiast po przeszczepie.
Aby sprawdzić czystość dodatniego eluentu CD34, należy pobrać 50 mikrolitrów zawiesiny i inkubować ją z 10 mikrolitrami sprzężonego z PE przeciwciała anty-ludzkiego CD34 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie umyj i ponownie zawiesić komórki w PBS i przystąp do wykonania cytometrii przepływowej. Po pozyskaniu przeanalizuj dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Najpierw należy pobrać i rozmrozić kriokonserwowane hepatocyty zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie zdejmij bio nakrętkę i wlej rozmrożone hepatocyty do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej podgrzane podłoże do rozmrażania. Kołysz rurką ręcznie przez kilka sekund, aby zawiesić komórki.
Osadzaj komórki w temperaturze 100 razy G i w temperaturze pokojowej przez osiem minut. Umyj granulowane komórki w PBS za pomocą 0,1% BSA i połącz je ze świeżymi lub rozmrożonymi HSPC w PBS do końcowej objętości 80 mikrolitrów na mysz. Najpierw przymocuj jeden koniec sterylnej rurki przedłużającej do igły o rozmiarze 30, a drugi koniec do strzykawki o średnicy jednego mililitra.
Napełnić strzykawkę zawiesiną połączonych HEP i HSPC. Umieścić strzykawkę w nacięciu powtarzalnej pipety dozującej i wyregulować dozownik tak, aby dozował 10 mikrolitrów w każdym naciśnięciu. Ogol każdą mysz zgodnie z opisem w protokole tekstowym i wyszoruj lewą stronę ciała każdej myszy 10% jodowidonem, a następnie 70% alkoholem izopropylowym.
Za pomocą nożyczek typu Vannas wykonaj małe nacięcie w skórze, mięśniu i otrzewnej po lewej stronie ściany otrzewnej, aby wejść do jamy otrzewnej około 5 milimetrów poniżej dolnej krawędzi klatki piersiowej. Zlokalizuj śledzionę i użyj kleszczy, aby lekko przyciągnąć ją do obszaru operacyjnego, aby uzyskać łatwy dostęp, i włóż igłę o rozmiarze 30 w dolny biegun śledziony. Następnie odblokuj tłok pipety dozującej i dozuj jednorazowo 10 mikrolitrów objętości, z ograniczeniem od 60 do 80 mikrolitrów na śledzionę.
Powoli cofnąć igłę i przyciąć śledzionę klipsami do podwiązywania za pomocą aplikatora do podwiązywania. Następnie użyj aplikatorów z bawełnianą końcówką zwilżonych sterylnym PBS, aby wepchnąć śledzionę z powrotem do jamy ciała. Użyj przerwanego wzoru szwów, aby zamknąć warstwę mięśniową ściany brzucha.
Osiągnij zamknięcie skóry za pomocą przerwanego wzoru szwów za pomocą szwów niewchłanialnych. Przenieś wszystkie potrzebne materiały do wyznaczonego obiektu poziomu bezpieczeństwa biologicznego Two Plus. Podczas pracy z wirusem należy nosić środki ochrony osobistej, w tym jednorazowy pokrowiec na cały fartuch, ochraniacze na buty, maskę na twarz i podwójne rękawice, w tym rękawice odporne na przecięcia.
Wybierz myszy z odtworzeniem ponad 15% ludzkich komórek CD45 dodatnich i z obecnością ludzkiej albuminy w surowicy pod kątem zakażenia HIV-1. Dootrzewnowo wstrzyknąć myszom od 1 000 do 10 000 zakaźnych dawek 50 HIV-1 ADA w objętości od 100 do 200 mikrolitrów na mysz. Po eutanazji myszy należy wyciąć wątrobę każdej myszy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Zbierz i utrwal wątroby w 4% paraformaldehydzie przez noc. Stworzenie podwójnie humanizowanego modelu myszy z ludzką wątrobą i komórkami odpornościowymi może być łatwo monitorowane na każdym etapie za pomocą bardzo prostej ELIZA i cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa jest regularnie wykonywana w celu oceny rozwoju funkcjonalnego układu odpornościowego i zobaczenia wpływu zakażenia wirusem HIV na komórki odpornościowe.
U podwójnie humanizowanych myszy rozwój funkcjonalnych komórek odpornościowych może wynosić od 15 do 90% bramy limfocytów. W celu oceny wszczepienia ludzkich hepatocytów, test ELIZA dla stężenia albuminy specyficznej dla człowieka wykonuje się co miesiąc w surowicy myszy. Myszy wszczepione zarówno HSPC, jak i HEP wykazują specyficzny dla człowieka poziom albuminy w zakresie od około siedmiu mikrogramów na mililitr do 377 mikrogramów na mililitr po jednym miesiącu, kontynuując wzrost w czasie obserwacji.
Wpływ zakażenia wirusem HIV na ludzkie komórki odpornościowe we krwi podwójnie humanizowanych myszy jest monitorowany za pomocą cytometrii przepływowej, a na HEP w wątrobie za pomocą albuminy specyficznej dla człowieka ELIZA. Po pięciu tygodniach HIV-1 powoduje spadek poziomu ludzkiej albuminy w surowicy i dochodzi do wyczerpania ludzkich hepatocytów CK18 dodatnich w odcinkach wątroby podwójnie humanizowanych myszy. Niższy stosunek CD4 do CD8 jest zwykle obserwowany we krwi i wątrobie myszy zakażonych wirusem HIV, w porównaniu z poziomami odnotowanymi u tej samej myszy przed zakażeniem.
Krew należy ostrożnie ułożyć warstwami na pożywce do separacji limfocytów w celu wyizolowania kożuchowca. Przed operacją delikatnie przytrzymaj śledzionę i wbij igłę w dolny biegun śledziony. Po wyizolowaniu hematopoetycznych komórek macierzystych kluczowe jest sprawdzenie czystości krwiotwórczych komórek macierzystych CD34-dodatnich, aby uniknąć komórek CD3-dodatnich i ostrych wstrzyknięć hepatocytów od różnych dawców.
Ponieważ humanizowane myszy wykazują fizjologiczny aspekt ludzkiego układu odpornościowego i wątroby, rozwinięte myszy można wykorzystać do badania fizjopatogenezy HIV oraz infekcji fizycznych i marskości wątroby.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół zapewnia niezawodną metodę stworzenia zmodyfikowanych myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Podwójnie rekonstytuowane myszy z niedoborem odporności są podatne na infekcję HIV-1 i odzwierciedlają uszkodzenie wątroby, jak to obserwuje się u zakażonych HIV pacjentów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Choroby zakaźne
Tło
- Zmodyfikowane myszy człowieka są niezbędne do badania chorób ludzkich.
- Te modele mogą naśladować ludzkie reakcje immunologiczne i funkcje wątroby.
- Badania nad infekcją HIV-1 wymagają odpowiednich modeli zwierzęcych do zrozumienia mechanizmów choroby.
- Wykorzystanie ludzkich komórek macierzystych z krwiotwórczych i hepatocytów poprawia istotność modelu.
Cel badania
- Stworzyć zmodyfikowanego mysza z funkcjonalnym ludzkim układem odpornościowym i wątroby.
- Zbadać immunopatologię spowodowana przez HIV.
- Zapewniać wgląd w mechanizmy uszkodzenia wątroby u osób zakażonych HIV.
Stosowane metody
- Wstrzyknięcie do śledziony ludzkich hepatocytów i komórek macierzystych CD34+.
- Wykorzystanie krwi pępowinowej do pozyskiwania komórek macierzystych.
- Stworzenie myszy z niedoborem odporności na integrację ludzkich komórek.
- Ocena podatności na infekcję HIV-1.
Główne wyniki
- Udane stworzenie podwójnie rekonstytuowanych myszy z niedoborem odporności.
- Demonstracja uszkodzenia wątroby podobnego do tego u pacjentów zakażonych HIV.
- Walidacja modelu do badania immunopatologii HIV.
- Potencjał do dalszych badań nad interwencjami terapeutycznymi.
Wnioski
- Protokół oferuje solidną metodę tworzenia zmodyfikowanych myszy.
- Ten model jest cenny dla zrozumienia uszkodzenia wątroby związanego z HIV.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do zbadania opcji leczenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The dual humanized TK-NOG mouse model enables mechanistic de-risking of HIV-associated liver pathogenesis by recapitulating human hepatocyte engraftment and immune system development. This system supports target validation and preclinical evaluation of antiviral and antiretroviral compounds in a disease-relevant context. It provides predictive confidence for translational biomarker alignment and portfolio triage in infectious disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on HIV-induced liver immunopathology using human hepatocytes and immune cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through measurable human albumin levels and immune cell reconstitution.
- Predictive Value: Supports preclinical model selection by demonstrating liver damage phenotypes comparable to HIV-infected patients.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream antiviral compound screening with quantifiable human-specific albumin ELISA readouts.
- Operational Value: Standardizes engraftment assessment via monthly human albumin ELISA and immune cell flow cytometry for reproducible monitoring.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across hepatitis virus co-infection studies and therapeutic intervention evaluations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant liver immunopathology to bridge discovery findings with preclinical validation of HIV pathogenesis mechanisms.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by monitoring human CK18+ hepatocyte depletion and CD4/CD8 ratio shifts post-infection.
- Translational Continuity: Supports evaluation of antiviral compounds in a system exhibiting physiological aspects of human liver and immune function.
Pipeline & Workflow Integration
The model integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for HIV-associated liver disease and co-infection studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of HIV-driven liver damage via human hepatocyte and immune cell engraftment in immunodeficient mice.
- Screening: Delivers assay readiness through quantifiable human albumin levels and immune cell profiling for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (human albumin ELISA, flow cytometry) enabling cross-condition comparison and effect size determination.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling liver damage and immune dysregulation observed in HIV-infected patients.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable capability for studying hepatitis virus co-infection and antiviral drug efficacy across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in HIV liver pathogenesis through dual reconstitution of human liver and immune compartments.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined engraftment thresholds (>15% human CD45+ cells, detectable human albumin).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of hepatocyte depletion and immune dysregulation.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on liver pathology mitigation in a human-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hematopoietic stem cell isolation, hepatocyte preparation, and murine surgical procedures.
- Depends on specialized instrumentation including flow cytometers, ELISA readers, and biosafety level two plus facilities.
- Necessitates cross-team standardization of engraftment validation protocols using human albumin ELISA and immune cell flow cytometry.
- Involves adaptation considerations for different donor sources of hepatocytes and HSPCs to maintain engraftment consistency.
- Limited by the need for treosulfan conditioning and ganciclovir administration to achieve dual reconstitution, which adds procedural complexity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:47
Processing of Umbilical Cord Blood and the Isolation of Human HSPCs
4:25
Preparation of Human Hepatocytes for Transplantation
5:10
Preparation for the Surgery and Instrasplenic Transplantation of Human HSPCs and Hepatocytes in Mice
6:50
HIV Infection of TK-NOG Mice and Its Effect on the Human Liver and Immune System
7:48
Results: Analysis of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model
9:25
Conclusion
